TWI809010B - Ｂ型肝炎病毒ｓ抗原之測定方法及測定套組 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種於檢體預處理中不進行強酸或強鹼處理，且不易受自身抗體之影響的高感度之HBsAg之測定方法及測定套組。自活體分離出之檢體中之B型肝炎病毒s抗原之測定方法包括：預處理步驟，其係將檢體與包含還原劑之預處理試劑進行混合而將B型肝炎病毒s抗原還原；及免疫測定步驟，其係對預處理後之檢體使用至少1種能夠與B型肝炎病毒s抗原之包含第98-179號胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應之抗體或其抗原結合性片段，進行B型肝炎病毒s抗原之免疫測定。

Description

B型肝炎病毒s抗原之測定方法及測定套組
本發明係關於一種B型肝炎病毒s抗原之測定方法及測定套組。
B型肝炎係目前肝疾病中最多之疾病，且係人感染B型肝炎病毒(HBV)所引起之病毒性肝炎。
該B型肝炎病毒之本體係呈直徑42nm之雙層構造之球形粒子之形狀並被稱為「丹恩(Dane)粒子」之粒子。關於丹恩粒子，已知：其表面由稱為B型肝炎病毒s抗原(HBsAg)之表面抗原所覆蓋，進而於內部存在包含HBc抗原(核心抗原)、HBe抗原、及編碼病毒基因之環狀雙鏈DNA之直徑27nm的核心構造。
HBsAg係具有感染性之HBV粒子表面之腫瘤構成外覆蛋白，且包含於包裹含有HBV-DNA之核心粒子之來自肝細胞之脂質雙層膜。又，於HBV感染者之血液中，亦存在無核心粒子且包含HBsAg之無感染性之小型球形粒子或管狀粒子。小型球形粒子於血液中之存在量最多，以相對於HBV粒子1~數個約為1000個之比率觀察到。目前正市售之HBsAg檢查主要是檢測處於該小型球形粒子之形態之HBsAg者。
HBsAg係包含全長226個胺基酸殘基之貫穿脂質雙層膜4次之膜蛋白(將其胺基酸序列示於序列編號1)。HBsAg之膜貫穿 構造模型並未完全解析，例如於非專利文獻1中揭示有一種膜貫穿模型(圖1)。根據該膜貫穿模型，於HBsAg中存在4個膜貫穿區域，HBsAg之8~23號胺基酸殘基為第1膜貫穿區域，80~98號胺基酸殘基為第2膜貫穿區域。此外，於HBsAg中還存在包含23~80號胺基酸殘基之脂質雙層之第1內側區域、包含98~179號胺基酸殘基之親水性之第2外側(ER內腔)區域、以及第179號以後之疏水性之第3膜貫穿區域、第2內側區域、第4膜貫穿區域。
作為習知之HBsAg之分析方法，一般為使用與HBsAg之共同抗原決定基a結合之抗體之方法。共同抗原決定基a位於HBsAg之第2外側(ER內腔)區域，即位於局部存在於病毒粒子表面之包含第98號至第179號胺基酸殘基之110~156號胺基酸殘基之胜肽上。報告有該共同抗原決定基a包含複雜之高次構造，而且存在至少4個表位(非專利文獻2)。
於HBV之急性感染之患者中，於感染初期，HBsAg為陽性，但其後HBs抗體成為陽性，HBsAg成為陰性。於患者之血液中之HBs抗體為陽性之情形時，若利用上述使用與共同抗原決定基a結合之抗體之方法對HBsAg進行分析，則因患者之HBs抗體導致分析方法所使用之抗體與HBsAg之結合受到阻礙，測定值變低。針對此種情況，可採用利用酸性劑或鹼性劑對檢體進行預處理以使由來自患者之HBs抗體(自身抗體)及HBsAg所形成之免疫複合體避免自身抗體之影響的手法、或利用界面活性劑等對檢體進行預處理以使存在於HBV粒子之內側之抗原(內側抗原：自身抗體不易結合)露出，使用與內側抗原特異性地結合之抗體進行檢測的手法(專利文獻1、2)。
於HBs抗體效價較高之患者中，即便使HBs抗體(自身抗體)自免疫複合體解離，亦存在於游離之自身抗體與用於免疫測定之抗體之間產生競爭反應之可能性。因此，已知於檢體之預處理步驟中藉由相對較強之酸處理或鹼處理(例如pH未滿3.0或pH超過12.0)而使游離之自身抗體進一步不活化的方法(例如專利文獻3)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利第4430677號
[專利文獻2]EP2088431A1
[專利文獻3]日本專利第6026564號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]V.D. Siegler, Volker Bruss, Role of Transmembrane Domains of Hepatitis B Virus Small Surface Proteins in Subviral-Particle Biogenesis, J. Virology, 87(3) 2013, pp. 1491-1496
[非專利文獻2]岡本宏明「日本臨床，分子肝炎病毒病學基礎‧臨床‧預防下卷A、B、D、E型肝炎病毒編」，1995年10月26日發行，p.212-222
然而，於藉由界面活性劑處理使HBV粒子之內側抗原露出並僅對內側抗原進行檢測之方法中，存在根據HBV株而產生偽 陰性之可能性，因此需要與外側抗原組合進行檢測(專利文獻2)。
又，關於在檢體之預處理中藉由強酸或強鹼而使自身抗體不活化之方法，亦存在因需要中和步驟導致操作繁雜、受到中和反應所產生之鹽之影響等課題。
本發明之目的在於提供一種於檢體預處理中不進行強酸或強鹼處理，且不易受自身抗體之影響的高感度之HBsAg之測定方法及測定套組。
本發明者等人進行了努力研究，結果發現：藉由於檢體中之HBsAg測定之檢體預處理步驟中使用還原劑將抗原還原化，進而於後階段之免疫測定中使用能夠與B型肝炎病毒s抗原之包含第98-179號胺基酸之經還原之胜肽進行反應的抗體，可解決本發明之課題。
即，本發明如以下所示。
(1)一種B型肝炎病毒s抗原之測定方法，其係自活體分離出之檢體中之B型肝炎病毒s抗原之測定方法，且包括：預處理步驟，其係將上述檢體與包含還原劑之預處理試劑進行混合而將B型肝炎病毒s抗原還原；及免疫測定步驟，其係對預處理後之檢體使用至少1種能夠與B型肝炎病毒s抗原之包含序列編號1之胺基酸序列中之第98-179號胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應之抗體或其抗原結合性片段，進行B型肝炎病毒s抗原之免疫測定。
(2)如(1)記載之方法，其中，上述還原劑為選自由2-(二乙基胺基)乙硫醇鹽酸鹽(DEAET)、參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫 蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇(ME)、半胱胺、三丁基膦(TBP)所構成之群組中之至少1種還原劑；且上述預處理步驟中之該還原劑之終濃度為0.5~100mM。
(3)如(1)或(2)記載之方法，其中，上述抗體能夠與B型肝炎病毒s抗原之包含序列編號1之胺基酸序列中之第111-170號胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應。
(4)如(3)記載之方法，其中，上述抗體能夠與B型肝炎病毒s抗原之包含序列編號1之胺基酸序列中之第111-156號胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應。
(5)如(4)記載之方法，其中，上述抗體能夠與B型肝炎病毒s抗原之包含序列編號1之胺基酸序列中之第111-130號胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應。
(6)如(1)至(5)中任一項記載之方法，其中，上述預處理步驟係於pH3.0以上且12.0以下之條件下進行。
(7)如(1)至(6)中任一項記載之方法，其中，上述預處理試劑進而包含界面活性劑。
(8)一種B型肝炎病毒s抗原之測定套組，其具備：(i)包含還原劑之預處理試劑；及(ii)免疫測定試劑，其包含至少1種能夠與B型肝炎病毒s抗原之包含序列編號1之胺基酸序列中之第98-179號胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應之抗體或其抗原結合性片段。
根據本發明，可提供一種於檢體預處理中不進行有可能成為感度降低之主要原因之酸、鹼處理，且可降低自身抗體之影 響的高感度之HBsAg之測定方法及測定套組。
圖1係HBsAg之膜貫穿模型之模式圖。
<HBsAg之測定方法>
本發明之方法係HBsAg之測定方法，其包括將自活體分離出之檢體與包含還原劑之預處理試劑進行混合之預處理步驟，且於免疫測定中，使用至少1種能夠與B型肝炎病毒s抗原(HBsAg)之包含序列編號1之胺基酸序列中之第98-179號(自N末端計數；胺基酸之位置編號均自N末端計數)之胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應之抗體(以下，亦稱為「還原外側識別抗體」)或其抗原結合性片段(於以下記載中，只要文理上不矛盾，則「抗體」此詞係以亦包含「抗原結合性片段」之含義使用)。
本發明之方法所測定之HBsAg係貫穿4次脂質雙層膜之包含226個胺基酸殘基之膜蛋白質。已知於HBV中存在若干基因型，例如基因型A、B、C、D、E、F、及G，HBsAg之胺基酸序列因其基因型而不同。又，亦已知a區域之抗原性存在數種型。藉由本發明之方法進行測定之HBsAg係以具有該等具異質性之胺基酸序列之HBsAg作為測定對象。
於圖1中表示HBsAg之膜貫穿構造模型。圖1之HBsAg之膜貫穿構造模型中之98~179號胺基酸殘基相當於親水性之第2外側(ER內腔)區域。本發明之方法中，於抗原抗體反應中所使用之抗 體(下文所述)係以HBsAg之第98~179號之經還原之胜肽作為表位之抗體，第98~179號之區域相當於第2外側區域。HBsAg之包含98~179號胺基酸殘基之胜肽係於HBV粒子之脂質雙層膜之外側之ER內腔所存在之親水性胜肽。其標準胺基酸序列為序列編號1之98~179號胺基酸序列。然而，本說明書中之第2外側區域只要為HBsAg之N末端側起第2號之脂質雙層之外側(內腔側)所存在之胜肽，則不限定為HBsAg之包含序列編號1之98~179號胺基酸序列之胜肽，例如亦存在為自N末端側起胺基酸編號不同之胜肽、或包含於序列編號1之98~179號胺基酸序列之1處或數處置換(變異)、缺失及/或插入有1個或數個胺基酸之胺基酸序列的胜肽之情況。再者，即便為使用包含此種序列編號1以外之胺基酸序列之胜肽作為免疫原之抗體或其抗原結合性片段，於使用能夠與包含序列編號1之胺基酸序列中之第98-179號胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應之抗體或其抗原結合性片段之情形時，亦包含於本發明之範圍內。
1.預處理步驟
本發明之方法包括檢體之預處理步驟。於本發明中，「檢體」表示來自包含HBsAg之活體之試樣，具體而言，例如可列舉血清、血漿、全血、尿、便、口腔黏膜、咽頭黏膜、腸道黏膜及活檢試樣(例如胰臟試樣、腸道試樣、肝臟試樣)以及該等之稀釋物。較佳為檢體為血清或血漿。又，於本發明中，所謂「預處理」係表示用以於使靶分子(此處為HBsAg)與特異性抗體進行反應之免疫測定步驟之前使檢體中所包含之靶分子構造或性質等變化之處理。進而，於本發明中，預處理係藉由將檢體與預處理試劑混合而實施。
於上述預處理試劑中包含還原劑。作為還原劑，可使用為了切斷蛋白質之S-S鍵所通常使用之任一者，並無特別限定。例如2-(二乙基胺基)乙硫醇鹽酸鹽(DEAET)、參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、半胱胺、三丁基膦(TBP)等既有之還原劑均可使用，就溶液中之穩定性優異之方面而言，可尤其適宜地使用DTT、TCEP、TBP。作為還原劑之濃度，以與檢體之混合液之終濃度計，較佳為設為0.5~100mM，尤佳為1.0~50mM，更佳為2.0~20mM。
藉由使上述預處理試劑中包含還原劑，而將檢體中所包含之HBsAg之S-S鍵切斷，使其立體構造解離而成為線性構造。藉此，圖1之HBsAg之膜貫穿構造模型中之第2外側區域(以下亦稱為「共同抗原決定基a」或「a-loop」)之立體構造亦成為線性。本發明者等人發現：大部分自身抗體為識別a-loop之立體構造之抗體，不與同一部分之經還原之(線性)胜肽反應(下文所述之實施例2)。藉由利用包含還原劑之預處理試劑對檢體進行處理，能夠降低經還原之HBsAg與自身抗體之反應性，能夠減少由自身抗體引起之對HBsAg測定值之負面影響。
關於預處理步驟中之pH(檢體與預處理試劑之混合液之pH)，較佳為pH成為3.0以上且12.0以下，尤佳為5.0以上且10.0以下，更佳為6.0以上且9.0以下。本發明中，藉由對預處理試劑加入還原劑，使HBsAg之立體構造發生變化，藉此可確實地消除自身抗體之靶分子之存在。由於不存在靶分子，因此不論抗體有無活性，自身抗體對抗原抗體反應造成之影響均變得極小。因此，無需如習知技術般使抗體不活化從而減小對靶分子(抗原)之影響。因此，即 便預處理試劑之pH為接近相對中性之條件，亦可達成本發明之目的。藉由將預處理試劑之pH設為上述範圍，可省略抗原抗體反應步驟之前之中和步驟或減少中和劑量，可避免或減少因中和步驟而生成鹽之影響等。又，由於檢體中之自身抗體不易產生失活，因此亦可與HBsAg測定同時、或於HBsAg之測定後實施同一檢體中之抗HBs抗體之測定。
於上述預處理試劑中亦可包含pH緩衝劑。pH緩衝劑只要為適合於上述pH範圍之緩衝劑則並無特別限定，例如可使用磷酸緩衝液、乙酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷、麥黃酮(Tricine)、二羥乙甘胺酸(Bicine)、三羥甲基胺基甲烷、咪唑、三乙基胺、甘胺醯甘胺酸等通常作為pH緩衝劑而廣泛使用之任一者。
於上述預處理試劑中亦可包含界面活性劑。尤其是於在下文所述之抗原抗體反應步驟中與還原外側識別抗體組合並使用能夠與內側抗原進行抗原抗體反應之抗體(內側識別抗體)之情形時，為了使HBV粒子內側之靶區域露出，需使用界面活性劑。作為界面活性劑，可使用陰離子性界面活性劑、陽離子性界面活性劑、兩性離子界面活性劑、非離子性界面活性劑之任一者，尤佳為陰離子性界面活性劑。作為陰離子性界面活性劑，可適宜地使用十二烷基硫酸鈉(SDS)、N-月桂醯肌胺酸(NLS)、十二烷基硫酸鋰、十二烷基苯磺酸鈉、去氧膽酸等，可尤其適宜地使用SDS。於使用陰離子界面活性劑之情形時，作為與檢體混合之混合液之預處理時之濃度(重量基準)，較佳為設為0.1~12.5%，尤佳為0.25~10%，更佳為0.5~7.5%。
於將預處理試劑所包含之主要之界面活性劑設為陰 離子性界面活性劑之情形時，為了減輕預處理後對反應系帶來之陰離子界面活性劑之影響，可將含陽離子性界面活性劑、兩性離子界面活性劑、非離子性界面活性劑單獨添加或添加包含該等數種之中和液。
作為上述預處理試劑所包含之界面活性劑，亦可使用陽離子界面活性劑代替陰離子界面活性劑。作為陽離子界面活性劑，尤佳為同一分子中具有碳數10個以上之單鏈烷基、及三級胺或四級銨鹽之陽離子性界面活性劑。作為此種界面活性劑之例，可列舉：癸基三甲基氯化銨、十二烷基三甲基氯化銨、十四烷基三甲基氯化銨、十六烷基三甲基氯化銨(C16TAC)、癸基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、氯化月桂基吡啶鎓、氯化十四烷基吡啶鎓、氯化鯨蠟基吡啶鎓等。陽離子界面活性劑之添加量以與檢體混合時之濃度計較佳為0.1%以上且15%以下，進而較佳為0.5%~10%。
除陽離子性界面活性劑以外，亦可進而包含非離子性界面活性劑等其他界面活性劑。藉由添加其他界面活性劑，能夠更高感度地檢測出HBsAg。
於預處理試劑中，亦可視需要包含脲、硫脲等其他蛋白質改質劑。改質劑之濃度以處理時濃度計較佳為0.1M以上，進而較佳為0.5M以上且未滿4M。又，為了增強處理效果，於預處理試劑中亦可添加單糖類、二糖類、檸檬酸、及檸檬酸鹽類之任一者、或將該等進行組合而添加。進而，於預處理試劑中亦可包含乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)等螯合劑。
於上述預處理步驟中混合之檢體與預處理試劑之體 積比較佳為設為1：10~10：1，尤佳為1：5~5：1，更佳為1：3~3：1。預處理步驟亦可於將活體試樣與預處理試劑進行混合之後進一步進行加熱。尤其是於預處理試劑中使用界面活性劑之情形時，為了提高其效果，較佳為進行加熱。預處理步驟中之溫度可設為95℃以下，尤其是20~90℃，進而為20~80℃、25~70℃、25~60℃、30~50℃、或35~45℃。關於預處理步驟，若於更高溫條件下進行加熱，則能夠以更短時間進行處理，另一方面，亦可於室溫條件下實施，於此情形時，反應時間會變長，但具有無需高溫加熱用裝置之優勢。預處理步驟之反應時間之上限並無特別存在，通常為60分鐘以下、尤佳為30分鐘以下。
2.免疫測定步驟
經本發明之方法之預處理步驟所處理之混合液繼而被供於免疫測定步驟中。免疫測定步驟包括(1)抗原抗體反應步驟、及(2)檢測步驟。
(1)抗原抗體反應步驟
於抗原抗體反應步驟中，將上述混合液與包含針對HBsAg之抗體之抗原抗體反應液進行混合，使預處理後之抗原與抗體進行反應。
本發明之方法所使用之抗體只要為能夠識別包含序列編號1之98~179號胺基酸序列之經還原之(線性)胜肽之抗體，則並無特別限定，例如可包含以下抗體：與包含序列編號1之98~179號胺基酸序列之胜肽進行抗原抗體反應的抗體；及與包含於序列編號1之98~179號胺基酸序列之1處或數處置換(變異)、缺失及/或插入有 1個或數個胺基酸之胺基酸序列之胜肽(其中，該胜肽為HBsAg之片段)進行抗原抗體反應的抗體。更具體而言，包含以下抗體：與包含序列編號1所表示之胺基酸中之121~130號胺基酸序列之胜肽、包含151~179號胺基酸序列之胜肽、包含111~130號胺基酸之胜肽、包含121~140號胺基酸之胜肽、包含98~156號胺基酸序列之胜肽、或於該等胜肽之一部分胺基酸被置換之胜肽等(胜肽全部為線性)進行抗原抗體反應的抗體。本發明之方法所使用之抗體只要為與上述線性之胜肽進行抗原抗體反應之抗體，則無特別限定，亦可識別包含複雜之高次構造之構造表位，例如共同抗原決定基a。亦存在由僅包含序列編號1之98~179號胺基酸序列之部分胜肽所無法形成而由較該部分胜肽長之胜肽、例如包含HBsAg全長之226個胺基酸殘基之全長胜肽所形成之表位。本發明所使用之抗體包含以下抗體：其與上述線性胜肽反應，且例如能夠與由較僅包含序列編號1之胺基酸中之98~179號胺基酸序列之部分胜肽長的胜肽所形成、且存在於包含序列編號1之98~179號胺基酸序列之區域的構造表位結合。
作為本發明之方法所使用之抗體，只要為能夠識別包含序列編號1之98~179號胺基酸序列之經還原之胜肽的抗體，則無特別限定。例如可列舉多株抗體、單株抗體、重組抗體、受體、或類似物等，較佳為單株抗體或其抗原結合性片段(以下，有時稱為「抗體片段」)。
作為單株抗體之抗體片段，只要為能夠識別包含序列編號1之98~179號胺基酸序列之經還原之胜肽的抗體片段，則無限定，例如可列舉Fab、Fab'、F(ab')2、或Fv等。該等抗體片段例如可藉由以下方式獲得：將本發明之單株抗體利用常規方法藉由蛋白質 分解酶(例如，胃蛋白酶或木瓜酶等)進行消化，繼而，藉由作為常規方法之蛋白質分離精製之方法進行精製。
本發明之方法中之HBsAg之測定原理只要為免疫測定，則並無特別限定，夾心法、競爭法、免疫凝集法等周知之免疫測定均可採用。該等之中，較佳為使用捕獲抗體及檢測抗體檢測HBsAg之夾心法。作為夾心法，可列舉屬於兩步驟法之正向夾心法(forward sandwich method)(逐次地進行固相化抗體與檢體中之抗原、及和固相結合之抗原與標記抗體之反應)、反向夾心法(預先使標記抗體與檢體中之抗原反應，並使所生成之抗原抗體複合物與固相化抗體反應)、及一步驟法(以一步驟同時進行固相化抗體、檢體中之抗原、標記抗體之反應)，該等均可採用。
本發明之方法中，將能夠識別HBsAg之包含序列編號1之98~179號胺基酸序列之經還原之胜肽的抗體(還原外側抗原識別抗體)使用於捕獲抗體及檢測抗體之至少一者。較佳為於捕獲抗體及檢測抗體之兩者使用還原外側抗原識別抗體。於將捕獲抗體設為還原外側抗原識別抗體之情形時，檢測抗體可為還原外側抗原識別抗體，亦可為識別經還原之內側抗原之抗體，較佳為設為還原外側抗原識別抗體。又，於將檢測抗體設為還原外側抗原識別抗體之情形時，捕獲抗體可為還原外側抗原識別抗體，亦可為還原內側抗原識別抗體，較佳為設為還原外側抗原識別抗體。再者，於任一情形時，均無法使用識別未經還原之外側抗原構造之抗體。又，於競爭法或免疫凝集法等中僅使用1種抗體之情形時，所使用之1種抗體為還原外側抗原識別抗體。
於本發明之方法中，只要於捕獲抗體及檢測抗體之任 一者使用至少1種還原外側抗原識別抗體，則作為捕獲抗體及/或檢測抗體，可將數種抗體組合使用。
於本發明之方法中，免疫測定步驟可包括：使經過預處理步驟之檢體與捕獲抗體及檢測抗體接觸之接觸步驟、及下文所述之對檢測抗體之訊號進行檢測之檢測步驟。又，上述接觸步驟亦可分成使上述檢體與捕獲抗體接觸之第1接觸步驟、及使檢測抗體與第1接觸步驟中所形成之抗原抗體複合體接觸之第2接觸步驟而進行。
更具體而言，例如，正向夾心法可以如下方式進行。首先，將與HBsAg結合之捕獲抗體固相化於微量盤或磁珠等不溶性載體。繼而，為了防止於捕獲抗體或不溶性載體之非特異性吸附，利用適當之封閉劑(例如，牛血清白蛋白或明膠等)進行不溶性載體之封閉。將經預處理步驟之檢體與一次反應液一起加入至固相化有捕獲抗體之板或珠粒，使捕獲抗體與檢體中之HBsAg接觸而結合(一次反應步驟)。其後，將未與捕獲抗體結合之抗原或夾雜物利用適當之洗淨液(例如，包含界面活性劑之磷酸緩衝液)洗淨。繼而，添加識別所捕獲之HBsAg之抗體及結合有鹼性磷酸酶(ALP)等酵素之標記抗體，使標記抗體與所捕獲之抗原結合(二次反應步驟)。藉由該反應，而於微量盤等載體上形成捕獲抗體-抗原-標記抗體之免疫複合體。將未結合之標記抗體利用洗淨液洗淨，添加針對標記抗體之酵素之顯色基質或發光基質使酵素與基質反應，藉此對訊號進行檢測。
於本發明之方法中使用之所謂捕獲抗體，係捕獲檢體中之HBsAg之抗體，但於上述使用不溶性載體之夾心法中，係固相 化於不溶性載體之固相抗體。於本發明之方法中使用之所謂檢測抗體，係檢測由捕獲抗體所捕獲之檢體中之HbsAg的抗體，於上述使用不溶性載體之夾心法中，係經酵素等標記之標記抗體。
於捕獲抗體及檢測抗體兩者使用還原外側抗原識別抗體之情形時，使用該等所結合之表位不同之抗體。所謂「表位不同」，意指表位完全不一致。例如，於2種抗體為相同之單株抗體之情形、或於2種抗體藉由表位抑制試驗而被完全地抑制之抗體之情形時，可認為2種抗體之表位一致。另一方面，於捕獲抗體與檢測抗體之表位為一部分重複之情形時，大部分情況可於本發明之方法中使用。
作為對抗體進行標記之酵素，可列舉山葵過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶、及螢光素酶等。又，除酵素以外，作為標記物質，亦可使用吖啶鎓衍生物等發光物質、銪等螢光物質、I125等放射性物質等。又，可根據標記物質適當選擇基質或發光衍生物質。
進而，本發明中之標記抗體亦包含結合有半抗原或低分子量之胜肽、凝集素等可利用於抗原抗體反應之訊號檢測之物質作為檢測標記物的抗體。半抗原中包含生物素、二硝苯(DNP)、螢光異硫氰酸鹽(Fluorescein Isothiocyanate，FITC)等。例如於使生物素與抗體結合而製造探針複合體之情形時，可對與生物素具有親和性之抗生物素蛋白標記ALP等酵素、螢光素等螢光物質、或吖啶鎓衍生物等發光物質，使之與探針複合體反應，藉由顯色、螢光、發光等檢測訊號。
抗體之標記方法並無特別限定，可使用習知公知之方 法，例如包含：利用酵素等標記物對抗體直接標記之方法、使抗體及酵素等標記物與葡聚糖等高分子化合物結合之方法、使標記抗體與葡聚糖等高分子化合物結合之方法等。
於本發明之抗體中包含動物之多株抗體及小鼠之單株抗體，為了獲得抗體而使動物免疫之方法、及為了獲得產生單株抗體之融合瘤之方法，除將HBsAg或HBsAg之部分胜肽使用作為免疫原以外，還可根據周知之方法實施，例如可根據續生物化學實驗講座(日本生物化學會編)、或免疫生物化學研究法(日本生物化學會編)中記載之方法進行。免疫用HBsAg可使用病毒粒子、或自病毒粒子精製HBsAg而使用。又，HBsAg及部分胜肽例如可藉由以下方式獲得：藉由基因重組使該等抗原於大腸桿菌中表現並進行精製。進而，HBsAg之部分胜肽可藉由化學合成而製備，例如可藉由Fmoc固相合成法、Boc固相合成法進行合成。所合成之胜肽可利用HPLC等公知之方法進行精製，亦可將末端胺基酸設為半胱胺酸，利用其SH基使胜肽與載體蛋白質結合，而作為免疫原使用。
本發明所使用之抗體可藉由將經還原之HBsAg或其胜肽片段使用作為免疫原使動物免疫而獲取。或者，可藉由將未經還原之HBsAg或其胜肽片段使用作為免疫原而獲取數種抗體之後，使用經還原之HBsAg或其胜肽片段進行篩選而獲取。用於免疫之動物並無特別限定，可使用綿羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、雞、牛、馬等。將HBsAg或其胜肽片段例如與等量之弗氏完全佐劑或Titer-Max gold(Titer Max公司)進行乳化混合，並投予至兔之皮下、或小鼠之腹腔內。其後，以1~2週間隔進行相同之免疫操作。自依此方式經免疫之動物採血製成血清或血漿，藉此可製備本發明 之抗體。
產生本發明之單株抗體之本發明之融合瘤可自上述經過免疫操作之動物獲取。例如，於對小鼠進行數次免疫操作之2週後，自尾靜脈接種溶解於磷酸緩衝生理鹽水(PBS)等之HBsAg或其胜肽片段。於其2~3天後，自小鼠無菌地摘除包含產生抗體之淋巴球之脾臟。使該淋巴球例如與骨髓瘤細胞進行細胞融合，藉此可構建產生單株抗體之融合瘤。
細胞融合例如可藉由於聚乙二醇之存在下使淋巴球及骨髓瘤細胞融合而進行。骨髓瘤細胞例如可使用具有如次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶缺損或胸苷激酶缺損之標記物之公知之細胞。具體而言，例如可列舉p3‧NS-1/1‧Ag4.1或SP2/0-Ag14等細胞。融合之細胞係藉由使用選擇培養基、例如HAT培養基，殺滅未融合之細胞而進行選擇。
繼而，對不斷增殖之融合瘤之培養上清液中之抗體產生之有無進行篩選。篩選可藉由以下方式而實施：使用固相酵素免疫測定法(ELISA法)等測定針對HBsAg及其胜肽片段之特異抗體之產生情況。選擇分泌目標抗體之融合瘤之選殖，進而藉由極限稀釋法重複進行次選殖，藉此可保證單株抗體之選殖性。依此方式，可選擇產生本發明之抗體之融合瘤。
本發明之融合瘤可利用公知之任意之培養基、例如RPMI1640，進行繼代培養。本發明之單株抗體可藉由對該融合瘤進行培養而製備，例如藉由於RPMI1640培養基中加入10%胎牛血清，於5%CO2存在下、37℃下進行培養而於培養上清液中產生抗體。又，於利用姥鮫烷進行過預處理之小鼠之腹腔內接種融合瘤， 並於10~20天後回收腹水，藉此能夠使腹水中產生抗體。本發明之抗體可藉由公知之方法進行精製，例如可利用使用ProteinG或ProteinA管柱之精製法、使用結合有HBsAg之親和管柱之方法、或使用離子交換管柱之方法等進行精製。
識別所獲得之單株抗體之表位可使用由來自HBsAg之序列所製作之重組抗原或經化學合成之10~20個胺基酸左右之合成胜肽，藉由固相酵素免疫測定法(ELISA法)來決定。自本發明之各融合瘤所產生之單株抗體之表位係藉由針對基於基因型不同之HBsAg之胺基酸序列使每10個殘基重疊並進行化學合成而得之包含20個胺基酸殘基之胜肽的反應性來決定。
3.檢測步驟
針對抗原抗體反應步驟中與HBsAg接觸之檢測抗體，藉由適合於檢測抗體所使用之標記之方法進行檢測，例如於使用酵素標記之情形時，添加酵素基質來進行檢測。例如，於使用鹼性磷酸酶(ALP)作為標記抗體之情形時，可設為使用3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3'-磷醯氧基)苯基-1,2-二氧雜環丁烷‧二鈉鹽(AMPPD)作為酵素基質的化學發光酵素免疫測定法(CLEIA)之系統。
<HBsAg之測定套組>
本發明之套組為B型肝炎病毒s抗原之套組，其具備(1)包含還原劑之預處理試劑、及(2)包含至少1種能夠與B型肝炎病毒s抗原之包含第98-179號胺基酸之經還原之胜肽進行反應之抗體的抗原抗體反應試劑。
關於此處所述之「抗原抗體反應試劑」，於在套組中將包含捕獲抗體之試劑及包含檢測抗體之試劑設為不同構成之情形時，表示任一者或兩者，於使用包含捕獲抗體及檢測抗體兩者之試劑之情形時，表示該試劑。即，於捕獲抗體及檢測抗體之至少一者使用至少1種能夠與B型肝炎病毒s抗原之包含第98-179號胺基酸之經還原之胜肽進行反應之抗體(還原外側抗原識別抗體)。
本發明之套組係於相互隔離之形態或組成物之形態中包含各構成試劑。具體而言，能夠以各構成試劑分別被收容於不同之容器(例如管體、板)之形態提供，亦能夠以一部分構成試劑為組成物之形態(例如同一溶液中)提供。或者，本發明之套組亦能夠以裝置之形態提供。具體而言，亦能夠以全部構成試劑收容於裝置中之形態提供。或者，亦能夠以構成試劑之一部分收容於裝置中之形態提供，且其餘者未被收容於裝置中之形態(例如收容於不同之容器之形態)提供。於此情形時，未被收容於裝置中之構成試劑於目標物質之測定時，可藉由注入至裝置中而使用。又，本發明之套組可包含HBsAg標準溶液、其他抗B型肝炎病毒抗體、使用說明書等。
[實施例] <實施例1 各種抗HBsAg單株抗體對還原抗原之反應性> (1)非還原、還原HBsAg固相化板之製備
將市售之天然HBsAg(Subtype ad，TRINA公司製造)以成為12.2μg/mL之方式利用PBS或包含6M脲之PBS進行稀釋，製備抗原稀釋液(脲(-)，脲(+))。將二硫蘇糖醇(DTT)利用離子交換水進行稀釋， 分別製備1、10、50、100、200、500、1000mM之還原劑液。於96孔微孔板(Nunc公司製造)之各孔逐一分注抗原稀釋液90μL，並向其中添加各還原劑液10μL。於室溫下靜置60分鐘之後，向其中以80μL/孔添加PBS或包含6M脲之PBS。於4℃下靜置一晚之後，利用PBS洗淨3次。分注封閉液(1% BSA，3%蔗糖，PBS)350μL，並於室溫下靜置3小時後，抽吸去除封閉液，並於室溫下進行風乾。
(2)單株抗體對各抗原之反應性試驗(ELISA)
使用表1所示之6種抗HBsAg單株抗體(抗體A~F)，實施對各培養板之反應性試驗。關於各抗體之製備，以包含目標表位區域之重組胜肽作為免疫原，除此以外，使用與專利文獻2相同之方法實施。又，關於表位之分析，亦使用與專利文獻2相同之方法實施。
關於抗體A~F，藉由(1)進行製備，即，關於抗體A~F，以分別成為1μg/mL之方式利用抗體稀釋液(0.024M磷酸二氫鉀，0.076M磷酸氫二鉀，0.25M氯化鈉，0.02M EDTA2Na，1%聚乙烯吡咯啶酮(k=30)，1% BSA，0.05% Tween20(商品名)，pH7.3)進行稀釋，製備抗體溶液。
Figure 107142714-A0101-12-0020-1
將各種抗體溶液分別以100μL/孔分注至(1)所製備之 各種培養板，並於室溫下靜置60分鐘。利用培養板洗淨液(包含0.05% Tween20(商品名)之PBS)洗淨5次後，將標記抗體液(將HRP標記抗小鼠IgG抗體利用抗體稀釋液稀釋10000倍而得之溶液)以100μL/孔進行分注，並於室溫下靜置60分鐘。利用培養板洗淨液洗淨3次後，以100mL/孔分注基質溶液(TMB溶液)，並於室溫下靜置30分鐘後，以100μL/孔分注2N硫酸使反應停止。對各孔之450/630nm之吸光度進行測定。將自各孔之吸光度減去空白樣品(僅PBS)之吸光度所得之值示於表2。
Figure 107142714-A0101-12-0021-3
抗體A係識別HBsAg之a-loop之構造之抗體，藉由將抗原還原，對抗原之反應性顯著降低。認為其主要原因在於：藉由將抗原還原，可識別抗體A之抗原之立體構造受到破壞。另一方面，抗體B、C及F對非還原抗原之反應性較低，相對於此，對還原抗原之反應性較高，進而，於脲存在下之反應性較高。關於抗體D、E，判明：對非還原抗原之反應性亦較高，但對還原抗原之反應性進一步變高。另一方面，幾乎未發現脲之影響。
<實施例2 自身抗體陽性檢體對還原抗原之反應性>
針對抗HBs抗體(HBsAb)陽性之血清檢體8例，進行對還原抗原之反應性試驗。非還原、還原抗原固相化板係利用與實施例1相同之方法進行製備。
作為樣品，製備以下樣品。
a)單株抗體溶液
將抗體A、D分別利用抗體稀釋液以成為1μg/mL之方式進行稀釋，製備抗體溶液。
b)自身抗體陰性血清
使用2例自身抗體陰性血清(N1、N2)。
c)自身抗體陽性血清
使用8例自身抗體陽性血清(P1~P8)。各檢體之抗體效價係使用Lumipulse HBsAb-N(富士REBIO公司製造)進行測定。將各檢體之測定值示於表3。
Figure 107142714-A0101-12-0022-4
於各種培養板以100μL/孔分注抗體稀釋液，向其中分別添加抗體溶液、檢體各10μL，並於室溫下靜置60分鐘。利用培養板洗淨液洗淨5次後，以100mL/孔分注標記抗體液(將HRP標記抗小鼠IgG抗體或HRP標記抗人類IgG抗體利用抗體稀釋液稀釋 10000倍而得之溶液)，並於室溫下靜置60分鐘。利用培養板洗淨液洗淨3次後，以100μL/孔分注基質溶液(TMB溶液)，並於室溫下靜置30分鐘後，以100μL/孔分注2N硫酸使反應停止。對各孔之450/630nm之吸光度進行測定。將自各孔之吸光度減去空白樣品(僅PBS)之吸光度所得之值示於表4。
Figure 107142714-A0101-12-0023-5
關於自身抗體陽性檢體8例，可確認：藉由將抗原還原，其反應性降低。關於8例中之2例(P2、P4)，對還原抗原稍微表現出反應，但對經還原劑及脲改質之抗原之反應性顯著降低。另一方面，關於抗體D，未發現由還原劑、脲引起之反應性降低，反而反應性提昇。根據以上情況，提示出：藉由於血清檢體之HBsAg之免疫測定時，使檢體還原且於抗原抗體反應系統中使用抗體D，可減少檢體中所包含之自身抗體與抗原之反應，從而提高目標抗原抗體反應之反應性。
<實施例3 自身抗體陽性檢體與抗HBsAg單株抗體之競爭試驗>
對自身抗體陽性檢體所包含之人類抗HBsAg抗體是否與各種 單株抗體競爭進行研究。
使用自身抗體陽性之血清檢體6例(P9~P14)。各血清檢體之抗體效價係使用Lumipulse HBsAb-N(富士REBIO公司製造)進行測定。各檢體之測定值如表3所示。
利用與實施例1相同之方法製備非還原抗原固相化板。將抗體A、D、E、F分別以成為100μg/mL之方式利用抗體稀釋液進行稀釋，以100μL/孔進行分注。將血清檢體P9~P14分別利用PBS稀釋5倍，以10μL/孔進而分注於分注有抗體之孔中。於室溫下靜置60分鐘後，利用培養板洗淨液洗淨5次。以100μL/孔分注標記抗體液(將HRP標記抗小鼠IgG抗體或HRP標記抗人類IgG抗體利用抗體稀釋液稀釋10000倍而得之溶液)，並於室溫下靜置60分鐘。利用培養板洗淨液洗淨3次後，以100μL/孔分注基質溶液(TMB溶液)，並於室溫下靜置30分鐘後，以100μL/孔分注2N硫酸使反應停止。對各孔之450/630nm之吸光度進行測定。將自各孔之吸光度減去空白樣品(僅PBS)之吸光度所得之值示於表5。
Figure 107142714-A0101-12-0024-6
於對各自身抗體陽性檢體添加有抗體A時，自身抗體對抗原之反應大幅降低，相對於此，於添加有抗體D、E、F時，完全未發現反應降低、或降低極為有限。提示出：檢體中之人類抗 HBsAg抗體與抗體A競爭，但幾乎不與抗體D、E、F競爭。
<實施例4-1 自身抗體陽性檢體之HBsAg測定(使用DTT)> (1)自身抗體陽性檢體之模型檢體之製備
針對已知HBsAg濃度之自身抗體陰性之管理血清檢體2例(M3、H3)，以終濃度成為1000mIU/mL之方式分別添加Hebsbulin(聚乙二醇處理抗HBs人類免疫球蛋白製劑)，製備自身抗體陽性模型血清檢體2例(M4、H4)。
(2)檢體預處理
針對(1)所製備之4種檢體(M3、M4、H3、H4)進行檢體預處理。預處理試劑係對基礎預處理試劑(2.39% NLS，50mM Tris，pH7.2)以終濃度成為20mM之方式添加DTT而製備。將各檢體100μL與各預處理試劑200μL進行混合，並於37℃下加溫60分鐘。加入離子交換水400μL進行稀釋，製備預處理混合液。又，針對HBsAg陰性血清3種檢體進行相同之預處理，作為空白樣品。
(3)HBsAg測定系統構建
將分別固相化有抗體A、B、D、E、F之磁性粒子以成為0.05%之方式加入至粒子稀釋液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA2Na，2% BSA，pH7.2)中，製備磁性粒子液。對將抗體A、D、E、G進行過鹼性磷酸酶標記之標記抗體利用標記體稀釋液(100mM MES，1% BSA，1mM NaCl，0.1mM ZnCl2，pH6.8)以成為0.5μg/mL之方式進行調整，製備標記體液。再者，抗體G之表位如表1所示。
將磁性粒子液、標記體液變更為上述者，並將血清檢體變更為上述預處理後檢體，除此以外，使用Lumipulse HBsAg-HQ(富士REBIO公司製造)，按照隨附文件中記載之方法進行HBsAg之測定，輸出發光強度(計數)。將各條件下之測定結果示於表6-1、6-2。表6-1、6-2所示之測定結果係自各條件下之M3、M4、H3、H4之計數值除去HBsAg陰性血清3種檢體之平均計數值所得之值。
Figure 107142714-A0101-12-0026-7
Figure 107142714-A0101-12-0026-8
於使用抗體A作為固相化抗體或標記體之情形時，揭示出：於預處理液中未使用還原劑之條件下，強烈受到自身抗體之影響，另一方面，於使用還原劑之條件下，計數值降低，感度整體降低。
於使用抗體D、抗體E作為固相化抗體或標記體之情形時，發現以下傾向：藉由對預處理液使用還原劑，計數值整體上升，且因自 身抗體之存在而引起之發光強度之降低程度減小，計數值之Ab(+)/Ab(-)變得更近於1之值。又，於使用抗體F作為固相化抗體，且使用抗體D或抗體E作為標記體之情形時，亦發現相同之傾向。
根據以上情況，提示出：於使用抗體D、E、F之任一者，並以於預處理液中包含還原劑之條件測定HBsAg之情形時，可避免自身抗體之影響，且以更高感度測定HBsAg。
<實施例4-2 自身抗體陽性檢體之HBsAg測定(使用TCEP、DEAET)> (1)HBsAg測定系統構建
於黑色96孔微孔板(F16 Maxisorp，賽默飛世爾(Thermo Fisher)製造)以100μL/孔分注分別包含5μg/mL之抗體B、抗體F之PBS，並於4℃下靜置一晚。利用PBS洗淨3次後，分注封閉液(1% BSA，3%蔗糖，PBS)350μL，並於室溫下靜置3小時。抽吸去除封閉液，並於室溫下進行風乾，製備抗HBsAg抗體固相化板。
對將抗體D、E進行過鹼性磷酸酶標記之標記抗體利用標記體稀釋液(100mM MES，1% BSA，1mM NaCl，0.1mM ZnCl2，pH6.8)以成為0.5μg/mL之方式進行調整，製備標記體液。
(2)自身抗體陽性檢體之模型檢體之製備
針對已知HBsAg濃度之自身抗體陰性之血清檢體2例(13(-)、H3)，以終濃度成為1000mIU/mL之方式分別添加Hebsbulin，製備自身抗體陽性模型血清檢體2例(13(+)、H4)。
(3)檢體預處理
針對(2)所製備之4種檢體(13(-)、13(+)、H3、H4)進行檢體預處理。預處理試劑係對基礎預處理試劑(2.39% NLS，50mM Tris，pH7.2)以終濃度成為20mM之方式添加TCEP或DEAET而製備。將各檢體100μL與各預處理試劑200μL進行混合，並於37℃下加溫60分鐘。針對HBsAg陰性血清3種檢體亦進行相同之預處理，作為空白樣品。
(4)HBsAg測定
於(1)所製備之抗HBsAg抗體固相化板以100μL/孔分注雜交緩衝液(0.024M磷酸二氫鉀，0.076M磷酸氫二鉀，0.25M氯化鈉，0.02M EDTA2Na，1%聚乙烯吡咯啶酮(k=30)，1% BSA，0.05% Tween20(商品名)，pH7.3)。進而，以50μL/孔分注(3)之經預處理過之檢體。於室溫下靜置60分鐘後，利用培養板洗淨液洗淨5次。以100μL/孔分注(1)所製備之標記體液，並於室溫下靜置30分鐘。利用培養板洗淨液洗淨5次後，以100μL/孔分注Lumipulse基質液(富士REBIO公司製造)。於室溫下靜置20分鐘後，利用微盤讀取器測定各孔之發光數。將各條件下之測定結果示於表7。表7所示之結果係自各條件下之13(-)、13(+)、H3、H4之計數值除去HBsAg陰性血清3種檢體之平均計數值所得之值。
Figure 107142714-A0101-12-0028-9
如表7所示，揭示出：於使用TCEP、DEAET作為還原劑之情形時，藉由將抗體D、E、F之任一者使用於粒子及/或標記體對HBsAg進行測定，亦不易受到自身抗體之影響。
<110> 富士麗比歐股份有限公司(FUJIREBIO INC.)
<120> B型肝炎病毒s抗原之測定方法及測定套組
<130> PF619-PCT
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<160> 1
<170> 專利第3.5版
<210> 1
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<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 1
Figure 107142714-A0305-02-0032-1
Figure 107142714-A0305-02-0033-2

Claims (8)

  1. 一種B型肝炎病毒s抗原之測定方法，其係自活體分離出之檢體中之B型肝炎病毒s抗原之測定方法，且包括：預處理步驟，其係將上述檢體與包含還原劑之預處理試劑進行混合而將B型肝炎病毒s抗原還原；及免疫測定步驟，其係對預處理後之檢體使用至少1種與B型肝炎病毒s抗原之包含序列編號1之胺基酸序列中之第98-179號胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應之抗體或其抗原結合性片段，進行B型肝炎病毒s抗原之免疫測定。
  2. 如請求項1之方法，其中，上述還原劑為選自由2-(二乙基胺基)乙硫醇鹽酸鹽(DEAET)、參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇(ME)、半胱胺、三丁基膦(TBP)所構成之群組中之至少1種還原劑；上述預處理步驟中之該還原劑之終濃度為0.5~100mM。
  3. 如請求項1之方法，其中，上述抗體與B型肝炎病毒s抗原之包含序列編號1之胺基酸序列中之第111-170號胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應。
  4. 如請求項3之方法，其中，上述抗體與B型肝炎病毒s抗原之包含序列編號1之胺基酸序列中之第111-156號胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應。
  5. 如請求項4之方法，其中，上述抗體與B型肝炎病毒s抗原之包含序列編號1之胺基酸序列中之第111-130號胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應。
  6. 如請求項1之方法，其中，上述預處理步驟係於pH3.0以上且 12.0以下之條件下進行。
  7. 如請求項1之方法，其中，上述預處理試劑進而包含界面活性劑。
  8. 一種B型肝炎病毒s抗原之測定套組，其具備：(1)包含還原劑之預處理試劑；及(2)免疫測定試劑，其包含至少1種與B型肝炎病毒s抗原之包含序列編號1之胺基酸序列中之第98-179號胺基酸之經還原之胜肽進行抗原抗體反應的抗體或其抗原結合性片段。
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