JPS63246668A - 糞便中の潜血検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ０発明の目的 （ａ）産業上の利用分野 この発明は糞便中の潜血の検出方法に関するものである
。

伽）従来技術 消化器系統の異常２例えば癌、潰瘍等を早期に発見する
検診方法として糞便中の血液特に血液中の代表的蛋白質
であるヘモグロビンを検出する。

この糞便中のヘモグロビンの検出には従来からベンチジ
ン法等の化学的糞便潜血反応法や免疫学的測定法による
検出が行われている。

（Ｃ）発明が解決しようとする問題点 ところが潜血を検出するのにヘモグロビンを検出する方
法は種々の欠点を有する。

すなわちヘモグロビンに対する化学的潜血反応法による
検出ではヒトヘモグロビンに対する特異性がなく、検査
前に食餌制限等を必要とし良い検出法ではない。

またヘモグロビンは抗体に対する力価が弱いので免疫学
的測定での測定感度が低（不利であり。

且つ消化酵素や腸、内細菌の産生ずる蛋白分解酵素の作
用によって構造変化をきたし易く免疫学的検出に不利で
あるが、特に糞便中のヘモグロビンを免疫学的反応法で
検出する場合。

（ａ）−・モグロビンが消化官から分泌される粘液成分
や腸内細菌の細胞壁成分と結合して免疫学的反応性が低
下するので偽陰性を示す。

（ｂ）糞便中のヘモグロビンは腸内細菌によって分解さ
れ易く２時間の経過と共に偽陰性を示す。

という問題がある。

すなわち糞便中の潜血を検出するにはヘモグロビンを検
出する方法には本質的に問題がある。

これに対し、血液に特異な物質としてヒトアルブミンを
免疫学的測定法で検出することが中山卓部氏他により「
医学のあゆみＪ　Ｖｏｌ、１４０．Ｎｏ、３．１９８７
．１．１７号に提案されている。

しかしながらヒトアルブミンは消化官出血以外に蛋白喪
失性胃腸症の場合にも選択的に漏出する代表的蛋白であ
り、且つヘモグロビンと同様に腸内細菌による影響がか
なり大きく糞便中の潜血を検出する方法としては不適当
である。

口１発明の構成 （ａ）問題点を解決するための手段 本発明はヘモグロビンの代わりに血液に含有されている
蛋白質であるトランスフェリンを免疫学的方法によって
検出することによって潜血を検出する方法であり従来法
の欠点を解消するものである。この方法を実施する場合
に糞便試料にグリコシダーゼ型溶菌酵素例えばリゾチー
ムを添加するとさらに良い結果が得られる。

（ｂ）作用 消化官出血があるとヘモグロビンを含めて他の血液成分
も同時に糞便中に混在している。血液中の蛋白質構成は
血球成分の主成分である赤血球のヘモグロビン以外に多
種類の蛋白質が雑多に混在する。本発明者らは、血液中
に１００■／ｄｉ以上に存在する蛋白質について検討し
２次ぎの結果を得て本発明をなしたものである。

（イ）アルブミン：前記の通り出血以外の漏出があり、
細菌の影響も大きい （ロ）免疫グロブリン：大腸粘膜の免疫機構に関与する
ものであり、出血とは無関係に腸内に多量に存在する。

（ハ）フィブリノーゲン：腸内細菌の影響を多く受け、
且つ免疫学的反応性が弱い。

（ニ）α１アンチトリプシン及びα２マクログロブリン
：出血以外糞便中に多量に存在する（ホ）ハプトグロブ
リン：ヘモグロビンと複合体を形成して、その相互作用
により両方の免疫反応性が弱い。

（へ）トランスフェリン：細菌に対する抵抗性が大きく
、蛋白喪失性胃腸症の場合にも漏出しにくい。免疫学的
反応性が大きい。また癌との関連性があり、糞便中の干
渉成分の影響が少ない。

即ち以上の検討結果、トランスフェリンは血液中に約２
５０■／ｄｉ含まれており、ヘモグロビンの約ｌ／６０
であるが充分に免疫反応により検出できるものであるこ
とが分かった。

この場合に検出方法としては普通の免疫学的検出方法を
用いればよい。

例えば、プラスチック製の先端に溝をもうけた採便サジ
を抗ヒトトランスフェリンを含むトリス緩衝液に一昼夜
浸漬してコーティングして、このサジを糞便中の異なっ
た場所に数回突きさして。

トイレットペーパーで余剰の糞便を拭きとり溝の部分に
一定量の糞便を採取する。これにより糞便中のトランス
フェリンは抗体と結合して採取される。一定時間抜採便
サジを洗浄し、公知（例えば吉武氏らの免疫実験法ＸＩ
　、　Ｐ、３４９７〜３５１９．１９８２）の方法で調
整したアルカリフォスファターゼ標識抗体に浸漬して抗
原抗体反応を行わせる。次いで採便サジを洗浄した後、
アルカリフォスファターゼをＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法で測
定する。すなわちフェニル燐酸基質液を入れた小試験管
に採便サジを入れて３７℃、３０分間インキュベートし
て呈色液を加えて反応を停止させ、呈色度を測定すれば
良い。

ＥＬｒＳＡ法（ｔＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｎ＋
Ｉｌ＋ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ、免疫学的測定
法）を用いることもできる。即ち綿棒により糞便を少量
採取する。或いは乾燥させた厚手の濾紙の上に糞便をヘ
ラで塗りつけてサンプリングしても良い。一方ＥＬＩＳ
Ａ用マイクロプレートの各穴に抗ヒトトランスフェリン
抗体（市販ＤＡＫＯ社製）を終濃度で８００倍希釈の割
合で含むトリス緩衝液（ｐＨ８，４，０，０５Ｍ）を１
００μｌづつ分注して４〜８°Ｃで１２時間放置してコ
ーティングする。

抗体をコーティングしたプレートを脱イオン水で洗浄後
、各穴に１％牛アルブミンを含む食塩加リン酸緩衝液を
１００μｆづつ分注する。これに前記の糞便の汁（便汁
）を５ｏｕｌ注入し、或いは濾紙の断片を浸漬し、３７
°Ｃで６０分間、抗原抗体反応をさせる。次いで良く洗
浄後アルカリフォスファターゼ標識抗体試薬を１００μ
２づつ各穴に分注し、３７°Ｃ９６０分間抗原抗体反応
をさせ、脱イオン水で洗浄後、アルカリフォスファター
ゼ測定用基質液を１００μｌづつ各穴に分注して３７°
Ｃ９３０分間反応後直ちに呈色試薬を１００μ！加えて
反応を停止させる。各穴の呈色液をマイクロプレート用
光度計で測光する。

（Ｃ）実施例 実施例１ 前記ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により６０例の濃厚便汁中のトラ
ンスフェリンを吸光度により測定し９次ぎに６０例の濃
厚便汁に全血３００００倍希釈液を添加して同様に測定
した。

その結果を無添加の試料の吸光度を横軸に全血添加試料
の呈色度を縦軸にプロットしたところ第１図のようにな
った。

６０例の便汁には血液を含有するものが含まれているが
、全ての便汁で全血を添加すると全血添加量だけトラン
スフェリンの検出による吸光度が増加した。

これによりトランスフェリンは微量の測定が可能であり
、しかも糞便中の潜血を検出するのに有効であることが
分かる。

実施例２ 健常者３０人の便汁を混合して造った約２５％便汁に全
血を終濃度１００００倍の割合で添加して各種の蛋白質
の量の時間的変化を調査した。結果は第２図の通りであ
った。

これによりトランスフェリン以外の蛋白質は時間と共に
腸内細菌による分解が進行するが、トランスフェリンは
殆ど変化せず、従って糞便中の潜血を検出には最適であ
ることが分かる。

実施例３ 実施例２の試料に溶菌酵素としてリゾチームを添加して
トランスフェリン量の時間的変化を測定した。その結果
は第３図の通りであった。

これによりトランスフェリンの腸内細菌による分解は少
ないが、それちりゾチームを添加するとさらに分解が阻
止ささることが分かる。

ハ２発明の効果 以上に詳しく説明したように２本発明は糞便中の潜血を
糞便中で安定なトランスフェリンを検出することによっ
て検出するので、従来のヘモグロビンを検出するのに比
べ極めて確実に検出できる特徴を有するものであり、さ
らに検出作業前の試料を長時間保存しても正しい検出が
できるので。

例えば大腸癌のスクリーニング等に用いて非常に有効な
糞便中の潜血検出方法である。

【図面の簡単な説明】

第１図はＥＬＩＳＡ法により濃厚便汁及びそれに全血３
００００倍希釈液を添加したもののトランスフェリンを
吸光度により測定して比較した結果を示すグラフである
。第２図は糞便中の各種蛋白質の時間的変化を示すグラ
フであり、第３図はリゾチームを添加した場合のトラン
スフェリンの時間的変化を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、糞便中に含まれるトランスフェリンを免疫学的測定
   法によって検出することを特徴とする糞便中の潜血検出
   方法 ２、糞便にグリコシダーゼ型溶菌酵素を添加してトラン
   スフェリンを検出することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の糞便中の潜血検出方法 ３、グリコシダーゼ型溶菌酵素としてリゾチームを用い
   ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の糞便中
   の潜血検出方法