JPS63246669A - 糞便中の潜血検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４１発明の目的 （ａ）産業上の利用分野 この発明は９例えば大腸癌のスクリーニング等を目的に
消化官における微小出血を免疫学的手法を用いてヒト由
来の血液成分を特異的に検出する方法に関するものであ
る。

（ｂ）従来技術 消化器系統の異常２例えば癌、潰瘍等を早期に発見する
検診方法として糞便中に混じた血液の代表的蛋白質であ
るヘモグロビンを免疫学的手法により検出することが行
われている。

糞便中のヘモグロビンの検出には従来からベンチジン法
等の化学的糞便潜血反応法や免疫学的測定法があるが、
一般に化学的反応法は非常に敏感であって偽陽性が多く
でる欠点があり、又同法では血液中のヘモグロビンのペ
ルオキシダーゼ活性を検出するがペルオキシダーゼ活性
は肉、野菜等にも存在するので検査前に食餌を制限する
必要が、ある。従って食事制限無しに検出するには免疫
学的方法が適当である。

最近Ｂａｒｒｏｗ　　（Ａｍ、Ｊ、Ｃ１ｉ、Ｐａｔｈｏ
ｌ、６９　：　３４２．１９７８　Ｍａｒｃｈ　）らを
始めとしてヒトヘモグロビンと抗ヒトヘモグロビンの抗
体−抗原反応を用いる免疫学的糞便潜血反応による測定
法が開発され１例えば特開昭６１−１３７０６４号にあ
るように濾紙に糞便を塗布しヒトヘモグロビン抗体を感
作した担体粒子と混合し、該混合物での担体粒子の凝集
状態を判定する方法や特願昭６０−０６９５９８号のに
あるように糞便を疎水性樹脂に接触させてヘモグロビン
を吸着させ、これに酵素標識抗体試薬により抗原抗体反
応を生ぜしめて基質液に浸して呈色度により検出する方
法等が公知である。

また血液に特異な物質としてヒトアルブミンを免疫学的
測定法で検出することが中山卓部氏他により「医学のあ
ゆみＪ　Ｖｏｌ、１４０．Ｎｏ、３．１９８７．１．１
７号に提案されている。

（Ｃ）発明が解決しようとする問題点 −ａにヘモグロビンは抗体に対する力価が弱いので免疫
学的測定での測定感度が低く不利であり。

且つ消化酵素や腸内細菌の産生ずる蛋白分解酵素の作用
によって構造変化をきたし易く免疫学的検出に不利であ
るが、特に糞便中のヘモグロビンを免疫学的反応法で検
出する場合。

（ａ）ヘモグロビンが消化官から分泌される粘液成分や
腸内細菌の細胞壁成分と結合して免疫学的反応性が低下
する （ｂ）糞便中のヘモグロビンは腸内細菌によって分解さ
れ易く（細菌の栄養源となり易い）９分解されて時間の
経過と共に減少する （Ｃ）ヘモグロビンを免疫学的方法で検出すると微量で
も検出可能であるが、量が増加しても呈色度が一定の限
界に達しそれ以上の量的判定ができない という問題点があり糞便中の潜血をヘモグロビンのみを
利用して検出するのは基本的問題がある。

またヒトアルブミンは消化官出血以外に蛋白喪失性胃腸
症の場合にも選択的に漏出する代表的蛋白であり、且つ
ヘモグロビンと同様に腸内細菌による影響がかなり大き
く糞便中の潜血を検出する方法としては不適当である。

口０発明の構成 （ａ）問題点を解決するための手段 本発明は採取した糞便にグリコシダーゼ型細胞壁溶解酵
素（以下溶菌酵素という）を作用せしめてヘモグロビン
の粘液成分、細胞壁成分との結合を分離させ且つ腸内細
菌による分解を阻止して前記（ａ）、　（ｂ）の問題を
解消すると共に、同時平行的に糞便中のトランスフェリ
ンを免疫学的方法により検出することにより前記（Ｃ）
、及びアルブミン検出法における問題をも解消するもの
である。

すなわち本発明は採取した糞便の試料にグリコシダーゼ
型溶菌酵素を作用せしめてヘモグロビンとトランスフェ
リンを同時に免疫学的測定方法によって検出することを
特徴とする糞便中の潜血検出方法である。

（ｂ）作用 グリコシダーゼ型溶菌酵素を食品、医薬等の防腐剤とし
て用いることは公知であり、これを糞便中に混入すると
長時間での腸内細菌によるヘモグロビンの分解を防止す
る効果がある。

さらに本発明者らは種々実験の結果、グリコシダーゼ型
溶菌酵素は前記の防腐効果以外に糞便中の粘液成分や腸
内細菌の細胞壁成分に結合しているヘモグロビンの結合
を短時間で分離させて免疫学的反応性を回復させる効果
も有することを発見した。

この場合に溶菌酵素としてはグリコシダーゼ型溶菌酵素
であれば良いが、リゾチームが一般に市販されており使
用し易い。

溶菌酵素を作用せしめるには単にその溶液に採取した糞
便を浸しても、溶解してもよい。また溶菌酵素を含有さ
せた寒天ゲル容器中に糞便の試料を差し込み吸収させる
方法や溶菌酵素を含ませた濾紙に糞便を塗りつける方法
等各種の方法で行うことができる。

次ぎにトランスフェリンの同時測定について説明する。

消化官出血があるとヘモグロビンを含めて他の血液成分
も同時に糞便中に混在している。血液中の蛋白質構成は
血球成分の主成分である赤血球やヘモグロビン以外に多
種類の蛋白質が雑多に混在する。本発明者らは、血液中
に１００■／ｄｉ以上に存在する蛋白質について検討し
た。

（イ）アルブミン：前記の通り出血以外の漏出があり、
細菌の影響も大きい （ロ）免疫グロブリン：大腸粘膜の免疫機構に関与する
ものであり、出血とは無関係に腸内に多量に存在する。

（ハ）フィブリノーゲン：腸内細菌の影響を多く受け、
且つ免疫学的反応性が弱い。

（ニ）α、アンチトリプシン及びα２マクログロブリン
：出血以外糞便中に多量に存在する（ホ）ハプトグロブ
リン：ヘモグロビンと複合体を形成して、その相互作用
により両方の免疫反応性が弱い。

（へ）トランスフェリン：細菌に対する抵抗性が大きく
、蛋白喪失性胃腸症の場合にも漏出しにくい。免疫学的
反応性が大きい。また癌との関連性があり、糞便中の干
渉成分の影響が少ない。

以上の検討結果、実験を行ったところトランスフェリン
は血液中に約２５０■／ｄｌ含まれ、量的にはヘモグロ
ビンの約１７６０であるが充分に免疫反応により検出で
きるものであり、しかもトランスフェリンは大きな濃度
域に対して直線的な吸光度特性を示すことが分かった。

本発明の検出方法としては普通の免疫学的測定方法を用
いればよい。

次ぎに本発明の実際の検出方法の例を示す。

（１）検出方法１（スティックＥＩＡ法）例えばポリス
チレン、ナイロン、塩化ビニール等の疎水性プラスチッ
ク材料でサジの部分に溝をもうけた採便サジを採取器と
する。市販の抗ヒトヘモグロビン抗体（ＤＡＫＯ社製）
及び抗ヒトトランスフェリン抗体（ＤＡＫＯ社製）をト
リス緩衝液（ｐＨ８，４，０，０５Ｍ　）中にそれぞれ
終濃度が２００倍希釈。

８００倍希釈（濃度及びその比率はこれに限定されるも
のではない）になるように加えて採便サジの先端を浸漬
し、４〜８°Ｃで一夜放置し、その後室温で乾燥して表
面にコーティングする。

採便サジで糞便の異なった場所を数回突き刺し。

トイレットペーパーでサジの部分の溝の上の余剰の糞便
を拭き取りサジのくぼみに一定量の糞便を残して試料と
する。

一方市販のアガロースを２％になるように食塩加リン酸
緩衝液（ｐＨ７，２，０，１Ｍ）に加え加熱溶解する。

これを約６０°Ｃに温度を下げた状態で溶菌酵素として
リゾチームを寒天溶液１−当たり３■の割合で又ＮａＮ
３を終濃度０．１％になるように加える。これを１　ｍ
ｌづつ寒天ゲル容器に分注して冷却してゲル化する。

この寒天容器中に採取サジを差し込み固定して一定時間
放置する。

そうすると採便サジに付いた糞便は寒天ゲル中に拡散し
、特に腸内細胞の細胞壁成分や粘液成分と結合している
ヘモグロビンがリゾチームによって分離されて免疫的反
応が可能な状態となり、糞便中ノヘモグロビンが完全に
サジの表面の抗ヒトヘモグロビン抗体に反応して補足さ
れる。また糞便中のトランスフェリンも抗ヒトトランス
フェリン抗体に補足される。またリゾチーム及びＮａＮ
３は防腐剤として作用するので、採便直後に検査を必要
とする糞便試料を防腐効果のある状態で保持でき且つ抗
原抗体反応を輸送中にも安定した状態で行わせることが
できる。またこの状態では臭気。

不潔感がなく集団検診におけるサンプリング法として適
している。

別に前記市販の抗血清（アガロース）に公知の（吉武氏
等著、免疫実験法ＸＩ、　ｐ　３４９７〜３５１９．１
９８２）方法でアルカリホスファターゼ標識抗体を調整
する。すなわち抗ヒトヘモグロビンと抗ヒトトランスフ
ェリンのアルカリホスファターゼ標識抗体をそれぞれ終
濃度５００倍希釈になるように、５％牛アルブミン、　
　０．５ｍＭ塩化マグネシウムを含む食塩加リン酸緩衝
液に加えて酵素標識抗体使用液を調整する。

前記ヘモグロビンとトランスフエリンヲ補足シた採便サ
ジを取り出して９表面を脱イオン水で洗浄して残存付着
糞便を除去し、この採便サジを酵素標識抗体使用液を０
．２５ｍｊ！を分注した小試験管に入れて３７°Ｃ１６
０分間抗原抗体反応を行わせる。

次いで採便サジを脱イオン水でよく洗浄しアルカリホス
フエターゼをＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法で測定する。

すなわち採便サジをフェニルリン酸基質液０．Ｍを入れ
た小試験管に入れて３７°Ｃ５３０分間インキュベート
して、呈色液０．３ｄを加え反応を停止させて呈色度（
この場合には赤色）を肉眼で測定し判定する。

（２ン　検出方法２（ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌ
ｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ］
）溶菌酵素としてリゾチームを食塩加リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２、０，１Ｍ　）　１　ｍｉ中に４．ＮａＮｚを
１　ｍｇの割合で溶解した液を染み込ませて乾燥した厚
手の濾紙のうんえにヘラで糞便を薄く塗ったものをサン
プルとする。または前記組成の溶液を１戚小壜中に入れ
ておき、細棒で糞便を少量とったものを入れて溶液サン
プルとする。いずれのサンプリング法においても糞便の
量を一定にすることが望ましい。

抗ヒトヘモグロビン抗体（ＤＡＫＯ社製）と抗ヒトトラ
ンスフェリン抗体（ＤＡＫＯ社製）を終濃度でそれぞれ
２００倍希釈、８００倍希釈の割合（これに限定されな
い）で含むトリス緩衝液（ｐＨ８，４，０，０５Ｍ　）
をＥＬＩＳＡ用マイクロプレートの各穴に１００μｌづ
つ分注し、４〜８°Ｃで一夜放置し抗体コーティングす
る。この抗体コーティングプレートを脱イオン水で洗浄
後各穴に１％牛アルブミンを含む食塩加リン酸緩衝液を
１００μ１分注する。

濾紙サンプリング法のばあいには直径５ｒｒｒｍのパン
チでくり抜いた濾紙を各穴に一枚づつ入れる。

溶液サンプリング法の場合には溶液を各穴に５０μ！い
れる。

次いで３７°Ｃ５６０分間抗原抗体反応をさせる。次ぎ
に良く洗浄後アルカリホスファターゼ標識抗体使ＪｆＨ
＆（抗ヒトヘモグロビン、抗ヒトトランスフェリンのい
ずれも５００倍希釈液）を１００μ２づつ各穴に分注し
、３７°Ｃ１６０分間抗原抗体反応をさせる。脱イオン
水でよく洗浄の後、Ｋｉｎｄ　−Ｋｉｎｇ法によるアル
カリホスファターゼ測定用基質液を１００μβづつ各穴
に分注して３７°Ｃ，３０分間反応後直ちに呈色試薬を
１００μｌ加えて反応を停止させる。

各穴の呈色度を肉眼判定またはマイクロプレート用光度
計で測光する。

いずれの場合にも複数の健常者からヘパリン採血した全
血を混和して脱イオン水で３万倍に希釈した試料を５０
ｕｌを用いて同時に検出を実施して呈色度を比較して判
定すると良い。

本発明法の場合１通常ヘモグロビン換算で２．５〜５μ
ｇ／！ｎｌが検出されるとに陽性と判定すれば良い。

（Ｃ）　　実施例 実施例１゜ 多数（１２９人）の糞便の試料につき、そのままの試料
とリゾチームを添加した場合のヘモグロビンをＥＬＩＳ
Ａ法によって測定した。

その結果を無添加の試料の呈色度を横軸にリゾチーム添
加試料の呈色度を縦軸にプロットしたところ第１図のよ
うになった。リゾチームを添加した試料の測定値は添加
しない測定値より大で（４５度の線より上にある）あり
、ヘモグロビンが完全に測定できていることが分かる。

通常上記のような検出においては吸光度が１００〜２０
０を限界として判別しているが、かなりの試料が無添加
では陰性であるが、添加すると陽性となり検出の精度が
上昇していることが分かる。

実施例２゜ 健常者３０人の便汁を混合して造った約２５％便汁に全
血を終濃度１００００倍の割合で添加してヘモグロビン
の量の時間的変化を調査した。結果は第２図の通りであ
った。　　これによりリゾチームを添加した便汁ではヘ
モグロビンの腸内細菌による分解の進行が阻止されてい
ることが分かる。

実施例３゜ 前記ＥＬＩＳＡ法により６０例の濃厚便汁中のトランス
フェリンを吸光度により測定し１次ぎに該６０例の濃厚
便汁に全血３００００倍希釈液を添加して同様に測定し
、その結果を無添加の試料の吸光度を横軸に全血添加試
料の呈色度を縦軸にプロットしたところ第３図のように
なった。６０例の便汁には始めから血液を含有するもの
が含まれているか、全ての便汁で全血を添加するとその
添加量だけトランスフェリンによる吸光度が増加するこ
とが分かる。即ちトランスフェリンは微量の測定が可能
であり、しかも糞便中の潜血を検出するのに有効である
ことが分かる。

実施例４゜ 健常者３０人の便汁を混合して造った約２５％便汁に全
血を終濃度１ｏｏｏｏ倍の割合で添加して各種の蛋白質
の量の時間的変化を調査した。結果は第４図の通りであ
った。これによりトランスフェリン以外の蛋白質は時間
と共に腸内細菌による分解が進行するが、トランスフェ
リンは殆ど変化せず、従って糞便中の潜血を検出には最
適であることが分かる。さらにこの試料に溶菌酵素とし
てリゾチームを添加してトランスフェリン量の時間的変
化を測定した。その結果は第５図の通りであり。

トランスフェリンの腸内細菌による分解は少ないが、そ
れもリゾチームを添加するとさらに分解が阻止されるこ
とが分かる。

実施例５゜ 便汁中に全血を種々の濃度に混合してＥＬＩＳＡ法によ
りヘモグロビン及びトランスフェリン含有量と吸光度と
の関係を相互に独立に（抗ヒトヘモグロビン或いは抗ヒ
トトランスフェリンのみを使用）測定したところ第６図
の通りであった。ヘモグロビンは約２．５μｇ／ｍｌの
含有量までは非常に敏感であるが、それ以上の含有量に
なると吸光度約２５０程度で飽和してしまう。一方トラ
ンスフェリンは含有量に対し殆ど直線的に吸光度が増加
することが分かる。

実施例６゜ 実施例５と同様の試料に対し、ヘモグロビン及びトラン
スフェリンを独立に測定すると共に本発明の方法を用い
て測定した結果を第７図に示す。

この結果から本発明の方法によると、低濃度域から高濃
度域まで敏感に糞便中の潜血を敏感に検出、測定するこ
とができることが分かる。

実施例７゜ 本発明の方法において、終濃度で抗ヒトヘモグロビン抗
体を２００倍希釈、抗トランスフェリン抗体をそれぞれ
２００．４００．８００倍希釈になるように調整したト
リス緩衝液を用いた場合を実験した。

結果は第８図に示す通りであった。

トランスフェリンの希釈倍数が変化しても結果には大き
な差がなく、良い直線性をもって検出。

測定が可能であることが分かる。また微量を検出するに
は抗ヒトトランスフェリン抗体を少な（シ。

全濃度域での測定は抗ヒトトランスフェリン抗体の濃度
を上げればよいことが分かる。

ハ０発明の効果 以上に詳しく説明したように１本発明は従来法に比し被
験者に食餌制限を必要とせず、糞便の試料を長時間保存
しても精密に糞便中の潜血を検出できるものであり、特
に大腸癌のスクリーニング等に用いて非常に有効な糞便
中の潜血検出方法である。

【図面の簡単な説明】

第１図は同じ糞便に溶菌酵素を添加した場合と無添加の
場合のヘモグロビンの測定結果を比較したグラフであり
、第２図は糞便中のヘモグロビンの量の時間的変化を比
較した結果を示すグラフである。第３図はＥＬＩＳＡ法
により濃厚便汁及びそれに全血３００００倍希釈液を添
加したもののトランスフェリンを吸光度により測定して
比較した結果を示すグラフであり、第４図は糞便中の各
種蛋白質の時間的変化を示すグラフ、第５図はりゾチー
ムを添加した場合のトランスフェリンの時間的変化を示
すグラフである。第６図は便汁中のヘモグロビン及びト
ランスフェリンの各濃度に対する吸光度の変化を示すグ
ラフ、第７図は本発明の方法による便汁中の潜血反応の
結果を示すグラフ。 第８図は抗ヒトヘモグロビン抗体と抗ヒトトランスフェ
リンの比率を変化させた場合の本発明方法による吸光度
の変化をしめずグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、糞便中の潜血検出方法において、糞便試料にグリコ
   シダーゼ型溶菌酵素を作用させ、該試料中のヘモグロビ
   ンとトランスフェリンを同時に免疫学的測定法により検
   出することを特徴とする糞便中の潜血検出方法 ２、グリコシダーゼ型溶菌酵素としてリゾチームを用い
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の糞便中
   の潜血検出方法 ３、採便サジに抗ヒトヘモグロビン抗体と抗ヒトトラン
   スフェリン抗体をコーティングして採便し、該試料を溶
   菌酵素を含むゲル中に差し込んで一定時間試料を保存し
   たのち免疫学的測定法によりヘモグロビンとトランスフ
   ェリンを同時に検出することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項あるいは第２項記載の糞便中の潜血検出方法