JPS62239056A - トランスフエリンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、単クローン性抗ヒトトランスフェリン抗体を
用いるヒトトランスフェリンの光学的測定方法に関する
。

〔発明の背景〕

トランスフェリンは主として肝臓で生成され、血清のみ
ならず細胞外液にも広く分布する鉄結合蛋白で、鉄イオ
ンの担体として鉄代謝に関連した諸臓器間の鉄輸送に重
要々役割を果たしている。

体液中のトランスフェリン量を測定する事は、各種疾患
の診断、予防、予後の経過を調べる上で重要々手段であ
る。

体液中のトランスフェリンを測定する方法に関しては、
近年その進歩にめざ捷しいものがあり、測定方法も免疫
学的な５ＲＴＤ法、レーザー比朧法、比濁法や鉄結合能
、フェリチン量を測定する方法等多くの方法が開発され
てきている。特に最近では、トランスフェリン測定を、
レーザーネフェロメーターや、多項目の生化学的測定を
対象に開発された自動分析装置で短時間に行なう方法が
、開発され普及しつつある。

しかし々からこれらの測定に使用する抗体は通常動物に
免疫をして得たポリクローナル抗体である為、抗原抗体
反応による凝集度が高く、濁シの度合が強すぎるので、
測定時に検体血清を希釈して用いなければならず、操作
が煩雑と々り又、希釈による誤差なども生じ易いという
欠点があった。

更に、自動分析装置に於ては、通常、試料の希釈は行な
わずに測定する事が前提となっているので、同一試料に
ついて、糖、脂質、酵素等の生化学的検査と一緒にトラ
ンスフェリンの測定を行うことは実際上不可能であった
。

また、トランスフェリンは血清中の含有量が高く、通常
血清中に１５０〜４００　ｍ９／ｄ７！存在し、動物に
免疫をして得たポリクローナル抗体を用いた比濁法ある
いは比朧法の如き光学的測定法においては、血清を希釈
せずに測定する場合は多量の抗体が必要と々す、又、そ
の結果極めて強い濁りが生じてしまう為、血清を希釈し
万いで測定することは到底不可能と考えられていた。従
って測定に際しては血清をあらかじめ１０〜３０倍、又
場合によっては１００倍程度（比朧法）に希釈したもの
を抗原抗体反応に使用して、光学的に測定することが必
要であった。

一方、抗原抗体反応を利用した臨床化学分析に於て単ク
ローン性抗体を用いている例としては、放射線免疫測定
法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、螢光免疫測
定法（ＦＩＡ）等がある。これらは抗原抗体反応後、抗
原又は抗体に標識した同位元素、酵素、螢光物質等を測
定することによシ間接的に試料中の測定対象抗原又は抗
体の量を求めるものであり、より精度の高い測定を行う
目的でこれが用いられている。

しかしながら抗原抗体反応による凝集の程度を直接光学
的に測定する方法に於て、これを効果的に利用している
例はこれまでに後に述べる免疫グロブリンの場合を除い
て皆無である。

その理由は、一般に、単クローン性抗体を用いた場合に
は、例えば抗原が本発明に係るトランスフェリンの場合
について言えば、トランスフェリン１分子当シ抗体と反
応する抗原決定基は１個しか存在せず、従って単クロー
ン性抗体とは１個所でしか結合でき々いので、動物由来
のポリクローナル抗体を用いた場合のようにトランスフ
ェリン１分子に対し不特定多数の抗体が結合してポリマ
ー化が進行し抗原抗体複合物の粒子が粗大化して濁度が
高く力るというようなことはないからである。従って、
これまで単クローン性抗体ではポリマー化が起らず、濁
りは形成されないと考えられていた。

このよう力状況下に於て、本発明者らは免疫グロブリン
の場合には単クローン性抗体を単独又は２種以上組み合
せて用いて、その抗原抗体反応による凝集の程度を直接
光学的に測定し得ることを見出し先に特許出願している
（特開昭６０−２３７３６３号）。これは、免疫グロブ
リンの場合には抗原上に抗体との結合部位が２ケ所ある
ので単クローン性抗体を単独で用いても、濁りの度合は
小さいけれども測定し得る程度の濁りは生じているので
はないかとの考えに基いてなされたものであり、事実、
免疫グロブリンの場合には単クローン性抗体を単独で用
いても測定可能々濁りが認められたのであった。これに
対し、本発明に係るトランスフェリンに於ては１分子当
シ抗体と反応する抗原決定基は１個しか存在せず、従っ
て、単クローン性抗体とは１個所でしか結合できないの
で、単クローン性抗体を単独で用いた場合には全く濁り
を生じず、これを２乃至数種用いたとしても測定し得る
程度に濁りを生じるとは到底考えられなかった。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、血清等生体試料を希釈することなくそ
のまま用いて、比朧法或は比濁法等光学的測定法により
トランスフェリンの定量を容易に且つ効率的に行い得る
方法を提供することにある。

〔発明の概要〕

本発明は、生体試料を希釈せずにそのまま使用し、単ク
ローン性抗ヒトトランスフェリン抗体を２種類又はそれ
以上組み合せて用いてこれと抗原抗体反応を行わせ、生
成する抗原抗体複合物に光を照射して光学的変化量を測
定することを特徴とするトランスフェリンの定量方法で
ある。

即ち、本発明者らは、トランスフェリンの光学的測定法
に於ける上記した如き問題点を解決すべく鋭意研究を重
ねた結果、単クローン性抗体を２種類又はそれ以上組み
合せて用いることにより、血清等生体試料の希釈を行な
わずに、適度な且つ充分測定可能々濁度が得られ、容易
に且つ効率的にトランスフェリンの比朧法或いは比濁法
による測定を行うことができることを見出し本発明を完
成するに到った。

本発明者らは、トランスフェリンに対する単クローン性
抗体と濁度との関係について研究を進めているうちに単
クローン性抗体を１種類用いた場合には全く濁りが認め
られ々いが、これを２種類又はそれ以上組み合せて用い
ると意外にも濁りが認められ、濁りの度合は単クローン
性抗体を適宜組み合わせて用いることにより調節でき、
それにより極めて適切な感度が得られることを見い出し
本発明に到達したのである。

即ち、単クローン性抗体を２種乃至数種用いた場合には
ポリクローナル抗体を用いた場合と測定濃度域が異々す
、ポリクローナル抗体の場合と比べるとか々り低濃度域
での測定と力るが、血清等の生体試料を希釈せずにその
一！ま用いた場合にはトランスフェリンにとってそれが
極めて適切な濃度域になっており、従って充分測定可能
な濁度（感度）が得られるということを本発明者らは見
出したのである。

本発明の方法によれば、血清等の生体試料を希釈するこ
となくそのまま測定することが可能であり、その結果、
希釈操作に伴う煩雑さ及び誤差を排除でき、正確性が向
上すると共に、同一試料について糖、脂質、酵素等多項
目の生化学的検査を一緒に行う自動分析装置への適用が
極めて容易となり、応用範囲が飛躍的に拡大される。

本発明の目的を達成するための第１段階は、抗体を産生
ずる単りローンノ・イブリドーマを作製することである
が、このノ・イブリドーマの作製方法は簡単には次の３
工程から成る。

１、免疫 ２、細胞融合 ３、　ハイプリドーマの選択と単クローン化以下、これ
について順を追って説明する。

免疫抗原はヒト血清より精製分離したトランスフェリン
を使用する。

トランスフェリンは生理食塩水、或いは緩衝液力とに溶
解し、マウス又はラット１匹あたり１回に１μＩから３
００μｇを投与するのが好ましい。免疫は数回に分けて
おこなうが、初回免疫はアジ−パントと共におこなうこ
とが一般的である。アジ−パントとしてはフロインドア
ジュバント、ミョウバンなどが使用される。免疫は２〜
４週間の間隔でおこない、最終免疫はアジ−パントを使
用せず、生理食塩水などに溶解し、腹腔内或いは静脈内
に投与する。免疫動物としては、一般にはラット、マウ
スが汎用される。これは細胞融合に使用する腫瘍細胞株
によって決められる為で、マウスの中でも免疫グロブリ
ンを産生じない腫瘍細胞株の確立されているＢＡＬＢ／
ｃがよく用いられる。最終免疫後２〜４日後に、リンパ
節、或いは肺臓を摘出し、得られるリンパ球を細胞融合
に供する。

一方細胞融合に使用される腫瘍細胞株としては、免疫グ
ロブリンを産生しないＰ３−Ｘ６３−８ＡＺ−ＵｌやＰ
３−ＮＳＩ−１などが使用される。細胞融合時にはリン
パ球を腫瘍細胞の５〜２０倍量多く用いる。ＭＥＭ培地
、ＭｃＣｏｙ培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地或いは等張
緩新液等で洗浄後、リンパ球と腫瘍細胞を遠心操作でペ
レット状態にする。ペレットをほぐした後、ＨｖＪ（セ
ンダイビールス）或いはＰＥＧ　（ポリエチレングリコ
ール）を加え細胞融合をおこなうが、通常は、取扱いの
容易々ＰＥＧの平均分子量１，０００〜８，０００の４
０〜６０％溶液を０５〜２ｍｌ使用する。融合促進剤と
して、ＰＥＧ添加時にジメチルスルホキシドなどを少量
加えることもあるが必須では々い。ＰＦ、Ｇ溶液を細胞
に添加し、融合反応を１〜１０分間程度おこ々っだ後、
ＭＥＭ培地或いはＲＰＭＩ　１６４０培地などを１０〜
５０ｍ１徐々に加え反応を停止する。融合反応停止後、
直ちに遠心し上清を除去する。牛胎児血清（Ｆｅ２）を
５〜２０％含むＭＥＭ培地或いはＲＰＭＩ　１６４０培
地に細胞を懸濁し、２４穴培養プレートにリンパ球が１
穴あたり１×１０５〜５　Ｘ　１０６個となるようｉ　
ｒｎｌずつ分注する。何れに於いても、フィーダー細胞
は添加する方が好ましい。フィーダー細胞としては、同
系のラットる。次にヒポキサンチンＩ　Ｘ　１０−４Ｍ
、アミノプテリン４．　Ｘ　１０−７Ｍ　’１チミジン
］、、６Ｘ１０”　Ｍを含むＲＰＭ丁１６４０培地（或
いはＭｇＭ培地）即ちＨＡＴ培地に換えていく。ＨＡＴ
培地交換の方法は一般には翌日培養プレートに融合後分
注した容量と等容量別え、更に翌日その半量をＨＡ’ｌ
’培地と交換する。その後２〜３日毎Ｉ−ＩＡＴ培地で
半量づつ交換する。融合後］０〜１４日目にアミノプテ
リンを除いたＨＴ培地で半量交換し、更にその１〜３日
毎に培地の半量ｅ　ＨＡＴ　ｅ含捷ない通常の培地に交
換する。融合細胞（）・イブリドーマ）の増殖の盛んな
穴の培養上清を種々の分析法、例えばＲ丁ＡＸＥＬＩＳ
Ａ等で目的の抗体産生ノ・イブリドーマを選択する。ノ
・イブリドーマを得たガらクローニングを行うが、その
方法としてはＦＡＣ８（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌＳｏｒｔｅｒ）　を用いる方
法、５ｏｆｔ　Ａｇａｒよりコロニーを拾いあげる方法
、一般によく用いられる限界希釈法などがある。どの方
法を用いてもクローニングは２回以上繰返し、完全に単
一クローンとする。

クローンを確立したならば、その細胞を１ｎｖｉｔｒ。

法またはｉｎ　ｖｉｖｏ法で培養することによって各種
単りローン性抗ヒトトランスフェリン抗体が得られる。

１ｎｖｉｔｒｏ法、ｉｎ　ｖｉｖｏ法のいずれでもよい
が、１ｎｖｉｖｏ法の方が抗体価がはるかに高いので望
ましい。

単クローン性抗体を用いたトランスフェリンの測定法と
しては比濁法、比朧法等がある。比濁法で測定する場合
は、既存の自動分析装置や分光光度計が使用でき、波長
としては好寸しくは３４０〜８００　ｎｍの範囲である
が特に限定されるものではない。又、比朧法で測定する
場合は、現在普及しているレーザー光源を使用したもの
等が利用できるが、光源及び検出方法は特に本発明を限
定するものではない。

測定に使用する緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸
緩衝液、ベロナール緩衝液等通常用いられている緩衝液
は全て使用でき、ＰＨは好ましくは、６０〜９．０の範
囲であるが特に限定されるものでは力い。

また、測定に使用する単クローン性抗体の種類及び数は
特に限定されるものではなく、必要な感度に合せて２種
類若しくはそれ以上適宜組み合わせて用いればよい。

単クローン性抗体の使用量については特に限定されるも
のでは六いが、通常抗体溶液１　ｍｌ中当り単クローン
性抗体０．０２ｍ９〜２ｍ９の濃度範囲で用いられる。

以下に参考例及び実施例をあげて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれら参考例、実施ン抗体及びこれ
を産生するノ・イブリドーマの作製（１）　　免疫 ヒトトランスフェリン１００μＩを溶解した０、１５Ｍ
１ｍ化ナトリウム０．１　ｍ、ｌとフロイントコンブリ
ートアジュバン）　０．１．　ｍｌを混合し、エマルジ
ョン抗原液とし、その０．２　ｒＩＬｌを、ＢＡＬＢ／
ｃ　マウス（雌、６週齢）の腹腔内に投与した。４週後
、ヒトトランスフェリン１００μＩを０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム０２ｍ１に溶解し、尾静脈に注射した。

（２）細胞融合 最終免疫より３日後、免疫マウスの肺臓を摘出し、ＬＯ
ｍｌのＲＰＭＩ　１６４０培地を入れたプラスチックシ
ャーレ中で、牌リンパ球をほぐした。。牌リンパ球を遠
心操作（１０００回転、１０分）を繰返しＲＰＭ１１６
４０培地で３回洗浄した。牌リンパ球１×１０個とマウ
ス骨髄腫細胞Ｐ３−ＮＳＩ−１１ＸＩ０７個を試験管中
で混合し、遠心操作で沈殿とした。上清を吸引除去した
後沈殿をかるくほぐし、５０チポリエチレングリコール
（平均分子量６，０００）１ｍｌをほぐした沈殿に加え
、試験管をまわしながら室温で１分間融合反応をおこな
った。その後３０秒ごと、ＲＰＭＩ　１６４０培地１　
ｍｌを５分間加え反応を停止した。

血清）を２０％含むＲＰＭＩ　１６４０培地５０ｍＡ！
中に細胞を懸濁した。２４穴プレ一ト２枚に細胞懸濁液
を１穴あたり１　ｍ１分注しＣＯ２インキ−ベーター内
で培養した。、 ２４時間後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン１×１０−４
Ｍ、アミノプテリン４Ｘ１０−’Ｍ、チミジン１、、６
　Ｘ　ＩＦ”Ｍ　ヲ含む２０％ＦＣ８添加ＲＰＭＩ　１
６４０培地）を１穴あたり、１ｍｌずつカロえｔｓ、２
日目、３日目さらに２日毎に培地の半量をＨＡＴ培地に
交換した。

１００日目培地の半量を上記のＨＡＴ培地よりアミノプ
テリンを除いたＨＴ培地で交換した。翌日から２日毎に
通常の培地即ち、１０　％　ＦＣ８添加ＲＰＭ１１６４
０培地に半量ずつ交換し、１８８日目培養上清を抗ヒト
トランスフェリン抗体産生の検定に供した。

（３）　　ハイプリドーマの選択 抗ヒトトランスフェリン抗体産生ハイプリドーマ選択の
ために４８穴の各細胞培養上清をＥＬＩＳＡにて分析し
た。まずＥＬＩＳＡ用９６穴プレートにヒトトランスフ
ェリンを１０μ９７ｍ１の濃度でＱ、　ｌ　ｍｌずつ分
注し、４℃１６時間静置してヒトトランスフェリンをプ
レートに固定化した。Ｔｗｅｅｎ　２０　（ノニオン系
界面活性剤、アトラス社商品名）を０，０５係含む］　
ＯｍＭ　ＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，４（洗浄液）で３回洗
浄した後、培養上清中の蛋白質の非特異的吸着を避ける
ために、１チ牛血清アルブミン溶液を０、２　ｍｌずつ
分注し、３７℃２時間静置した。次に洗浄液で３回洗浄
後細胞培養上清を０．１　ｍＡ！分注し、３７℃２時間
静置した。陰性対照として２０％ＦＣ８添加ＲＰＭＩ　
１６４０培地を０．１　＋＋＋１分注した。更に洗浄液
で３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロ
ブリン抗体溶液０．１　ｒｒＬｌを分注し３７℃２時間
静置した。洗浄液で３回洗浄後０．４％オルトフェニレ
ンジアミン溶液０．１　ｍｌ１分注し、室温で２分反応
後６Ｎ硫酸０．０５　ｍｌ、を加え反応を停止させ、Ｏ
−０，４９０ｎｍを測定した。陰性対照の２倍以上の０
．Ｄ、　ｌ示す培養上清中で増殖しているハイプリドー
マを抗ヒトトランスフェリン抗体産生ハイプリドーマと
して選択した。４８大中３穴に抗ヒトトランスフェリン
抗体産生を認めた。

（４）　　単クローン化 ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週齢）の胸腺を摘出し、１
０ｒｎｌのＲＰＭＩ　１６４０培地をいれたプラスチッ
クシャーレ中で胸腺リンパ球をほぐした胸腺リンパ球を
遠心操作（１０００回転、１０分）を繰返しＲＰＭ１１
６４０培地で３回洗浄した。胸腺リンパ球を２０％ＦＣ
８添加、ＲＰＭＩ　１６４０培地５０ｍ１に浮遊させた
。

この浮遊液に抗ヒトトランスフェリン抗体産生ハイプリ
ドーマ５００個／ｒｎｌの溶液０．１　ｍｌを加え、よ
く混合後、９６穴培養プレートに１穴あたり０．２ｍｌ
ずつ分注し１０日間、ＣＯ２インキ−ベーター内で培養
した。細胞増殖の認められる培養上清をＥＬＩＳＡにて
分析の結果、抗ヒトトランスフェリン抗体産生ハイプリ
ドーマ６クローンを得た。このウチの１クローンを更に
同上操作をおこ々い抗ヒトトランスフェリン抗体産生ハ
イプリドーマ４クローンを得、単クローン化を完全なも
のとした。

（５）単クローン性抗体の作製 （４）までの操作で得られたクローンＴＦ−２２刈０６
個をＲＰＭＩ　１６４０培地０．２　ｍＡに浮遊させ、
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、６週齢）の腹腔内に投与し、
腹水を回収した。腹水４　ｒｎｌに飽和硫安溶液を徐々
に加え、最終硫安飽和濃度を５０係とし、室温で２時間
攪拌した後、遠心操作（３，０００回転、１０分）で沈
殿を回収し、生理食塩水５ｒｎｌを加え溶解した。これ
を生理食塩水で１０倍ずつ段階希釈してゆきＥＬＩｓＡ
にて分析し、抗体活性の認められる希釈倍数を求めたと
ころ、１０６であった。なおマウスＩｇＧ含量（抗体の
力価の目安）を抗マウスＩｇＧのウサギ血清を含有する
アガロースプレートにより測定（５ＲＩＤ法）したとこ
ろ１５■／ｍｌであった。

（６）　　（４）　ｔでの操作で得られたクローンＴＦ
−５について（５）と同様の操作を行ない単クローン性
抗体５ｍ１．を得た。又、（５）と同様の方法で抗体活
性及びマウスＩｇＧ含量を求めたところ、抗体活性は１
０６、マウスＩｇＧ含量は２０　ｍ９７ｍ１であった。

（７）　　（４）までの操作で得られたクローンＴＦ−
１４について（５）と同様の操作を行ない単クローン性
抗体５　ｍｌを得た。又、（５）と同様の方法で抗体活
性及びマウスＩｇＧ含量を求めたところ、抗体活性は１
ｏ５、マウスＩｇＧ含量は１７■／ｍｌであった。

実施例１　単クローン性抗体を用いたヒト血清トランス
フェリンの定量 試薬二次の各試薬を調製した。

１、緩衝液 ポリエチレングリコール　６０００　　　　Ｍ塩化ナト
リウム　　　　　　　　　　　０．１’０．１Ｍ　トリ
ス塩酸緩衝液、ｐＨ７，２１００ｍＡ２、抗体溶液 参考例１で得た単クローン性抗体ＴＦ−２１ｗＬｌ参考
例１で得た単クローン性抗体ＴＦ−５１ｍｌ緩衝液　　
　　　　１００ｍ１ ３、標準血清 トラフ　スフ　ｘリン含量　１５０　、３００　、４５
０ｍ９／ｄｌの標準血清 試料：ヒト血清 操作法：試験管に標準血清及びヒト血清をそのま１１０
μｌとり、これに抗体溶液３　ｍｌを添加して３７℃、
１０分間反応させた後、分光光度計で５０５　ｎｍの吸
光度を測定した。別に、標準血清及びヒト血清１０μｌ
に抗体を含まない緩衝液３ｍｌを添加して３７℃１０分
間加温後、分光光度計（日立６２４形）で層長１０箇、
波長５０５　ｎｍの吸光度を同様に測定した。

計算法： ×２５０ 標準血清による検量線を第１図に示す。

また、上記計算式により求めたヒト血清トランスフミリ
ン量と本実施例で用いたヒト血清試料を５ＲＩＤ法によ
り求めたトランスフェリン量を表１に対比して示す。

表　　　１ γ＝０．９９２ ｙ＝　１．０２ｘ−２，６ 表１より、本測定方法は５ＲＩＤ法によるそれとよい相
関を示していることが判る。

実施例２　単クローン性抗体を用いたヒト血清トランス
フェリンの定量 試料二次の各試薬を調製した。

１　緩衝液 ポリエチレングリコール　６０００　　　４Ｆ塩化ナト
リウム　　　　　　　　　　　０．９ｇ００１Ｍベロナ
ール緩衝液、ｐＨ７，５１００ｍＡ２、抗体溶液 参考例１で得た単クローン性抗体ＴＦ−２３，５ｍｌ参
考例１で得た単クローン性抗体ＴＦ−５０，５ｍｌ参考
例１で得た単クローン性抗体ＴＦ−１４０，５ｒｎｌ緩
衝液　　　　　　１００ｍ１ ３、標準血清 トランスフェリン含量　１００　、２００　、３００゜
５００■／ｄｌの標準血清 試料：ヒト血清 操作法：キーペットに標準血清及びヒト血清をそのまま
１０μｌをとシ、抗体溶液５００μノを添加しく２２） て室温で１５分間反応させた後、レーザーネフエロメー
ター（ＺＤ−８０１）で波長６３３　ｎｍに於ける散乱
光量を測定した。別に抗体溶液の代りに緩衝液を用いて
同様の測定を行った。

ヒトトランスフェリンと抗体の反応による散乱光量（Ｄ
ｓ）は次の式により算出される。

Ｄｓ　　＝Ｄｓ−Ａ　　−Ｄｓ−Ｂ 標準血清による検量線を第２図に示す。また第２図より
求めた本実施例に於けるヒト血清試料のトランスフェリ
ン量と５ＲＩＤ法によシ求めた本実施例に於けるヒト血
清試料のトランスフェリン量を表２に対比して示す。

上人下、−うミ、白 、でパ ；・・、啄きｊ ・　守 ＼定− 表　　　２ γ＝０．９９８ ’ｌ　＝　０．９９９ｘ十０．５ （９Ａ） （Ｚ５） 表２より、本測定方法は５ＲＩＤ法によるそれとよい相
関を示していることが判る。

〔発明の効果〕

以上述べた如く本発明は、単クローン性抗体を用いて抗
原抗体反応による凝集の程度を光学的に測定することに
より体液中のトランスフェリンを効率的に測定する方法
を提供するものであり、血清等の生体試料を希釈せずに
そのまま測定に供することを可能としたことにより、希
釈操作に伴う煩雑さ及び誤差を排除でき、正確性が向上
すると共に、同一試料について多項目の測定を行う自動
分析装置への適用を極めて容易力らしめた点に甚だ顕著
な効果を奏するものであシ斯業に貢献するところ極めて
大なるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に於ける標準血清によるトランスフ
ェリン量の検量線を表わし、横軸の各トランスフェリン
量（■／ｄｉ　）について得られた吸光度（ＯＤ）を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 （６任） 第２図は、実施例２に於ける標準血清によるトランスフ
ェリン量の検量線を表わし、横軸の各トランスフェリン
量（ｍｙ／ｃｔｅ）について得られた光散乱強度（ｍｖ
）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 特許出願人　　和光純薬工業株式会社 トランスフ午リン量（ワ／ｄり トランス７手リン量（ｒｎ矛／ｌｙ　）手続補正書 昭和６２年７月９日 １、事件の表示 昭和６１年　特許願　第０８３４０４号２、発明の名称 トランスフェリンの定量方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 〒　５４１ 住　所　大阪府大阪市東区道峰町３丁目１０番地連絡先
　特許法（東京）置０３−２７０−８５７１名　称　和
光純薬工業株式会社 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 （１）明細書１１頁７行目に記載の「於いても、」を「
於戴ても、」と補正する。 （２）明細書１５頁１５行目に記載のｒＨＴ培地で」を
ｒＨＴ培地に」と補正する。 （３）明細書１８頁４行目に記載の「投与し、」の後に
「約２週間後、」を挿入する。 （４）明細書１８頁１２行目から１３行目にかけて記載
の、「抗マウス１８Ｇのウサギ血清」を「抗マウス＋３
Ｇウサギ血清」と補正する。 以上

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）生体試料を希釈せずにそのまま使用し、単クロー
   ン性抗ヒトトランスフェリン抗体を２種類又はそれ以上
   組み合せて用いてこれと抗原抗体反応を行わせ、生成す
   る抗原抗体複合物に光を照射して光学的変化量を測定す
   ることを特徴とするトランスフェリンの定量方法。
2. （２）単クローン性抗ヒトトランスフェリン抗体が、マ
   ウスの腫瘍ラインからの細胞とヒトトランスフェリンで
   予め免疫されたマウスの脾細胞との融合により形成され
   たハイブリドーマより産生される単クローン性抗ヒトト
   ランスフェリン抗体である、特許請求の範囲第１項に記
   載のトランスフェリンの定量方法。
3. （３）光学的変化量が光散乱強度の変化量である、特許
   請求の範囲第１項又は第２項に記載のトランスフェリン
   の定量方法。
4. （４）光学的変化量が透過光量の変化量である、特許請
   求の範囲第１項又は第２項に記載のトランスフェリンの
   定量方法。