JP7198222B2 - Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の測定方法及び測定キット - Google Patents

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Description

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の測定方法及び測定キットに関する。
Ｂ型肝炎は、現在、肝疾患の中で最も多い疾患であり、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）がヒトに感染することにより引き起こされるウイルス性肝炎である。
このＢ型肝炎ウイルスの本体は、直径４２ｎｍの二重構造の球形粒子の形状をとっている「デーン（Ｄａｎｅ）粒子」と称される粒子である。デーン粒子は、その表面がＢ型肝炎ウイルスｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）と称される表面抗原でおおわれており、さらに内部にはＨＢｃ抗原（コア抗原）、ＨＢｅ抗原、及びウイルス遺伝子をコードする環状二重鎖ＤＮＡを含む直径２７ｎｍのコア構造が存在することが知られている。
ＨＢｓＡｇは、感染性を有するＨＢＶ粒子表面の腫瘍構成外被蛋白であり、ＨＢＶ－ＤＮＡを含むコア粒子を包み込んでいる肝細胞由来の脂質二重膜に包含されている。また、ＨＢＶ感染者の血液中には、コア粒子がなく、ＨＢｓＡｇからなる感染性のない小型球形粒子や管状粒子も存在する。小型球形粒子は血中に最も多量に存在しており、ＨＢＶ粒子が１～数個に対して約１０００個の比率で観察される。現在市販されているＨＢｓＡｇ検査は、主にこの小型球形粒子の形態にあるＨＢｓＡｇを検出するものである。
ＨＢｓＡｇは、全長２２６アミノ酸残基からなる脂質二重膜を４回貫通する膜蛋白である（そのアミノ酸配列を配列番号１に示す）。ＨＢｓＡｇの膜貫通構造モデルは完全に解明されているわけではないが、例えば、非特許文献１に膜貫通モデルの１つが開示されている（図１）。この膜貫通モデルによると、ＨＢｓＡｇには、４つの膜貫通領域が存在し、ＨＢｓＡｇの８～２３番のアミノ酸残基が第１膜貫通領域、８０～９８番のアミノ酸残基からなる第２膜貫通領域である。これに加えて、ＨＢｓＡｇには、２３～８０番のアミノ酸残基からなる脂質二重層の第１内側領域、９８～１７９番のアミノ酸残基からなる親水性の第２外側（ＥＲルーメン）領域、そして１７９番目以降の疎水性の第３膜貫通領域、第２内側領域、第４膜貫通領域が存在する。
従来のＨＢｓＡｇの分析方法としては、ＨＢｓＡｇの共通抗原決定基ａに結合する抗体を使用する方法が一般的であった。共通抗原決定基ａは、ＨＢｓＡｇの第２外側（ＥＲルーメン）領域、すなわちウイルス粒子表面に局在している９８番目から１７９番目のアミノ酸残基の１１０～１５６番のアミノ酸残基からなるペプチド上に位置している。この共通抗原決定基ａは複雑な高次構造からなり、その上に、少なくとも４つのエピトープが存在すると報告されている（非特許文献２）。
ＨＢＶの急性感染の患者においては、感染初期においてＨＢｓＡｇが陽性であるが、その後ＨＢｓ抗体が陽性となり、ＨＢｓＡｇが陰性となる。患者の血液中のＨＢｓ抗体が陽性の場合、前記の共通抗原決定基ａに結合する抗体を用いた方法でＨＢｓＡｇを分析すると、患者のＨＢｓ抗体により分析方法に使用する抗体のＨＢｓＡｇへの結合が阻害され、測定値が低くなる。これについては、検体を酸性化剤またはアルカリ化剤で前処理して、患者由来のＨＢｓ抗体（自己抗体）とＨＢｓＡｇとで形成される免疫複合体を自己抗体の影響を回避する手法や、検体を界面活性剤等で前処理してＨＢＶ粒子の内側に存在する抗原（内側抗原：自己抗体が結合しにくい）を露出させ、内側抗原に特異的に結合する抗体を用いて検出する手法をとることができる（特許文献１、２）。
ＨＢｓ抗体価の高い患者においては、ＨＢｓ抗体（自己抗体）を免疫複合体から解離させたとしても、遊離の自己抗体と免疫測定に使用する抗体との間で競合反応が生じる可能性があった。そのため、検体の前処理工程で、比較的強い酸処理またはアルカリ処理（例えばｐＨ３．０未満またはｐＨ１２．０超）により遊離の自己抗体をさらに不活化させる方法が知られる（例えば、特許文献３）。
特許第４４３０６７７号 EP 2088431 A1 特許第６０２６５６４号
V.D. Siegler, Volker Bruss, Role of Transmembrane Domains of Hepatitis B Virus Small Surface Proteins in Subviral-Particle Biogenesis, J. Virology, 87(3) 2013, pp. 1491-1496 岡本宏明「日本臨床、分子肝炎ウイルス病学 基礎・臨床・予防 下巻 Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ型肝炎ウイルス編」、平成７年１０月２６日発行、ｐ．２１２－２２２
しかし、界面活性剤処理によりＨＢＶ粒子の内側抗原を露出させ、内側抗原のみを検出する方法においては、ＨＢＶ株によっては偽陰性が生じる可能性があったことから、外側抗原と組み合わせて検出する必要があった（特許文献２）。
また、検体の前処理において、強い酸またはアルカリによる自己抗体の不活化を行う方法についても、中和工程を要するため手技が煩雑である、中和反応で生じる塩の影響を受ける、等の課題があった。
本発明の目的は、検体前処理において、強い酸またはアルカリ処理を行わず、かつ、自己抗体の影響を受けにくい、高感度のＨＢｓＡｇの測定方法及び測定キットを提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討の結果、検体中のＨＢｓＡｇ測定の検体前処理工程において、還元剤を使用して抗原を還元化し、さらに後段の免疫測定においてＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の９８－１７９番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと反応可能な抗体を使用することで、本発明の課題を解決し得ることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）生体から分離された検体中のＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の測定方法であって、
前記検体を、還元剤を含む前処理試薬と混和してＢ型肝炎ウイルスｓ抗原を還元する前処理工程と、
前処理後の検体をＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の、配列番号１のアミノ酸配列における９８－１７９番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと抗原抗体反応可能な抗体又はその抗原結合性断片を少なくとも１種類使用してＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の免疫測定を行う免疫測定工程を含む、
Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の測定方法。
（２）前記還元剤が、２－（ジエチルアミノ）エタンチオール塩酸塩（ＤＥＡＥＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール（ＭＥ）、システアミン、トリブチルフォスフィン（ＴＢＰ）からなる群より選択された少なくとも１つの還元剤であり、
前記前処理工程における該還元剤の終濃度が０．５～１００ｍＭである、（１）に記載の方法。
（３）前記抗体が、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の、配列番号１のアミノ酸配列における１１１－１７０番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと抗原抗体反応可能である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記抗体が、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の、配列番号１のアミノ酸配列における１１１－１５６番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと抗原抗体反応可能である、（３）に記載の方法。
（５）前記抗体が、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の、配列番号１のアミノ酸配列における１１１－１３０番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと抗原抗体反応可能である、（４）に記載の方法。
（６）前記前処理工程が、ｐＨ３．０以上１２．０以下の条件下で行われる、（１）～（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）前記前処理試薬が、さらに界面活性剤を含む、（１）～（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）
（i）還元剤を含む前処理試薬、及び
（ii）Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の、配列番号１のアミノ酸配列における９８－１７９番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと抗原抗体反応可能な抗体又はその抗原結合性断片を少なくとも１種類含む免疫測定試薬
を具えたＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の測定キット。
本発明によれば、検体前処理を感度低下の要因となりうる酸・アルカリ処理を行わず、自己抗体の影響を低減し得る、高感度のＨＢｓＡｇの測定方法及び測定キットを提供することができる。
ＨＢｓＡｇの膜貫通モデルの模式図である。
＜ＨＢｓＡｇの測定方法＞
本発明の方法は、生体から分離された検体と、還元剤を含む前処理試薬とを混和する前処理工程を含み、免疫測定において、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）の、配列番号１のアミノ酸配列における９８－１７９番目（Ｎ末端から数えて。アミノ酸の位置番号はいずれもＮ末端から数えたもの）のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと抗原抗体反応可能な抗体（以下、「還元外側認識抗体」とも称する）又はその抗原結合性断片（以下の記述において、文脈上矛盾がない限り、「抗体」という語は、「抗原結合性断片」をも包含する意味で用いる）を少なくとも１種類使用する、ＨＢｓＡｇの測定方法である。
本発明の方法で測定されるＨＢｓＡｇは、脂質二重膜を４回貫通する２２６アミノ酸残基からなる膜タンパク質である。ＨＢＶにはいくつかの遺伝子型、例えば、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧがあることが知られており、その遺伝子型によって、ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列が異なっている。またa領域の抗原性には複数の型があることも知られている。本発明の方法により測定されるＨＢｓＡｇは、これらのヘテロジェナイティーのあるアミノ酸配列を有するＨＢｓＡｇを測定対象とする。
図１にＨＢｓＡｇの膜貫通構造モデルを示す。図１のＨＢｓＡｇの膜貫通構造モデルにおける９８～１７９番のアミノ酸残基は、親水性の第２外側（ＥＲルーメン）領域に相当する。本発明の方法で、抗原抗体反応において使用される抗体（後述）は、ＨＢｓＡｇの９８～１７９番目の還元されたペプチドをエピトープとする抗体であるが、９８～１７９番目の領域は、第２外側領域に相当する。ＨＢｓＡｇの９８～１７９番のアミノ酸残基からなるペプチドは、ＨＢＶ粒子の脂質二重膜の外側のＥＲルーメンに存在する親水性のペプチドである。その標準的なアミノ酸配列は、配列番号１の９８～１７９番のアミノ酸配列である。しかしながら、本明細書における第２外側領域は、ＨＢｓＡｇのＮ末側から第２番目の脂質二重層の外側（ルーメン側）に存在するペプチドであればＨＢｓＡｇの配列番号１の９８～１７９番のアミノ酸配列からなるペプチドに限定されず、例えば、Ｎ末側からのアミノ酸の番号が異なるペプチドや、配列番号１の９８～１７９番のアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換（変異）、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドである場合もある。なお、このような配列番号１以外のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として用いた抗体又はその抗原結合性断片であっても、配列番号１のアミノ酸配列における９８－１７９番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと抗原抗体反応可能な抗体又はその抗原結合性断片を用いる場合には、本発明の範囲に含まれる。
１．前処理工程
本発明の方法は、検体の前処理工程を含む。本発明において、「検体」とは、ＨＢｓＡｇを含む生体由来の試料を示し、具体的には、例えば、血清、血漿、全血、尿、便、口腔粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜および生検試料（例、膵臓試料、腸管試料、肝臓試料）並びにこれらの希釈物が挙げられる。好ましくは、検体は、血清または血漿である。また、本発明において、「前処理」とは、ターゲット分子（ここではＨＢｓＡｇ）と特異的抗体とを反応させる免疫測定工程の前に、検体中に含まれるターゲット分子の構造や性質等を変化させるための処理を示すものとする。さらに、本発明において、前処理は、検体と前処理試薬とを混和することで実施される。
前記前処理試薬には、還元剤が含まれる。還元剤としては、タンパク質のＳ-Ｓ結合を切断するために通常使用されるものをいずれも使用可能であり、特に限定はされない。例えば、２－（ジエチルアミノ）エタンチオール塩酸塩（ＤＥＡＥＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール、システアミン、トリブチルフォスフィン（ＴＢＰ）等の既存の還元剤をいずれも使用可能であるが、溶液中の安定性に優れることから、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、ＴＢＰを特に好適に使用できる。還元剤の濃度としては、検体との混和液の終濃度として０．５～１００ｍＭ、特に１．０～５０ｍＭ、さらに２．０～２０ｍＭとすることが好ましい。
前記前処理試薬に還元剤が含まれることにより、検体中に含まれるＨＢｓＡｇのＳ-Ｓ結合が切断され、その立体構造が解離してリニアな構造となる。これにより、図１のＨＢｓＡｇの膜貫通構造モデルにおける第２外側領域（以降、「共通抗原決定基ａ」または「ａ－ｌｏｏｐ」とも称する）の立体構造もリニアとなる。本発明者らは、自己抗体の多くが、ａ－ｌｏｏｐの立体構造を認識する抗体であり、同部分の還元された（リニアな）ペプチドには反応しないことを見出した（後述・実施例２）。検体を、還元剤を含む前処理試薬で処理することにより、還元されたＨＢｓＡｇと自己抗体との反応性を低下させることが可能となり、自己抗体によるＨＢｓＡｇ測定値への負の影響を低減させることができる。
前処理工程におけるｐＨ（検体と前処理試薬との混和液のｐＨ）は、ｐＨが３．０以上１２．０以下、特に５．０以上１０．０以下、さらに６．０以上９．０以下となることが好ましい。本発明では、前処理試薬に還元剤を加えることにより、ＨＢｓＡｇの立体構造を変化させることで、自己抗体のターゲット分子の存在を事実上なくすことができる。ターゲット分子が存在しないため、自己抗体が抗原抗体反応に与える影響は、抗体の活性の有無に関わらず極めて小さくなる。そのため、従来技術のように、抗体を不活化させてターゲット分子（抗原）への影響を低減させる必要がない。したがって、前処理試薬のｐＨは、比較的中性に近い条件であっても、本発明の目的を達成することが可能となる。前処理試薬のｐＨを上記範囲とすることで、抗原抗体反応工程の前の中和工程の省略または中和剤量の低減が可能となり、中和工程に起因する塩の生成の影響等を回避または低減することができる。また、検体中の自己抗体の失活が生じにくくなることから、ＨＢｓＡｇの測定と同時に、またはＨＢｓＡｇの測定後に、同検体中の抗ＨＢｓ抗体の測定を実施することも可能となる。
前記前処理試薬には、ｐＨ緩衝剤が含まれていてもよい。ｐＨ緩衝剤は、上記ｐＨ範囲に適した緩衝剤であれば特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス、トリシン、ビシン、トリス、イミダゾール、トリエチルアミン、グリシルグリシン等、通常ｐＨ緩衝剤として広く使用されているものをいずれも使用可能である。
前記前処理試薬には、界面活性剤が含まれていてもよい。特に、後述の抗原抗体反応工程において、還元外側認識抗体と組み合わせて、内側抗原と抗原抗体反応可能な抗体（内側認識抗体）を使用する場合には、ＨＢＶ粒子の内側のターゲット領域を露出させるため、界面活性剤を使用する必要がある。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤のいずれも使用可能であるが、特に陰イオン性界面活性剤が好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ－ラウロイルサルコシン（ＮＬＳ）、ドデシル硫酸リチウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、デオキシコール酸などを好適に使用でき、特にＳＤＳを好適に使用できる。陰イオン界面活性剤を使用する場合は、検体と混和した混和液の前処理時の濃度（重量基準）として、０．１～１２．５％、特に０．２５～１０％、さらに０．５～７．５％とすることが好ましい。
前処理試薬に含まれる主要な界面活性剤を陰イオン性界面活性剤とする場合、前処理後に、反応系に持ち込まれる陰イオン界面活性剤の影響を軽減するために、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤を単独または複数含む中和液を添加してもよい。
前記前処理試薬に含まれる界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤に代えて、陽イオン界面活性剤を使用することもできる。陽イオン界面活性剤としては、特に炭素数１０個以上の一本鎖アルキル基と、第３級アミンまたは第４級アンモニウム塩を同分子中に有している陽イオン性界面活性剤が好ましい。このような界面活性剤の例としては、デシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（Ｃ１６ＴＡＣ）、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）、ラウリルピリジニウムクロライド、テトラデシルピリジニウムクロライド、セチルピリジニウムクロライド等が挙げられる。陽イオン界面活性剤の添加量は、検体との混和時の濃度で０．１％以上１５%以下が好ましく、さらに、０．５％～１０％が好ましい。
陽イオン性界面活性剤に加えて、さらに非イオン性界面活性剤等の他の界面活性剤が含まれていてもよい。他の界面活性剤の添加により、さらに高感度にＨＢｓＡｇを検出することが可能となる。
前処理試薬には、必要に応じて、尿素、チオ尿素等、他のタンパク変性剤が含まれていてもよい。変性剤の濃度は、処理時濃度で０．１Ｍ以上が好ましく、さらに０．５Ｍ以上４Ｍ未満が好ましい。また、前処理試薬には、処理効果を増強させるために、単糖類、二糖類、クエン酸、及びクエン酸塩類のいずれか、またはこれらを組合せて添加してもよい。さらに、前処理試薬には、ＥＤＴＡ等のキレート剤が含まれていてもよい。
前記前処理工程において混和する検体と前処理試薬の体積比は、１：１０～１０：１、特に１：５～５：１、さらに１：３～３：１とすることが好ましい。前処理工程は、生体試料と前処理試薬を混和した後、さらに加熱をしてもよい。特に、前処理試薬に界面活性剤を使用する場合には、その効果を高めるために加熱をすることが好ましい。前処理工程における温度は、９５℃以下、特に２０～９０℃、さらに、２０～８０℃、２５～７０℃、２５～６０℃、３０～５０℃、または３５～４５℃とすることができる。前処理工程は、より高温条件下で加熱すれば、より短時間での処理が可能となるが、一方で、室温条件下でも実施可能であり、この場合、反応時間は長くなるが、高温加熱用のデバイスを必要としない、という利点がある。前処理工程の反応時間の上限は特に存在しないが、通常６０分以下、特に３０分以下でよい。
２．免疫測定工程
本発明の方法の前処理工程で処理された混和液は、次いで免疫測定工程に供される。免疫測定工程は、(1)抗原抗体反応工程と、(2)検出工程を含む。
(1) 抗原抗体反応工程
抗原抗体反応工程においては、上記混和液を、ＨＢｓＡｇに対する抗体を含む抗原抗体反応液と混合して、前処理後の抗原と抗体とを反応させる。
本発明の方法で使用する抗体は、配列番号１の還元された（リニアな）９８～１７９番のアミノ酸配列よりなるペプチドを認識できる抗体であれば、特に限定されないが、例えば、配列番号１の９８～１７９番のアミノ酸配列からなるペプチドに抗原抗体反応する抗体及び配列番号１の９８～１７９番のアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換（変異）、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、該ペプチドは、ＨＢｓＡｇの断片である）に抗原抗体反応する抗体を含むことができる。より具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸における１２１～１３０番のアミノ酸配列からなるペプチド、１５１～１７９番のアミノ酸配列からなるペプチド、１１１～１３０番のアミノ酸からなるペプチド、１２１～１４０番のアミノ酸からなるペプチド、９８～１５６番のアミノ酸配列からなるペプチド、又はそれらのペプチドの一部のアミノ酸が置換されたペプチド等（ペプチドは全てリニア）に抗原抗体反応する抗体が含まれる。本発明の方法で使用する抗体は、上記のリニアなペプチドに抗原抗体反応する抗体であれば特に限定はされず、複雑な高次構造からなる構造エピトープ、例えば、共通抗原決定基ａを認識してもよい。配列番号１の９８～１７９番のアミノ酸配列のみからなる部分ペプチドでは形成することができず、その部分ペプチドより長いペプチド、例えば、ＨＢｓＡｇの全長である２２６アミノ酸残基からなる全長ペプチドによって形成されるエピトープも存在する。本発明で使用する抗体は、上記のリニアなペプチドに反応し、かつ、例えば、配列番号１のアミノ酸における９８～１７９番のアミノ酸配列のみからなる部分ペプチドより長いペプチドによって形成され、配列番号１の９８～１７９番のアミノ酸配列からなる領域に存在する構造エピトープに結合することのできる抗体を包含する。
本発明の方法で使用する抗体としては、配列番号１の還元された９８～１７９番のアミノ酸配列よりなるペプチドを認識できる抗体であれば、特に限定されない。例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、レセプター、又はアナログなどを挙げることができるが、好ましくはモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片（以下、「抗体フラグメント」と呼ぶことがある）である。
モノクローナル抗体の抗体フラグメントとしては、配列番号１の還元された９８～１７９番のアミノ酸配列よりなるペプチドを認識できる抗体フラグメントであれば、限定されないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ等を挙げることができる。これらの抗体フラグメントは、例えば、本発明のモノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することで、得ることができる。
本発明の方法におけるＨＢｓＡｇの測定原理は、免疫測定であれば特に限定されず、サンドイッチ法、競合法、免疫凝集法等の周知の免疫測定のいずれをも採用することができる。これらのうち、好ましくは、ＨＢｓＡｇを捕捉抗体と検出抗体を使用して検出するサンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法としては、２ステップ法であるフォワードサンドイッチ法（固相化抗体と検体中の抗原、固相に結合した抗原と標識抗体との反応を逐次的に行う）、リバースサンドイッチ法（予め標識抗体と検体中の抗原を反応させ、生成した抗原抗体複合物を固相化抗体と反応させる）、及び１ステップ法（固相化抗体、検体中の抗原、標識抗体の反応を同時に１ステップで行う）を挙げることができるが、これらのいずれも採用可能である。
本発明の方法では、ＨＢｓＡｇの配列番号１の還元された９８～１７９番のアミノ酸配列よりなるペプチドを認識できる抗体（還元外側抗原認識抗体）を、捕捉抗体及び検出抗体の少なくとも一方に使用する。好ましくは、捕捉抗体及び検出抗体の両方に還元外側抗原認識抗体を使用する。捕捉抗体を還元外側抗原認識抗体とする場合は、検出抗体は、還元外側抗原認識抗体でも還元された内側抗原を認識する抗体でもよいが、還元外側抗原認識抗体とすることが好ましい。また、検出抗体を還元外側抗原認識抗体とする場合は、捕捉抗体は、還元外側抗原認識抗体でも還元内側抗原認識抗体でもよいが、還元外側抗原認識抗体とすることが好ましい。なお、いずれの場合も、還元されていない外側抗原構造を認識する抗体を用いることはできない。また、競合法や免疫凝集法等で、抗体を１種類しか使用しない場合には、使用する1種類の抗体が還元外側抗原認識抗体である。
本発明の方法において、捕捉抗体及び検出抗体のいずれかにすくなくとも１種の還元外側抗原認識抗体を使用していれば、捕捉抗体及び／または検出抗体として、複数種の抗体を組み合わせて使用してもよい。
本発明の方法において、免疫測定工程は、前処理工程を経た検体を捕捉抗体及び検出抗体と接触させる接触工程と、後述する、検出抗体のシグナルを検出する検出工程を含むことができる。また、前記接触工程は、前記検体と捕捉抗体とを接触させる第１接触工程と、第１接触工程で形成された抗原抗体複合体に検出抗体を接触させる第２接触工程に分けて行うことも可能である。
より具体的には、例えば、フォワードサンドイッチ法は以下のように行うことができる。まず、マイクロプレートや磁性ビーズなどの不溶性担体に、ＨＢｓＡｇと結合する捕捉抗体を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体が固相化されたプレートやビーズに、前処理工程を経た検体を一次反応液と一緒に加え、捕捉抗体と検体中のＨＢｓＡｇとを接触させ、結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたＨＢｓＡｇを認識する抗体とアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）などの酵素が結合した標識抗体を添加し、捕捉された抗原に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体－抗原－標識抗体の免疫複合体がマイクロプレート等の担体上に形成される。結合しなかった標識抗体を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。
本発明の方法において使用する捕捉抗体とは、検体中のＨＢｓＡｇを捕捉する抗体であるが、前記の不溶性担体を用いたサンドイッチ法では、不溶性担体に固相化される固相抗体である。 本発明の方法において使用する検出抗体とは、捕捉抗体によって捕捉された検体中のＨＢｓＡｇを検出する抗体であるが、前記の不溶性担体を用いたサンドイッチ法では、酵素などによって標識された標識抗体である。
捕捉抗体及び検出抗体の両方に還元外側抗原認識抗体を用いる場合、それらの結合するエピトープが異なる抗体を用いる。「エピトープが異なる」とは、エピトープが完全に一致しないことを意味する。例えば、２つの抗体が同じモノクローナル抗体である場合や、２つの抗体がエピトープ阻害試験により、完全に阻害される抗体である場合は、２つの抗体のエピトープが一致しているといえる。一方、捕捉抗体と検出抗体のエピトープが一部重複している場合は、多くの場合、本発明の方法において使用することができる。
抗体を標識する酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β－ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼなどを挙げることができる。また酵素以外にも、標識物質として、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、Ｉ１２５などの放射性物質などを使用することができる。また、標識物質に会わせて基質や発光誘導物質を適宜選択することができる。
更に、本発明における標識抗体は、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体も含む。ハプテンにはビオチン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ＦＩＴＣなどが含まれる。例えばビオチンを抗体に結合させ、プローブ複合体を作成した場合、ビオチンに親和性のあるアビジンにＡＬＰなどの酵素、フルオレセインなどの蛍光物質、又はアクリジニウム誘導体などの発光物質を標識し、プローブ複合体と反応させ発色、蛍光、発光などによりシグナルを検出することができる。
抗体の標識方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、抗体を酵素などの標識物で直接標識する方法、デキストランなどの高分子化合物に抗体と酵素などの標識物を結合させる方法、標識抗体をデキストランなどの高分子化合物に結合させる方法などが含まれる。
本発明の抗体には、動物のポリクローナル抗体及びマウスのモノクローナル抗体が包含されるが、抗体を得るために動物を免疫する方法、及びモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得るための方法は、ＨＢｓＡｇやＨＢｓＡｇの部分ペプチドを免疫原として用いることを除いて、周知の方法によって実施することができ、例えば、続生化学実験講座（日本生化学会編）、又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法に従って、行うことができる。免疫用のＨＢｓＡｇは、ウイルス粒子、又はウイルス粒子からＨＢｓＡｇを精製し、用いることができる。また、ＨＢｓＡｇ及び部分ペプチドは、例えば、それらの抗原を遺伝子組み換えにより大腸菌で発現させ、精製することによって得ることができる。更に、ＨＢｓＡｇの部分ペプチドは、化学合成によって調製することができ、例えば、Ｆｍｏｃ固相合成法、Ｂｏｃ固相合成法によって合成できる。合成したペプチドは、ＨＰＬＣ等の公知の方法で精製することができ、末端のアミノ酸をシステインとし、そのＳＨ基を利用して、ペプチドを担体タンパク質に結合させ、免疫原として使用することもできる。
本発明で使用する抗体は、還元したＨＢｓＡｇまたはそのペプチド断片を免疫原として用いて、動物を免疫することによって、取得することができる。または、還元していないＨＢｓＡｇまたはそのペプチド断片を免疫原として用いて複数種の抗体を取得した後、還元したＨＢｓＡｇまたはそのペプチド断片を用いてスクリーニングを行うことで取得することができる。免疫に用いる動物は、特に限定されないが、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、トリ、ウシ、ウマなどを用いることができる。ＨＢｓＡｇまたはそのペプチド断片を、例えば、等量のフロイントの完全アジュバント又はＴｉｔｅｒ－Ｍａｘ ｇｏｌｄ（Ｔｉｔｅｒ Ｍａｘ社）と乳化混合し、ウサギの皮下や、マウスの腹腔内に投与する。以後、１～２週間間隔で、同様の免疫操作を行う。このようにして免疫した動物から採血し、血清又は血漿とすることにより、本発明の抗体を調製することができる。
本発明のモノクローナル抗体を産生する本発明のハイブリドーマは、前記の免疫操作を行った動物から取得することができる。例えば、マウスに数回の免疫操作を行った２週後に、尾静脈からリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）等に溶解したＨＢｓＡｇまたはそのペプチド断片を接種する。その２～３日後に、マウスから抗体を産生するリンパ球を含む脾臓を無菌的に摘出する。このリンパ球を、例えば、ミエローマ細胞と細胞融合させることにより、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立することが可能である。
細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールの存在下で、リンパ球及びミエローマ細胞を融合させることによって行うことができる。ミエローマ細胞は、例えば、ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナ－ゼ欠損のようなマーカーを有する公知の細胞を用いることができる。具体的には、例えば、ｐ３・ＮＳ－１／１・Ａｇ４．１又はＳＰ２／０－Ａｇ１４などの細胞を挙げることができる。融合した細胞は、選択培地、例えばＨＡＴ培地を用いて、融合しなかった細胞を死滅させることによって選択する。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中の抗体産生の有無をスクリーニングする。スクリーニングは、ＨＢｓＡｇ及びそのペプチド断片に対する特異抗体の産生を固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）などを用いて測定することによって実施することができる。目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択し、更に限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことによって、モノクローナル抗体のクローン性を保証することができる。このようにして、本発明の抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
本発明のハイブリドーマは、公知の任意の培地、例えば、ＲＰＭＩ１６４０で継代培養することができる。本発明のモノクローナル抗体は、このハイブリドーマを培養することによって、調製することができるが、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ウシ胎児血清を加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養することによって、培養上清中に抗体が産生される。また、プリスタンで前処理したマウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、１０～２０日後に、腹水を回収することによって、腹水中に抗体を産生させることが可能である。本発明の抗体は、公知の方法により精製することができるが、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＧ又はＰｒｏｔｅｉｎＡカラムを用いた精製法、ＨＢｓＡｇを結合させたアフィニティーカラムを用いる方法、又はイオン交換カラムを用いる方法などで精製することができる。
得られたモノクローナル抗体の認識するエピトープは、ＨＢｓＡｇ由来の配列から、作製した組換え抗原又は化学合成した１０～２０アミノ酸程度の合成ペプチドを用いて、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）によって、決定することができる。本発明の各ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体のエピトープは、遺伝子型の異なるＨＢｓＡｇのアミノ酸配列に基づき１０残基ずつオーバーラップし、化学合成した２０アミノ酸残基からなるペプチドに対する反応性によって決定した。
３．検出工程
抗原抗体反応工程でＨＢｓＡｇに接触させた検出抗体について、検出抗体に使用した標識に適した方法、例えば酵素標識を用いた場合は酵素の基質を添加することによって、検出する。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を標識抗体として用いた場合は、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を酵素基質として用いた化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）の系とすることができる。
＜ＨＢｓＡｇの測定キット＞
本発明のキットは、（１）還元剤を含む前処理試薬、及び（２）Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の９８－１７９番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと反応可能な抗体を少なくとも１種類含む抗原抗体反応試薬を具えたＢ型肝炎ウイルスｓ抗原のキットである。
ここでいう「抗原抗体反応試薬」は、キットにおいて、捕捉抗体を含む試薬と検出抗体を含む試薬を別の構成とする場合は、いずれか一方若しくは両方を示し、捕捉抗体と検出抗体の両方を含む試薬を用いる場合は当該試薬を示す。すなわち、捕捉抗体及び検出抗体の少なくとも一方に、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の９８－１７９番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと反応可能な抗体（還元外側抗原認識抗体）を少なくとも１種類用いるものとする。
本発明のキットは、互いに隔離された形態または組成物の形態において各構成試薬を含む。具体的には、各構成試薬はそれぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよいが、一部の構成試薬が組成物の形態（例、同一溶液中）で提供されてもよい。あるいは、本発明のキットは、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成試薬の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成試薬の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成試薬は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。また、本発明のキットは、ＨＢｓＡｇ標準液、他の抗Ｂ型肝炎ウイルス抗体、使用説明書などを含むことができる。
＜実施例１ 各種抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体の還元抗原への反応性＞
（１）非還元・還元ＨＢｓＡｇ固相化プレートの調製
市販のネイティブＨＢｓＡｇ（サブタイプａｄ、ＴＲＩＮＡ社製）をＰＢＳまたは６Ｍ尿素を含むＰＢＳで１２．２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、抗原希釈液（尿素（－）、尿素（＋））を調製した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）をイオン交換水で希釈し、１、１０、５０、１００、２００、５００、１０００ｍＭの還元剤液をそれぞれ調製した。９６穴マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに抗原希釈液を９０μＬずつ分注し、ここに各還元剤液を１０μＬ添加した。室温で６０分間静置したのち、ここにＰＢＳまたは６Ｍ尿素を含むＰＢＳを８０μＬ／ウェル添加した。４℃で一晩静置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。ブロッキング液（１％ ＢＳＡ、３％ スクロース、ＰＢＳ）を３５０μＬ分注して、室温で３時間静置した後、ブロッキング液を吸引除去し、室温で風乾した。
（２）モノクローナル抗体の各抗原への反応性試験（ＥＬＩＳＡ）
表１に示す６種の抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（抗体Ａ～Ｆ）を用いて、各プレートへの反応性の試験を実施した。各抗体の調製は、目的とするエピトープ領域を含む組み換えペプチドを免疫原とした以外は、特許文献２と同様の方法を用いて実施した。また、エピトープの解析についても、特許文献２と同様の方法を用いて実施した。
抗体Ａ～Ｆについて、（１）で調製したすなわち、抗体Ａ～Ｆについて、それぞれ１μｇ／ｍＬとなるように抗体希釈液（０．０２４Ｍ リン酸二水素カリウム、０．０７６Ｍ リン酸水素二カリウム、０．２５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０２Ｍ ＥＤＴＡ２Ｎａ、１％ ポリビニルピロリドン（ｋ＝３０）、１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、ｐＨ７．３）で希釈して抗体溶液を調製した。
Figure 0007198222000001
各種抗体溶液を、（１）で調製した各種プレートにそれぞれ１００μＬ／ウェル分注し、室温で６０分間静置した。プレート洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）を含むＰＢＳ）で５回洗浄した後、標識抗体液（ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を抗体希釈液で１００００倍希釈した溶液）を１００μＬ／ウェル分注し、室温で６０分間静置した。プレート洗浄液で３回洗浄した後、基質溶液（ＴＭＢ溶液）を１００μＬ／ウェル分注し、室温で３０分静置した後、２Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェル分注して反応を停止させた。各ウェルの４５０/６３０ｎｍの吸光度を測定した。各ウェルの吸光度からブランク（ＰＢＳのみ）の吸光度を減じた値を表２に示す。
Figure 0007198222000002
抗体Ａは、ＨＢｓＡｇのａ－ｌｏｏｐの構造を認識する抗体であるが、抗原を還元することで、抗原への反応性が著しく低下した。これは、抗原を還元することで、抗体Ａが認識し得る抗原の立体構造が壊れたことが要因と考えられた。一方、抗体Ｂ、Ｃ及びＦは、非還元抗原に対しては反応性が低いのに対し、還元抗原に対する反応性は高く、さらに、尿素存在下での反応性が高かった。抗体Ｄ、Ｅは、非還元抗原に対する反応性も高いが、還元抗原に対する反応性はさらに高くなることが判明した。一方で、尿素の影響はほとんど見られなかった。
＜実施例２ 自己抗体陽性検体の還元抗原への反応性＞
抗ＨＢｓ抗体（ＨＢｓＡｂ）陽性の血清検体８例について、還元抗原への反応性試験を行った。非還元・還元抗原固相化プレートは、実施例１と同様の方法で調製した。
サンプルとして、以下を調製した。
ａ）モノクローナル抗体溶液
抗体Ａ、Ｄをそれぞれ抗体希釈液で１μｇ／ｍＬとなるように希釈して、抗体溶液を調製した。
ｂ）自己抗体陰性血清
２例の自己抗体陰性の血清（Ｎ１、Ｎ２）を用いた。
ｃ）自己抗体陽性血清
８例の自己抗体陽性の血清（Ｐ１～Ｐ８）を用いた。各検体の抗体価は、ルミパルスＨＢｓＡｂ－Ｎ（富士レビオ社製）を用いて測定した。各検体の測定値を表３に示す。
Figure 0007198222000003
各種プレートに抗体希釈液を１００μＬ／ウェル分注し、そこへ抗体溶液、検体をそれぞれ１０μＬずつ添加し、室温で６０分間静置した。プレート洗浄液で５回洗浄した後、標識抗体液（ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体またはＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を抗体希釈液で１００００倍希釈した溶液）を１００μＬ／ウェル分注し、室温で６０分間静置した。プレート洗浄液で３回洗浄した後、基質溶液（ＴＭＢ溶液）を１００μＬ／ウェル分注し、室温で３０分静置した後、２Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェル分注して反応を停止させた。各ウェルの４５０/６３０ｎｍの吸光度を測定した。各ウェルの吸光度からブランク（ＰＢＳのみ）の吸光度を減じた値を表４に示す。
Figure 0007198222000004
自己抗体陽性検体８例について、抗原を還元することで、その反応性が低下することが確認できた。８例のうち２例（Ｐ２、Ｐ４）については、還元抗原に対しても少し反応を示したが、還元剤と尿素で変性させた抗原に対する反応性は著しく低下した。一方で、抗体Ｄについては、還元剤、尿素による反応性低下は見られず、むしろ反応性が向上した。以上のことより、血清検体のＨＢｓＡｇの免疫測定に際し、検体を還元し、かつ抗原抗体反応系に抗体Ｄを用いることで、検体中に含まれる自己抗体と抗原との反応を低減させ、目的とする抗原抗体反応の反応性を高めることができることが示唆された。
＜実施例３ 自己抗体陽性検体と抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体との競合試験＞
自己抗体陽性検体に含まれるヒト抗ＨＢｓＡｇ抗体が、各種モノクローナル抗体と競合するかを検討した。
自己抗体陽性の血清検体６例（Ｐ９～Ｐ１４）を使用した。各血清検体の抗体価は、ルミパルスＨＢｓＡｂ－Ｎ（富士レビオ社製）を用いて測定した。各検体の測定値は表３に示す通りであった。
非還元抗原固相化プレートを、実施例１と同様の方法で調製した。抗体Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆを、それぞれを１００μｇ／ｍＬとなるように抗体希釈液で希釈し、１００μＬ／ウェル分注した。血清検体Ｐ９～Ｐ１４をそれぞれＰＢＳで5倍希釈し、抗体を分注したウェル中にさらに１０μＬ／ウェル分注した。室温で６０分間静置した後、プレート洗浄液で５回洗浄した。標識抗体液（ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体またはＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を抗体希釈液で１００００倍希釈した溶液）を１００μＬ／ウェル分注し、室温で６０分間静置した。プレート洗浄液で３回洗浄した後、基質溶液（ＴＭＢ溶液）を１００μＬ／ウェル分注し、室温で３０分静置した後、２Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェル分注して反応を停止させた。各ウェルの４５０/６３０ｎｍの吸光度を測定した。各ウェルの吸光度からブランク（ＰＢＳのみ）の吸光度を減じた値を表５に示す。
Figure 0007198222000005
各自己抗体陽性検体に抗体Ａを添加した際には、自己抗体の抗原への反応は大きく低下したのに対し、抗体Ｄ、Ｅ、Ｆを添加した際には、反応低下は全く見られないか、極めて限定的であった。検体中のヒト抗ＨＢｓＡｇ抗体は、抗体Ａとは競合するが、抗体Ｄ、Ｅ、Ｆとはほとんど競合しないことが示唆された。
＜実施例４－１ 自己抗体陽性検体のＨＢｓＡｇ測定（ＤＴＴ使用）＞
（１）自己抗体陽性検体のモデル検体の調製
ＨＢｓＡｇ濃度既知の自己抗体陰性の管理血清検体２例（Ｍ３、Ｈ３）について、ヘブスブリン（ポリエチレングリコール処理抗ＨＢｓヒト免疫グロブリン製剤）を終濃度が１０００ｍＩＵ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加し、自己抗体陽性モデル血清検体２例（Ｍ４、Ｈ４）を調製した。
（２）検体前処理
（１）で調製した４検体（Ｍ３、Ｍ４、Ｈ３、Ｈ４）について、検体前処理を行った。前処理試薬は、ベース前処理試薬（２．３９％ ＮＬＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２）にＤＴＴを終濃度２０ｍＭとなるように添加して調製した。各検体１００μＬと各前処理試薬２００μＬとを混和し、３７℃で６０分間加温した。イオン交換水４００μＬを加えて希釈し、前処理混和液を調製した。また、ＨＢｓＡｇ陰性血清３検体について、同様の前処理を行い、ブランクとした。
（３）ＨＢｓＡｇ測定系構築
抗体Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆをそれぞれ固相化した磁性粒子を、粒子希釈液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ、２％ ＢＳＡ、ｐＨ７．２）に０．０５％となるように加え、磁性粒子液を調製した。抗体Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇをアルカリフォスファターゼ標識した標識抗体を標識体希釈液（１００ｍＭ ＭＥＳ、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ６．８）で０．５μｇ／ｍＬとなるように調整し、標識体液を調製した。なお、抗体Ｇのエピトープは表１に示す通りである。
磁性粒子液、標識体液を上記のものに変更し、血清検体を上記の前処理後検体に変更とした以外は、ルミパルスＨＢｓＡｇ－ＨＱ(富士レビオ社製)を用いて、添付文書に記載の方法に従ってＨＢｓＡｇの測定を行い、発光強度（カウント）を出力した。各条件における測定結果を表６－１、６－２に示す。表６－１、６－２に示す測定結果は、各条件におけるＭ３、Ｍ４、Ｈ３、Ｈ４のカウント値から、ＨＢｓＡｇ陰性血清３検体の平均カウント値を除いた値である。
Figure 0007198222000006
 Ｎ．Ｄ．データなし
Figure 0007198222000007
 Ｎ．Ｄ．データなし
抗体Ａを固相化抗体または標識体として使用した場合、前処理液に還元剤を使用しない条件では、自己抗体の影響を強く受ける一方、還元剤を使用した条件ではカウント値が低下し、全体的に感度が低下することが示された。
抗体Ｄ、抗体Ｅを固相化抗体または標識体として使用した場合、前処理液に還元剤を使用することで、全体的にカウント値が上がり、かつ、自己抗体の存在による発光強度の低下の程度が低減し、カウント値のＡｂ（＋）／Ａｂ（－）が、より１に近い値になる傾向が見られた。また、抗体Ｆを固相化抗体、抗体Ｄまたは抗体Ｅを標識体として使用した場合においても、同様の傾向が見られた。
以上より、抗体Ｄ、Ｅ、Ｆのいずれかを使用し、前処理液に還元剤を含む条件でＨＢｓＡｇを測定した場合に、自己抗体の影響を回避し、かつ、より高感度でＨＢｓＡｇを測定し得ることが示唆された。
＜実施例４－２ 自己抗体陽性検体のＨＢｓＡｇ測定（ＴＣＥＰ、ＤＥＡＥＴ使用）＞
（１） ＨＢｓＡｇ測定系構築
黒色９６穴マイクロウェルプレート（Ｆ１６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製）に、抗体Ｂ、抗体Ｆをそれぞれ５μｇ／ｍＬ含むＰＢＳを１００μＬ／ウェル分注し、４℃で一晩静置した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ブロッキング液（１％ ＢＳＡ、３％ スクロース、ＰＢＳ）を３５０μＬ分注して、室温で３時間静置した。ブロッキング液を吸引除去し、室温で風乾し、抗ＨＢｓＡｇ抗体固相化プレートを調製した。
抗体Ｄ、Ｅをアルカリホスファターゼ標識した標識抗体を標識体希釈液（１００ｍＭ ＭＥＳ、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ６．８）で０．５μｇ／ｍＬとなるように調整し、標識体液を調製した。
（２）自己抗体陽性検体のモデル検体の調製
ＨＢｓＡｇ濃度既知の自己抗体陰性の血清検体２例（１３（－）、Ｈ３）について、ヘブスブリンを終濃度が１０００ｍＩＵ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加し、自己抗体陽性モデル血清検体２例（１３（＋）、Ｈ４）を調製した。
（３）検体前処理
（２）で調製した４検体（１３（－）、１３（＋）、Ｈ３、Ｈ４）について、検体前処理を行った。前処理試薬は、ベース前処理試薬（２．３９％ ＮＬＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２）にＴＣＥＰまたはＤＥＡＥＴを終濃度２０ｍＭとなるように添加して調製した。各検体１００μＬと各前処理試薬２００μＬとを混和し、３７℃で６０分間加温した。ＨＢｓＡｇ陰性血清３検体についても同様の前処理を行い、ブランクとした。
（４）ＨＢｓＡｇ測定
（１）で調製した抗ＨＢｓＡｇ抗体固相化プレートにハイブリダイゼーション緩衝液（０．０２４Ｍ リン酸二水素カリウム、０．０７６Ｍ リン酸水素二カリウム、０．２５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０２Ｍ ＥＤＴＡ２Ｎａ、１％ ポリビニルピロリドン（ｋ＝３０）、１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、ｐＨ７．３）を１００μＬ／ウェル分注した。さらに、（３）の前処理済みの検体を５０μＬ／ウェル分注した。室温で６０分間静置した後、プレート洗浄液で５回洗浄した。（１）で調製した標識体液を１００μＬ／ウェル分注し、室温で３０分間静置した。プレート洗浄液で５回洗浄した後、ルミパルス基質液（富士レビオ社製）を１００μＬ／ウェル分注した。室温で２０分間静置した後、マイクロプレートリーダーで各ウェルの発光カウントを測定した。各条件における測定結果を表７に示す。表７に示す結果は、各条件における１３（－）、１３（＋）、Ｈ３、Ｈ４のカウント値から、ＨＢｓＡｇ陰性血清３検体の平均カウント値を除いた値である。
Figure 0007198222000008
表７に示す通り、還元剤としてＴＣＥＰ、ＤＥＡＥＴを使用した場合においても、抗体Ｄ、Ｅ、Ｆのいずれかを粒子及び／または標識体に使用してＨＢｓＡｇを測定することで、自己抗体の影響を受けにくくなることが示された。

Claims (8)

  1. 生体から分離された検体中のＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の測定方法であって、
    前記検体を、還元剤を含む前処理試薬と混和してＢ型肝炎ウイルスｓ抗原を還元する前処理工程と、
    前処理後の検体をＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の、配列番号１のアミノ酸配列における９８－１７９番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと抗原抗体反応可能な抗体又はその抗原結合性断片を少なくとも１種類使用してＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の免疫測定を行う免疫測定工程を含む、
    Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の測定方法。
  2. 前記還元剤が、２－（ジエチルアミノ）エタンチオール塩酸塩（ＤＥＡＥＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール（ＭＥ）、システアミン、トリブチルフォスフィン（ＴＢＰ）からなる群より選択された少なくとも１つの還元剤であり、
    前記前処理工程における該還元剤の終濃度が０．５～１００ｍＭである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抗体が、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の、配列番号１のアミノ酸配列における１１１－１７０番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと抗原抗体反応可能である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記抗体が、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の、配列番号１のアミノ酸配列における１１１－１５６番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと抗原抗体反応可能である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記抗体が、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の、配列番号１のアミノ酸配列における１１１－１３０番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと抗原抗体反応可能である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記前処理工程が、ｐＨ３．０以上１２．０以下の条件下で行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記前処理試薬が、さらに界面活性剤を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. （１）還元剤を含む前処理試薬、及び
    （２）Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の、配列番号１のアミノ酸配列における９８－１７９番目のアミノ酸よりなる還元されたペプチドと抗原抗体反応可能な抗体又はその抗原結合性断片を少なくとも１種類含む免疫測定試薬
    を具えたＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の測定キット。
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