JPH0378655A - 血液の人獣鑑別法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は血液を含む試料についてヒト由来か他の動物種
由来かを鑑別する血液の人獣鑑別法および試薬に関する
。

（従来の技術） 血液の人獣鑑別は、例えば犯罪現場に残された血液、血
痕がヒト由来であるか他の動物種由来であるかを鑑別す
ることが重要な手がかりとなる法医学領域において特に
重要な検査項目の１つである。

一方、血液の人獣鑑別は、法医学領域のみならず、ある
種の生物（例えば蚊）によって媒介される疾病（例えば
フィラリアやマラリア）における伝播経路を解明するた
めに、例えば蚊によって吸血された血液がヒトのもので
あるのか他の動物種のものであるのかを判別する必要が
ある場合など、医動物学などの分野においても重要であ
る。

血液の人獣鑑別法は、法医学領域を中心に検討されてき
た。これまでの鑑別法は主としてヒトヘモグロビン、ヒ
トアルブミン、ヒトＩｇＧなどに特異的な抗血清を用い
た酵素免疫法（以下ＥＬＩＳＡと略記する）（例えば日
本法医学会総会要旨集、ｐ２６８（１９８８））　、ラ
テックス凝集反応（例えば日本法医学会総会要旨集、ｐ
２６９　（１９８８））、特異抗体と検体を反応させた
のちの抗体溶液のヒトヘモグロビン、ヒトアルブミンな
どの反応性でみる方法（例えば日本法医学会誌、４Ｌ　
２１０　（１９８７）、　Ｚ、　Ｒｅｃｈｔｍｅｄ。

鉦、　９９（１９８６））などのほか、ＤＮＡハイブリ
ッド形成による方法（例えば日本法医学会総会要旨集、
ｐ５５６　（１９８７））や等速電気泳動法（東女医誌
、皿。

７５３　（１９８３））や簡便な方法としてヒト血液成
分に対する抗血清を用いた重層法や免疫拡散法などが行
われていた。

また、例えば吸血蚊の人獣鑑別についても前記の方法が
とられていた。

（発明が解決しようとする課題） しかし、これらの方法の最大の難点は、ニホンザル、チ
ンパンジー、ゴリラなどの血液とヒトの血液との鑑別が
、これらの獣とヒトとの類似性が高いために容易でない
ことである。実際、ヒトヘモグロビンなどのヒトタンパ
ク質をウサギなどに免疫して得られる抗血清を用いる方
法では、ニホンザルの血液またはヘモグロビンなどで吸
収操作を行ったのち、ニホンザルとの鑑別に用いている
。

法医学上、わが国においては現実問題として、チンパン
ジーやゴリラとの鑑別は事実上皆無に近いが、ニホンザ
ルとの鑑別は、まれであっても必要な場合がある。

本発明者らは、特開昭６３−２７３４７２号に記載され
たヒトヘモグロビンに対するモノクローナル抗体の特異
性をさらに検討した。その結果、これらのモノクローナ
ル抗体のうち、特に４Ｅ６．５Ｃ１０，４八１１は、ニ
ホンザルヘモグロビンに対しても反応性を示さず、極め
てヒトヘモグロビンに対して特異性が高いことを見出し
た。

従って、本発明は、これらのモノクローナルのヒトヘモ
グロビンに対して特異性が高い性質を利用して、従来法
と異なり、吸収操作などの煩雑な手間を必要とせず、簡
便で精度の高い血液の人獣鑑別法を提供することを目的
とする。

（課題を解決するための手段） 本発明は、ヒトヘモグロビンに対して特異的なモノクロ
ーナル抗体を用いて、その由来の動物種が未知である血
液もしくは血痕もしくは血液を含む試料について、ヒト
由来か他の動物種由来かを鑑別することを特徴とする血
液の人獣鑑別法および、ヒトヘモグロビンに対して特異
的なモノクローナル抗体を用いた試薬である。

モノクローナル抗体は、モノクローンの抗体産生細胞が
産生ずる抗体で一次構造が均一である。

多発性骨髄腫症やマクログロブリン血症等の患者の血清
中に見出されるが、最近では細胞融合法により容易に得
ることができる。

本発明に用いることができるヒトヘモグロビンに対して
特異的なモノクローナル抗体は、特開昭６３−２７３４
７２号に記載されたモノクローナル抗体である。これら
の抗体は、直接、抗体が含まれる腹水のまま用いること
もでき、さらに抗血清と異なりモノクローナル抗体であ
るがゆえに、均一な特異性と力価を有する抗体が調製で
き、これを用いることができることも本性の利点である
。

これらの抗体の調製法としては、例えば、市販のヒトヘ
モグロビンを抗原として、人を除くマウス、ラット、モ
ルモット、ウサギ、ヤギ等の動物に免疫し、調製した肺
細胞から得られた抗体産生細胞と、免疫動物由来のミエ
ローマ細胞とを細胞融合し、生成したハイブリドーマを
培地中で培養するかあるいはマウス腹腔に移植して腹水
化し、必要に応じて常法によりスクリーニングとクロー
ニングを繰り返して産生させることができる。これらの
抗体は、ヒトヘモグロビンに対して選択的に結合し得る
抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体である。

本発明において鑑別の対象となる血液は、血痕のように
極少量でよい。

鑑別法を節単に述べると、例えば検体にモノクローナル
抗体を結合させ、アルカリホスファターゼ標識抗マウス
ＩｇＧ処理し、ｐ−ニトロフェニルフォスフェートと反
応させ、吸光度を測定する等のＥＬＩＳＡ法で行うこと
ができる。

以下、本発明の鑑別法を、好適例によって詳細に説明す
る。

血液の入獄鑑別は次のようにして行う。

市販の９６ウエルＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートに検体（血液
もしくは血痕、血液を含む試料から適当な緩衝液で抽出
したもの）を炭酸緩衝液、ｐＨ９，６で数段階に希釈し
、ウェル当り１００μ！加える。室温で２時間静置後、
リン酸緩衝食塩水（以下、ＰＢＳと略記する）で１〜３
回洗浄する。次いで、１％ゼラチン−ＰＢＳをウェルい
っばいに満たし、室温で１０〜３０分静置した後、０．
０５％７ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ　（以下、ＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎと略記する）で３回洗浄する。次にヒトヘモ
グロビンに特異的なモノクローナル抗体（例えば４Ｅ６
もしくは５Ｃ１０もしくは４Ａ１１の含まれた腹水、も
しくは、精製モノクローナル抗体）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎで適度に希釈し、１００ｐｌずつ各ウェルに加え、室
温２時間静置後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。

次いで、市販のアルカリフォスファターゼ標識抗マウス
ＩｇＧを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで適度に希釈し、各ウェ
ルに１００ｐｌずつ加え、室温で２時間静置した後、Ｐ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３〜５回洗浄する。次に１０％ジェ
タノールアミン緩衝液に１■／ｒｎｌの濃度でとかした
ｐ−二トロフェニルフォスフェ−１・溶液を１００μ！
加え、室温１５〜６０分反応後、ＥＬＩＳＡリーダーで
基質溶液のみを加えたウェルを対照として４０５ｎｍに
おける吸光度を測定する。

（発明の効果） 本発明によれば、モノクローナルがヒトヘモグロビンに
対して特異性が高い性質を利用して、血液の入獄鑑別を
行うことができ、しかも、従来法と異なり吸収操作など
の煩雑な手間を必要とせず簡便で精度の高い血液の入獄
鑑別法を提供することができる。

従って、医学の分野、特に法医学の分野においての利用
が期待される。

（実施例） 以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。

参考例１ 抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体の調製ヒトヘモ
グロビンをＰＢＳに溶解し、１■／−に調製した。そし
て、同容量のフロイント完全アジュバントまたは、フロ
インド不完全アジュバントと良く懸濁し、初回のみ１０
０ｎヘモグロビン／マウスで、２回目以降は５０硝ヘモ
グロビン／マウスとなるように、オス４退会のＢ　Ａ　
Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに腹腔内投与した。免疫は、２週
間から２力月の間隔で５回行った。なお、細胞融合３日
前に行う最終免疫は、ＰＢＳに溶解したヒトヘモグロビ
ン（ｌｔｒｃ／ｍｅ）をアジュバントを用いずに５０硝
／ｍ１で腹腔内投与した。

最終免疫３日後にヒトヘモグロビン免疫マウスから摘出
・調製した肺細胞と、骨髄腫細胞（Ｐ３−ＮＳ１／１−
Ａｇ４−１　、以下ミエローマと略記する）を５：１に
混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−４０００）
により細胞融合を行った。ポリエチレングリコールを除
去し、融合した細胞を１０％牛脂児血清（以下、Ｆｅ２
と略記する）を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地（１万
Ｕ／１ペニシリン、５０■／１ストレプトマイシンを含
む）で培養した。融合翌日、ＨＡＴ培地（１００μＭヒ
ポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチ
ミジンを含む１０％ＦＣ３−ＲＰＭ■培地）で培養を行
った。次にＥＬ　Ｉ　ＳＡによりスクリーニングを行い
、限界希釈法によるクローニングを行った。その結果、
５株の融合細胞（ハイブリドーマ）を樹立したく表１）
。

クローニングを行ったハイブリドーマをＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスに腹腔内投与して、抗体の腹水化を行った。得られ
た腹水は、３０００ｒｐｍ　、　５分間室温で遠心分離
した上清を、５０％硫安沈澱処理し、ヒトヘモグロビン
をリガンドしたアフイニテイクロマトグラフィーにより
抗体を精製した。

精製したモノクローナル抗体の種類・構造を示すクラス
及びサブクラスを、マウス　モノクローナル　タイピン
グ　キット（Ｍｉｌｅｓ社）により調べた。また、各抗
体の等電点を等電点電気泳動によって決定した。結果を
表１に示す。

表１ ４Ａ１１　　　　　　　　　Ｉ　ｇ　Ｇ２−　　　　　
　　　　７．４４０１０　　　　　　　　１　ｇＭ　　
　　　　　　　　　５．９４Ｅ６　　　　　　　　　Ｉ
　ｇ　Ｇｚｂ　　　　　　　　　　７．６４Ｅ１２　　
　　　　　　１　ｇＭ　　　　　　　　　　　６．３次
に通常広く行われている化学的検出法では偽陽性を示す
各動物種のヘモグロビンとヒトへモグロビンとの反応性
の比較を行うことにより、前記抗体の特異性の検討を行
った。得られた５つのモノクローナル抗体の各種ヘモグ
ロビンとの反応性は、ＥＬＩＳＡにより調べた。ＥＬＩ
ＳＡプレートに、ヒト、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒツ
ジ、ウサギの各ヘモグロビンを０．５ｎｖ／＋＋＋ｔ？
Ｍ度で５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、２時間物理的吸着さ
せた後に、１％牛血清アルブミンによるブロッキング後
、抗体と反応させた。ヘモグロビンと抗体との結合は、
ビオチン−アビジン系によるアルカリフォスファターゼ
活性により確認した。各抗体のヒトヘモグロビンに対す
る反応性を１００％としたときの各種ヘモグロビンとの
相対反応を表２に示した。

その結果、４０１０．４Ｅ１２抗体は、ヒト以外のヘモ
グロビンとも交差反応してしまうため、本発明の血液の
入獄鑑別には不適当である。一方、４Ａ１１．４Ｅ　６
．５Ｃ１０抗体は、ウサギヘモグロビンと弱い反応を示
すものの、ヒトヘモグロビンに対して高い特異性を示す
ことがわかった。

表２ リ　ヒトヘモグロビンとの反応性を１００％とした時の
各ヘモグロビンとの相対反応性。

実施例１ 異なる５人のヒト血液１〜５、及びニホンザル、ウシ、
ウマ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ニワ＋す、ハ
マチの各血液を炭酸緩衝液、ｐＨ９，６で１００〜１０
０．０００倍に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェル
に１００ｐｒずつ加えた。室温で２時間静置後、ＰＢＳ
で洗浄し、１％ゼラチン−ＰＢＳを加え、室温で３０分
間静置後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。

次にヒトヘモグロビンに特異的なモノクローナル抗体４
Ｅ６の腹水をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２００倍に希釈し、
各ウェルに１００ｐｌずつ添加し、室温で２時間静置し
た。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、市販のアルカリフォ
スファターゼ標識抗マウスＩｇＧを１３，０００倍に希
釈し、各ウェルに１００μ！ずつ加え、室温で２時間静
置後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、１０％ジェタノー
ルアミン緩衝液、ｐＨ９，８に１■／　ｍｌの濃度でと
かしたｐ−ニトロフェニルフォスフェートを、各ウェル
１００ｐｌずつ加え、室温で１時間反応後、４０５ｎｍ
における吸光度を測定した。

第１図に示すごとく、５人のヒト血液１〜５とニホンザ
ルを含む他動物血液との間には、吸光度に大きな差が認
められ、少なくとも吸光度０．１５を境に鑑別は容易で
あることがわかった。

実施例２ ヒトの血液を吸ったことがわかっているヒト吸血蚊、ウ
シの血液を吸ったことがわかっているつシ吸血蚊、ハム
スターの血液を吸ったことがわかっているハムスター吸
血蚊、各々１匹を炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，６，
５０μ！中に加え、吸血蚊から血液を抽出した。これに
同緩衝液２００μｌを加えたものを原液とし、同緩衝液
でさらに０〜１００倍に希釈したものを試料に、以下実
施例１と同様の方法でＥＬＩＳＡを行った。

結果を表３に示す。

表１から明らかなように、吸血蚊においてもヒトと他動
物置との鑑別は容易であることがわかった。

動物血液との吸光度を示すグラフである。

表３ 吸血蚊　　　吸血蚊 ０　　　０．３２　　　　０．１１ １０−’　　　０．４６　　　　０．１１１０−、”　
　　０．２６　　　　０．１１吸血蚊 ０゜１２ ０．１２ ０．１０

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトヘモグロビンに対して特異的なモノクローナ
   ル抗体を用いて、その由来の動物種が未知の血液もしく
   は血痕もしくは血液を含む試料について、ヒト由来か他
   の動物種由来かを鑑別することを特徴とする血液の人獣
   鑑別法。
2. （２）ヒトヘモグロビンに対して特異的なモノクローナ
   ル抗体が、ヒトヘモグロビンを抗原として人を除く動物
   に免疫して得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを
   細胞融合し、生成したハイブリドーマを培地中で培養す
   るかあるいはマウス腹腔に移植して腹水化し、必要に応
   じて常法によりスクリーニングとクローニングを繰り返
   し、産生したヒトヘモグロビンに対して選択的に結合し
   得る抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体である請求
   項１記載の血液の人獣鑑別法。
3. （３）ヒトヘモグロビンに対して特異的なモノクローナ
   ル抗体を用いた血液の人獣鑑別用試薬。
4. （４）ヒトヘモグロビンに対して特異的なモノクローナ
   ル抗体が、ヒトヘモグロビンを抗原として人を除く動物
   に免疫して得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを
   細胞融合し、生成したハイブリドーマを培地中で培養す
   るかあるいはマウス腹腔に移植して腹水化し、必要に応
   じて常法によりスクリーニングとクローニングを繰り返
   し、産生したヒトヘモグロビンに対して選択的に結合し
   得る抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体である請求
   項３記載の血液の人獣鑑別用試薬。