PL188200B1 - Oznaczanie cPSA - Google Patents

Abstract

I Sposób oznaczania związanego antygenu swoistego dla gruczołu krokowego (cPSA) w próbce krwi, znamienny tym, ze obejmuje etapy (a) poddania całkowitego PSA (tPSA) w próbce krwi takiej obróbce, aby uczynić wolny PSA (fPSA) w zasadzie niewykrywalnym w teście immunologicznym, 1 (b) oznaczania PSA, w poddanej obróbce próbce krwi, za pomocą testu immunologicznego, przy czym w zasadzie tylko cPSAjest wykrywalny w tym teście 6 Sposób oznaczania związanego antygenu swoistego dla gruczołu krokowego (cPSA) w próbce krwi. znamienny tym, że obejmuje etapy (a) poddawania próbki krwi, dla wytworzenia płynnej mieszaniny, kontaktowi z trzema przeciwciałami anty-PSA (i) pierwszym przeciwciałem anty-PSA, wiążącym się z PSA całkowitym (tPSA) (n) drugim przeciwciałem anty-PSA, wiążącym się z tPSA, lecz w zasadzie niezdolnym do wiązania się z PSA wtedy, gdy PSA jest związane z takim przeciwciałem, które wiąże się z wolnym PSA (fPSA), a nie wiąże się z cPSA, przy czym jedno z tych dwóch przeciwciał, pierwszego i drugiego, jest wyznakowane („przeciwciało wyznakowane”), a drugie jest unieruchomione lub podatne na unieruchomienie w celu oddzielenia z piynnei mieszaniny testowej („przeciwciało wychwytujące''). i (iii) trzecim przeciwciałem anty-PSA, wiążącym się z fPSA, lecz nie z cPSA, przy czym związanie tego trzeciego przeciwciała z tPSA powoduje, że fPSA staje się w zasadzie niewykrywalne w niniejszym sposobie, (b) oddzielania tego przeciwciała wychwytującego z płynnej mieszaniny testowej, i (c) oznaczaniu znacznika w oddzielonej fazie przeciwciała wychwytującego lub w pozostałej części płynnej mieszaniny testowej II Sposób ułatwiania wykrywania raka gruczołu krokowego u mężczyzn, znamienny tym, ze obejmuje etapy (a) oznaczania poziomu związanego antygenu swoistego dla gruczołu krokowego (cPSA) w próbce krwi pobranej od pacjenta. i (b) oznaczania, czy poziom cPSA we krwi pacjenta przekracza górną granicę normy, wynoszącą około 3-4 ng/m

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest oznaczanie immunologicznie związanej postaci oznaczalnego antygenu swoistego dla gruczołu krokowego (PSA) w próbce krwi. Bardziej szczegółowo, przedmiotem niniejszego wynalazku jest oznaczanie postaci związanej w teście immunometrycznym o podwójnej swoistości i kliniczna przydatność testu na obecność związanej postaci PSA.

Ludzki antygen swoisty dla gruczołu krokowego (PSA) stanowi glikoproteinę o ciężarze około 33000 daltonów, wykazujący znaczną homologię aminokwasów z rodziną kalikrein ludzkich (1,2); stwierdzono, że stanowi on proteazę serynową wykazującą aktywność podobną do trypsyny i chymotrypsyny (3,4,5). PSA wydzielany jest przez komórki nabłonka gruczołu krokowego i stanowi jedno z głównych białek płynu nasiennego (6). Po odkryciu, że stężenie PSA rośnie w surowicy pacjentów z rakiem gruczołu krokowego, liczne badania potwierdziły, że białko to stanowi istotny i klinicznie przydatny marker biologiczny w diagnostyce i leczeniu pacjentów z rakiem gruczołu krokowego (7,8,9,10).W ostatnich czasach uwaga badaczy skupia się na oznaczaniu PSA w surowicy w celu wczesnego wykrywania raka gruczołu krokowego u mężczyzn bez objawów klinicznych. Amerykańskie Towarzystwo Raka i Amerykańskie Towarzystwo Urologiczne wydało niedawno zalecenie badań przesiewowych u wszystkich mężczyzn powyżej 50 r.ż., polegających na oznaczaniu PSA w surowicy i badaniu per rectum (11).

Z kilku względów wartość kliniczna wczesnego wykrywania raka gruczołu krokowego pozostaje kontrowersyjna. Po pierwsze, nie jest jasne, czy leczenie raka gruczołu krokowego we wczesnych stadiach poprawia wskaźniki przeżycia w populacji chorych z tym nowotworem. Trwają obecnie badania kliniczne nad tymi zagadnieniami. Po drugie, w niedawnym badaniu klinicznym oceniono skuteczność oznaczania PSA w surowicy w połączeniu z badaniem per rectum we wczesnym wykrywaniu raka gruczołu krokowego u mężczyzn powyżej 50 r.ż. (12). Spośród 1060 pacjentów, u których badanie per rectum było nieprawidłowe, lub stwierdzano podwyższone wartości PSA, tylko u 22% stwierdzono raka gruczołu krokowego. Dane te wykazują, że 70-80% wszystkich biopsji gruczołu krokowego wykonuje się u męzczyzn, którzy nie mają raka. Ponieważ u 30-50% mężczyzn powyżej 50 r.ż. stwierdza się w autopsji cechy raka gruczołu krokowego, liczba niepotrzebnych biopsji gruczołu krokowego, wywołanych przez podwyższone wartości PSA w testach, mogłaby być bardzo wysoka. Konsekwencją tego byłoby zarówno zwiększenie kosztów opieki medycznej, jak i zwiększenie chorobowości związanej z przeprowadzaniem biopsji.

Kilka laboratoriów niezależnie od siebie wykazało, że PSA tworzy kompleksy z inhibitorami proteaz, takimi jak aj-antychymotrypsyna (ACT), a₂-makroglobulina i arantytrypsyna (13-19). PSA w kompleksie z ACT lub ai-antytrypsyną lub w postaci wolnej, niezwiązanej, można wykryć w surowicy za pomocą testów immunologicznych. Większa część czynnego immunologicznie PSA w surowicy jest związana z ACT; stwierdzono istotną korelację między odsetkiem PSA związanym z ACT a całkowitym stężeniem PSA w surowicy (13). Jednakże nie jest możliwe oznaczanie PSA związanego z a₂-makroglobuliną z powodu przeszkody przestrzennej przeciwciała przyłączającego się do PSA po tym, jak PSA tworzy kompleks z tą proteazą. We wcześniejszych badaniach sugerowano, że poziom PSA-ACT i stosunek PSA/ACT do PSA całkowitego będą przydatne w diagnostyce raka gruczołu krokowego (13,15,16,17), jednak z rozmaitych powodów (z których niektóre podano poniżej) trudno jest wyciągnąć wnioski co do klinicznej wartości oznaczania PSA-ACT.

Lilja, Stenman i wsp. w swojej pracy opublikowanej w 1991 stwierdzili, że PSA istnieje w surowicy w postaci wolnej i w postaci związanej (w postaci kompleksów) z ACT i Ui-antytrypsyną (13,18). W dalszych pracach Stenman i wsp. udowodnili, że oznaczanie PSA-ACT w połączeniu z oznaczaniem PSA wolnego plus w postaci kompleksów (związanego), zwane188 200 go PSA całkowitym, jakkolwiek konwencjonalne testy PSA nie pozwalają na oznaczenie PSA związanego z a2-makroglobuliną, może umożliwić odróżnienie mężczyzn z rakiem gruczołu krokowego od mężczyzn z łagodnymi chorobami gruczołu krokowego, takimi jak łagodny przerost gruczołu krokowego (BPH). Jednakże dokładne oznaczanie kompleksów PSA-ACT nie było osiągalne z powodu technicznych problemów z dokładnym oznaczaniem kompleksu. Stenman i wsp. stwierdzili, że korelacja wartości PSA-ACT z oznaczaniem PSA całkowitego nie była odpowiednia w zakresie niższych wartości, i ze punkt przecięcia z osią y był przesunięty w górę, co wskazuje na błąd dodatni w oznaczaniu PSA związanego (13 i Patent Stanów Zjednoczonych 5501983). I tak, stwierdzili oni, że dla większości badanych pacjentów stężenie PSA-ACT było wyższe, niż stężenie PSA całkowitego (Patent Stanów Zjednoczonych 5501983). Przeprowadzono następnie analizę korelacji dla PSA związanego i wolnego, która wykazała nachylenie krzywej 1,12, wskazujące na błąd dodatni oznaczania kompleksu PSA-ACT (16). Pettersson i wsp. badali błąd dodatni po stwierdzeniu zwiększonych wartości PSA-ACT w surowicy kobiet (20). Jakkolwiek dodanie heparyny zmniejszało częstość występowania wartości fałszywie dodatnich w surowicy kobiet, późniejsze próby oznaczania kompleksów PSA-ACT u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego i BPH nadal wykazywały znaczący błąd dodatni w oznaczaniu kompleksów (21).

Z powodu trudności, na jakie napotykano w oznaczaniu kompleksów PSA-ACT, uwaga większości badaczy skupiła się na oznaczaniu wolnego, niezwiązanego PSA wraz z oznaczaniem PSA całkowitego. Obecnie jasne jest, że przy wartościach PSA całkowitego wynoszących 4-10 ng/ml istnieje potrzeba zwiększonej swoistości badania. Przy wartościach PSA całkowitego <4,0 ng/ml ryzyko raka gruczołu krokowego jest małe; podobnie, gdy PSA całkowite przekracza 10 ng/ml, ryzyko raka gruczołu krokowego wynosi >50% i niezbędne jest wykonanie biopsji gruczołu krokowego. W „szarej strefie” diagnostycznej (ogólnie, 2-20 ng/ml, a według większości badaczy, 4-10 ng/ml), ryzyko raka jest wysokie, jednak odsetek wyników fałszywie dodatnich jest również wysoki. W retrospektywnym zastosowaniu wartości stosunku PSA wolnego do PSA całkowitego wykazano, ze swoistość PSA całkowitego w szarej strefie 4-10 ng/ml można poprawić z około 50-60% do 70-80% (22-26). To ulepszenie swoistości może spowodować 20-30% spadek ilości niepotrzebnie wykonanych biopsji. W PCT WO 96-26441 i WO 97-12245 podobnie opisano zastosowanie stosunku PSA wolnego do PSA całkowitego do poprawy różnicowania, odpowiednio, BPH i rakiem, u pacjentów z poziomem PSA całkowitego wynoszącym od 2,5-20 ng/ml.

Oznaczanie PSA wolnego nastręcza jednak inne trudności techniczne. Po pierwsze, w szarej strefie diagnostycznej odsetek PSA całkowitego jest zazwyczaj dość niski, około 5-30%. Odpowiedni test na wolny PSA musi zatem umożliwiać dokładne oznaczanie w zakresie 0,2-3,0 ng/ml. Ponadto, stężenie wolnego PSA nie różni się znamiennie u pacjentów z BPH i rakiem, a stosunek PSA wolnego do PSA całkowitego zmniejsza się z powodu zwiększenia odsetka PSA związanego z ACT. Ponadto, wolny PSA nie jest stabilny w surowicy, i poziom PSA wolnego, jak wiadomo, zmniejsza się z czasem, prawdopodobnie z powodu wiązania z a2-makroglobuliną.

Kolejne badania dostarczyły dalszych wiadomości na temat problemów związanych z dokładnym oznaczaniem PSA-ACT we krwi, jak również na temat prób przezwyciężenia tych problemów. W 1994 badacze z Hybritech donosili o opracowaniu testu immunologicznego typu „sandwich” na PSA-ACT z zastosowaniem przeciwciał anty-PSA i anty-ACT. Stwierdzili oni, że oznaczanie wartości PSA-ACT nie jest klinicznie bardziej swoiste w diagnostyce raka gruczołu krokowego. W późniejszych pracach ta sama grupa, wraz z badaczami z John Hopkins Medical Institutions donosiła, ze wadą testu immunologicznego typu „sandwich” anty-PSA/anty-ACT jest duzy stopień wiązania nieswoistego i błąd dodatni oznaczania PSA-ACT. O ile nie zostanie znalezione rozwiązanie tych problemów, z uwagi na nie oznaczanie PSA-ACT nie ma żadnego znaczenia klinicznego (28). Następnie, ta połączona grupa badaczy donosiła o przezwyciężeniu problemu wiązania nieswoistego przez opracowanie testu immunologicznego typu „sandwich” na obecność PSA-ACT, opartego na monoklonalnych przeciwciałach skierowanych swoiście przeciwko kompleksowi PSA-ACT (29,30). Jednak w badaniach klinicznych nie wykazano żadnej poprawy swoistości wykrywania raka gruczołu kro6

188 200 kowego poprzez oznaczanie tylko kompleksu PSA-ACT w porównaniu z oznaczaniem PSA całkowitego lub z obliczaniem stosunku PSA-ACT do PSA całkowitego (29). Proponowano inne sposoby przezwyciężenia problemów związanych z oznaczaniem PSA-ACT, w tym zastosowanie środków blokujących (31).

Pozostaje niejasne, dlaczego odsetek PSA związanego z ACT u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego zwiększa się, może to być jednak związane z obserwacją, że przeciwciała skierowane przeciwko ACT nie barwią nabłonka gruczołu krokowego pacjentów z BPH i że w takiej tkance nie znajduje się transkryptów mRNA. Przeciwnie, w nabłonku gruczołu krokowego pacjentów z rakiem gruczołu krokowego można wykryć immunoreaktywność anty-ACT i syntezę mRNA (32). Wyniki te sugerują, że w nowotworach gruczołu krokowego PSA może wiązać się in situ z ACT przed uwolnieniem do surowicy. Alternatywny mechanizm może polegać na dostaniu się aktywnego PSA do krwi obwodowej. Wolne PSA, wykrywane w surowicy zdrowych mężczyzn, ulega cięciu proteolitycznemu i jest nieczynne enzymatycznie. Nowotwory jednak wydzielają czynniki angiogenne (naczyniotwórcze), które powodują zwiększenie unaczynienia tkanek nowotworowych. Możliwe jest więc, że w nowotworach większa część enzymatycznie czynnego PSA przedostaje się do krwi obwodowej. Można oczekiwać, że ten czynny PSA będzie się wiązać z inhibitorami proteaz, takimi jak ACT, powodując wyższy odsetek kompleksów PSA-ACT w surowicy pacjentów z rakiem gruczołu krokowego.

W związku z powyzszym istnieje potrzeba opracowania sposobu dokładnego oznaczania związanego PSA i oceny znaczenia klinicznego poziomu związanego PSA we krwi w odniesieniu do przesiewowych badań męzczyzn pod kątem raka gruczołu krokowego.

W publikacji EP 635575 opisano wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych wiążących się z wolnym PSA, nie wiążących się jednak z kompleksami PSA-ACT.

Przedmiotem PCT WO 95/18381 jest monoklonalno-poliklonalny test immunometryczny do oznaczania PSA, który zdolny jest do ekwimolamej odpowiedzi na PSA wolne i związane poprzez dodanie przeciwciała wiążącego się z wolnym PSA i nie wiążącego się z PSA w postaci kompleksów.

W zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych o numerze 08/595155 i w pracy Zhou Z., Ng PC, Very DL, Allard WJ, Yeung KK, J. Clin. Lab. Anal. (1996), 10:155-159, opisano sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego, zapewniającego ekwimolamą odpowiedź na wolne i związane PSA w monoklonalno-poliklonalnym teście immunometrycznym. Opisane przeciwciało monoklonalne wykazuje unikalną właściwość wiązania się z PSA w celu uniemożliwienia wiązania się PSA z przeciwciałami wiążącymi PSA wolne i nie wiążą PSA związanego.

W opublikowanym japońskim dokumencie patentowym 62-46263 opisano test immunologiczny typu „sandwich” do oznaczania PSA w kompleksie z inhibitorem proteaz.

W opublikowanym niemieckim zgłoszeniu patentowym 4322342 opisano sposób oznaczania PSA całkowitego i PSA-ACT w jednym teście w celu uzyskania wartości do obliczenia stosunku PSA-ACT do PSA całkowitego.

Chichibu i wsp. w Journal of Medicine and Pharmaceutical Sciences (Japonia, 1996) 36 (3) : 477-483, opisali test immunologiczny typu „sandwich” do wykrywania PSA-ACT z zastosowaniem anty-PSA osadzonego na kulkach i wyznakowanego enzymami anty-ACT. Brak danych na temat możliwości dokładnego oznaczania PSA-ACT w próbce krwi.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób oznaczania związanego PSA (zwanego w dalszym ciągu niniejszego opisu „cPSA”) w próbce krwi przez poddanie próbki krwi takiej obróbce, aby niezwiązane, to znaczy wolne PSa (fPSA) uczynić niewykrywalnym w teście immunologicznym i następnie oznaczanie PSA w poddanej obróbce próbce krwi za pomocą testu immunologicznego, w którym wykrywa się tylko cPSA. Test immunologiczny można przeprowadzić w dowolny sposób znany ze stanu techniki, jednak zwykle stosuje się test kompetycyjny lub test immunometryczny o podwójnej swoistości. Sposób według niniejszego wynalazku można przeprowadzić różnymi metodami, jak to opisano bardziej szczegółowo poniżej. Ogólnie, sposoby te obejmują sposoby oddzielania, w których fPSA fizycznie usuwa się lub wychwytuje z mieszaniny do testu immunologicznego, jak również sposoby, w których

188 200 dokonuje się modyfikacji determinanty lub determinant antygenowych w fPSA poprzez interakcję chemiczną w celu takiej modyfikacji fPSA, aby nie był on zdolny do wiązania się z przeciwciałem stosowanym w teście immunologicznym, w ten sposób skutecznie eliminując fPSA z testu.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest szczególnie korzystny sposób wykonania testu immunologicznego o podwójnej swoistości oparty na układzie reakcyjnym z trzema przeciwciałami:

(a) pierwsze przeciwciało anty-PSA (monoklonalne lub poliklonalne), wiążące się z tPSA i uczestniczące w teście immunologicznym;

(b) drugie przeciwciało anty-PSA (korzystnie, monoklonalne), również wiążące się z tPSA i również uczestniczące w teście immunologicznym, które jednak dobiera się tak, aby posiadało tę właściwość, że jest w zasadzie niezdolne do wiązania się z PSA, gdy PSA związane jest z przeciwciałem skierowanym swoiście przeciwko fPSA (to drugie przeciwciało zwane jest w niniejszym opisie „MMI”), i (c) trzecie przeciwciało anty-PSA, skierowanym swoiście przeciwko fPSA, które, korzystnie, jest przeciwciałem monoklonalnym.

Jedno z przeciwciał, pierwsze lub drugie, anty-PSA, uczestniczące w teście immunologicznym, wyznakowuje się w celu jego wykrywania (przeciwciało to można nazywać przeciwciałem „wyznakowanym” lub „detekcyjnym”), natomiast drugie przeciwciało jest unieruchomione lub też unieruchamialne w celu oddzielenia z mieszaniny testowej (przeciwciało „wychwytujące”). W związku z tym, można wytworzyć takie warunki testu, w których fPSA z próbki krwi będzie wiązało się z przeciwciałem skierowanym swoiście przeciwko fPSA (przeciwciałem trzecim), powodując, że fPSA z próbki nie będzie zdolne do wiązania się ze wspomnianym uprzednio MMI (przeciwciałem drugim). Ponieważ test immunometryczny o podwójnej swoistości zależy od wiązania PSA z oboma wzmiankowanymi wyżej przeciwciałami pierwszym i drugim (przeciwciałem „wyznakowanym” i „wychwytującym”), wiązanie przeciwciała skierowanego swoiście przeciwko fPSA prowadzi w konsekwencji do tego, że postać fPSA staje się niewykrywalna w teście immunometrycznym o podwójnej swoistości. Należy zauwazyć, że mimo że wszystkie trzy przeciwciała stosowane w tym szczególnym układzie testowym są skierowane swoiście przeciwko jednej lub więcej postaci PSA (to znaczy, że żadne z nich nie jest skierowane przeciwko żadnemu z inhibitorów proteaz zawartych w cPSA), szczególne właściwości przeciwciał umożliwiają swoiste oznaczanie cPSA.

Stwierdzono, że oznaczanie poziomu cPSA we krwi jest czułym i swoistym sposobem wykrywania raka gruczołu krokowego. Korzystne jest również to, że testy cPSA wykazują zwiększoną dokładność analityczną w porównaniu z testami polegającymi na oznaczaniu fPSA, ponieważ cPSA stanowi dominującą postać PSA i czynniki środowiskowe i analityczne (np. wiek próbki), powodujące zmianę dystrybucji PSA pomiędzy postać fPSA i cPSA znacznie mniej oddziaływają na dokładność oznaczeń cPSA w porównaniu z oznaczeniami fPSA.

Ponieważ głównym składnikiem cPSA jest PSA związane z inhibitorem proteaz a)-antychymotrypsyną (ACT), testy swoiste ze względu na PSA-ACT również wykazują korzystną czułość, swoistość i inne cechy testów cPSA.

Wynalazek został zilustrowany na rysunku, na którym fig. 1A stanowi wykres przedstawiający hamowanie immunoreaktywności PSA w teście immunometrycznym o podwójnej swoistości na tPSA w obecności trzech różnych przeciwciał monoklonalnych, skierowanych przeciwko epitopowi E PSA. Próbki zawierające fPSA w stężeniu 50 ng/ml inkubowano wstępnie z każdym przeciwciałem monoklonalnym (MAb) anty-fPSA przez 30-60 minut i poddano badaniu w urządzeniu Bayer Immuno 1™ Assay. Na fig. IB przedstawiono podobne doświadczenie, w którym dwa przeciwciała anty-E, PSa 20 i ME2, wykazały zależne od stężenia hamowanie immunoreaktywności fPSA w teście tPSA. Próbki zawierające fPSA w stężeniu 10 ng/ml inkubowano wstępnie z MAb PSA 20 lub ME2 przez 30-60 minut i poddano badaniu w urządzeniu Bayer Immuno 1™ Assay.

Figura 2A stanowi wykres ukazujący, że dodanie przeciwciała anty-E PSA 20 do testu tPSA zapewnia format testu immunologicznego do oznaczania cPSA. Dokonano oznaczania próbek zawierających około 11 ng/ml PSA całkowitego ze zmienną zawartością wolnego

188 200 i związanego PSA w obecności 300 ug/ml MAb PSA 20, stosując urządzenie Bayer Immuno 1. Fig. 2B stanowi podobny wykres ukazujący, ze MAb ME2 można również stosować dla testu immunologicznego do ilościowego oznaczania cPSA. Dokonano oznaczania próbek zawierających około 11 ng/ml PSA całkowitego ze zmienną zawartością wolnego i związanego PSA w obecności 25 pg/ml MAb ME2, stosując urządzenie Bayer Immuno 1.

Figura 3 stanowi tabelę ukazującą. ze PSA 20 można stosować do automatyzacji testu cPSA w automatycznym urządzeniu do analizy immunologicznej. W formacie I testu zastosowano MAb PSA 20 dodane do koniugatu MMl-fluoresceina (Rl) z całkowitym czasem inkubacji 38 minut. W formacie II testu zastosowano inkubację wstępną MAb PSA 20 z próbkami i całkowity czas inkubacji wynoszący 78 minut. Wyniki przedstawiono jako prędkość wytwarzania zabarwienia.

Figury 4A i 4B stanowią tabele podsumowujące wyniki oznaczania całkowitego, związanego i wolnego PSA w surowicy męzczyzn z rakiem gruczołu krokowego, BPH lub w zdrowej grupie kontrolnej, dobranej ze względu na wiek. Do nieselekcjonowanej populacji pacjentów, oznaczonej jako „wszyscy”, należą próbki pochodzące od mężczyzn z rakiem gruczołu krokowego, BPH lub od zdrowych mężczyzn z grupy kontrolnej, dobranej ze względu na wiek, niezależnie od wartości tPSA. Po stratyfikacji grup pacjentów ze względu na wartość tPSA, do analizy przedstawionej na fig. 4A i do części cPSA analizy przedstawionej na fig. 4B włączono dodatkowe próbki, które dobrano według wartości tPSA do szarej strefy diagnostycznej, jak to omówiono poniżej.

Figura 4C stanowi wykres analizy regresyjnej wyników uzyskanych z zastosowaniem dostępnego w handlu testu na PSA całkowite w porównaniu z wynikami uzyskanymi z zastosowaniem korzystnego testu cPSA próbek pobranych od mężczyzn z rakiem gruczołu krokowego i z łagodną chorobą gruczołu krokowego.

Figury 5A-5F stanowią wykresy przedstawiające korelację między wartościami testu cPSA a wartościami testu PSA-ACT, uzyskanymi przy badaniu surowicy mężczyzn z rakiem gruczołu krokowego, BPH i mężczyzn ze zdrowej populacji.

Figura 6 stanowi tabelę podsumowującą wyniki oznaczenia cPSA i PSA-ACT surowicy mężczyzn z rakiem gruczołu krokowego, BPH i u zdrowych mężczyzn z grupy kontrolnej, dobranej ze względu na wiek. Nieselekcjonowana populacja pacjentów (oznaczona „wszyscy”) i grupy pacjentów poddane stratyfikacji ze względu na poziom cPSA były identyczne z grupami poddanymi analizie w badaniach, których wyniki przedstawiono na fig. 4A i 4B.

Figura 7 stanowi tabelę ukazującą korelację wartości odciętych (tzn. górnej granicy normy) i swoistość w dobranych czułościach wśród wartości testowych uzyskanych z zastosowaniem dostępnego w handlu korzystnego testu tPSA i obliczenia stosunku fPSA/tPSA.

W rozumieniu niniejszego wynalazku, następujące terminy będą miały wskazane znaczenie: PSA oznacza antygen swoisty gruczołu krokowego.

tPSA, czyli PSA całkowite, oznacza całkowitą ilość oznaczalnego metodami immunologicznymi PSA w próbce krwi, tzn. PSA w postaci związanej lub wolnej, zdolnego do odpowiedzi na pomiary konwencjonalnymi testami immunologicznymi. W oparciu o obecny stan wiedzy, rozumie się, że PSA krwi, związane z niektórymi inhibitorami proteaz (włączając w to ACT, (ii-antytrypsynę i inhibitor inter-a-trypsyny) są immunologiczne oznaczalne, natomiast nie jest oznaczalne PSA związane z niektórymi innymi inhibitorami proteaz, takimi jak a 2-makroglobulina.

fPSA, czyli wolne PSA, oznacza PSA w swej wolnej, niezwiązanej postaci. cPSA, czyli PSA związane, oznacza PSA, które nie stanowi fPSA.

Epitop E oznacza zbiór epitopów na PSA, stanowiących miejsca wiązania przeciwciał, które przyłączają się do fPSA, lecz nie do cPSA.

Przeciwciała anty-E oznaczają przeciwciała przyłączające się do epitopu E i w ten sposób swoiście wiążące się z fPSA.

Przeciwciało oznacza całą immunoglobulinę, tzn. IgG lub IgM, lub fragment immunoglobuliny, zawierający miejsce wiążące przeciwciała, np. fragmenty Fab, Fab' i F(ab')2 lub ich agregaty.

188 200

Przedmiotem niniejszego wynalazku są sposoby oznaczania cPSA w próbce krwi poprzez oznaczanie tPSA testem immunologicznym po doprowadzeniu fPSA w próbce krwi do takiego stanu, aby stał się niewykrywalny. Dla specjalisty będzie oczywiste, że do oznaczania tPSA można stosować rozmaite testy immunologiczne, i że można stosować różne sposoby, aby uczynić fPSA w krwi niewykrywalnym.

Ogólnie, testy immunologiczne tPSA są testami kompetycyjnymi lub niekompetycyjnymi. Pierwsze z tych sposobów typowo wykorzystują unieruchomione lub unieruchamialne przeciwciała skierowane przeciwko PSA (anty-PSA) i wyznakowaną postać PSA. PSA z próbki i wyznakowane PSA współzawodniczą o wiązanie z anty-PSA. Po oddzieleniu powstałego wyznakowanego PSA, który związał się z anty-PSA (frakcja związana) od wyznakowanego PSA, które pozostało niezwiązane (frakcja niezwiązana), oznacza się poziom znacznika we frakcji związanej lub niezwiązanej; ilość tę porównuje się z ilością PSA w badanej próbce dowolnym konwencjonalnym sposobem, np. poprzez porównanie z krzywą standardową.

Sposoby niekompetycyjne są szerzej stosowane w oznaczeniach tPSA, przy czym najbardziej popularną metodę stanowi test immunometryczny o podwójnej swoistości (zwany niekiedy sposobem typu „sandwich”). W testach immunometrycznych stosuje się dwa przeciwciała anty-PSA. Jedno z przeciwciał anty-PSA jest wyznakowane (niekiedy zwane jest ono przeciwciałem „detekcyjnym”), natomiast drugie przeciwciało jest unieruchomione lub unieruchamiane (i zwane jest niekiedy przeciwciałem „wychwytującym”). Jak to wiadomo ze stanu techniki, przeciwciała „wychwytujące” i „detekcyjne” można poddawać kontaktowi z próbką badaną jednocześnie lub sekwencyjnie. Sposoby sekwencyjne polegają na inkubacji przeciwciała „wychwytującego” z próbką i dodaniu przeciwciała „wyznakowanego” po określonym czasie (co zwane jest niekiedy metodą „do przodu” - „forward”); lub można najpierw inkubować próbkę z przeciwciałem „detekcyjnym”, a następnie dodać przeciwciało „wyznakowane” (sposób te zwany jest niekiedy metodą „odwrotną” - „reverse”). Po przeprowadzeniu inkubacji niezbędnej (niezbędnych) do wykonania testu, przeciwciało „wychwytujące” oddziela się z płynnej mieszaniny testowej i oznacza się poziom znacznika w co najmniej części co najmniej jednej z faz oddzielonego przeciwciała „wychwytującego” lub pozostałości płynnej mieszaniny testowej; zwykle z fazy oddzielonego przeciwciała „wychwytującego”, ponieważ zawiera ona PSA związane przez przeciwciało „wychwytujące” i „detekcyjne” (przeciwciała te, wraz z PSA, między innymi, tworzą „sandwich”).

W typowym teście immunometrycznym PSA o podwójnej swoistości jedno przeciwciało „wychwytujące” i „detekcyjne” stanowi, lub oba te przeciwciała stanowią, przeciwciała monoklonalne. Znacznik stosowany do przeciwciała „detekcyjnego” dobiera się spośród znaczników znanych ze stanu techniki. Zwykle znacznik stanowi enzym lub cząstka chemiluminescencyjna, jednak może go również stanowić izotop radioaktywny, fluorofor, wykrywalny ligand (np. wykrywalny przez wtórne wiązanie z wyznakowanym partnerem wiążącym) i tym podobne. Ważną cechą przeciwciała „wychwytującego” jest to, że zapewnia ono środki umożliwiające oddzielenie go z pozostałości mieszaniny testowej. Tak więc, jak to wiadomo ze stanu techniki, przeciwciało „wychwytujące” można wprowadzać do testu w postaci już unieruchomionej lub nierozpuszczalnej, lub tez może ono być w postaci unieruchamialnej, tzn. w postaci, która umożliwia unieruchomienie po wprowadzeniu przeciwciała „wychwytującego” do testu. Przykłady unieruchomionych przeciwciał „wychwytujących” stanowią przeciwciała kowalentnie lub niekowalentnie związane z fazą stałą, taką jak cząstka magnetyczna, cząstka lateksu, płytka z zagłębieniami do mikromiareczkowania, kulka, miseczka lub inne naczynie reakcyjne. Przykładem unieruchamialnego przeciwciała „wychwytującego” jest przeciwciało chemicznie zmodyfikowane cząstką liganda, np. haptenem, biotynąlub tp., które można następnie unieruchomić poprzez kontakt z unieruchomioną (jak to opisano powyżej dla bezpośrednio unieruchomionych przeciwciał „wychwytujących”) postacią partnera wiązania dla ligandu, np. z przeciwciałem, awidyną lub tp.

Wyżej opisane sposoby formatów i testów immunologicznych stanowią nieograniczający przykład; ogólnie, rozumie się, że w niniejszym wynalazku można zastosować dowolny test, lub dowolny sposób lub format testu immunologicznego.

188 200

Rozumie się również, że można stosować różne środki do tego, aby uczynić fPSA w próbce niewykrywalnym. Według jednej cechy niniejszego wynalazku, środki te może stanowić izolacja lub oddzielenie fPSA z próbki z pozostałej części próbki krwi, z której wykonuje się test immunologiczny. Wynikiem takiego oddzielenia może być fizyczne oddzielenie frakcji fPSA od płynnej mieszaniny testowej lub też izolacja lub sekwestracja fPSA in situ w mieszaninie testowej. Na przykład, fPSA można oddzielić i uczynić niewykrywalnym, przepuszczając próbkę badaną przez kolumnę lub inną macierz z materiału, który selektywnie usuwa fPSA, np. przez adsorpcję jonowymienną, filtrację na sicie molekularnym, wiązanie powinowactwa lub tym podobne, lub przez kontaktowanie próbki badanej z unieruchomioną lub unieruchamialną postacią przeciwciała skierowanego swoiście przeciwko fPSA, np. anty-fPS A związanego z cząstką magnetyczną lub lateksową.

Według wynalazku innej cechy niniejszego wynalazku, fPSA czyni się niewykrywalnym w teście immunologicznym poprzez obróbkę próbki badanej środkami fizycznymi, chemicznymi (w tym biochemicznymi) lub innymi, zmieniającymi lub modyfikującymi odpowiednią determinantę (determinanty) antygenowe, w taki sposób, aby uczynić fPSA w zasadzie niezdolnym do wiązania z przeciwciałem stosowanym w teście immunologicznym PSA. Można następnie przeprowadzić test immunologiczny PSA bezpośrednio w powstałej mieszaninie testowej. Na przykład, obróbka taka może polegać na różnicowej denaturacj i fPSA i cPSA, na przykład poprzez ogrzewanie lub schładzanie; dodanie chemicznego środka denaturującego, denaturującego determinanty antygenowe fPSA (epitop E), przy czym ten środek denaturujący nie działa przeciwko determinantom cPSA, które chroni się przez wiązanie w kompleksy, np. swoiste dla proteaz, dla peptydów występujących tylko w regionie epitopu E, i tym podobnie; dodanie środka biochemicznego wiązącego lub w inny sposób blokującego region epitopu E, takiego jak np. białkowe lub lipidowe środki wiążące, środki naśladujące działanie substratu (np. peptydy przypominające prawidłowy substrat rozpoznawany przez miejsce enzymatyczne regionu epitopu E, takie jednak, którego przyłączenie nie powoduje enzymatycznego rozszczepienia ani reakcji), i tym podobne. Powyższe przykłady sposobów uzyskania pożądanej inaktywacji immunologicznej fPSA nie są ograniczające; dla specjalisty oczywiste będą inne skuteczne sposoby.

Szczególny unikalny sposób oznaczania cPSA według niniejszego wynalazku polega na pomysłowej modyfikacji konwencjonalnego testu immunometrycznego o podwójnej swoistości. W tym nowym sposobie jedno z przeciwciał, przeciwciało „wychwytujące” lub „detekcyjne” dobiera się tak, aby było ono zdolne do wiązania tPSA (to znaczy, wiąże się ono z epitopem znajdującym się zarówno na fPSA, jak i cPSA), ale aby było w zasadzie niezdolne do wiązania się z PSA wtedy, gdy PSA jest związane z przeciwciałem skierowanym swoiście przeciwko fPSA (tzn. z przeciwciałem anty-E). To unikalne przeciwciało zwane jest w niniejszym opisie MMI. Tak więc, dodając przeciwciało anty-E jako trzecie przeciwciało, osiąga się to, że fPSA związane z anty-E jest w zasadzie niezdolne do wiązania się z MMI, tak więc jest w zasadzie niemożliwe wykrycie go w teście immunometrycznym o podwójnej swoistości opartym na MMI.

W szczególnie korzystnym wykonaniu, drugie przeciwciało (przeciwciało MMI) i trzecie przeciwciało (przeciwciało anty-E), niezależnie od siebie, stanowią, korzystnie, przeciwciała monospecyficzne, to znaczy, przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne, wytworzone konwencjonalną metodą przeciwsurowiczą w taki sposób, Że frakcja przeciwciała składa się w zasadzie z przeciwciał, które wiążą się z danym, swoistym epitopem, i najkorzystniej, stanowi przeciwciało monoklonalne. Ponadto, przeciwciało anty-E może, jeżeli jest to pożądane, zawierać więcej niz jedno przeciwciało, to znaczy więcej niż jedno przeciwciało monoklonalne w celu uzyskania pożądanego hamowania MMI. Należy również rozumieć, że pożądany stopień hamowania wiązania przeciwciała MMI z fPSA, uzyskany przez wiązanie z przeciwciałami anty-E, będzie typowo wynosił powyżej 90%, bardziej typowo powyżej 95% i najbardziej typowo powyżej 99%.

Szczególnie korzystne monoklonalne przeciwciała MMI można wytworzyć różnymi sposobami. Ogólnie, przeciwciało monoklonalne wytwarza się stosując konwencjonalne techniki hybrydyzacji komórek somatycznych z zastosowaniem sposobu przesiewu do selekcji

188 200 linii komórek hybrydoma, co prowadzi do wyizolowania hybrydoma wytwarzających przeciwciała monoklonalne o określonych właściwościach wiązania MMI. Zasada takiego przesiewu opiera się na dobraniu przeciwciał blokujących wiązanie innych przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom dostępnym na fPSA, lecz nieobecnym na cPSA, np. przeciwko epitopowi E, przy czym same te przeciwciała wykazują w zasadzie takie samo wiązanie z fPSA, co z cPSA.

Hybrydyzacja komórek somatycznych stanowi obecnie sposób dobrze znany specjalistom; można ją stosować w niniejszym wynalazku we wszystkich jej odmianach, w zależności od potrzeb. Ogólnie, wytwarza się populację hybrydoma przez fuzję komórek szpiczaka z limfocytami pobranymi od zwierzęcia, które uprzednio immunizowano przeciwko analizowanemu białku. Immunizacja zwierzęcia-gospodarza, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza pobudzenie układu immunologicznego zwierzęcia do wytwarzania przeciwciał, które będą wiązać się z jednym lub więcej epitopami badanego białka. Dla specjalisty oczywiste będzie, że wynik taki można uzyskać dowolnymi sposobami, włączając w to, lecz bez ograniczenia, podawanie tego białka natywnego, syntetycznego immunogenu peptydowego, komórek transfekujących wykazujących ekspresję epitopów badanego białka na swej powierzchni, lub tym podobnych, do krwi obwodowej zwierzęcia-gospodarza. Podobnie, znane specjalistom są sposoby wytwarzania i zbierania przeciwciał monoklonalnych, sklonowanych linii komórek hybrydoma; ogólnie biorąc, w sposobie według niniejszego wynalazku można stosować dowolne znane metody.

Jak to opisano powyżej, głównym kryterium przesiewu hybrydoma, wytwarzających przeciwciała monoklonalne wykazujące charakterystykę MMI, jest to, że wytwarzają one przeciwciało monoklonalne, które (i) wiąże się w zasadzie jednakowo z fPSA i cPSA, ale (ii) jest w zasadzie niezdolne do wiązania się z PSA wtedy, gdy PSA jest związane z przeciwciałem skierowanym swoiście przeciwko fPSA (z przeciwciałem anty-E). Zamiast tego, lecz mniej korzystnie, kryterium przesiewu może być takie, że dobiera się hybrydoma, które wytwarzają przeciwciała monoklonalne, które (i) wiąże się w zasadzie jednakowo z fPSA i cPSA, ale (ii) po związaniu z PSA powoduje, że PSA staje się w zasadzie niezdolne do wiązania się z przeciwciałami skierowanymi swoiście przeciwko fPSA, to znaczy, z przeciwciałami, które mogą wiązać się z fPSA, lecz nie z cPSA. Sposób, w jaki przeciwciało monoklonalne MMI według niniejszego wynalazku działa dla uzyskania tego skutku, nie jest w pełni wyjaśniony; jednakże spekuluje się, ze wiązanie przeciwciała monoklonalnego (to znaczy, przeciwciała anty-E) z fPSA blokuje, maskuje, zasłania lub zmienia epitop (epitopy) dostępne zarówno na fPSA, jak i cPSA, dla wiązania się z przeciwciałem lub przeciwciałami skierowanym (skierowanymi) przeciwko takiemu epitopowi (epitopom). Przykładem przeciwciał monoklonalnych MMI stosowanych według niniejszego wynalazku stanowi przeciwciało MMI, stosowane w urządzeniu Bayer Immuno 1™ PSa Assay (Bayer Corporation, Tarrytown, New York, Stany Zjednoczone); przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez linię komórek hybrydoma 346.7.4 i 346.7.26, zdeponowane przez autorów niniejszego wynalazku (Bayer Corporation) w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Stany Zjednoczone, 10 kwietnia 1997, pod numerami depozytu, odpowiednio, HB-12338 i HB-12337; i przeciwciała monoklonalne wiążące się z w zasadzie tym samym epitopem, co dowolne z wyżej wymienionych przeciwciał.

Korzystnie, reagenty i inne składniki testu, niezbędne do przeprowadzenia wyżej opisanego, szczególnie korzystnego sposobu oznaczania cPSA, dostarcza się w postaci zestawu testowego, to znaczy opakowania zawierającego wszystkie składniki i aparaturę analityczną niezbędne użytkownikowi do przeprowadzenia testu. Zestaw testowy zawiera co najmniej opisane szczegółowo przeciwciała „wychwytujące” i „detekcyjne” i jedno lub więcej przeciwciał anty-E.

Stwierdzono obecnie, ze poziom cPSA we krwi mężczyzn ma istotne znaczenie kliniczne w porównaniu ze znanymi ze stanu techniki poziomem tPSA i wartością stosunku fPSAtPSA. Bardziej szczegółowo, przeprowadzono badanie wstępne z zastosowaniem próbek surowicy od 216 pacjentów, w tym 53 pacjentów z rakiem gruczołu krokowego, 75 pacjentów z BPH i 88 zdrowych męzczyzn z grupy kontrolnej w wieku powyżej 50 lat (poniżej;

188 200 dane przedstawione na fig. 4A). W tym badaniu wstępnym górną granicę normy w teście cPSA ustalono w taki sposób, aby zapewnić czułość wykrywania przypadków raka gruczołu krokowego równą czułości pomiaru tPSA (odpowiednio, 85% w stosunku do 88%). Dla wszystkich badanych pacjentów swoistość w populacjach zdrowej i BPH była również porównywalna w zakresie porównania cPSA ze stosunkiem fPSA/tPSA. Wyniki te potwierdzono w następnym badaniu z zastosowaniem próbek surowicy pobranych od 300 pacjentów poddanych biopsji w wyniku skierowania do urologa, w tym 75 pacjentów z rakiem gruczołu krokowego i 225 pacjentów, u których biopsja pozwoliła na wykluczenie raka gruczołu krokowego (poniżej; dane przedstawione na fig. 3b). Stwierdzenie, że czułość i swoistość testu tPSA stosowanego w połączeniu z obliczaniem stosunku fPSA/tPSA oznacza, że sama wartość cPSA pozwala również wyciągnąć prawdziwe wnioski, jeżeli przeprowadzi się stratyfikację populacji pacjentów do szarej strefy diagnostycznej. Nie określono szczegółowo zakresu diagnostycznej szarej strefy, jednakże we wszystkich zakresach porównywanych w tym badaniu, czułość i swoistość testu cPSA była porównywalna z czułością i swoistością testu oznaczania PSA całkowitego i wolnego. Dane te wskazują, ze jeden test, oznaczanie cPSA, pozwala na wykrywanie raka gruczołu krokowego w sposób równie skuteczny, jak oznaczanie PSA całkowitego, i że ponadto wykazano lepszą swoistość przy zastosowaniu dwóch testów, fPSA i tPSA.

W badaniach odnoszonych do powyzszego badania górna granica normy, dobrana dla danych z testu cPSA, wynosiła 3,75 ng/ml (przy czym wartość tę wyrażono jako równoważnik stężenia PSA). Tę górną granicę normy dobrano w taki sposób, aby osiągnąć czułość wykrywania raka gruczołu krokowego w grupie mężczyzn z histologicznie potwierdzonym rakiem w zasadzie podobną do czułości uzyskiwanej z zastosowaniem wartości górnej granicy normy wynoszącej 4,0 ng/ml w teście tPSA (85% w porównaniu z 88% w badaniu wstępnym i 81% w porównaniu z 83% w badaniu następnym). Jasne jest oczywiście, że przy badaniu większych grup optymalna wartość górnej granicy normy dla wartości cPSA może w pewnym stopniu ulegać zmianie, jednakże sądzi się, że ta optymalna wartość górnej granicy normy będzie w każdym razie wynosić około 3-4 ng/ml (co odpowiada około 9-12 ng/ml PSA-ACT). Dobranie górnej granicy normy powyżej wartości 4 ng/ml, jak się sądzi, dawałoby w wyniku niedopuszczalny klinicznie poziom czułości, natomiast dobranie górnej granicy normy poniżej 3 ng/ml mogłoby przez niektórych klinicystów być uznane za zwiększenie czułości przy dopuszczalnym zmniejszeniu swoistości. Uważa się jednak, że niezależnie od poziomu czułości, sposób oznaczania cPSA według wynalazku pozwala na osiągnięcie, w pojedynczym teście, znaczącej poprawy poziomu swoistości w porównaniu z konwencjonalnymi technikami tPSA, i równego lub ulepszonego poziomu swoistości w porównaniu z niedawno opublikowanymi technikami opartymi na obliczaniu stosunku wyników dwóch testów, np. fPSA/tPSA. Ponadto, można zwiększyć wykrywanie raka gruczołu krokowego u mężczyzn bez objawów klinicznych poprzez kilkakrotne oznaczanie cPSA w czasie, jak to wykazano dla wielokrotnych oznaczeń tPSA (29).

Oprócz powyżej omówionego zastosowania do wykrywania raka gruczołu krokowego, oznaczanie cPSA jest korzystne w monitorowaniu przebiegu choroby u pacjentów, u których rozpoznano raka gruczołu krokowego, zwłaszcza po zastosowaniu leczenia przeciwnowotworowego pierwszego rzutu. Stwierdzono, ze monitorowanie takich pacjentów przez wielokrotne oznaczanie tPSA jest korzystne we wczesnym wykrywaniu wznowy raka gruczołu krokowego. Uważa się, że cPSA jest swoistą dla raka postacią PSA, i jest tą postacią, której wzrostu poziomu w surowicy należy się spodziewać wtedy, gdy dochodzi do wzrostu utajonych komórek nowotworowych i dawania przez nie przerzutów. W związku z tym, zmiany poziomu cPSA we krwi w czasie korelują ze zmianami w stanie choroby, w szczególności wzrost poziomu cPSA we krwi po leczeniu jest oznaką nawrotu choroby.

Ponadto, jako ze cPSA składa się głównie z PSA-ACT, znaczenie kliniczne i korzyści z oznaczania cPSA rozciągają się również na oznaczenia PSA-ACT (jak to wykazano w badaniu, w którym uzyskano wyniki przedstawione na fig. 6). Ogólnie, techniki testów immunologicznych do oznaczania PSA-ACT, które najłatwiej jest wykonać korzystając z obecnie dostępnej aparatury, stanowią testy immunometryczne o podwójnej swoistości z zastosowaniem

188 200 przeciwciała anty-PSA w połączeniu z przeciwciałem anty-ACT lub przeciwciałem skierowanym swoiście przeciwko kompleksowi PSA-ACT. Jednym ze sposobów wytwarzania tego drugiego przeciwciała jest monoklonalna selekcja przeciwciała skierowanego przeciwko epitopowi konformacyjnemu na kompleksie PSA-ACT, to znaczy w punkcie (lub w pobliżu tego punktu) na powierzchni kompleksu, w którym składowe PSA i ACT stykają się. Obecnie jednak techniki te nie są zbyt dobrze rozwinięte i/lub napotykają na trudności analityczne; w związku z tym, dopóki nie nastąpią korzystne zmiany w stanie techniki, oznaczanie PSA-ACT będzie wymagać zastosowania bardziej uciążliwych sposobów. Na przykład, jak to wykazał Leinonen i wsp., kompleksy PSA-ACT można oddzielać przez chromatografię żelową filtracyjną (sito molekularne) i oznaczać w testach wykrywających tPSA lub swoistych ze względu na PSA-ACT (15).

Poniżej przedstawiono przykłady, ilustrujące niniejszy wynalazek bez jego ograniczenia.

Przykłady

Materiały

Do przeciwciał anty-PSA, stosowanych w niniejszych badaniach, należą MMI, przeciwciało monoklonalne rozpoznające epitop, który ulega ekspresji na PSA wolnym i PSA związanym z inhibitorami proteinaz. Przeciwciało wytwarza się w płynie puchlinowym myszy i oczyszcza przez chromatografię powinowactwa do białka A z zastosowaniem rutynowych sposobów. MP2 stanowi poliklonalne przeciwciało anty-PSA, wytworzone przez organizm kozy i oczyszczone przez chromatografię powinowactwa na unieruchomionym PSA. PSA 19, PSA 20, PSA 30 (CanAg Diagnostics aB, Gothenburg, Szwecja) i ME2 (Biospacific, Emeryville, Kalifornia, Stany Zjednoczone) stanowią przeciwciała monoklonalne, rozpoznające epitop E PSA. ACT 53 (CanAg Diagnostics) stanowi przeciwciało monoklonalne skierowane swoiście przeciwko ACT. Wolne przeciwciało skierowane swoiście przeciwko gruczołowi krokowemu (Stripps Laboratories, San Diego, Kalifornia, Stany Zjednoczone) oczyszczono z ludzkiego płynu nasiennego z 98% czystością poprzez elektroforezę na żelu z soli sodowej siarczanu dodecylowego i poliakrylamidu i przechowywano w buforze, zawierającym 10 mM Tris, 0,1% azydku sodowego, pH 8,0. PSA-ACT (Stripps Laboratories, San Diego, Kalifornia, Stany Zjednoczone) wykazywał powyżej 96% czystosć w elektroforezie na żelu z soli sodowej siarczanu dodecylowego i poliakrylamidu i przechowywano go w buforze, zawierającym 10 mM octanu sodowego, 150 mM chlorku sodowego i 0,1% azydku sodowego, pH 5,6.

Test Bayer Immuno 1™ na PSA całkowite

Test Bayer Immuno 1 na PSA całkowite (tPSA) stanowi test typu „sandwich” z zastosowaniem przeciwciała monoklonalnego do wychwytywania i przeciwciała poliklonalnego do detekcji (wykrywania) PSA. Przeciwciało monoklonalne anty-PSA (MMI) jest sprzężone z fluoresceiną (Rl), a oczyszczone techniką chromatografii powinowactwa przeciwciało poliklonalne (MP2) jest sprzężone z fosfatazą zasadową (R2). Przeciwciała rozcieńcza się do stężenia 1,5 pg/ml dla Rl i 6,15 pg/ml dla R2 w buforze zawierającym 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, i 5% inaktywowanej cieplnie prawidłowej surowicy koziej (Biocell Laboratories, Carson, Kalifornia, Stany Zjednoczone). Próbki o objętości 65 μ1 każdego z tych dwóch przeciwciał inkubuje się z próbką o objętości 20 jii w kuwecie reakcyjnej w temperaturze 37°C, i powstały kompleks immunologiczny (R1-PSA-R2) wychwytuje się przez dodanie cząstek magnetycznych powleczonych monoklonalnymi przeciwciałami antyfluoresceinowymi (20 pl). Po etapie płukania dla usunięcia nadmiaru odczynników i składników próbki dodaje się 300 |il 23 mM fosforanu p-nitrofenylowego. Prędkość tworzenia zabarwienia monitoruje się mierząc absorbancję przy 405 lub 450 nm i ta prędkość wytwarzania zabarwienia jest wprost proporcjonalna do stężenia PSA w próbce badanej. Blizsze szczegóły przedstawiono w J. Clin. Lab. Anal. (1996), 10:155-159. Kalibrację analizatora Bayer Immuno 1 prowadzi się z zastosowaniem kałibratorów Bayer Immuno 1 SET Point® PSA, wytworzonych z wolnego PSA w stężeniu 0, 2, 10, 25, 50 i 100 ng/ml. Do wytworzenia standardowej krzywej kalibracyjnej stosuje się algorytm dopasowywania na siatce sześciennej.

Test Bayer Immuno 1 na PSA wolne

Dokonano adaptacji sposobu opisanego powyżej dla testu Bayer Immuno 1 na PSA całkowite w celu oznaczania PSA wolnego poprzez podstawienie zamiast przeciwciała „wy14

188 200 chwytującego” Rl przeciwciała monoklonalnego skierowanego swoiście przeciwko wolnemu PSA (PSA 19 - CanAg), sprzężonego z fluoresceiną. Przeciwciało monoklonalne Rl skierowane przeciwko wolnemu PSA zastosowano z tym samym poliklonalnym przeciwciałem anty-PSA sprzężonym z fosfatazą zasadową (R2), które stosowano w teście na PSA całkowite. Koniugat Rl rozcieńczono do stężenia 2,5 ng/ml, a R2 stosowano w stężeniu 6,16 pg/ml. Pozostałe warunki były podobne do warunków testu tPSA, z tym wyjątkiem, że objętość próbki wynosiła 35 (j.1 na test, a objętość dodanych cząstek magnetycznych wynosiła 15 pl/test.

Metoda Bayer Immuno 1 na PSA-ACT

Format testu Bayer Immuno 1 PSA-ACT był taki sam, jak testu Bayer Immuno 1 tPSA, z wyjątkiem następujących zmian: (1) przeciwciało monoklonalne, skierowane swoiście przeciwko ACT, ACT 53, jest sprzęzone z fosfatazą zasadową i stosuje się je do detekcji w stężeniu 2 pg/ml; (2) PSA-ACT stosuje się jako kalibrator i antygen kontrolny z 50 mM bufora MES, 6% BSA, pH 5,8 i (3) stosuje się protokół z dwukrotnym płukaniem, takim, że antygen inkubuje się najpierw z przeciwciałem „wychwytującym”, powstały kompleks płucze się dla usunięcia niezwiąząnego antygenu, i dodaje się pozostałe składniki surowicy, po czym przeciwciało „detekcyjne”.

Selekcja i optymalizacja przeciwciał swoistych do hamowania immunoreaktywności PSA wolnego w teście na PSA całkowite

Niniejszy wynalazek jest oparty na obserwacji, że test na wykrywanie PSA całkowitego można uczynić swoistym na kompleksy PSA-inhibitor proteaz poprzez dodanie antygenu skierowanego przeciwko epitopowi E PSA. Badano czteiy przeciwciała monoklonalne, PSA 19, PSA 20, PSA 30 i ME2, skierowane swoiście przeciwko epitopowi E cząsteczki PSA, ze względu na ich zdolność do zmniejszania reaktywności wolnego PSA w teście na oznaczanie PSA całkowitego. Kalibratory stosowane w teście na oznaczanie PSA całkowitego wytworzono stosując 100*% czysty PSA oczyszczony z płynu nasiennego. Przeciwciała anty-E, PSA 19, PSA 20 i PSA 30, dodano do 50 ng/ml kalibratora PSA, w stężeniach 0, 10, 25, 50, 100 i 200 pg/ml. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut mieszaniny te poddano testowi na oznaczanie PSA całkowitego i oznaczono odtwarzanie PSA. Jak to przedstawiono na fig. 1A, wszystkie trzy przeciwciała monoklonalne PSA 19, PSA 20 i PSA 30 wykazały istotne hamowanie reaktywności wolnego PSA w teście na oznaczanie PSA całkowitego. To zmniejszenie immunoreaktywneści PSA wolnego zależało od stężenia dla każdego z przeciwciał, jednakże jedynie PSA 20 sięgał nasycenia. Spośród tych trzech przeciwciał anty-E, PSA 20 powodowało największe zmniejszenie sygnału wolnego PSA.

W oddzielnym doświadczeniu porównywano PSA 20 i ME2 ze względu na ich zdolność hamowania wiązania wolnego PSA w teście tPSA. Do 10 ng/ml kalibratora dodano przeciwciała monoklonalne w stężeniu 0-400 pg/ml. Jak to przedstawiono na fig. IB, MAb ME2 hamuje ilościowo wiązanie wolnego PSA w całkowitym PSA i osiąga nasycenie w stężeniu poniżej 6,125 pg/ml. Dane te wykazują ze niektóre przeciwciała przeciwko epitopowi E mają zdolność hamowania wiązania przeciwciała MMI z wolnym PSA. Jednakże, MAb ME2 hamuje wiązanie wolnego PSA w teście PSA całkowitego w znacznie niższych stężeniach i w znacznie większym stopniu, niż inne przeciwciała skierowane przeciwko epitopowi E. Hamowanie to może być spowodowane wyższym powinowactwem przeciwciała ME2 do epitopu E; lub też epitop E może stanowić zbiór epitopów różniących się nieznacznie właściwościami.

Oznaczanie kompleksów PSA związanego w urządzeniu Bayer Immuno 1

Dodanie przeciwciał monoklonalnych PSA 20 i ME2 do testu PSA całkowitego eliminuje większość immunoreaktywności związanej z wolnym PSA. W celu demonstracji ilościowego oznaczania związanego PSA, wytworzono mieszaniny o różnej zawartości wolnego i związanego z ACT PSA przy całkowitym stężeniu PSA wynoszącym około 11 ng/ml. Stosunek PSA wolnego : związanego w mieszaninach wynosił 100 : 0, 80 : 20, 50 : 50, 20 : 80 i 0 : 100. Dokonano oznaczenia tych mieszanin z zastosowaniem trzech formatów testów immunologicznych, w urządzeniu Bayer Immuno 1: dostępny w handlu test na PSA całkowite (tPSA), test Bayer Immuno 1 na wolne PSA (fPSA) i test Bayer Immuno 1 na PSA związane (cPSA). Test Bayer Immuno 1 na PSA związane był identyczny jak test tPSA, z tym wyjątkiem, że dla

188 200 wyników przedstawionych na fig. 2A do każdej próbki dodano MAb PSA 20 w końcowym stężeniu wynoszącym 300 pg/ml, i ze stężenie koniugatu MM1 z fluoresceiną zmniejszono z 1,5 pg/ml do 0,5 pg/ml. Dla doświadczenia przedstawionego na fig. 2B, do każdej próbki dodano MAb ME2 w końcowym stężeniu wynoszącym 25 pg/ml, i że koniugat MM1 - fluoresceina zastosowano również w stężeniu 0,5 ng/ml. Dla oznaczania PSA całkowitego i PSA wolnego dokonano kalibracji urządzenia Bayer Immuno 1 za pomocą zestawu kalibracyjnego Bayer Immuno 1 SET Point, dostępnego w handlu do zastosowania w teście tPSA Bayer Immuno 1. W celu oznaczania PSA związanego (cPSA) wytworzono kalibratory w zakresie stężeń 0-100 ng/ml z zastosowaniem PSA związanego z ACT w 50 mM MES, 6% BSA, pH 5,8.

Dodanie MAb PSA 20 do testu PSA całkowitego zapewnia sposób o niemal ilościowej reaktywności z PSA związanym (fig. 2 A). Odpowiedź na poszczególne mieszaniny w teście cPSA była liniowa, i oznaczanie stężenia PSA całkowitego i PSA związanego dało zgodne wyniki - około 10 ng/ml dla wszystkich badanych próbek, tak jak tego oczekiwano. Podobnie, MAb ME2 zapewnia sposób o ilościowej reaktywności z PSA związanym w całym zakresie proporcji wolnego i związanego PSA (fig. 2B). Ponadto, w teście na PSA związane z zastosowaniem MAb ME2, stosuje się istotnie niższe stężenie MAb ME2 (25 pg/ml) w porównaniu ze stężeniem w teście dla MAb PSA 20 (300 pg/ml). Dane te wskazują, że trzy przeciwciała reagujące z różnymi epitopami na cząsteczce PSA (MM1, MP2 i albo PSA 20, albo ME2) można stosować łącznie dla zapewnienia sposobu dokładnego oznaczania PSA związanego.

Automatyzacja testu cPSA

Obróbka wstępna próbek pobranych od pacjentów z użyciem MAb skierowanego przeciwko epitopowi E nie jest praktyczna w zastosowaniu w laboratorium klinicznym. Dokładne odmierzenie MAb do próbki jest trudne i czasochłonne i prowadzi do niedopuszczalnie wysokiego prawdopodobieństwa niedokładności wyniku. Opracowano zatem sposoby pełnej automatyzacji testu cPSA.

Zautomatyzowane techniki MAb PSA 20

W formacie I testu, MAb PSA 20 dodano do odczynnika R1, MM1-fluoresceiny, w stężeniu 500 pg/ml, i test prowadzono tak, jak dla metody tPSA, stosując do kalibracji PSA-ACT. Test trwał 38 minut. W formacie II testu próbkę poddano obróbce wstępnej MAb PSA 20, w miejscu prowadzenia testu. W tym formacie przeciwciało PSA 20 dodawano do kuwety reakcyjnej razem z próbką pobraną od pacjenta i inkubowano przez 50 minut. Następnie dodano MM1-fluoresceinę w stężeniu 0,5 pg/ml, MP2-ALP w stężeniu 6,15 pg/ml i cząstki magnetyczne powleczone przeciwciałami antyfluoresceinowymi, i całość inkubowano przez dalsze 28 minut. Po wymyciu nadmiaru odczynników i nieprzereagowanej surowicy dodano substrat, i monitorowano tworzenie się zabarwienia, w ten sam sposób, jak dla testu tPSA. Stosowano próbki zawierające wolne PSA w stężeniu wynoszącym od 2 ng/ml do 25 ng/ml. Wyniki na fig. 3 ukazują że stosując dowolną z tych metod można uzyskać skuteczne zmniejszenie sygnału wolnego PSA do bardzo niskiego poziomu. Wyniki te sugerują, że można dokonać całkowitej automatyzacji tej metody na urządzeniu Bayer Immuno 1.

Zautomatyzowana metoda MAb ME2

MAb ME2 hamuje wiązanie MAb MM1 z fPSA w teście tPSA w istotnie niższym stężeniu i w większym stopniu, niż MAb PSA 20. Ponadto, format II testu wymaga dłuższego czasu i zastosowania dwóch kaset odczynników. W związku z tym, dobrano MAb ME2 jako trzecie przeciwciało do automatyzacji testu cPSA poprzez dodanie do testu tPSA na dwa sposoby - ME2 w stężeniu 50 i 100 ng dodano do odczynnika 1 (R1) lub też do odczynnika 2 (R2). Wyniki ukazują że po dodaniu ME2 do, odpowiednio, R1 i R2, reaktywność fPSA ulegała 97% i 98% hamowaniu. W oparciu o te dane stwierdzono, ze test cPSA można zmodyfikować w taki sposób, aby stosować MAb ME2 w odczynniku R2 w końcowym stężeniu wynoszącym 100 pg/ml.

Oznaczanie PSA związanego w surowicy

Badania pilotażowe

Próbki surowicy pobrane od 53 pacjentów z rakiem gruczołu krokowego, 75 pacjentów z BPH i 88 zdrowych mężczyzn z grupy kontrolnej, dobranej ze względu na wiek, poddano

188 200 analizie stosując trzy testy: tPSA, fPSA i cPSA. Próbki badane w teście cPSA poddano obróbce wstępnej 25 pg/ml przeciwciała ME2, natomiast próbek badanych w teście fPSA i tPSA nie poddawano obróbce wstępnej. Testy kalibrowano, stosując wolne PSA lub też kompleksy PSA-ACT, jak to opisano powyżej. Wyniki badania przedstawiono na fig. 4A. Górną granicę normy, 3,75 ng/ml (wyrażoną jako równoważnik stężenia PSA) dobrano w celu osiągnięcia czułości wykrywania raka gruczołu krokowego w grupie mężczyzn z histologicznie potwierdzonym rakiem w zasadzie podobnej do czułości osiąganej przy zastosowaniu górnej granicy normy 4,0 ng/ml w teście tPSA (85% w porównaniu z 88%). Przy tej górnej granicy normy swoistość w populacji zdrowej i w populacji z BPH, badanych w tym badaniu, była również porównywalna, ze względu na cPSA, z dwuetapowym testem, w którym po uzyskaniu dodatniego wyniku tPSA przeprowadzano test fPSA i obliczano stosunek fPSA/tPSA. Stwierdzenie, ze czułość i swoistość testu tPSA stosowanego łącznie z obliczaniem stosunku fPSA/tPSA jest równa czułości i swoistości samego testu cPSA, było również prawdziwe, jeżeli dokonano stratyfikacji populacji pacjentów do diagnostycznej szarej strefy. Nie zdefiniowano szczegółowo diagnostycznej szarej strefy, jednakże w całym zakresie objętym niniejszym badaniem czułość i swoistość testu cPSA była porównywalna z czułością i swoistością uzyskanymi z zastosowaniem łącznym testu na PSA całkowite i PSA wolne. Dane te wskazują że w pojedynczym teście, teście na cPSA, można wykrywać raka gruczołu krokowego równie skutecznie, jak oznaczając PSA całkowite, i ponadto, że test cPSA wykazuje ulepszoną swoistość, jaką ma łączne stosowanie dwóch testów: fPSA i tPSA.

Badanie kliniczne

W szpitalu Seattle VA Hospital w Seattle, stan Washington, Stany Zjednoczone, analizowano próbki surowicy pobrane od 300 pacjentów poddanych biopsji (75 z potwierdzonym rakiem gruczołu krokowego), stosując trzy testy: tPSA (z użyciem Hybritech Tandem® PSA Assay, San Diego, Kalifornia, Stany Zjednoczone), fPSA (z użyciem Hybritech Tandem® Free PSA Assay) i cPSA (z wykorzystaniem zautomatyzowanej metody MAb ME2, jak to opisano powyżej). Testy kalibrowano, stosując wolne PSA lub też kompleksy PSA-ACT, jak to opisano powyżej. Wyniki badania przedstawiono w postaci tabeli na fig. 4B i w postaci analizy regresyjnej na fig. 4C. Górną granicę normy, 3,75 ng/ml (wyrażoną jako równoważnik stężenia PSA) dobrano znowu, w celu osiągnięcia czułości wykrywania raka gruczołu krokowego w grupie mężczyzn z histologicznie potwierdzonym rakiem w zasadzie podobnej do czułości osiąganej przy zastosowaniu górnej granicy normy 4,0 ng/ml w teście tPSA (81% w porównaniu z 83%). Przy tej górnej granicy normy swoistość w populacji zdrowej i w populacji z BPH, badanych w tym badaniu, była również porównywalna, ze względu na cPSA, z dwuetapowym testem (powyżej; tPSA + fPSA/tPSA). Na fig. 4C kółka w dolnym prawym kwadrancie wykresu przedstawiają dane dotyczące pacjentów, u których raka nie potwierdzono (34 ze 117, czyli 29%), i u których można by uniknąć ryzyka, dyskomfortu i wydatków związanych z biopsją gdyby decyzję o ewentualnym wykonaniu biopsji oparto na oznaczaniu cPSA, a nie na oznaczaniu tPSA. Ponadto, podobnie jak w badaniu pilotażowym, stwierdzenie, ze czułość i swoistość testu tPSA stosowanego łącznie z obliczaniem stosunku fPSA/tPSA jest równa czułości i swoistości samego testu cPSA, było również prawdziwe, jeżeli dokonano stratyfikacji populacji pacjentów do diagnostycznej szarej strefy (jak wyżej).

Dane z niezależnych badań, pilotażowego i klinicznego, wskazują, że w pojedynczym teście, teście na cPSA, można wykrywać raka gruczołu krokowego równie skutecznie, jak oznaczając PSA całkowite, i ponadto, że test cPSA wykazuje ulepszoną swoistość, jaką ma łączne stosowanie dwóch testów: fPSA i tPSA.

Korelacja pomiędzy cPSA a PSA-ACT

Dla stwierdzenia, który rodzaj związanego PSA oznacza się w teście cPSA, opracowano test do oznaczania PSA związanego z ACT. Jak donoszono w literaturze, ten rodzaj PSA związanego stanowi główną postać związanego PSA w surowicy. Uprzednie próby oznaczania PSA-ACT, z zastosowaniem metod manualnych, napotkały na trudności techniczne, jak to opisano powyżej. W związku z tym opracowano zautomatyzowany test immunologiczny do oznaczania kompleksu PSA-ACT w systemie Bayer Immuno 1™. Badano tę sama populację pacjentów, jak to opisano powyżej dla badania pilotażowego, stosując zautomatyzowany test

188 200

PSA-ACT. Wyniki przedstawiono na fig. 6A-6F, gdzie ukazano analizę regresyjną wyników uzyskanych z zastosowaniem zautomatyzowanego testu PSA-ACT w porównaniu z wynikami uzyskanymi z zastosowaniem zautomatyzowanego testu cPSA. Dla wszystkich populacji pacjentów, to znaczy osób zdrowych, chorych z rakiem gruczołu krokowego i z łagodną chorobą gruczołu krokowego (BPH) przeprowadzono analizę regresyjną dla wszystkich próbek, w zakresie zawierającym wyniki badań większości próbek. Sposób ten zastosowano w celu eliminacji obciążenia analizy regresyjnej spowodowanego małą liczbą wartości wysokich. W każdym razie, nachylenie regresji wynosiło 0,93-0,98. Dane te wskazują, że około 93-98% substancji oznaczanych w teście cPSA stanowi PSA-ACT. Nie jest obecnie znana natura biochemiczna pozostałych 2-7% cPSA.

Swoistość testów PSA w wybranych zakresach czułości

Wyznaczono górną granicę normy dla testu cPS A w celu osiągnięcia podobnej czułości, jak w teście tPSA. Stosując tę wartość granicy normy, udowodniono, że test cPSA zapewnia poprawę swoistości w stosunku do metod obecnie stosowanych w praktyce medycznej, to znaczy, tPSA. Oznaczano również swoistość testu cPSA, stosując różne wartości górnej granicy normy. Wszystkie wyniki, pochodzące z badań klinicznych opisanych powyżej, zastosowano w analizie charakterystyki operacyjnej dla odbiorcy (Receiver Operator Characteristics ROC). Następnie z analizy ROC określono swoistość przy różnych poziomach czułości, wynoszących 80-100%. Wartości czułości poniżej 80% mają niewielką wartość kliniczną, ponieważ sposoby diagnostyczne stosowane obecnie zapewniają co najmniej taki sam poziom czułości. Wyniki przedstawione na fig. 7 wykazują, ze przy wszystkich poziomach czułości test cPSA zapewnia zwiększoną czułość w stosunku do testu tPSA i w przybliżeniu taką samą, lub nieznacznie lepszą, swoistość, jak zastosowanie dwóch testów, tPSA i fPSA. Ponadto, poprawa swoistości jest widoczna również wtedy, gdy próbki od pacjentów stratyfikowano do diagnostycznej szarej strefy. Wyniki te wykazują ponadto, że górną granicę normy dla testu PSA można dobierać w szerokim zakresie, w zalezności od pożądanego poziomu czułości i swoistości, jednakże przy wszystkich wartościach górnej granicy normy, wynoszących od około 3 do 4 ng/mg, test cPSA zapewnia ulepszoną swoistość w porównaniu z testem tPSA, i w przybliżeniu równą swoistość, jak wartość stosunku fPSA/tPSA.

Niniejszy wynalazek został szczegółowo opisany, i podano przykłady jego wykonania, powyżej; oczywiście, dokonywać można licznych modyfikacji wynalazku bez wychodzenia poza jego zakres.

Claims (27)

1. (1) pierwsze przeciwciało anty-PSA wiążące się z PSA całkowitym (tPSA), (2) drugie przeciwciało anty-PSA wiążące się z tPSA, lecz w zasadzie niezdolnym do wiązania się z PSA wtedy, gdy PSA jest związane z takim przeciwciałem, które wiąże się z wolnym PSA (fPSA), a nie wiąże się z cPSA, przy czym jedno z tych dwóch przeciwciał, pierwszego i drugiego, jest wyznakowane, a drugie jest unieruchomione lub podatne na unieruchomienie w celu oddzielenia z wodnej mieszaniny testowej, i (3) trzecie przeciwciała anty-PSA, wiążące się z fPSA, lecz nie z cPSA.

   1. Sposób oznaczania związanego antygenu swoistego dla gruczołu krokowego (cPSA) w próbce krwi, znamienny tym, że obejmuje etapy:

   (a) poddania całkowitego PSA (tPSA) w próbce krwi takiej obróbce, aby uczynić wolny PSA (fPSA) w zasadzie niewykrywalnym w teście immunologicznym, i (b) oznaczania PSA, w poddanej obróbce próbce krwi, za pomocą testu immunologicznego, przy czym w zasadzie tylko cPSA jest wykrywalny w tym teście.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze etap (a) przeprowadza się poprzez oddzielenie fPSA od pozostałej części próbki krwi, i tym, że etap (b) przeprowadza się w tej pozostałej części próbki krwi.
3. 3.75 ng/ml.

   3.75 ng/ml.

   3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (a) przeprowadza się poprzez dodanie do próbki krwi środka chemicznego modyfikującego determinanty antygenowe fPSA w stopniu wystarczającym do tego, aby spowodować, że fPSA staje się w zasadzie niezdolne do wiązania się z przeciwciałem stosowanym w teście immunologicznym, i tym, że etap (b) przeprowadza się w mieszaninie testowej wytworzonej poprzez dodanie środka chemicznego do próbki krwi.
4. 4. Sposób według dowolnego z zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, ze test immunologiczny stanowi test immunologiczny o podwójnej swoistości.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że oba przeciwciała stosowane w immunologicznym teście immunometrycznym stanowią przeciwciała monoklonalne.
6. 6. Sposób oznaczania związanego antygenu swoistego dla gruczołu krokowego (cPSA) w próbce krwi, znamienny tym, że obejmuje etapy:

   (a) poddawania próbki krwi, dla wytworzenia płynnej mieszaniny, kontaktowi z trzema przeciwciałami anty-PSA:

   (i) pierwszym przeciwciałem anty-PSA, wiążącym się z PSA całkowitym (tPSA) (ii) drugim przeciwciałem anty-PSA, wiążącym się z tPSA, lecz w zasadzie niezdolnym do wiązania się z PSA wtedy, gdy PSA jest związane z takim przeciwciałem, które wiąże się z wolnym PSA (fPSA), a nie wiąże się z cPSA, przy czym jedno z tych dwóch przeciwciał, pierwszego i drugiego, jest wyznakowane („przeciwciało wyznakowane”), a drugie jest unieruchomione lub podatne na unieruchomienie w celu oddzielenia z płynnej mieszaniny testowej („przeciwciało wychwytujące”), i (iii) trzecim przeciwciałem anty-PSA, wiążącym się z fPSA, lecz nie z cPSA, przy czym związanie tego trzeciego przeciwciała z fPSA powoduje, że fPSA staje się w zasadzie niewykrywalne w niniejszym sposobie, (b) oddzielania tego przeciwciała wychwytującego z płynnej mieszaniny testowej, i (c) oznaczaniu znacznika w oddzielonej fazie przeciwciała wychwytującego lub w pozostałej części płynnej mieszaniny testowej.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że drugie przeciwciało anty-PSA stanowi przeciwciało monoklonalne.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, ze trzecie przeciwciało anty-PSA stanowi przeciwciało monoklonalne.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, ze trzecie monoklonalne przeciwciało anty-PSA wiąże się w zasadzie z tym samym epitopem, co przeciwciało monoklonalne wytwarzane przez linię komórkowąATCC HB-12337 lub HB-12338.
10. 10. Sposób według zastrz. 6 albo 7, albo 8, albo 9, znamienny tym, ze pierwsze przeciwciało anty-PSA stanowi przeciwciało monoklonalne.
11. 11. Sposób ułatwiania wykrywania raka gruczołu krokowego u mężczyzn, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    188 200 (a) oznaczania poziomu związanego antygenu swoistego dla gruczołu krokowego (cPSA) w próbce krwi pobranej od pacjenta, i (b) oznaczania, czy poziom cPSA we krwi pacjenta przekracza górną granicę normy, wynoszącą około 3-4 ng/ml.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, ze górna granica normy wynosi około
13. 13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że cPSA oznacza się sposobem według dowolnego z zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5.
14. 14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że cPSA oznacza się sposobem według dowolnego z zastrz. 6 albo 7, albo 8, albo 9, albo 10.
15. 15. Sposób monitorowania przebiegu choroby u pacjenta - mężczyzny z rozpoznanym rakiem gruczołu krokowego, znamienny tym, że obejmuje przeprowadzenie wielokrotnych testów immunologicznych w celu oznaczania zmian poziomu antygenu swoistego dla gruczołu krokowego (cPSA) w próbce krwi pobranej od takiego pacjenta, przy czym zmiany poziomu cPSA we krwi korelują ze zmianami stanu choroby.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że cPSA oznacza się sposobem według dowolnego z zastrz. 6 albo 7, albo 8, albo 9, albo 10.
17. 17. Sposób monitorowania przebiegu choroby u pacjenta po leczeniu raka gruczołu krokowego, znamienny tym, ze obejmuje przeprowadzenie wielokrotnych testów immunologicznych w celu oznaczania zmian poziomu antygenu swoistego dla gruczołu krokowego (cPSA) w próbce krwi pobranej od takiego pacjenta, przy czym wzrost poziomu cPSA we krwi jest wskaźnikiem nawrotu choroby.
18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że cPSA oznacza się sposobem według dowolnego z zastrz. 6 albo 7, albo 8, albo 9, albo 10.
19. 19. Sposób ułatwiania wykrywania raka gruczołu krokowego u męzczyzn, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (a) oznaczania poziomu PSA-ACT w próbce krwi pobranej od pacjenta, i (b) oznaczania, czy poziom PSA-ACT we krwi pacjenta przekracza górną granicę normy, wynoszącą około 3-4 ng/ml.

    2θ.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że górna granica normy wynosi około
21. 21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że poziom PSA-ACT w próbce krwi pacjenta oznacza się poprzez test immunometryczny o podwójnej swoistości z użyciem przeciwciała anty-PSA i przeciwciała anty-ACT.
22. 22. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że poziom PSA-ACT w próbce krwi pacjenta oznacza się poprzez test immunometryczny o podwójnej swoistości z użyciem przeciwciała anty-PSA i przeciwciała swoiście wiążącego się z kompleksem PSA-ACT.
23. 23. Zestaw testowy do oznaczania związanego antygenu swoistego dla gruczołu krokowego (cPSA) w próbce krwi, znamienny tym, ze zawiera:
24. 24. Zestaw testowy według zastrz. 23, znamienny tym, że drugie przeciwciało anty-PSA stanowi przeciwciało monoklonalne.
25. 25. Zestaw testowy według zastrz. 24, znamienny tym, ze trzecie przeciwciało anty-PSA stanowi przeciwciało monoklonalne.
26. 26. Zestaw testowy według zastrz. 25, znamienny tym, ze trzecie monoklonalne przeciwciało anty-PSA wiąże się w zasadzie z tym samym epitopem, co przeciwciało monoklonalne wytwarzane przez linię komórkową ATCC HB-12337 lub HB-12338.

    188 200
27. 27. Zestaw testowy według dowolnego z zastrz. 23 albo 24, albo 25, albo 26, znamienny tym, że pierwsze przeciwciało anty-PSA stanowi przeciwciało mononklonalne.