CN115128280B - 一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条、试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于前列腺炎诊断试剂领域，具体公开了一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条、试剂盒及其制备方法和应用；所述试纸包括依序搭接在PVC底板上的样品垫、标记垫、层析条和吸水垫；所述层析条上设置有划线的检测区T和质控区C；所述检测区T包被有抗PSEP抗体二号，质控区C包被有羊抗兔IgG抗体；标记垫包被有荧光标记抗PSEP抗体一号；检测时，尿液样本通过样品垫上样，尿液中的PSEP与标记垫中的荧光标记抗PSEP抗体一号结合形成免疫结合物，该结合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区T，与膜上的抗PSEP抗体二号起反应，经特定波长激发光源激发后产生荧光信号，为慢性前列腺炎提供一种非侵入性的无痛快速检验方法。
Description
技术领域
本发明属于前列腺炎诊断试剂领域，具体公开了一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条。
背景技术
慢性前列腺炎(ChronicProstatitis，CP)是泌尿外科中青年男性最常见的疾病之一，据报道其占泌尿外科男性门诊就诊患者的25%左右。据流行病学调查，我国成人男性人群中，10%以上有前列腺炎样症状，50%男性不同时期均患过前列腺炎。说明潜在的慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛（CPPS)患者众多，同时，由化学品、物理因素或生物制剂引起的炎症过程还是人类癌症的发病机制中重要因子。在前列腺癌中，炎症的存在及细胞上皮组织损伤后再生被认为是恶性转化的关键因素。前列腺组织受到炎性细胞的浸润，从而释放出各种活性物质，这些物质的释放还与细菌及病毒感染、尿酸增高及食用前列腺致癌物有关。在过去10年中，炎症和癌症之间的联系，以及前列腺炎作为前列腺癌高危因素的假说已经在流行病学、临床、形态学、病原学、细胞和分子水平上进行充分的研究并得到证实。事实上，文献中指出，大约12%以上前列腺炎症，如不及时治疗可转化为前列腺癌。所以前列腺炎严重影响男性健康。
前列腺炎临床表现因患者个体差异而缺乏特异性，因此在临床上治疗效果一直不满意。根据1997年美国国立卫生研究院(NIH)对前列腺炎的分类，即NIH分类法，包括Ⅰ型:急性细菌性前列腺炎(ABP);Ⅱ型:慢性细菌性前列腺炎(CBP);Ⅲ型:又分为ⅢA，慢性非细菌性前列腺炎(CAP)和ⅢB，慢性骨盆疼痛综合征(CPPS);Ⅳ型:无症状的炎症性前列腺炎(AIP)。临床实践中，通常以Ⅲ型慢性前列腺炎多见，约占90%左右，所以慢性前列腺炎主要指的是Ⅲ型慢性前列腺炎。在临床实际工作中，泌尿男科医师对首诊的CAP和CPPS患者选择的检查方法(多选)前3位是尿常规(80.3%)、前列腺按摩液检查(71.0%)、体检(包括直肠指检)(63.2%)。前列腺按摩液检查和直肠指检对患者有一定侵入性，而大多数诊断却仍然依赖于临床表征和医生经验。因此非常需要操作简便同时准确可靠的诊断方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明公开了一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条、试剂盒及其制备方法和应用，PSEP为人前列腺小体外泄蛋白的缩写，下同。
本发明的技术方案如下：
一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条，所述试纸包括依序搭接在PVC底板上的样品垫、标记垫、层析条和吸水垫；所述层析条上设置有划线的检测区T和质控区C；所述检测区T包被有抗PSEP抗体二号，质控区C包被有羊抗兔IgG抗体；标记垫包被有荧光标记抗PSEP抗体一号；检测时，尿液样本通过样品垫上样，尿液中的PSEP与标记垫中的荧光标记抗PSEP抗体一号结合形成免疫结合物，该结合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区T，与膜上的抗PSEP抗体二号起反应，经特定波长激发光源激发后产生荧光信号，信号的强弱与样本中PSEP的含量成正比。
进一步的，上述一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条，样品垫为玻璃纤维素膜，试纸条的宽度为2-4mm；T线和C线的间隔为3-7mm；样品垫与标记垫之间重叠2-4mm；标记垫与层析条之间重叠1-3mm；层析条与吸水垫之间重叠2-4mm。
进一步的，上述一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条，所述荧光标记抗PSEP抗体一号中，使用荧光微球偶联PSEP抗体一号，荧光微球的粒径为100～200nm，荧光微球的激发波长为280～450nm，发射波长为380～640nm。
进一步的，上述一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条，所述荧光标记抗PSEP抗体一号由以下步骤制备：
S1.荧光微球初洗：
（1）取固含量1%的荧光微球100μL，装到圆底离心管中；
（2）加入500μL初洗缓冲液，8000g离心30min；
（3）使用移液器缓慢吸取上清；
（4）加入250μL初洗缓冲液，用超声波清洗机超声5min以重悬沉淀；
（5）重复2-3操作，最后一次离心去上清后加入200μL初洗缓冲液超声5min以重悬沉淀；
S2.荧光微球活化：
（1）使用初洗缓冲液配制100mg/mLEDC，100mg/mLNHS，备用；
（2）取200μLEDC溶液加入到离心管中，混匀反应5min，超声3min；
（3）取100μLNHS溶液加入到离心管中，混匀反应15min，超声3min；
S3.偶联抗体：
（1）8000g离心5min，以使荧光微球全部沉淀至离心管底部；
（2）使用移液器缓慢吸取上清；
（3）向圆底离心管中加入500μL偶联缓冲液，用超声波清洗机超声3min以重悬沉淀；
（4）重复上述操作共计3次；
S4.封闭：
（1）偶联反应完成后，将离心管置于超声波清洗机中，超声3min；
（2）加入250μL封闭缓冲液，混匀封闭反应1小时，反应期间每30min将溶液置于超声波清洗机中，超声3min；
（3）封闭反应完成后，将溶液至于超声波清洗机中，超声3min；
S5.终洗：
（1）8000g离心30min，以使荧光微球全部沉淀至离心管底部；
（2）使用移液器缓慢吸取上清；
（3）向圆底离心管中加入500μL终洗缓冲液，用超声波清洗机超声3min以重悬沉淀；
（4）重复上述操作共计3次；
（5）加入终洗液100μL，恢复至荧光微球原体积，超声5min，置于冰箱冷藏，待用。
进一步的，上述一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1）样品垫的制备：将样品垫用封闭液浸泡后，置于湿度＜20％、温度为55～60℃的烘箱，干燥12～24h，然后于2～25℃密封保存；
2）标记垫的制备：将荧光标记抗PSEP抗体一号用一号包被缓冲液调节至浓度为0.01～0.05mg/mL喷涂在标记垫上，喷量为2～4μL/cm，喷涂完成后，将标记垫置于湿度＜20％的55～60℃的烘箱，干燥12～24h，然后于2～25℃密封保存；
3）层析条的制备；将抗PSEP抗体二号、羊抗兔IgG抗体分别用二号和三号包被缓冲液调节至浓度为0.1～0.5mg/mL；然后分别喷到层析条的检测线T和质控线C上，喷量均为0.1～0.2μL/mm；检测线和质控线间隔为3-7mm，喷涂完成后，将层析条置于湿度＜20％的55～60℃烘箱，干燥24～72h，然后于2～25℃密封保存；
4）试纸条的制备：将制备的样品垫、标记垫、层析条，以及吸水纸依序搭接黏贴在PVC底板上，并切割成2～4mm宽度的试纸条，即得所述检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条。
进一步的，上述一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条的制备方法，所述一号包被缓冲液包括以下质量分数的组分：0.2～1％的酪蛋白，1％～5％的蔗糖，0.1-0.5%海藻糖、0.1～1％的Tween-20，0.1～0.5％的胆酸钠，0.02～0.05％的Proclin300，0.05M、pH7.4的PBS缓冲液；
所述二号包被缓冲液包括以下质量分数的组分：0.8～1.2％的酪蛋白，3％～10％的蔗糖，0.5-1.5%海藻糖、0.1～1％的Tween-20，0.1～0.5％的胆酸钠，0.02～0.05％的Proclin300，0.05M、pH7.4的PBS缓冲液；
所述三号包被缓冲液包括以下质量分数的组分：1.5～2.5％的酪蛋白，12％～18％的蔗糖，1.5-2.5%海藻糖、0.1～1％的Tween-20，0.1～0.5％的胆酸钠，0.02～0.05％的Proclin300，0.1M、pH7.4的PBS缓冲液；
所述封闭液包括以下质量分数的组分：1-2.5%BSA、3-6%蔗糖、5-10%PEG4000、0.5-1.5%TritonX-100、pH9.5的0.05M硼砂缓冲液。
进一步的，上述一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条的制备方法，所述标记垫为玻璃纤维素膜，所述层析条为反蛋白石结构硝酸纤维素光子晶体薄膜。
进一步的，上述检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条或其制备方法在制备慢性前列腺炎诊断试剂盒中的应用。
进一步的，上述检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条或其制备方法在制备慢性前列腺炎诊断试剂盒中的应用，包括以下步骤：
a将试纸条装入检测卡中制成诊断试剂盒；
b待检尿液样本恢复至室温，开启免疫荧光分析仪；
c按分析仪说明书进行操作：用滴管垂直加入1滴尿液样本至试纸条的样品垫对应的检测卡加样孔内，孵育5分钟;
d孵育完成后，分析仪对检测卡进行荧光检测，并报告相应的浓度结果；
同时，采用ELISA法对相同的样本进行PSEP检测，作为对比。
进一步的，一种慢性前列腺炎诊断试剂盒，包括上述PSEP荧光层析试纸条。
本发明具有如下有益效果:
本荧光免疫试剂条（盒）提供一种荧光免疫层析双抗夹心法方法，检测尿液中前列腺小体外泄蛋白，作为前列腺炎辅助诊断。检出限低至0.5ng/ml,灵敏度极高，此检测方法简便可靠，整个检测过程只需要5-10分钟。适用于各类检测机构定性或半定量筛查。本试纸条为目前前列腺炎诊断提供一种新颖的非侵入性的无痛快速检验方法。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
所述荧光微球选购字为度生物（VDOBIOTECH）1.材质：含有稀土元素的聚苯乙烯高分子聚合物2.均一度：CV<5%，3.尺寸范围：100nm—200nm，4.表面功能基团：羧基（COOH）；激发波长360nm，发射波长615nm。
实施例1
制备例
一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条，所述试纸包括依序搭接在PVC底板上的样品垫、标记垫、层析条和吸水垫；所述层析条上设置有划线的检测区T和质控区C；所述检测区T包被有抗PSEP抗体二号，质控区C包被有羊抗兔IgG抗体；标记垫包被有荧光标记抗PSEP抗体一号；检测时，尿液样本通过样品垫上样，尿液中的PSEP与标记垫中的荧光标记抗PSEP抗体一号结合形成免疫结合物，该结合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区T，与膜上的抗PSEP抗体二号起反应，经特定波长激发光源激发后产生荧光信号，信号的强弱与样本中PSEP的含量成正比；抗体供应商：美国EliOnco公司，或者（抗体一号根据CN201910932461.5 杂交瘤细胞LCZ8A3及其分泌的单克隆抗体和应用中的制备，抗体二号根据CN201410074972.5 一种前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体与应用 中制备。）
样品垫为玻璃纤维素膜，试纸条的宽度为2mm；T线和C线的间隔为3mm；样品垫与标记垫之间重叠2mm；标记垫与层析条之间重叠1mm；层析条与吸水垫之间重叠2mm；
所述荧光标记抗PSEP抗体一号中，使用荧光微球偶联PSEP抗体一号，荧光微球的粒径为100～200nm，荧光微球的激发波长为280～450nm，发射波长为380～640nm；
所述荧光标记抗PSEP抗体一号由以下步骤制备：
S1.荧光微球初洗：
（1）取固含量1%的荧光微球100μL，装到圆底离心管中；
（2）加入500μL初洗缓冲液，8000g离心30min；
（3）使用移液器缓慢吸取上清；
（4）加入250μL初洗缓冲液，用超声波清洗机超声5min以重悬沉淀；
（5）重复2-3操作，最后一次离心去上清后加入200μL初洗缓冲液超声5min以重悬沉淀；
S2.荧光微球活化：
（1）使用初洗缓冲液配制100mg/mLEDC，100mg/mLNHS，备用；
（2）取200μLEDC溶液加入到离心管中，混匀反应5min，超声3min；
（3）取100μLNHS溶液加入到离心管中，混匀反应15min，超声3min；
S3.偶联抗体：
（1）8000g离心5min，以使荧光微球全部沉淀至离心管底部；
（2）使用移液器缓慢吸取上清；
（3）向圆底离心管中加入500μL偶联缓冲液，用超声波清洗机超声3min以重悬沉淀；
（4）重复上述操作共计3次；
S4.封闭：
（1）偶联反应完成后，将离心管置于超声波清洗机中，超声3min；
（2）加入250μL封闭缓冲液，混匀封闭反应1小时，反应期间每30min将溶液置于超声波清洗机中，超声3min；
（3）封闭反应完成后，将溶液至于超声波清洗机中，超声3min；
S5.终洗：
（1）8000g离心30min，以使荧光微球全部沉淀至离心管底部；
（2）使用移液器缓慢吸取上清；
（3）向圆底离心管中加入500μL终洗缓冲液，用超声波清洗机超声3min以重悬沉淀；
（4）重复上述操作共计3次；
（5）加入终洗液100μL，恢复至荧光微球原体积，超声5min，置于冰箱冷藏，待用。
上述检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1）样品垫的制备：将样品垫用封闭液浸泡后，置于湿度＜20％、温度为55℃的烘箱，干燥12h，然后于2℃密封保存；
2）标记垫的制备：将荧光标记抗PSEP抗体一号用一号包被缓冲液调节至浓度为0.01mg/mL，喷涂在标记垫上，喷量为2μL/cm，喷涂完成后，将标记垫置于湿度＜20％的55℃的烘箱，干燥12h，然后于2℃密封保存；
3）层析条的制备；将抗PSEP抗体二号、羊抗兔IgG抗体分别用二号和三号包被缓冲液调节至浓度为0.1mg/mL；然后分别喷到层析条的检测线T和质控线C上，喷量均为0.1μL/mm；检测线和质控线间隔为3mm，喷涂完成后，将层析条置于湿度＜20％的55℃烘箱，干燥24h，然后于2℃密封保存；
4）试纸条的制备：将制备的样品垫、标记垫、层析条，以及吸水纸依序搭接黏贴在PVC底板上，并切割成2mm宽度的试纸条，即得所述检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条。
所述一号包被缓冲液包括：0.2％的酪蛋白，1％的蔗糖，0.1%海藻糖、0.1％的Tween-20，0.1％的胆酸钠，0.02％的Proclin300，0.05M、pH7.4的PBS缓冲液；
所述二号包被缓冲液包括：0.8％的酪蛋白，3％的蔗糖，0.5%海藻糖、0.1％的Tween-20，0.1％的胆酸钠，0.02％的Proclin300，0.05M、pH7.4的PBS缓冲液；
所述三号包被缓冲液包括：1.5％的酪蛋白，12％的蔗糖，1.5%海藻糖、0.1％的Tween-20，0.1％的胆酸钠，0.02％的Proclin300，0.1M、pH7.4的PBS缓冲液；
所述封闭液包括：1%BSA、3%蔗糖、5%PEG4000、0.5%TritonX-100、pH9.5的0.05M硼砂缓冲液；
所述标记垫为玻璃纤维素膜，所述层析条为反蛋白石结构硝酸纤维素光子晶体薄膜。
实施例2
制备例
一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条，所述试纸包括依序搭接在PVC底板上的样品垫、标记垫、层析条和吸水垫；所述层析条上设置有划线的检测区T和质控区C；所述检测区T包被有抗PSEP抗体二号，质控区C包被有羊抗兔IgG抗体；标记垫包被有荧光标记抗PSEP抗体一号；检测时，尿液样本通过样品垫上样，尿液中的PSEP与标记垫中的荧光标记抗PSEP抗体一号结合形成免疫结合物，该结合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区T，与膜上的抗PSEP抗体二号起反应，经特定波长激发光源激发后产生荧光信号，信号的强弱与样本中PSEP的含量成正比；抗体供应商：美国EliOnco公司，或者（抗体一号根据CN201910932461.5 杂交瘤细胞LCZ8A3及其分泌的单克隆抗体和应用中的制备，抗体二号根据CN201410074972.5 一种前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体与应用 中制备。）。
样品垫为玻璃纤维素膜，试纸条的宽度为3mm；T线和C线的间隔为5mm；样品垫与标记垫之间重叠3mm；标记垫与层析条之间重叠2mm；层析条与吸水垫之间重叠3mm；
所述荧光标记抗PSEP抗体一号中，使用荧光微球偶联PSEP抗体一号，荧光微球的粒径为100～200nm，荧光微球的激发波长为280～450nm，发射波长为380～640nm；
所述荧光标记抗PSEP抗体一号由以下步骤制备：
S1.荧光微球初洗：
（1）取固含量1%的荧光微球100μL，装到圆底离心管中；
（2）加入500μL初洗缓冲液，8000g离心30min；
（3）使用移液器缓慢吸取上清；
（4）加入250μL初洗缓冲液，用超声波清洗机超声5min以重悬沉淀；
（5）重复2-3操作，最后一次离心去上清后加入200μL初洗缓冲液超声5min以重悬沉淀；
S2.荧光微球活化：
（1）使用初洗缓冲液配制100mg/mLEDC，100mg/mLNHS，备用；
（2）取200μLEDC溶液加入到离心管中，混匀反应5min，超声3min；
（3）取100μLNHS溶液加入到离心管中，混匀反应15min，超声3min；
S3.偶联抗体：
（1）8000g离心5min，以使荧光微球全部沉淀至离心管底部；
（2）使用移液器缓慢吸取上清；
（3）向圆底离心管中加入500μL偶联缓冲液，用超声波清洗机超声3min以重悬沉淀；
（4）重复上述操作共计3次；
S4.封闭：
（1）偶联反应完成后，将离心管置于超声波清洗机中，超声3min；
（2）加入250μL封闭缓冲液，混匀封闭反应1小时，反应期间每30min将溶液置于超声波清洗机中，超声3min；
（3）封闭反应完成后，将溶液至于超声波清洗机中，超声3min；
S5.终洗：
（1）8000g离心30min，以使荧光微球全部沉淀至离心管底部；
（2）使用移液器缓慢吸取上清；
（3）向圆底离心管中加入500μL终洗缓冲液，用超声波清洗机超声3min以重悬沉淀；
（4）重复上述操作共计3次；
（5）加入终洗液100μL，恢复至荧光微球原体积，超声5min，置于冰箱冷藏，待用。
上述检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1）样品垫的制备：将样品垫用封闭液浸泡后，置于湿度＜20％、温度为58℃的烘箱，干燥18h，然后于15℃密封保存；
2）标记垫的制备：将荧光标记抗PSEP抗体一号用一号包被缓冲液调节至浓度为0.025mg/mL喷涂在标记垫上，喷量为3μL/cm，喷涂完成后，将标记垫置于湿度＜20％的58℃的烘箱，干燥18h，然后于15℃密封保存；
3）层析条的制备；将抗PSEP抗体二号、羊抗兔IgG抗体分别用二号和三号包被缓冲液调节至浓度为0.25mg/mL；然后分别喷到层析条的检测线T和质控线C上，喷量均为0.15μL/mm；检测线和质控线间隔为5mm，喷涂完成后，将层析条置于湿度＜20％的58℃烘箱，干燥48h，然后于15℃密封保存；
4）试纸条的制备：将制备的样品垫、标记垫、层析条，以及吸水纸依序搭接黏贴在PVC底板上，并切割成3mm宽度的试纸条，即得所述检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条。
所述一号包被缓冲液包括：0.5％的酪蛋白，2.5％的蔗糖，0.25%海藻糖、0.5％的Tween-20，0.25％的胆酸钠，0.035％的Proclin300，0.05M、pH7.4的PBS缓冲液；
所述二号包被缓冲液包括：1％的酪蛋白，5％的蔗糖，1%海藻糖、0.5％的Tween-20，0.25％的胆酸钠，0.035％的Proclin300，0.05M、pH7.4的PBS缓冲液；
所述三号包被缓冲液包括：2％的酪蛋白，15％的蔗糖，2%海藻糖、0.5％的Tween-20，0.25％的胆酸钠，0.035％的Proclin300，0.1M、pH7.4的PBS缓冲液；
所述封闭液包括：1.5%BSA、4.5%蔗糖、8%PEG4000、1%TritonX-100、pH9.5的0.05M硼砂缓冲液；
所述标记垫为玻璃纤维素膜，所述层析条为反蛋白石结构硝酸纤维素光子晶体薄膜。
实施例3
制备例
一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条，所述试纸包括依序搭接在PVC底板上的样品垫、标记垫、层析条和吸水垫；所述层析条上设置有划线的检测区T和质控区C；所述检测区T包被有抗PSEP抗体二号，质控区C包被有羊抗兔IgG抗体；标记垫包被有荧光标记抗PSEP抗体一号；检测时，尿液样本通过样品垫上样，尿液中的PSEP与标记垫中的荧光标记抗PSEP抗体一号结合形成免疫结合物，该结合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区T，与膜上的抗PSEP抗体二号起反应，经特定波长激发光源激发后产生荧光信号，信号的强弱与样本中PSEP的含量成正比；抗体供应商：美国EliOnco公司或者（抗体一号根据CN201910932461.5 杂交瘤细胞LCZ8A3及其分泌的单克隆抗体和应用中的制备，抗体二号根据CN201410074972.5 一种前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体与应用 中制备。）。
样品垫为玻璃纤维素膜，试纸条的宽度为4mm；T线和C线的间隔为7mm；样品垫与标记垫之间重叠4mm；标记垫与层析条之间重叠3mm；层析条与吸水垫之间重叠4mm；
所述荧光标记抗PSEP抗体一号中，使用荧光微球偶联PSEP抗体一号，荧光微球的粒径为100～200nm，荧光微球的激发波长为280～450nm，发射波长为380～640nm；
所述荧光标记抗PSEP抗体一号由以下步骤制备：
S1.荧光微球初洗：
（1）取固含量1%的荧光微球100μL，装到圆底离心管中；
（2）加入500μL初洗缓冲液，8000g离心30min；
（3）使用移液器缓慢吸取上清；
（4）加入250μL初洗缓冲液，用超声波清洗机超声5min以重悬沉淀；
（5）重复2-3操作，最后一次离心去上清后加入200μL初洗缓冲液超声5min以重悬沉淀；
S2.荧光微球活化：
（1）使用初洗缓冲液配制100mg/mLEDC，100mg/mLNHS，备用；
（2）取200μLEDC溶液加入到离心管中，混匀反应5min，超声3min；
（3）取100μLNHS溶液加入到离心管中，混匀反应15min，超声3min；
S3.偶联抗体：
（1）8000g离心5min，以使荧光微球全部沉淀至离心管底部；
（2）使用移液器缓慢吸取上清；
（3）向圆底离心管中加入500μL偶联缓冲液，用超声波清洗机超声3min以重悬沉淀；
（4）重复上述操作共计3次；
S4.封闭：
（1）偶联反应完成后，将离心管置于超声波清洗机中，超声3min；
（2）加入250μL封闭缓冲液，混匀封闭反应1小时，反应期间每30min将溶液置于超声波清洗机中，超声3min；
（3）封闭反应完成后，将溶液至于超声波清洗机中，超声3min；
S5.终洗：
（1）8000g离心30min，以使荧光微球全部沉淀至离心管底部；
（2）使用移液器缓慢吸取上清；
（3）向圆底离心管中加入500μL终洗缓冲液，用超声波清洗机超声3min以重悬沉淀；
（4）重复上述操作共计3次；
（5）加入终洗液100μL，恢复至荧光微球原体积，超声5min，置于冰箱冷藏，待用。
上述检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1）样品垫的制备：将样品垫用封闭液浸泡后，置于湿度＜20％、温度为60℃的烘箱，干燥24h，然后于25℃密封保存；
2）标记垫的制备：将荧光标记抗PSEP抗体一号用一号包被缓冲液调节至浓度为0.05mg/mL喷涂在标记垫上，喷量为4μL/cm，喷涂完成后，将标记垫置于湿度＜20％的60℃的烘箱，干燥24h，然后于25℃密封保存；
3）层析条的制备；将抗PSEP抗体二号、羊抗兔IgG抗体分别用二号和三号包被缓冲液调节至浓度为0.5mg/mL；然后分别喷到层析条的检测线T和质控线C上，喷量均为0.2μL/mm；检测线和质控线间隔为7mm，喷涂完成后，将层析条置于湿度＜20％的60℃烘箱，干燥72h，然后于25℃密封保存；
4）试纸条的制备：将制备的样品垫、标记垫、层析条，以及吸水纸依序搭接黏贴在PVC底板上，并切割成4mm宽度的试纸条，即得所述检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条。
所述一号包被缓冲液包括：1％的酪蛋白，5％的蔗糖，0.5%海藻糖、1％的Tween-20，0.5％的胆酸钠，00.05％的Proclin300，0.05M、pH7.4的PBS缓冲液；
所述二号包被缓冲液包括：1.2％的酪蛋白，10％的蔗糖，1.5%海藻糖、01％的Tween-20，0.5％的胆酸钠，0.05％的Proclin300，0.05M、pH7.4的PBS缓冲液；
所述三号包被缓冲液包括：2.5％的酪蛋白，18％的蔗糖，2.5%海藻糖、1％的Tween-20，00.5％的胆酸钠，0.05％的Proclin300，0.1M、pH7.4的PBS缓冲液；
所述封闭液包括：2.5%BSA、6%蔗糖、10%PEG4000、1.5%TritonX-100、pH9.5的0.05M硼砂缓冲液；
所述标记垫为玻璃纤维素膜，所述层析条为反蛋白石结构硝酸纤维素光子晶体薄膜。
实施例4
试纸条灵敏度分析
灵敏度分析：取前列腺小体外泄蛋白质控品QC1、QC2、QC3、QC4、QC5、QC6、QC7、QC8、QC9，QC10浓度分别为20ng/ml,15ng/ml,10ng/ml,5ng/ml,2.4ng/ml,1.2ng/ml，1.0ng/ml，0.8ng/ml，0.5ng/ml，0.25ng/ml每个样品浓度测试5条，测试时间为15分钟。
测试流程为
a将试纸条装入检测卡中制成诊断试剂盒；
b待检尿液样本恢复至室温，开启免疫荧光分析仪（干式荧光免疫分析仪FIC-Q100中翰盛泰）；
c按分析仪说明书进行操作：用滴管垂直加入1滴尿液样本至试纸条的样品垫对应的检测卡加样孔内，孵育5分钟;
d孵育完成后，分析仪对检测卡进行荧光检测，并报告相应的浓度结果；表1所示为目测判读结果。
表1灵敏度检测结果
结果显示，当检测样品溶液中前列腺小体外泄蛋白的含量≥0.5ng/ml时，试纸条通过免疫荧光分析仪能正常检测判读，而且检出率为100％。结果表明，本发明提供的PSEP荧光层析试纸条大大提高了检测的方便性，且准确率高，具有重要的临床应用价值。
实施例6
临床符合性分析
以试纸条测试结果与列腺小体外泄蛋白通过酶联免疫法定量检测（参照在先专利CN104897900B-一种前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体与应用）的检测结果比较，判断检测结果的一致性。选取临床样本20例，其中10例阳性尿样（编号P），10例P为阴性尿样（编号N）。表2所示为测试结果。
表2临床样本符合性
根据对上述临床样本的测试，可见PSEP荧光层析试纸条检测结果与前列腺小体外泄蛋白通过酶联免疫法定量检测的测试结果阴阳性符合率均为100%，证明其特异性和灵敏度均符合要求，具有很强的实用性。
综合以上实施例可以看出，本荧光免疫试剂条（盒）提供一种荧光免疫层析双抗夹心法方法，检测尿液中前列腺小体外泄蛋白，作为前列腺炎辅助诊断。检出限低至0.5ng/ml,灵敏度极高，此检测方法简便可靠，整个检测过程只需要5-10分钟。适用于各类检测机构定性或半定量筛查。本试纸条为目前前列腺炎诊断提供一种新颖的非侵入性的无痛快速检验方法。
以上所述实施例仅表达了本发明的有限几种优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条，其特征在于，所述试纸包括依序搭接在PVC底板上的样品垫、标记垫、层析条和吸水垫；所述层析条上设置有划线的检测区T和质控区C；所述检测区T包被有抗PSEP抗体二号，质控区C包被有羊抗兔IgG抗体；标记垫包被有荧光标记抗PSEP抗体一号；检测时，尿液样本通过样品垫上样，尿液中的PSEP与标记垫中的荧光标记抗PSEP抗体一号结合形成免疫结合物，该结合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区T，与膜上的抗PSEP抗体二号起反应，经特定波长激发光源激发后产生荧光信号，信号的强弱与样本中PSEP的含量成正比；
样品垫为玻璃纤维素膜，试纸条的宽度为2-4mm；T线和C线的间隔为3-7mm；样品垫与标记垫之间重叠2-4mm；标记垫与层析条之间重叠1-3mm；层析条与吸水垫之间重叠2-4mm；
所述荧光标记抗PSEP抗体一号中，使用荧光微球偶联PSEP抗体一号，荧光微球的平均粒径为100～200nm，荧光微球的激发波长为280～450nm，发射波长 为380～640nm；
所述荧光标记抗PSEP抗体一号由以下步骤制备：
S1.荧光微球初洗：
（1）取固含量1%的荧光微球100μL，装到圆底离心管中；
（2）加入500μL初洗缓冲液，8000g离心30min；
（3）使用移液器缓慢吸取上清；
（4）加入250μL初洗缓冲液，用超声波清洗机超声5min以重悬沉淀；
（5）重复（2）-（3）操作，最后一次离心去上清后加入200μL初洗缓冲液超声5min以重悬沉淀；
S2.荧光微球活化：
（1）使用初洗缓冲液配制100mg/mL EDC，100mg/mL NHS，备用；
（2）取200μL EDC溶液加入到离心管中，混匀反应5min，超声3min；
（3）取100μL NHS溶液加入到离心管中，混匀反应15min，超声3min；
S3.偶联抗体：
（1）8000g离心5min，以使荧光微球全部沉淀至离心管底部；
（2）使用移液器缓慢吸取上清；
（3）向圆底离心管中加入500μL偶联缓冲液，用超声波清洗机超声3min以重悬沉淀；
（4）重复上述（1）-（3）操作共计3次；
S4.封闭：
（1）偶联反应完成后，将离心管置于超声波清洗机中，超声3min；
（2）加入250μL封闭缓冲液，混匀封闭反应1小时，反应期间每30min将溶液置于超声波清洗机中，超声3min；
（3）封闭反应完成后，将溶液至于超声波清洗机中，超声3min；
S5.终洗：
（1）8000g离心30min，以使荧光微球全部沉淀至离心管底部；
（2）使用移液器缓慢吸取上清；
（3）向圆底离心管中加入500μL终洗缓冲液，用超声波清洗机超声3min以重悬沉淀；
（4）重复上述操作（1）-（3）共计3次；
（5）加入终洗液100μL，恢复至荧光微球原体积，超声5min，置于冰箱冷藏，待用；
上述检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1）样品垫的制备：将样品垫用封闭液浸泡后，置于湿度＜20％、温度为55～60℃的烘箱，干燥12～24h，然后于2～25℃密封保存；
2）标记垫的制备：将荧光标记抗PSEP抗体一号用一号包被缓冲液调节至浓度为0.01～0.05mg/mL喷涂在标记垫上，喷量为2～4μL/cm，喷涂完成后，将标记垫置于湿度＜20％的55～60℃的烘 箱，干燥12～24h，然后于2～25℃密封保存；
3）层析条的制备；将抗PSEP抗体二号、羊抗兔IgG抗体分别用二号和三号包被缓冲液调节至浓度为0.1～0.5mg/mL；然后分别喷到层析条的检测线T和质控线C上，喷量均为 0.1～0.2μL/mm；检测线和质控线间隔为3-7mm，喷涂完成后，将层析条置于湿度＜20％的55～60℃烘箱，干燥24～72h，然后于2～25℃密封保存；
4）试纸条的制备：将制备的样品垫、标记垫、层析条，以及吸水纸依序搭接黏贴在PVC底板上，并切割成2～4mm宽度的试纸条，即得所述检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条；
所述一号包被缓冲液包括以下质量分数的组分：0.2～1％的酪蛋白，1％～5％的蔗糖，0.1-0.5%海藻糖、0.1～ 1％的Tween-20，0.1～0.5％的胆酸钠，0.02～0.05％的Proclin300， 0.05M、pH7.4的PBS 缓冲液；
所述二号号包被缓冲液包括以下质量分数的组分：0.8～1.2％的酪蛋白，3％～10％的蔗糖，0.5-1.5%海藻糖、0.1～1％的Tween-20，0.1～0.5％的胆酸钠，0.02～0.05％的Proclin300， 0.05M、pH7.4的PBS 缓冲液；
所述三号包被缓冲液包括以下质量分数的组分：1.5～2.5％的酪蛋白，12％～18％的蔗糖，1.5-2.5%海藻糖、0.1～1％的Tween-20，0.1～0.5％的胆酸钠，0.02～0.05％的Proclin300， 0.1M、pH7.4的PBS 缓冲液；
所述封闭液包括以下质量分数的组分：1-2.5% BSA、3-6%蔗糖、5-10% PEG4000、0.5-1.5% TritonX-100、pH9.5的0.05M硼砂缓冲液；
所述标记垫为玻璃纤维素膜，所述层析条为反蛋白石结构硝酸纤维素光子晶体薄膜。
2.如权利要求1所述的试纸条在制备慢性前列腺炎诊断试剂盒中的应用。
3.一种慢性前列腺炎诊断试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条。
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