KR20060121315A

KR20060121315A - 유사구조 단백질 비율 측정을 이용한 진단장치

Info

Publication number: KR20060121315A
Application number: KR1020050043394A
Authority: KR
Inventors: 남정현; 모효정; 이원진; 한주현; 강희근; 차정학; 장진동; 임은정
Original assignee: 휴마시스 주식회사
Priority date: 2005-05-24
Filing date: 2005-05-24
Publication date: 2006-11-29
Also published as: US20090208983A1; KR101068612B1; EP1883816A4; WO2006126821A1; EP1883816A1; US8101369B2

Abstract

본 발명은 진단 대상에서 채취한 액상 시료 중에 분비되는 단백질 중 유사구조를 가지고 있는 단백질 비율의 진단 장치에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 2 종 이상의 유사구조 단백질에 대하여 동일한 인식부위를 갖는 검출 표식자-항체와 짝을 이루어 각각의 유사구조 단백질을 샌드위치 방법으로 특이하게 인식하는 항체가 고정된 반응부위로 이루어져 있는 진단장치이며, 이를 사용하여 다낭성 난소증후군에서 여포자극호르몬과 황체형성호르몬의 비율, 그리고 비정상임신에서 hCG 이성체의 비율, 그리고 전립선암의 진단에 있어서 전립선특이항원 유사구조 단백질의 비율을 확인하여 다낭성 난소증후군, 비정상임신, 전립선암 등을 조기진단 할 수 있는 진단장치에 관한 것이다.

유사구조 단백질, 다낭성 난소증후군(PCOS), 비정상임신, 전립선암, 여포자극호르몬(FSH), 황체형성호르몬(LH), 인간 융모성 성선자극호르몬(hCG), 전립선 특이단백질

Description

유사구조 단백질 비율 측정을 이용한 진단장치{Diagnose device that used to measure the ratio of protein with similar structure}

도 1는 본 발명의 유사구조 단백질들의 비율 진단방법에 관한 것으로, 유사구조 단백질의 검출과정의 단계를 모식도로 나타낸 것이다. 1은 2종 이상의 유사구조 단백질들이 함유된 시료를 나타내고; 2와 3은 유사구조단백질이 각각의 비율에 따라 항체-검출표식자와 결합하여 결합체를 형성한 것을 나타내고; 4, 5는 유사구조단백질 특이항체가 반응부위에 결합된 후 2,3의 결합체와 각각 샌드위치 반응한 것을 나타내며; 6은 반응부위의 지지부위를 나타낸다.　

도 2a는 본 발명의 진단방법을 사용하여 제조한 면역크로마토그래피 진단장치의 모식도이다. 1은 플라스틱 하우징, 2는 시료투입구, 3은 진단장치의 판독창, 4, 5, 6은 각각 반응 결과선1, 반응 결과선2, 시험종료선(C)을 나타낸다. 　

도 2b는 도 2a의 플라스틱 하우징에 삽입되어 있는 스트립의 모식도이다. 7은 접착지지판, 8은 시료점적패드, 9는 항체-검출표식자 결합체가 함유된 패드, 10은 시료흡수패드, 11, 12는 각각 반응결과선1, 반응결과선2, 그리고 13은 시험종료선을 나타낸다. 　

도 2c는 도 2a의 면역크로마토그래피 진단장치를 사용한 진단판정의 예를 나 타낸 것이다.

도 3은 비정상 임신 진단에 있어서, 검출 항체 쌍을 사용하여 임산부 소변의 완전형 hCG 및 변형 hCG의 웨스턴 블럿분석을 한 결과이다. M은 분자량마커를 나타내고; 항체 1, 2는 각각 변형 hCG 검출항체 1, 2를나타내며; 항체 3, 4는 각각 완전형 hCG 검출항체 1, 2를 나타낸다. 또한 S1은 완전형 hCG 표준품, S2는 베타 hCG 표준품, 1내지 4는 각각 임산부 소변을 나타낸다.

도 4는 다낭성난소증후군의 황체형성호르몬과 여포자극호르몬의 비율측정에 사용되는 항체-검출표식자와 반응부위에 적용된 특이 단일클론항체를 사용한 간접 효소면역측정(indirected ELISA ) 실험 결과의 표준곡선이다.

도 5는 다양한 비율로 제조된 황체형성호르몬 및 여포자극호르몬, 완전형 hCG 및 변형 hCG 시료를 사용한 간접 효소면역측정(indirected ELISA ) 실험결과이다.

도 6은 비정상임신 진단에 있어서, 완전형 hCG 검출 항체쌍 및 변형 hCG 검출 항체쌍을 사용한 간접 효소면역측정(indirected ELISA ) 실험에서 나타난 정상임신 및 비정상임신 시료의 완전형 hCG 및 변형 hCG의 분포결과이다.

도 7은 정상임신 및 자궁외임신 임상소변 및 혈액에 있어서, 변형 hCG 및 완전형 hCG의 비율에 관한 분포도이다.

도 8은 정상임신 및 자궁외임신 임산부를 대상으로 한 변형 hCG 및 완전형 hCG의 비율검사법을 사용하여 검사의 민감도 및 특이도를 나타낸 ROC 곡선 분포이다.

도 9와 도 10은 본 발명의 다낭성난소증후군 진단장치를 사용하여, 다양한 비율의 황체형성호르몬 및 여포자극호르몬 시료를 시험한 결과와 이를 표로 나타낸 것이다.

본 발명은 유사구조를 갖는 단백질이 포함되어 있는 시료 중에서 유사구조 단백질의 비율을 분석하는 진단장치에 관한 것이다.

시료 중의 유사구조 단백질의 분비 비율에 대한 검사방법은, 현재 효소면역분석법(enzyme immunoassay; EIA) 및 방사면역분석법(radio immunoassay; RIA) 등의 방법을 이용하여 각각의 분석물질의 정량적 수치를 확인한 후, 그 비율을 확인하여 질병의 진단에 응용하고 있다.

그러나, 상기 방법들은 서로 다른 에피토프를 인식하는 단일클론항체를 사용하여 분석물질을 정량하기 때문에, 정량값이 분석 방법에 따라 서로 상이할 뿐만 아니라 표준품에 따라서 상이한 수치를 보이고 있는 실정이다. 이와 같이 한 환자의 시료에서 서로 상이한 수치를 이용한 비율의 확인은 오차가 매우 크기 때문에 객관적인 임상적 결과로 활용하기가 매우 힘든 실정이다.

다낭성 난소증후군(polycystic ovary syndrome; PCOS)은 청소년 및 성인에서 각각 5% 내외의 높은 발병율을 보이고 있으며, 가임기 젊은 여성에서 비교적 흔한 질병으로 알려져 있다. 다낭성 난소증후군 환자의 난소는 정상인에 비하여 2∼3배 커져 있으며 약 10여개의 소낭이 존재한다. 정상인 여성에서도 초음파 상에서 약 30%가 다낭성 난소 증상을 보이기도 하지만, 불임 환자를 대상으로 검사를 해보면 약 75% 이상이 다낭성 난소증후군을 가지고 있으며, 반복되는 유산의 원인이 되기도 한다고 보고되고 있다. 또한, 에스트로겐의 계속된 자극에 의한 자궁내막암과 유방암, 여성호르몬 증가에 의한 지질변화로 관동맥 경화증의 빈도가 증가함이 보고 되고 있으며, 인슐린 과다혈증을 동반하여 당뇨병의 빈도가 높다. 또한, 다낭성 난소증후군은 무배란의 가장 흔한 원인이며, 치명적인 합병증이 동반되어 임상적 중요성이 크다.

다낭성 난소증후군은 임상적 증상, 혈액검사 또는 초음파검사에 의하여 진단되고 있는데, 희발 월경이나 무월경 등의 비정상적인 월경이나, 다모증, 비만, 불임 그리고 여드름 등의 임상적 증상과 여성 호르몬의 불균형 등을 확인하여 진단할 수 있다. 이와 같이 다낭성 난소증후군은 청소년기에 적절하게 스크리닝하여 치료하지 않을 경우에는 불임 등의 다양한 합병증을 유발하는 질병이다.

페르티(Pertti) 등은 정상 여성들로부터 다낭성 난소증후군을 구별하는 방법으로, 황체형성호르몬(luteinizing hormone; LH), 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone; FSH), 안드로스텐디온(androstenedione)의 농도를 비교하여 분석한 결과 민감도 98%, 특이도 93%를 보였다고 보고하고 있다(Fertility & Sterility. 1996. 65(3):517~522). 테일러(Taylor) 등에 의하면 다낭성 난소증후군의 75% 이상이 황체형성호르몬 농도가 증가되어 있으며, 황체형성호르몬/여포자극 호르몬의 비율이 증가되어 있는 경우가 94%에 달하였다고 보고하고 있다(J.Clinical Endocrinology & Metabolism. 1997. 82(7):2248~2256). 이와 같이 다낭성 난소증후군의 진단에 있어서 황체형성호르몬과 여포자극호르몬 비율은 의미 있는 결과로 사용되고 있다. 그러나 황체형성호르몬 및 여포자극호르몬의 정량값을 각각 정량분석기를 통하여 정량한 후, 황체형성호르몬/여포자극호르몬 비율을 확인하는 방법은 1차 스크리닝 방법으로는 적절하지 않기 때문에, 한번의 조작으로 다낭성 난소증후군을 조기에 스크리닝하여 위험군을 선별하는 검사법은 현재 없는 실정이다.

한국특허 제0403871호에 의하면 정상임신과 자궁외임신을 진단함에 있어서 완전형 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotrophin; 이하 hCG 라 칭함)과 변형 hCG를 검출하는 단일클론항체의 조합에 의하여 정상임신과 자궁외임신을 진단하는 장치 및 이의 제조방법에 관하여 개시하고 있다. 자궁외임신을 진단함에 있어서 완전형 hCG와 변형 hCG의 비율을 확인하여 시료 중의 유사구조 단백질을 서로 다른 항체 쌍으로 검출하는 방법으로 개시하고 있다. 그러나 상기 한국특허 제0403871호는 각각 서로 다른 단일클론항체의 쌍을 사용하여 유사구조 단백질을 각각 검출하여 그 비율을 측정하는데 중점을 두고 있어, 유사구조 단백질의 비율을 즉시 확인할 수 없다는 문제점이 있다.

또한, 미국특허 제 5,786,220호는 정상임신과 비정상임신을 구별하는 원스텝 진단시약의 제조방법에 관하여 개시하고 있는데, 여성체액 중의 프로게스테론과 hCG의 농도를 동시에 측정함으로써 정상임신, 유산, 자궁외 임신, 암 등을 진단할 수 있다고 기술하고 있다. 즉, 혈액중의 프로게스테론의 농도가 25 ng/ml 이하인 동시에 hCG의 농도가 25~2,500 mIU/ml 일 때에는 자연 유산 및 자궁외 임신으로 진단하며, 프로게스테론의 농도가 25 ng/ml 이상이고 hCG 의 농도가 2,500 mIU/ml 이상일 때에는 정상 자궁내 임신으로 진단하는 방법을 개시하고 있다.

국제공개공보 제0070094호에 의하면, 시료 중 초기임신관련아이소폼(early pregnancy associated molecular isoform; EPMI)과 특이하게 반응하는 항체를 사용하여 영양막(trophoblast) 또는 비영양막 악성종양(non-trophoblast malignancy)의 진단방법에 관하여 개시하고 있다. 상기 국제공개공보 제0070094호에 따르면, 시료 중의 초기임신관련아이소폼과 항체를 반응시켜 시료 중의 초기임신관련아이소폼의 양과 완전형 hCG을 측정하고 이들의 비율을 산출하여, 초기임신에서 정상임신과 유산, 융모성질환과 비융모성질환을 선별할 수 있는 방법을 개시하고 있다.

상기와 같이 공지되어 있는 hCG 농도의 배가시간(doubling time, 임신 5~9 주 사이에 hCG의 혈중농도가 1.4~2일 마다 2배로 증가됨)을 측정하는 방법과 임산부 체액 중의 유리 β hCG 농도를 측정하는 자궁외 임신 진단법은 반복적인 채혈 과정을 거쳐야하는 단점을 가지고 있다. 또한 hCG의 농도 측정과 함께 프로게스테론의 농도 측정을 병행해야 한다는 점에서 본 발명과 진단원리가 상이하고, 정상임신과 비정상임신의 구별은 가능하지만 임산부에게 매우 위험한 질환인 자궁외 임신과 일반적인 자연유산을 초기단계에 효과적으로 구별하기 어렵다는 문제점을 가지고 있다.

한편, 전립선 특이항원(prostate specific antigen; 이하 PSA라 칭함)은 전 립선의 정상 상피세포나 암세포 모두에게서 정상적으로 분비되는 단백질이지만, 정상적인 상황에서는 사정시 응고된 정액을 용해하는 효소이기도 하다. PSA는 정상적으로는 전립선에서만 나타나지만, 종양이나 감염과 같이 정상 전립선의 구조가 파괴되는 상황에서는 혈류에서도 나타난다. 더욱이 전립선염 같은 염증이나 전립선 비대증과 같이 종양이 아니면서 전립선이 커진 상황에서도 혈중의 PSA 수치는 올라간다. 미국 암 협회에 따르면 전립선암은 남자에게서 가장 많이 진단되는 암이라고 보고하고 있으며, 1999년에는 약 179,300건의 전립선암이 진단되었고, 남자에게서 전립선암은 폐암 다음으로 사망률(37,000명)이 높은 암이다. 최근 PSA가 혈청에서 몇 가지 분자구조를 가지고 있다는 것을 발견한 후로 PSA 검사가 빠르게 발전했다. 대부분의 PSA는 혈청에서 다양한 단백질분해효소 저해제(protease inhibitor)인 ACT(Alpha 1 antichymotrypsin), AMG(alpha-2-macroglobulin)들과 결합한다. ACT와 PSA의 복합체는 혈청에서의 주요 구조이며 종종 복합 PSA라고 불린다. PSA 중에도 아무 것에도 붙지 않고 효소적으로 불활성화되어 있는 비복합체 구조로 존재하는 것이 있다. 이것을 유리(free) PSA라고 부른다. PSA 검사는 혈액중의 유리 PSA와 총(total) PSA의 검사를 통하여 이루어지는데, 유리 PSA의 비율은 전립선암의 민감도와 특이도를 증대시킬 수 있는 널리 인정받는 방법임이 밝혀져 있다. 유리 PSA 검출은 직장수지 검사에서는 전립선암이 의심되지는 않지만, 총 PSA 수치가 4.0~10.0ng/ml인 경우 전립선암과 양성질환을 구별할 수 있다는데 의의가 있다. 또한, 전립선암의 가능성은 유리 PSA가 낮을수록 높기 때문에 유리 PSA의 비율 측정으로 불필요한 생검을 20~40% 가량 줄일 수 있으며, 90% 이상의 특이도로 종양을 정확히 검출해 낼 수 있다. 또한 Klaus(Clinical Chemistry. 2000. 46(1) : 47-54) 등에 의하면 PSA-ACT와 유리 PSA의 비율의 검사 역시 전립선암과 양성질환을 구별하는 마커로서 사용된다고 보고하고 있다.

이와 같이 기존의 방법은 2 가지 검사방법을 각각 실시하고 이들의 수치를 비교하여 유사구조 단백질의 비율을 확인하고 있는데, 진단장치의 특성에 따라 절대 수치의 변화가 심하여 표준화를 시킬 수 없다는 문제점이 있다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 유사구조를 갖는 단백질이 포함되어 있는 시료 중에서 유사구조 단백질의 비율을 분석하는 진단장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 시료 중의 유사구조를 갖는 단백질의 비율을 분석하는 진단장치에 관한 것으로서, 본 발명자들은 사람의 체액 중에 분비되는 단백질 중에 유사구조를 가지고 있는 단백질의 비율을 분석하고 이 비율이 질병의 진단에 사용될 수 있음 알고 본 발명을 완성하게 되었다. 즉, 본 발명은 하나의 시료에 존재하는 유사구조 단백질의 농도 비율을 동일한 기준으로 평가할 수 있다는데 유효성이 있으며, 검사방법의 단순화에 따른 검사시간의 단축할 수 있는 장점을 가지고 있다.

본 발명은

a) 2종 이상의 유사구조 단백질들에 대하여 동일한 인식부위를 갖는 1종의 탐식자와 검출표식자가 결합된 1차 탐식자-검출표식자 결합체, 그리고

b) 상기 유사구조 단백질들 각각을 특이적으로 인식하는 유사구조 단백질들 각각에 대한 탐식자들로서 2종 이상의 2차 탐식자들이

짝으로 구성되며,

상기 2차 탐식자들은 각각 서로 다른 위치에 고정되어 있어 이들 전체가 판독부위를 형성하며,

상기 1차 탐식자-검출표식자는 별도의 용기에 담아서 또는 이동상에 의한 이동이 가능한 상태로 멤브레인패드상에 위치시켜 제공되며,

시료 중 상기 유사구조 단백질들의 각각의 양을 측정할 필요없이 1차 탐식자 및 2차 탐식자와 상기 유사구조 단백질들과의 반응결과를 동시 분석하여 상기 유사구조 단백질들의 비율 판독이 바로 가능한 것임을 특징으로 하는, 유사구조 단백질 비율에 의하여 진단이 가능한 질환의 진단장치에 관한 것이다.

본 발명의 진단장치에서 상기 1차 및 2차 탐식자는 단일클론항체, 다클론항체 및 렉틴로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

상기 검출표식자는 방사성동위원소, 효소, 염료, 마그네틱비드, 콜로이달 골드, 세레니움 및 라텍스비드로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하다.

본 발명의 진단장치에서 상기 시료는 진단 대상으로부터 채취된 액상시료인 것이 바람직하다. 액상시료로는 뇨, 타액 또는 혈액 등을 예로 들 수 있다. 분석방법은 예를 들면, 면역크로마토그래피법, 엘리자법(ELISA), 방사면역분석시험법(Radio immunoassay), 응집법(RPHA), 면역센서법(immunosensor)등이 있다.

본 발명의 진단장치는, 분석방법이 면역크로마토그래피법이고,

제1차 패드 및 제2차 패드를 포함하며,

제1차 패드에는 1차 탐식자-검출표식자 결합체가 미리 또는 사용직전에 점적되어 이동상에 의하여 이동이 가능한 상태로서 제공되며,

제2차 패드에는 2차 탐식자들이 각각 독립된 위치에 고정되어 있어 판독부위를 형성하는 것이 바람직하다. 이때 시료점적용 패드와 시료흡수패드를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 면역크로마토그래피법을 이용한 진단장치는

a) 시료가 제1차 패드에 로딩되어 검출대상인 유사구조단백질들을 포함한 유사구조단백질들이 시료중 존재비율에 따라 경쟁적으로 1차 탐식자-검출표식자 결합체와 결합한 후

b) 제2차 패드에 도달하여 검출대상인 유사구조단백질들이 각각 해당 2차 탐식자에 결합하여 각각 정해진 2차 탐식자의 위치에 나타난 검출표식자의 신호에 의하여 검출대상인 유사구조단백질들의 비율을 판독함을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 진단장치는, 분석방법이 엘리자법이고,

2차 탐식자들이 각각 독립적으로 고정되어 있는 각각의 웰들과 1차 탐식자-검출표식자 결합체가 담겨서 제공되는 용기를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 엘리자법을 이용한 진단장치는

a) 시료를 1차 탐식자-검출표식자 결합체 용기에 주입하여 검출대상인 유사구조단백질들의 시료중 존재비율에 따라 이들이 경쟁적으로 1차 탐식자-검출표식자 결합체와 결합한 후

b) 1차 탐식자-검출표식자와 결합된 유사구조단백질 결합체를 2차 탐식자들이 고정되어 있는 각각의 웰들에 각각 주입하여, 시료중 검출대상인 유사구조단백질들이 해당 2차 탐식자에 결합되어 해당 웰에 고정되도록 한 후 나타나는 검출 표식자의 신호로부터, 각각 웰에 고정된 유사구조단백질의 상대 비율을 판독함을 특징으로 한다.

본 발명의 진단장치에서 유사구조 단백질 비율에 의하여 진단이 가능한 질환은 예를 들면 첫번째로 다낭성난소증후군이 있으며, 이때 유사구조 단백질은 황체형성호르몬과 여포자극호르몬이 된다.

본 발명에 따르는 다낭성난소증후군 진단장치에서,

1차 탐식자는

황체형성호르몬과 여포자극호르몬의 동일 부위를 인식하는 단일클론의 또는 다클론의 항-황체형성호르몬 항체 또는 항-여포자극호르몬 항체이며;

2차 탐식자들은

황체형성호르몬와 여포자극호르몬의 각각에 대하여 특이적인 부위를 인식하는 각각의 항체인 항 황체형성호르몬 단일클론항체와 항 여포자극호르몬 단일클론항체일 수 있다.

또한 본 발명의 진단장치에서 유사구조 단백질 비율에 의하여 진단이 가능한 질환은 예를 들면 두번째로 비정상임신, 자궁외임신 또는 유산이며, 이때 유사구조 단백질이 완전형 hCG와 변형 hCG가 된다.

상기 변형 hCG는 분자량 약 26kDa의 사람 태반성 융모성선자극호르몬(hCG) 관련 단백질인 것이 바람직하다.

본 발명에 따르는 비정상임신, 자궁외임신 또는 유산 진단장치에서,

1차 탐식자는

완전형 hCG와 변형 hCG의 베타 서브유닛의 동일부위를 인식하는 단일클론의 또는 다클론의 항β-hCG 항체이며;

2차 탐식자들은

완전형 hCG와 변형 hCG의 각각에 대하여 특이적인 부위를 인식하는 각각의 항체인 항 완전형 hCG 단일클론항체와 항 변형 hCG 단일클론항체일 수 있다.

또한 본 발명의 진단장치에서 유사구조 단백질 비율에 의하여 진단이 가능한 질환은 예를 들면 세번째로 전립선암 또는 전립선비대증이며, 이때 유사구조 단백 질이 유리 PSA와 PSA-ACT가 된다.

본 발명에 따르는 전립선암 또는 전립선비대증 진단장치에서,

1차 탐식자는

유리 PSA와 PSA-ACT의 동일 부위를 인식하는 단일클론의 또는 다클론의 항 PSA 항체이며;

2차 탐식자들은

유리 PSA와 PSA-ACT의 각각에 대하여 특이적인 부위를 인식하는 각각의 항체인 항 유리 PSA 단일클론항체와 항 PSA-ACT 단일클론항체일 수 있다.

본 발명의 기본 원리는 면역학적 분석 방법 중 샌드위치 방법을 이용한 분석 방법이며, 이러한 분석 방법에 사용되는 항체는 분석하고자 하는 시료의 민감도 및 특이도를 결정하기 때문에 항체의 선별 사용이 매우 중요하다. 샌드위치 분석법에는 주로 두 종의 항체를 사용하게 되는데 이 두 종의 항체는 항원에 대한결합 위치가 각기 다른 곳에 존재해야만 그 민감도를 유지할 수 있다. 만약 사용되는 두 항체와 항원과의 결합부위가 유사하거나 근접된 곳에 있으면 구조적 방해(steric hindrance)로 인하여 민감도가 떨어지게 된다.

더욱 상세하게는 본 발명은, 2종 이상의 유사구조 단백질에 대하여 동일한 인식부위를 갖는 항체, 그리고 2종 이상의 유사구조 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 사용함을 특징으로 하며; 유사구조 단백질의 동일한 부위를 인식하는 항체는 검출표식자가 결합되어 있고, 유사구조 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 적당한 반응부위에 고정되어 있다. 즉 유사구조 단백질이 포함된 시료가 첨가되면 동일부위를 인식하는 항체가 유사구조 단백질의 비율에 따라 결합하고, 유사구조 단백질 특이 단일클론항체가 각각 시료 중의 비율에 따라 샌드위치 형태로 결합하여 시료 중의 유사구조 단백질의 비율을 분석하는 진단장치에 관한 것이다. 또한 검출표식자와 결합하여 유사 구조단백질의 동일한 인식부위를 인식하는 항체는 단일 클론항체 또는 유사구조 단백질 모두를 인식하는 다클론항체이고, 시료로 진단 대상으로부터 채취된 뇨, 혈액 등 체액을 이용한다.

본 발명은 상기 검출표식자로서 방사성동위원소, 효소, 염료, 마그네틱비드, 콜로이달 골드, 세레니움 및 라텍스비드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 이용할 수 있고, 면역크로마토그래피, 엘리자법(ELISA), 방사성동위원소법(Radio immunoassay), 응집법(RPHA), 면역센서(immunosensor) 를 이용하여 진단할 수 있다.

상기 본 발명의 진단 장치을 사용하여, 다낭성 난소증후군에서 여포자극호르몬(FSH)과 황체형성호르몬(LH) 농도의 비율; 비정상임신(failed pregnancy)에서 완전형 hCG와 변형 hCG의 비율; 또는 전립선암(prostatic carcinoma)의 진단에 있어서 전체 전립선 특이단백질과 자유 전립선 특이단백질의 비율을 확인하여, 다낭성 난소증후군, 비정상임신 또는 전립선암 등을 조기진단할 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예는, 유사구조 단백질의 동일한 에피토프를 인식하는 단일클론항체와 이와 쌍을 이루어 유사구조 단백질의 서로 다른 특이적인 에피토프를 인식하는 단일클론항체를 이용한 방법으로서, 동일한 에피토프를 인식하는 단일클론항체는 착색미립자 또는 효소 등의 신호발생물질이 결합되어 있고, 서로 다른 에피토프를 인식하는 단일클론항체는 고체표면에 부착되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 사용될 수 있는 착색미립자로서 예를 들면 폴리스티렌 입자, 콜로이달 골드 등 다양한 미립자가 있는데, 이들 중에서 콜로이달 골드가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 20 내지 60 nm 크기의 콜로이달 골드이다.

상기 본 발명의 진단장치에 시료를 첨가하면 시료 중에 존재하는 각각의 유사구조 단백질이 각각의 비율에 따라 단일클론항체에 결합하게 되고, 각각의 유사구조 단백질에 결합된 단일클론항체-착색미립자가 고체표면에 부착되어 있는 각각의 유사구조 단백질의 다른 에피토프를 인식하는 단일클론항체와 시료 중에 존재하는 비율에 따라 각각 결합한다. 이와 같이 서로 다른 에피토프를 인식하는 단일클론항체에 결합된 유사구조 단백질은 그 존재량에 따라 각각 확인되어 결국에는 시료 중에 존재하는 유사구조 단백질의 비율을 확인할 수 있게 되는 것이다.

이러한 본 발명의 진단장치는 적어도 3종 이상의 단일클론항체, 즉 유사구조 단백질에 동일한 에피토프를 인식하는 단일클론항체 1종과 유사구조 단백질의 특이적인 서로 다른 부위를 인식하는 2종의 서로 다른 단일클론항체를 사용함을 특징으로 한다.

본 발명의 시료 중에 존재하는 유사구조 단백질은 적어도 1개 이상의 동일한 에피토프를 가지고 있으며, 2개 이상의 각각의 단백질에 특이적인 서로 다른 에피토프를 가지고 있는 유사구조 단백질임을 특징으로 한다. 이와같은 유사구조 단백질로는, 예를 들어 인간 융모성 성선자극호르몬의 완전형(intact) hCG와 변형 hCG, 황체형성호르몬과 여포자극호르몬, PSA-ACT와 유리 PSA가 있다.

본 발명의 진단장치는 유사구조, 즉 2개 이상의 항체를 인식하는 에피토프를 갖는 유사항원의 비율의 진단에 이용될 수 있으며, 예를 들면 다낭성 난소증후군에 있어서 황체형성호르몬 및 여포자극호르몬의 비율의 검사 그리고 비정상임신의 진단에 있어서 완전형 hCG와 변형 hCG 비율의 검사 그리고 전립선암의 진단에 있어서 PSA-ATS와 유리 PSA의 비율의 검사 등에 사용될 수 있다. 그러나 본 발명의 진단방법을 이용한 진단의 예가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 진단장치는 검출표식자와 결합되어 있는 유사호르몬의 동일부위를 인식하는 항체가 시료 내에 존재하는 유사호르몬의 비율에 따라 각각 결합하게 되면 검출표식자-항체-유사호르몬 결합체가 판독부위에 있는 각각의 유사호르몬에 특이적인 단일클론항체와 결합하게 되어 시료에 포함되어 있는 유사호르몬의 농도를 즉시 검사할 수 있게 된다는 판단 하에 예의 연구를 거듭한 결과 황체형성호르몬과 여포자극호르몬의 비율을 검사하여 다낭성 난소증후군을 조기스크리닝 할 수 있으며, 완전형 hCG와 변형 hCG 비율을 검사하여 자궁외임신 등의 비정상임신을 조기 스크리닝 할 수 있고, PSA-ATS와 유리 PSA 비율을 검사하여 전립선암의 진단에 있 어서 전립선암과 전립선비대증의 여부를 판단하여 심각한 부작용을 초래하는 불필요한 조직 생검을 줄일 수 있는 방법으로 유용하다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서는 유사구조 단백질의 동일부위를 인식하는 하나의 항체를 사용하여, 시료 중에 포함되어 있는 각각의 유사구조 단백질이 비율에 따라 자발적으로 반응하므로 유사구조 단백질의 비율을 확인할 수 있다. 즉, 시료 중에 존재하는 완전형 hCG와 변형 hCG의 비율에 의하여 결합체의 양이 차이가 나고 종국적으로는 유사구조 단백질의 비율이 즉시 확인될 수 있다는 점에서 구별될 수 있다.

또한 전립선암의 진단에 대하여 본 발명에서와 같이 만들어진 진단장치를 사용할 경우에 PSA-ACT와 유리 PSA의 비율을 한번의 조작으로 검사할 수 있으며 이를 통하여 전립선암으로 부터 양성질환을 구별하여 불필요한 조직생검의 비율을 줄일 수 있는 진단법으로 사용할 수 있다.

본 발명의 진단장치를 사용하여 상기 유사호르몬의 비율을 진단하는 방법은 다음과 같다. 본 진단장치의 예는 하기의 예에 국한되는 것이 아니며, 이는 단지 본 발명의 이해를 쉽게 하기 위하여 설명하는 것이다.

본 발명의 진단장치의 구성 및 작용원리를 도 1 내지 도 10으로 예를 들어 설명한다. 도 1는 본 발명의 유사구조 단백질들의 비율 진단방법에 관한 것으로, 유사구조 단백질의 검출과정의 단계를 모식도이고, 도 2a는 본 발명의 하나인 면 역크로마토그래피 진단장치의 모식도이다. 또한 이 진단장치는 판독부위가 1개 이상 구성되어 있으며, 판독부위에는 유사 구조단백질의 서로 다른 인식부위를 인식하는 특이 항체로 이루어져 있다.

　　본 발명의 진단장치 중에서 면역크로마토그래피를 이용한 진단장치의 한가지 예는 도 2a에서와 같으며 검사를 수행할 수 있는 진단용 스트립을 적당한 플라스틱 하우징(1)에 넣어 만든다. 플라스틱 하우징은 (2)의 시료투입구와 (3)의 결과표시창이 있으며, (4), (5)의 결과반응라인과 (6)의 시험종료선으로 구성되어 있다. 이와 같이 플라스틱 하우징에 조립되는 스트립은 도 2b와 같이 7의 적당한 플라스틱 판 위에 니트로셀루로오스 멤브레인을 붙이고 서로 다른 유사단백질들에 각각 특이하게 반응하는 2종의 단일클론항체(11과 12)와 검사결과의 정도검사를 실시할 수 있는 종료선(13)을 고정하였다. 그리고 유사구조단백질의 동일 부위에 결합하여 2종 이상의 유사구조 단백질과 동시에 결합할 수 있는 항체-검출표식자 결합체가 함유된 항체-검출표식자 패드(9)가 접착되어 있다. 본 발명의 진단장치를 활용하여 유사구조단백질 등이 포함되어 있는 검체를 도 2a의 시료투입구(2)에 투입하게 되면 항체-검출표식자와 유사단백질 들이 각각 결합체를 형성하고, 이 결합체가 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 고정된 (11) 및 (12)에 각각 시료중의 유사구조 단백질의 존재 비율에 따라 결합하여 결합된 양에 따라 발색되게 된다. 이와같이 결합된 반응선은 도 2c에서와 같이 검체에 검출대상 단백질이 없으면 결과라인에 선이 나타나지 않고, 만일 유사단백질이 존재하면 결과라인에 유사구조단백질의 분비비율(2, 3, 4)에 따라 선이 나타나게되어 비율을 확인할 수 있게 되는 것이다.　

따라서 본 발명의 다낭성난소증후군 진단장치의 경우에 LH/FSH 비율이 2.0 이상일 경우 다낭성난소증후군으로 진단할 수 있기 때문에 FSH의 반응감도를 LH 반응감도에 비하여 2배 높여, 만일 LH/FSH 비율이 2.0 이면 발색비율이 동등하게 나타날 수 있게 설계하였다. 따라서 도 2c의 (2) 내지 (3)은 LH/FSH 비율이 2.0 이상으로 판독하여 다낭성난소증후군으로 진단할 수 있으며, 도 2c의 (4)의 경우에는 LH/FSH 비율이 2.0 미만으로서 정상으로 진단할 수 있게 설계되었다.　

　또한 본 발명의 다른 한가지 예인 비정상임신의 진단 장치의 경우에는, 완전형 hCG 및 변형 hCG에 대하여 동일한 에피토프를 인식하는 단일클론항체에 착색미립자 및 효소 등의 표식자를 결합시킨 단일클론항체 표식자 결합체를 제조하였다. 이 단일클론항체-표식자 결합체는 2종 이상의 유사호르몬 즉, 완전형 hCG 와 변형 hCG에 대하여 동일한 에피토프를 인식하여 모두 결합하게 된다. 면역크로마토그래피법에서는 멤브레인 패드 표면에 완전형 hCG 만을 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 적용하여 고정시키고, 또 변형 hCG 만을 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 고정시켰다. 이와 같이 제조된 진단장치에 시료가 첨가되면 시료중의 완전형 hCG 및 변형 hCG의 존재 비율에 따라 각각 단일클론항체 표식자 결합체와 결합하게 된다. 비율에 따라 결합된 단일클론항체-표식자-hCG 결합체는 이동하여, 멤브레인에 고정되어 있는 완전형 hCG에 특이적인 단일클론항체와, 변형 hCG에 특이적인 단일클론항체와 각각 결합하게 된다. 이와 같이 결합된 농도에 따라 유사구조단 백질의 비율을 원스텝으로 진단할 수 있게 되는 것이다.

또 다른 한가지 예 전립선암 진단장치의 경우에는, free PSA와 PSA-ACT 비율의 진단에 있어서 free PSA와 PSA-ACT를 모두 검출할 수 있는 다클론항체를 검출표식자와 결합시켰다. 판독부위의 결과선1에는 free PSA에 특이적인 단일클론항체를 고정시켰으며, 결과선2에는 PSA-ACT에 특이적인 단일클론항체를 고정시켰다. 이와 같이 제작된 진단장치로 시료를 검사하여 free PSA와 PSA-ACT 비율을 측정할 수 있다.　　

본 발명의 진단장치에 적용한 항체는 하기에 기재된 표 1에서와 같이 다낭성난소증후군의 진단장치에서는 검출표식자 결합항체로서 황체형성호르몬 및 여포자극호르몬의 동일부위에 결합할 수 있는 항α-황체형성호르몬 항체 및 항α-여포자극호르몬 항체중에서 선택된 1종을 사용하였고; 반응부위 고정항체는 항완전형-황체형성호르몬 단일클론항체 및 항완전형-여포자극호르몬 단일클론항체를 각각 사용하여야만 한다.

또한 완전형 hCG와 변형 hCG의 비율을 진단하는 진단장치에 있어서는 완전형 hCG와 변형 hCG의 동일인식부위를 인식하는 항β-hCG 항체를 검출표식자에 사용하고; 반응부위 고정항체로는 항완전형-hCG와 항변형-hCG에 각각 특이적인 단일클론항체를 사용한다.

전립선암 진단에 있어서는 검출표식자 결합항체로서 항-PSA 단일클론항체를 사용하였고, 반응부위 고정항체로는 항-free PSA 항체와 항 PSA-ACT 항체를 고정하였다. 이와같이 적용된 항체 쌍을 사용하여 다낭성난소증후군, 비정상임신(자궁외 임신), 전립선암의 조기스크리닝에 활용할 수 있다. 　

유사 구조단백질의 비율 진단장치에 적용된 항체

진단명	검출표식자 결합항체	반응부위 1 고정항체	반응부위 2 고정항체
다낭성 난소증후군	항 α-여포자극호르몬 항체, 또는 항 α-황체형성호르몬 항체	항 완전형-황체 형성호르몬 항체	항 완전형-여포 자극호르몬 항체
비정상임신	항 β-hCG 항체	항 완전형-hCG 항체	항 변형-hCG 항체
전립선암	항 PSA 단일클론항체	항 유리 PSA 항체	항 PSA-ACT 항체

본 발명의 진단장치가 유사구조단백질의 비율을 검사하는 모든 면역측정법에 활용될 수 있음은 본 업계에 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다. 　

더욱 상세하게는, 본 발명은 사람의 체내에서 유사구조를 갖는 유사구조 단백질을 동일한 비율로 결합하는 한 종류의 항체를 사용하여 유사구조 단백질 각각의 비율에 따라 결합시키는 단계 및 유사구조 단백질 각각에 매우 특이적인 단일클론항체를 사용하여 유사구조 단백질의 비율을 특이적으로 검출하는 진단장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명에 의하면, 다낭성 난소증후군 환자의 체액에서 유사 구조를 갖는 여포자극호르몬과 황체형성호르몬의 농도의 비율을 확인할 수 있으며, 비정상임신에 있어서 완전형 hCG와 변형 hCG 비율을 즉시 각각 확인할 수 있고, 전립선암에 있어서 PSA-ACT와 유리 PSA의 비율을 확인하여 전립선암을 진단하는 동시에 전립선암과 전립선비대증을 선별할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 단일클론항체의 제조

본 발명에 사용된 단일클론항체는 본 발명에서 제조하여 사용하거나 상용 단일클론항체를 사용할 수도 있다. 면역 및 세포융합은 공지된 세포 융합(cell fusion) 방법(Galfre, G 등 1981, Methods Enzymol. 73:3-46)을 사용하였다. 먼저 8주령의 Balb/C 마우스를 준비하여 FSH, LH, 완전형-hCG, 변형-hCG, free PSA, PSA-ACT를 각각 20㎍/100㎕와 Freund's 완전 보조액 100㎕를 완전히 유화시켜 1차 복강 주사하고, 같은 방법으로 3주 뒤에 프로인트(Freund's) 불완전 보조액 100㎕와 유화하여 2차 복강 주사하였다. 1주일 후 마우스로부터 채혈하여 항체 형성 여부를 면역효소측정법으로 확인한 다음, 상기 단백질들을 20㎍씩 각각 꼬리에 정맥주사하였다. 3일 뒤 마우스의 비장 세포를 취하여 미리 배양된 Sp2/O 세포와 PEG를 이용하여 융합시킨다. 융합된 세포를 HAT 배양액에 첨가하고 96 웰에서 배양하면서 적당한 항체를 분비하는 세포를 선별하였다. 대량으로 배양된 배양액을 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상층액을 모아 단백질 A 세파로즈(proteion A-sepharose, FF)에 통과시키고 인산염 완충액으로 세척한 다음 0.1M 글리신 완충액으로 용출 시켰다. 용출액을 인산염 완충액으로 투석하고 농도를 조정하여 진단장치의 제조에 사용하였다.

실시예 2. 단일클론항체의 특성분석

가. 간접면역효소측정법(Indirected ELISA)에 의한 특성분석

본 발명에 사용된 각 항체들의 반응특성을 설명하기 위하여 간접면역효소측정법을 이용하였다. 마이크로티터 96웰 플레이트에서 각 유사호르몬들을 1㎍/well 농도의 인산염 완충액(phosphate buffered saline)으로 코팅버퍼(coating buffer, 0.1M carbonate buffer, pH= 9.5)에 희석하여 100㎕씩 첨가하고 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 면역 와셔(immuno washer)로 제거하고 세척용액(phosphate buffered salne, 0.05% Tween 20, 0.1% sodium azide)으로 3회 세척한 후 차단 용액(blocking solution, 0.2% casein/PBS)을 300㎕씩 첨가하여 실온에서 3시간 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 세척용액으로 3회 세척하였다. 그런 다음 본 발명의 단일클론항체-HRP(horsered peroxidase) 컨쥬게이트를 각각 1 ㎍/well 및 2 ㎍/well이 되도록 각 well에 100㎕씩 첨가한다. 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 첨가한 HRP-컨쥬게이트 용액을 버리고 세척용액으로 3회 세척하였다. HRP 서브스트레이트 키트(Bio-Rad, USA)의 발색시약을 100㎍/well씩 첨가하여 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 종말 용액(stop solution, 3% oxalic acid)을 100㎕/well 첨가하고 자동 엘리자 판독기(automatic ELISA reader, Bio-Rad, USA)에서 A₄₅₀를 측정하였다.

표 2에서는 본 발명에서 제조된 단일클론항체의 특성에 대하여 개시하고 있으며, 표 2에 개시된 항체의 특성이 본 발명의 범위를 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 단일클론항체를 이용한 진단장치의 제조에 있어서 각 항체들의 적용부위는 변형시켜 사용 할 수 있으며, 검출표식자 결합항체를 제외한 반응부위 1 및 2 고정항체는 서로 바꾸어 사용할 수 있으며 이에 따라 진단장치의 성능에 영향을 미치지 않는다.

Indirected ELISA에 의한 항체쌍의 반응특성 비교

진단명	구 　분	검출표식자 결합항체	반응부위1 고정항체	반응부위 2 고정항체
다낭성난소증후군	항체명	항-αFSH 또는 αLH 항체	항-완전형-LH 항체	항-완전형-FSH 항체
다낭성난소증후군	반응특성　 (%)	α-FSH(100%) 　 α-LH(100%) 　 β-FSH(<1%) 　 β-LH(<1%) 　 TSH(<1%)	FSH(100%) 　 LH(<1%) 　 TSH(<1%)	FSH(<1%) 　 LH(100%) 　 TSH(<1%)
비정상임신	항체명	항-βhCG 항체	항 완전형-hCG 항체	항 변형-hCG 항체
비정상임신	반응특성　 (%)	I-hCG(100%), 　 변형 hCG(100%), 　 LH(<1%), 　 TSH(<1%), 　 FSH(<1%)	i-hCG(100%), 　 변형 hCG(<10%) 　　 LH(<1%), 　 TSH(<0.1%) 　　 FSH(<1%)	i-hCG(<1%), 　　 변형 hCG(100%) 　 LH(<1%), 　 TSH(<0.1%) 　 FSH(<1%)
전립선암	항체명	항-PSA 항체	항-free PSA 항체	항 PSA-ACT 항체
전립선암	반응특성　 (%)	free PSA(100%)　 PSA-ACT(100%)	free PSA(100%) 　 PSA-ACT(<1%)	free PSA(<1%)　 PSA-ACT(100%)

나. 웨스턴 블럿 분석(Western blot analysis)에 의한 특성 분석

본 발명의 완전형 hCG와 변형 hCG의 비율검사를 통하여 비정상임신 진단장치에 적용된 항체들이 임산부 체액 중의 완전형 hCG 및 변형 hCG의 검출여부를 확인하기 위하여, 완전형 hCG 표준품(S1), 베타 hCG 표준품(S2) 그리고 동일한 정상임산부의 소변(1, 2, 3, 4)을 SDS-겔 전기영동을 실시하고 니트로셀룰로오스멤브레인에 전이시킨 다음, 완전형 hCG 및 변형 hCG의 비율진단에 사용된 단일클론항체(항체1, 2, 3, 4)들을 각각 결합시켰다. 그런 다음 2차항체(goat anti-mouse IgG-HRP)를 결합시키고, 발색시약을 사용하여 단일클론항체와 결합된 단백질 밴드를 확인하였다.

도 3에서와 같이, 변형 hCG를 검출하는 항체 쌍을 각각 반응시킨 항체1 내지 항체2에서는 변형 hCG 만이 반응하였고; 완전형 hCG 검출 항체인 항체 3 내지 항체4를 반응시킨 경우에는, 완전형 hCG가 2가지 항체에서 공통적으로 반응하여 각 단일클론항체들이 각각 변형 hCG 내지 완전형 hCG를 특이적으로 검출함을 확인할 수 있었다. 나아가 특히 변형 hCG로서, 임산부의 소변에서 약 26 kDa 크기의 hCG 관련 단백질을 검출하여 반응시킨 경우에 보다 명확하게 비정상임신 여부를 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 약 26 kDa 크기의 hCG 관련 단백질을 비정상임신 진단에 특이적으로 활용하는 경우에 다른 분자량의 단백질보다 반응성이 커서 한 번의 시험으로 보다 명확하게 결과를 알 수 있다는 것을 의미하므로, 이에 대한 특이적인 단일클론항체를 제조, 사용하는 경우에 산업적 이용 가능성이 크다고 할 수 있다.

실시예 3 면역효소측정(ELISA) 진단장치에 의한 특성 분석

가. 면역효소측정(ELISA) 진단장치에 의한 유사단백질 비율의 검증

유사단백질 비율을 진단하는데 있어서 면역효소측정(ELISA) 진단장치는 2개의 반응웰(시료웰1, 시료웰2)에 분석하고자 하는 유사호르몬 각각을 특이적으로 감지하는 단일클론항체들을 고정하였다. 그리고 2개의 유사호르몬의 공통부위를 인식하는 항체, 즉, 다낭성난소증후군 진단에 있어서는 항-α-FSH/LH 단일클론항체, 비정상임신진단에 있어서는 항-β-hCG 단일클론항체, 전립선암 및 전립선비대증 진단에 있어서는 항-PSA 단일클론항체를 HRP(horse radish peroxidase)와 각각 결합시켜 단일클론항체-검출표식자 결합체를 제조하였다. 시료웰1과 시료웰2에는 다낭성난소증후군 진단장치에 관해서는 항-β-FSH 단일클론항체와 항-β-LH 단일클론항체를 사용하였으며; 비정상임신의 진단에 대해서는 완전형-hCG 단일클론항체와 변형-hCG 단일클론항체을 사용하였고; 전립선암 진단장치에서는 항-유리 PSA 단일클론항체와 항-PSA-ACT 단일클론항체를 사용하였다. 이 단일클론항체들을 각각 코팅 버퍼(coating buffer, 0.1M carbonate buffer, PH=9.5)에 10㎍/㎖, 20 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 100㎕씩 첨가하고 37℃에서 2시간 반응시킨 후 세척용액(phosphate buffered salne, 0.05% Tween 20, 0.1% sodium azide)으로 3회 세척하고, 차단용액(blocking solution, 0.2% casein/PBS)을 300㎕씩 첨가하여 실온에서 3시간 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 세척용액으로 3회 세척하고 건조하여 유사 단백질 비율의 진단장치에 관한 엘리자 키트를 제조하였다.

이와같이 제조된 간접효소면역측정(indirected ELISA )진단장치 중에서 다낭성난소증후군 진단장치의 경우에는 도 4에서와 같이 항-α-FSH/LH 항체와 항 완전형-LH 항체 쌍, 항-α-FSH/LH 항체와 항-완전형-FSH 항체 쌍을 각각 사용하여 다양한 농도의 황체형성호르몬 및 여포자극호르몬을 검사한 결과에서, hLH 항체쌍은 hLH 만을 검출하였고, hFSH 항체쌍은 hFSH 만을 검출하였다.

도 5에서와 같이 유사비율 단백질인 LH/FSH 비율과 변형 hCG/완전형 hCG 비율을 다양하게 제조하여 만든 검체에서도 다낭성난소증후군 및 비정상임신 진단장치에 적용된 항체쌍이 모두 정확하게 유사비율 단백질의 비율을 검출하였다.

나. 비정상임신 진단에 있어서 변형 hCG 비율 검증

임산부 중에서 비정상임신의 선별검사를 위한 변형 hCG의 농도분포 및 임상적 유효성을 확인하기 위하여 완전형 hCG 검출 항체쌍 및 변형 hCG 검출 항체쌍을 사용한 샌드위치 엘리자(sandwich ELISA)법을 실시하였다. 정상임신 및 자궁외임신 임산부 검체에서 정상임신군 40예는 불임클리닉 또는 산전 클리닉에서 초음파 검사상 자궁내 임신낭이 확인된 환자중 추적 관찰중 태아 심박음이 확인된 환자를 대상으로 하였고, 추적관찰중 계류유산, 불완전 또는 완전 유산된 환자는 대상군에서 제외하였다. 자궁외 임신군 25예는 외부병원으로부터 자궁외 임신 의증하에 전원되거나, 불임클리닉 또는 산전클리닉에서 추적 관찰중 자궁내 임신낭이 확인되지 않은 환자중 복강경 수술 후 조직 검사상 자궁외 임신으로 진단된 환자를 대상으로 하였다.

검체의 채취는 정상임신군의 경우 초음파 검사상 처음으로 자궁내 임신낭이 확인된 시기에 소변을 채취하였으며, 자궁외 임신의 경우 복강경 검사상 자궁외 임신이 육안적으로 확인된 시점을 기준으로 하여 환자로부터 소변 및 혈액을 각각 50cc 및 3cc 채취하여 실험전 미리 영하 20℃로 냉동 보관하여 둔 후 소변 및 혈액의 완전형 hCG 및 변형 hCG를 측정하였다.

도 6에서와 같이 정상임신 소변에서 완전형 hCG 및 변형 hCG는 각각 486 ±19.9ng/ml, 149 ±10.2ng/ml이며, 혈액에서는 1,018 ±50.3ng/ml, 468 ±51.6ng/ml이었다. 또한 자궁외임신 소변에서 완전형 hCG 및 변형 hCG는 각각 160 ±27.4ng/ml, 14.1 ±6.6이며, 혈액에서는 350 ±17.5ng/ml, 35.9 ±17.5ng/ml이었다. 본 결과는 자궁외임신에서의 변형 hCG가 정상임신에 비하여 유의하게 감소된 결과를 보여주었다.

도 7에서는 정상임신 및 자궁외임신의 소변 및 혈액에서 변형 hCG 및 완전형 hCG의 분비비율을 나타낸 모식도로서 각 검체에서 분비비율이 유의하게 차이를 보여 정상자궁내임신군과 자궁외임신군을 적절하게 구분하여 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.

표 3에서는 임상시험군에 있어서 변형 hCG 및 완전형 hCG 농도분포 및 분비비율에 대한 종합적인 결과를 나타내고 있다.

비정상임신(자궁외임신) 진단에 있어서 변형 hCG 및 완전형 hCG 농도분포 비교

구 　분	정상자궁내임신　 (개체수 = 40)	자궁외임신　 (개체수 =25)	p value
나이(세)	29.5±0.43	29.8±0.75	NS(0.68)
최종 월경후 경과일(일)	50.2±1.23	48.6±1.65	NS(0.49)
혈액 완전형 hCG(ng/mL)	1,018±50.3	350±59.4	<0.001
혈액 변형 hCG(ng/mL)	468±51.6	35.9±17.5	<0.001
혈액 변형 hCG/완전형 hCG(%)	42.2±4.2	9.5±4.0	<0.001
소변 완전형 hCG(ng/mL)	486±19.9	160±27.4	<0.001
소변 변형 hCG(ng/mL)	149±10.2	14.1±6.6	<0.001
소변 변형 hCG/완전형 hCG(%)	29.7±1.9	4.6±1.9	<0.001

약어 : NS, 유의성 없음

도 8은 변형 hCG 및 완전형 hCG의 다양한 분비비율을 바탕으로 산출된 비정상임신(자궁외임신) 진단에 있어서의 민감도 및 특이도를 나타낸 ROC 곡선이다. 본 결과를 볼 때, 소변 및 혈액에서의 변별력을 갖는 기준은 각각 16.2%와 9%일 때 민감도와 특이도가 각각 소변에서 92%와 90%이며, 혈액에서는 80%와 85%를 보였다. 이와 같이 비정상임신의 진단에 있어서 본 발명의 변형 hCG와 완전형 hCG의 비율을 기준으로 할 경우에 매우 높은 진단율을 보임을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 면역크로마토그래피를 적용한 본 발명의 진단장치의 제조

가. 콜로이달 골드(착색미립자)의 제조

본 발명에 사용된 착색미립자는 20~60나노미터 크기의 콜로이달 골드(Colloidal gold)를 사용하였다. 콜로이달 골드를 제조하기 위하여 먼저 500ml 라운드 플라스크에 2차 증류수 220ml을 첨가하였다. 그 다음 플라스크를 핫 플레이트(Corning 사, 미국)에 위치시키고 수증기의 증발을 막기 위하여 리프럭스 장치(Pyrex 사, 미국)를 설치하였다. 핫 플레이트를 작동시켜 현탁시키면서 100℃까지 가열하였다. 증류수의 온도가 100℃ 이상 증가하였을 때, 2% 골드 클로라이드(Sigma 사, 미국) 1.0ml을 가하여 완전히 혼합한 다음 1% 소디움 싸이트리트(Sigma 사, 미국) 2.0ml을 가하여 격렬하게 혼합하였다. 그 다음 30분간 계속 가열하여 콜로이달 골드의 생성을 유도하였다. 이와 같이 제조된 콜로이달 골드는 불순물 및 응집체를 제거하기 위하여 0.45㎛ 여과지로 여과하여 본 발명의 진단장치 제조에 사용하였다.

나. 면역크로마토그래피 진단장치 제조

단일클론항체 결합 착색미립자를 제조하기 위해 착색미립자로서 콜로이달 골드 50ml씩을 각각의 비이커에 넣어 교반하면서 항-β-hCG 단일클론항체 또는 항-α-FSH 단일클론항체 또는 항-PSA 단일클론항체를 착색미립자 1ml 당 1 내지 15㎍이 되도록 첨가하여 20분 내지 30분간 계속 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 1 내지 10% 소혈청 알부민 또는 소디움 카제인이 포함된 차단(blocking) 용액을 최종농도 0.1 내지 1%의 농도로 각각의 비이커에 첨가하고 20분 내지 30분간 반응시켰다. 이 반응액을 50ml 원심분리튜브(Corning 사, 미국)에 담아 초원심분리기(Backman 사, 미국)에서 10,000rpm으로 10~20 분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 침전물을 취하여 안정액(0.5 내지 2% 소혈청 알부민, 1 내지 5% 슈크로오스, 50 내지 100mM 트리스 완충액(pH 7.5~9.0))에 현탁하였다. 이러한 현탁액을 일정한 농도로 조정하여 착색미립자 패드에 적신 다음 건조시켰다. 항체고정 멤브레인을 제조하기 위하여, 결과선1에는 항-완전형 hCG 단일클론항체 또는 항-β-FSH 단일클론항체; 또는 항- PSA 단일클론항체와 항-변형 hCG 단일클론항체를 일정량 분주하여 고정시켰다. 그리고 결과선 2에는 항 변형 hCG 단일클론항체 또는 항-β-LH 단일클론항체; 또는 항-PSA-ACT 단일클론항체를 일정량 분주하여 고정시켰다. 그런 다음 종료선에는 항-마우스 면역클로블린지 다클론항체를 분주하여 고정시켰다. 시료 점적패드(유리섬유, Millipore사, 미국)나 셀룰로오스 종이(Whatman 사, 미국)를 사용하였으며, 시료 흡수패드는 셀룰로오스 종이(Whatman 사,미국)를 사용하였다. 이와 같이 제조된 단일클론항체 착색미립자패드, 항체점적 멤브레인, 시료점적패드, 시료흡수패드를 접착성 폴리에스테르 지지판에 접착시킨 다음 그 위에 항체 결합 착색미립자 패드를 일부분이 겹치도록 접착시켰다. 그 다음 시료점적패드를 길이방향으로 1 내지 10mm 겹치도록 접착시키고, 시료 흡수패드를 1 내지 5mm 겹치도록 접착시켜 유사구조 단백질 비율의 진단스트립을 제조하였다. 이와같이 제조된 스크립을 적당한 플라스틱 하우징에 넣고 조립하여 본 발명의 다낭성난소증후군 진단장치 내지 비정상임신진단장치 내지 전립선암과 전립선비대증의 선별 진단장치를 각각 제조하였다.

본 발명의 유사단백질 비율에 관한 면역크로마토그래피 진단장치에서 다낭성난소증후군 진단장치의 경우에는 LH/FSH 비율이 1.5 내지 2.3 이상일 경우 양성(다낭성난소증후군)으로, 1.5 내지 2.3 미만일 경우 음성(정상)으로 판정하도록 제작하였으며, 비정상임신 진단장치의 경우에는 변형 hCG/완전형 hCG 비율이 0.1 내지 0.5 미만일 경우에는 양성(비정상임신)으로 제작되었고, 0.1 내지 0.5 이상일 경우에는 음성(정상임신)으로 판정하도록 제작되었다. 또한 전립선암 및 전립선비대증 진단장치의 경우에는 0.1 내지 0.25 미만일 경우에는 양성(전립선암)으로 판정하도록 제작되었고, 0.1 내지 0.25 이상일 경우에는 음성(전립선비대증)으로 판정하도록 제작되었다.

도 9에서는 다낭성난증후군 진단용 면역크로마토그래피 진단장치의 판정결과를 나타낸다. LH/FSH 비율에 따라 2.3 비율 이상에서는 LH 결과선이 FSH 결과선 보다 강하게 반응하여 양성으로 판정할 수 있었고, 1.0 비율 이하에서는 LH 결과선이 FSH 결과선 보다 약하게 반응하여 음성으로 판정할 수 있었다. 상기 결과는 본 발명의 한가지 예인 면역크로마토그래피 진단장치가 유사단백질의 비율을 정확하게 감지하여 진단에 활용할 수 있음을 확인할 수 있는 실예로서 제시할 수 있는 것이다.

본 발명의 면역크로마토그래피 진단장치를 사용하여 보다 다양한 비율농도의 시료 에서 황체형성호르몬 및 여포자극호르몬의 비율을 확인한 결과는 표 4 및 도10에서와 같다. 황체형성호르몬과 여포자극호르몬의 농도비율이 0.1 ~ 3.1인 농도로 각각 제조한 시험용액을 면역크로마토그래피 진단장치로 시험한 결과에서 비율이 2.l 이상인 농도에서는 모두 양성으로 판정할 수 있었으며, 비율이 1.5 이하인 농도에서는 모두 음성으로 판정할 수 있었다. 즉, 황체형성호르몬과 여포자극호르몬의 비율이 2.1 이상일 경우에는 다낭성난소증후군에서의 호르몬 분비비율과 동일한 결과를 얻을 수 있으며, 정상여성의 경우에는 1.5 이하의 비율로 분비됨을 나타낸다.

황체형성호르몬 및 여포자극호르몬

황체형성호르몬/여포자극호르몬 농도비율(mIU/mL/mIU/mL)
2.5/0.8	2.5/1.0	2.5/1.2	2.5/1.7	2.5/2.5	2.5/5	2.5/25
5.0/1.7	5.0/2.0	5.0/2.4	5.0/3.3	5.0/5.0	5.0/10	5.0/50
10/3.3	10/4.0	10/4.8	10/6.7	10/10	10/20	10/100
15/5.0	15/6.0	15/7.1	15/10	15/15	15/30	15/150
20/6.7	20/8.0	20/9.5	20/13.3	20/20	20/40	20/200
30/10	30/12	30/14.3	30/20	30/30	30/60	30/300
40/13.3	40/16	40/19	40/26.7	40/40	40/80	40/400
50/16.7	50/20	50/23.8	50/33.3	50/50	50/100	50/500
100/33.3	100/40	100/47.6	100/66.7	100/100	100/200	·
500/166.7	500/200	500/238.1	500/333.3	500/500	·	·
3.1 비율	2.5 비율	2.1 비율	1.5 비율	1.0 비율	0.5 비율	0.1 비율
질환 양성	질환 양성	질환 양성	질환 음성	질환 음성	질환 음성	질환 음성

본 발명의 진단장치는 시료 중의 유사구조 단백질의 비율을 즉시 진단할 수 있는데 그 효과가 크다. 이 진단장치는 다낭성 난소증후군에서 여포자극호르몬과 황체형성호르몬 농도의 비율, 비정상임신에서 완전형 hCG와 변형 hCG의 비율, 전립선암에서 총 PSA 및 유리 PSA의 비율을 확인하여 비정상임신, 다낭성 난소증후군, 전립선암 등의 조기진단 및 대단위 스크리닝에 활용할 수 있다.

Claims

a) 2종 이상의 유사구조 단백질들에 대하여 동일한 인식부위를 갖는 1종의 탐식자와 검출표식자가 결합된 1차 탐식자-검출표식자 결합체, 그리고

b) 상기 유사구조 단백질들 각각을 특이적으로 인식하는 유사구조 단백질들 각각에 대한 탐식자들로서 2종 이상의 2차 탐식자들이

짝으로 구성되며,

상기 2차 탐식자들은 각각 서로 다른 위치에 고정되어 있어 이들 전체가 판독부위를 형성하며,

상기 1차 탐식자-검출표식자는 별도의 용기에 담아서 또는 이동상에 의한 이동이 가능한 상태로 멤브레인패드상에 위치시켜 제공되며,

시료 중 상기 유사구조 단백질들의 각각의 양을 측정할 필요없이 1차 탐식자 및 2차 탐식자와 상기 유사구조 단백질들과의 반응결과를 동시 분석하여 상기 유사구조 단백질들의 비율 판독이 바로 가능한 것임을 특징으로 하는,

유사구조 단백질 비율에 의하여 진단이 가능한 질환의 진단장치.
제 1항에 있어서, 상기 1차 및 2차 탐식자가 단일클론항체, 다클론항체 및 렉틴로 이루어진 군에서 선택된 것인 진단장치.
제 1항에 있어서, 상기 검출표식자가 방사성동위원소, 효소, 염료, 마그네틱 비드, 콜로이달 골드, 세레니움 및 라텍스비드로 이루어진 군에서 선택된 것인 진단장치.
제 1항에 있어서, 상기 시료가 진단 대상으로부터 채취된 액상시료인 것인 진단장치.
제 4항에 있어서, 상기 액상시료가 뇨, 타액 또는 혈액인 것인 진단장치.
제 1항에 있어서, 상기 분석방법은 면역크로마토그래피법, 엘리자법(ELISA), 방사면역분석시험법(Radio immunoassay), 응집법(RPHA) 또는 면역센서법(immunosensor)인 것인 진단장치.
제 6항에 있어서, 상기 분석방법이 면역크로마토그래피법이고,

제1차 패드 및 제2차 패드를 포함하며,

제1차 패드에는 1차 탐식자-검출표식자 결합체가 미리 또는 사용직전에 점적되어 이동상에 의하여 이동이 가능한 상태로서 제공되며,

제2차 패드에는 2차 탐식자들이 각각 독립된 위치에 고정되어 있어 판독부위를 형성하는 것인 진단장치.
제 7항에 있어서, 시료점적용 패드와 시료흡수패드를 추가로 포함하는 것인 진단장치.
제 7항에 있어서,

a) 시료가 제1차 패드에 로딩되어 검출대상인 유사구조단백질들을 포함한 유사구조단백질들이 시료중 존재비율에 따라 경쟁적으로 1차 탐식자-검출표식자 결합체와 결합한 후

b) 제2차 패드에 도달하여 검출대상인 유사구조단백질들이 각각 해당 2차 탐식자에 결합하여 각각 정해진 2차 탐식자의 위치에 나타난 검출표식자의 신호에 의하여 검출대상인 유사구조단백질들의 비율을 판독함을 특징으로 하는 진단장치.
제 6항에 있어서, 상기 분석방법이 엘리자법이고,

2차 탐식자들이 각각 독립적으로 고정되어 있는 각각의 웰들과 1차 탐식자-검출표식자 결합체가 담겨서 제공되는 용기를 포함하는 진단장치.
제 10항에 있어서,

a) 시료를 1차 탐식자-검출표식자 결합체 용기에 주입하여 검출대상인 유사구조단백질들의 시료중 존재비율에 따라 이들이 경쟁적으로 1차 탐식자-검출표식자 결합체와 결합한 후

b) 1차 탐식자-검출표식자와 결합된 유사구조단백질 결합체를 2차 탐식자들이 고정되어 있는 각각의 웰들에 각각 주입하여, 시료중 검출대상인 유사구조단백 질들이 해당 2차 탐식자에 결합되어 해당 웰에 고정되도록 한 후 나타나는 검출 표식자의 신호로부터, 각각 웰에 고정된 유사구조단백질의 상대 비율을 판독함을 특징으로하는 진단장치.
제 1항에 있어서, 유사구조 단백질 비율에 의하여 진단이 가능한 질환이 다낭성난소증후군이고,

유사구조 단백질이 황체형성호르몬과 여포자극호르몬인 것인 진단장치.
제 12항에 있어서, 1차 탐식자가

황체형성호르몬과 여포자극호르몬의 동일 부위를 인식하는 단일클론의 또는 다클론의 항-황체형성호르몬 항체 또는 항-여포자극호르몬 항체이며,

2차 탐식자들은

황체형성호르몬와 여포자극호르몬의 각각에 대하여 특이적인 부위를 인식하는 각각의 항체인 항 황체형성호르몬 단일클론항체와 항 여포자극호르몬 단일클론항체인 것인 진단장치.
제 1항에 있어서, 유사구조 단백질 비율에 의하여 진단이 가능한 질환이 비정상임신, 자궁외임신 또는 유산이고,

유사구조 단백질이 완전형 hCG와 변형 hCG인 것인 진단장치.
제 14항에 있어서, 변형 hCG가 분자량 약 26kDa의 사람 태반성 융모성선자극호르몬(hCG) 관련 단백질인 것인 진단장치.
제 14항에 있어서, 1차 탐식자가

완전형 hCG와 변형 hCG의 베타 서브유닛의 동일부위를 인식하는 단일클론의 또는 다클론의 항β-hCG 항체이며,

2차 탐식자들은

완전형 hCG와 변형 hCG의 각각에 대하여 특이적인 부위를 인식하는 각각의 항체인 항 완전형 hCG 단일클론항체와 항 변형 hCG 단일클론항체인 것인 진단장치.
제 1항에 있어서, 유사구조 단백질 비율에 의하여 진단이 가능한 질환이 전립선암 또는 전립선비대증이고,

유사구조 단백질이 유리 PSA와 PSA-ACT인 것인 진단장치.
제 17항에 있어서, 1차 탐식자가

유리 PSA와 PSA-ACT의 동일 부위를 인식하는 단일클론의 또는 다클론의 항 PSA 항체이며,

2차 탐식자들은

유리 PSA와 PSA-ACT의 각각에 대하여 특이적인 부위를 인식하는 각각의 항체인 항 유리 PSA 단일클론항체와 항 PSA-ACT 단일클론항체인 것인 진단장치.