JP4274330B2 - ｃＰＳＡの測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液サンプル中の免疫学的に測定可能な複合体形態の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の測定に関する。より特定すると、本発明は、２部位免疫測定アッセイによる複合体化ＰＳＡの測定および複合体化ＰＳＡアッセイの数値の臨床上の意義に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）はヒトカリクレインファミリーに高度にアミノ酸相同性の約３３，０００ダルトンの糖タンパク質であり（１，２）、トリプシンおよびキモトリプシン様活性を有するセリンプロテアーゼであることが示されている（３，４，５）。ＰＳＡは前立腺の上皮細胞から分泌され、精液中に見出だされる主要なタンパク質の１つである（６）。前立腺ガンの患者の血清中でＰＳＡの濃度が上昇するという発見に続く多数の報告により、このタンパク質が前立腺ガン患者を治療する上で重要かつ臨床上有用なバイオマーカーであることが立証された（７，８，９，１０）。最近の努力は、無症状者の前立腺ガンの早期検出のための血清ＰＳＡ試験の利用に注がれている。実際、アメリカガン学会（American Cancer Society ）およびアメリカ泌尿器学会（American Urological Society ）は最近、５０才を超えたすべての男性は毎年直腸指診（ＤＲＥ）とともに血清ＰＳＡを使用してスクリーニングを受けるべきであると勧告した（11）。
【０００３】
前立腺ガンの早期検出の臨床的価値はいくつかの理由によって論争の的となっている。第１に、早期段階での前立腺ガンの治療が発症集団における生存率を改善するかどうかが明白でない。この論点を目的として計画された臨床試験は現在実施中である。第２に、最近、５０才を超えた男性における前立腺ガンの早期検出のために、血清ＰＳＡ測定の有効性について、直腸指診（ＤＲＥ）とあわせて臨床試験で測定した（12）。異常ＤＲＥまたは上昇したＰＳＡ試験値のいずれかを有した１０６０人の患者の内、２２％のみが前立腺ガンであった。これらのデータは全前立腺生検の７０−８０％がガンでない男性に実施されることを示している。５０才を超えた男性の３０−５０％が剖検上前立腺ガンの徴候を示すから、上昇ＰＳＡアッセイによって標的とされる不必要な前立腺生検の数は非常に高いということができる。このことは、医療コストの増大および生検操作に関連した罹病率の増大の両方の結果を招く。
【０００４】
ＰＳＡがα1-抗キモトリプシン（ＡＣＴ）、α2-マクログロブリンおよび α1-抗トリプシンなどのプロテアーゼインヒビターとの複合体を形成すること を、いくつかの研究室が別々に示した（13−19）。ＡＣＴ若しくはα1-抗トリ プシンとの複合体、または遊離の非複合体形態のＰＳＡはイムノアッセイ技術によって血清中で検出可能である。実際、血清中の免疫反応性ＰＳＡの大部分はＡＣＴと複合体化し、ＡＣＴに結合したＰＳＡおよび総血清ＰＳＡ濃度間には有意な相関性が証明されている（13）。しかし、α2-マクログロブリンに結合した ＰＳＡは、このプロテアーゼとの複合体化にともなう抗体のＰＳＡへの結合の立体障害によって、血清中で測定することができない。初期の研究において、ＰＳＡ−ＡＣＴレベルおよび総ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣＴの割合は前立腺ガン診断において有用であることが示唆された（13，15，16，17）が、種々の理由（その中のいくつかについて以下に論述する）によって、ＰＳＡ−ＡＣＴの血清測定の臨床上の有用性の結論を下すことは困難だった。
【０００５】
Lilja，Stenmanおよび共同研究者たちは１９９１年に、血清ＰＳＡが遊離形態ならびにＡＣＴおよびα1-抗トリプシンとの複合体で存在することを発表した（13，18）。その後の研究において、Stenman らは、遊離プラス複合体化ＰＳＡ（通常のＰＳＡアッセイではα2-マクログロブリンとの複合体化ＰＳＡは測定さ れないが、これを総ＰＳＡと称する）と関連させたＰＳＡ−ＡＣＴの測定が、前立腺ガンの男性と良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）などの良性の前立腺疾患の男性との鑑別を改善するらしいことを表明した。しかし、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の正確な測定は、この複合体の正確な測定における技術的問題のため、達成されていない。Stenman らは、ＰＳＡ−ＡＣＴ数値と総ＰＳＡの測定との相関関係は低濃度末端では良好でなく、ｙ軸交点が上昇して、複合体化ＰＳＡの過剰回収を示すことを発見した（13および米国特許第５，５０１，９８３ 号）。実際に、彼らは、試験した大部分の患者について、ＰＳＡ−ＡＣＴの濃度が総ＰＳＡよりも高いことを発見した（米国特許第５，５０１，９８３号）。その後の複合体および遊離のＰＳＡの相関関係の分析は、勾配１．１２を示し、これはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の過剰回収を示した（16）。Petterssonらは、メスの血清中で上昇したＰＳＡ−ＡＣＴ数値を発見した時、この過剰回収に注目した（20）。ヘパリンの添加はメス血清における偽陽性値の率を減少させたが、前立腺ガンおよびＢＰＨ患者におけるＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の測定の最近の試みでは、複合体の有意な過剰回収が示され続けている（21）。
【０００６】
ＰＳＡ−ＡＣＴ測定において遭遇するこの問題点のため、文献中の関心は総ＰＳＡの測定とともに複合体化していない遊離のＰＳＡの測定に移った。総ＰＳＡ値の範囲が約４−１０ｎｇ／ｍＬの場合に改善された特異性が要求されることは、現在 明白である。血清総ＰＳＡが＜４．０ｎｇ／ｍＬの場合、前立腺ガンのリスクは低い；同様に、総ＰＳＡが＞１０ｎｇ／ｍＬの場合、前立腺ガンのリスクは＞５０％であり、前立腺生検が必要となる。診断のグレイゾーン内（一般的に２−２０ｎｇ／ｍＬ、普通は ４−１０ｎｇ／ｍＬ）において、ガンのリスクは高いが偽陽性の割合もまた高い。遊離 ＰＳＡ／総ＰＳＡ比の遡及適用(retrospective application) によって、４−１０ｎｇ／ｍＬグレイゾーンにおける総ＰＳＡの特異性をおよそ５０−６０％から７０−８０％に改善することができることが示された（22−26）。この改善された特異性の結果、不必要な生検を２０−３０％減少させることができる。ＰＣＴ国際公開公報第９６−２６４４１号および国際公開公報第９７−１２２４５号には総ＰＳＡレベルが ２．５と２０ｎｇ／ｍＬの間の患者におけるＢＰＨおよびガンのそれぞれの鑑別を改善するための、遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡ比の使用について同様に記載されている。
【０００７】
しかし、遊離ＰＳＡの測定にはそれ自体に技術上の困難性がある。第１に、診断のグレイゾーン内において、遊離ＰＳＡの割合は典型的にはかなり低く、５−３０％の範囲である。したがって遊離ＰＳＡアッセイを成功させるためには、０．２−３．０ｎｇ／ｍＬの範囲内を正確に測定しなければならない。また、遊離ＰＳＡの濃 度はＢＰＨおよびガン患者において有意な差異がなく、遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡ比はＡＣＴと複合体化したＰＳＡの割合の増加によって減少する。その上、遊離ＰＳＡは血清中で安定ではなく、遊離ＰＳＡレベルは時間が経つと、おそらくα2 -マクログロブリンとの複合体化によって、減少することが知られている。
【０００８】
この間に、こうした問題を克服するための試みにともなって、血液中のＰＳＡ−ＡＣＴの正確な測定に関連する問題のさらに別の認識が得られた。１９９４年、Hybritech の研究者らは、抗ＰＳＡおよび抗ＡＣＴ抗体を使用したＰＳＡ−ＡＣＴのためのサンドイッチイムノアッセイの開発を報告した。彼らは、測定したＰＳＡ−ＡＣＴ値が前立腺ガンの診断における改善された臨床上の特異性を証明することができないと結論づけた（27）。後に、このグループはJohns Hopkins Medical Institutionsの研究者らと共同して、抗ＰＳＡ／抗ＡＣＴサンドイッチイムノアッセイ法は有意の非特異的結合およびＰＳＡ−ＡＣＴの過剰回収の難点があるという知見を報告した。彼らは、解決することなく、これらの問題がＰＳＡ−ＡＣＴの測定を臨床的に無意味なものとしていると結論づけた（28）。続いて、この共同グループは、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に特異的なモノクローナル抗体を基礎とするＰＳＡ−ＡＣＴのサンドイッチイムノアッセイの開発を通してこの非特異的結合の問題を克服したと報告した（29，30）。しかし、彼らの臨床研究では、総ＰＳＡの測定または総ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣＴの計算上の比に比較して、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のみの測定による前立腺ガンに対する特異性の何らかの改善を示すことができなかった（29）。ブロック試薬の使用を含む、ＰＳＡ−ＡＣＴ測定に関連する問題を克服するその他の研究方法が提案されてきた（31）。
【０００９】
前立腺ガンの患者において、なぜＡＣＴと複合体化したＰＳＡの割合が増大するかは不明のままであるが、ＡＣＴに対する抗体がＢＰＨ患者からの前立腺上皮を染色(stain) しないとともに、この組織においてｍＲＮＡの転写が見られないという観察に関係があるかもしれない。反対に、前立腺ガンの患者からの前立腺上皮において抗ＡＣＴの免疫反応性およびｍＲＮＡ合成が検出される（32）。これらの結果は、前立腺腫瘍中で、ＰＳＡは血清中に放出される前にin situ でＡＣＴと複合体化するらしいことを示唆している。活性ＰＳＡの血流への移行には別の機構が関与するようである。健康な男性からの血清中に見られる遊離ＰＳＡはタンパク質分解によって切断され、酵素的に不活性である。しかし、腫瘍は血管原性因子を合成し、これが腫瘍組織の血管新生の増加を導く。腫瘍中では、より大きな割合の酵素的に活性なＰＳＡが血流へ移行できるようである。この活性ＰＳＡはＡＣＴなどのプロテアーゼインヒビターと複合体化するものと予想され、これによって前立腺ガン患者からの血清中でのＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のより高い割合がもたらされると考えられる。
【００１０】
したがって、前立腺ガンに関する男性患者のスクリーニングに関連して、複合体化ＰＳＡの正確な測定方法が必要であるとともに、複合体化ＰＳＡの血中レベルの臨床上の意義を評価する必要がある。
欧州特許第６３５，５７５号には、遊離ＰＳＡには結合するがＰＳＡ−ＡＣＴには結合しないモノクローナル抗体の調製について記載されている。
【００１１】
ＰＣＴ国際公開公報第９５／１８３８１号は、遊離ＰＳＡには結合するが複合体化ＰＳＡには結合しなし抗体の添加によって、遊離および複合体化ＰＳＡに対して等モルの応答性を提供することができるようにした、ＰＳＡ測定のためのモノクローナル／ポリクローナルイムノアッセイ法に関係している。
米国特許出願番号第０８／５９５，１５５号およびZhou Z,Ng PC,Very DL,Allard WJ,Yeung KK,J.Clin.Lab.Anal.(1996),10:155-159,には、モノクローナル／ポリクローナルイムノアッセイにおいて遊離および複合体化ＰＳＡに対して等モルの応答性を提供するモノクローナル抗体の調製方法が記載されている。記載されているモノクローナル抗体は、ＰＳＡに結合して、遊離ＰＳＡには結合するが複合体化ＰＳＡには結合しない抗体にＰＳＡが結合するのを実質的に不可能にするという、独特の特性を有している。
【００１２】
日本特許公告公報第６２−４６２６３号にはプロテアーゼインヒビターとの複合体化ＰＳＡの測定のためのサンドイッチイムノアッセイが記載されている。
ドイツ特許出願公開公報第４，３２２，３４２号には、総ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣＴの比率を計算するための数値を提供する目的で、単一のアッセイにおいて総ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴの両方を測定する方法が記載されている。
【００１３】
Chichibuらは、Journal of Medicine and Pharmaceutical Science(Japan,1996)36(3):477-483,において、ビーズに結合させた抗ＰＳＡおよび酵素標識抗ＡＣＴを使用したＰＳＡ−ＡＣＴのためのサンドイッチイムノアッセイを記述している。血液サンプル中のＰＳＡ−ＡＣＴを正確に測定する能力を確定するデータは含まれていない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、複合体化ＰＳＡ（ここではｃＰＳＡと称する）を測定するための方法を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明の方法は、複合体化していない、すなわち遊離のＰＳＡ（ｆＰＳＡ）がイムノアッセイで検出されなくなるように血液サンプルを処理し、その後にイムノアッセイによって処理血液中のＰＳＡを測定してｃＰＳＡのみを検出するものである。イムノアッセイは通常のどんな様式でも実施することができるが、より一般的には競合イムノアッセイまたは二部位イムノアッセイ(two-site immunometric assay) である。本発明は以下により詳細に記載するような各種の方法によって達成することができる。一般的に、こうした方法として、イムノアッセイ試験混合物からｆＰＳＡを物理的に除去するかまたは残存させる分離方法、およびｆＰＳＡをイムノアッセイ法において使用する抗体に基本的に結合することができなくさせることによって、アッセイから効果的にｆＰＳＡを取り去るために、ｆＰＳＡ中の抗原決定基または決定基群を化学的相互作用などによって修飾する方法が含まれる。
【００１６】
３抗体試薬系を基礎として、特に有利な二部位イムノアッセイ法が考案された：
（ａ）ｔＰＳＡに結合し、イムノアッセイに関与する、第１の抗ＰＳＡ抗体（モノクローナルまたはポリクローナル抗体）、
（ｂ）同じくｔＰＳＡに結合し、同じくイムノアッセイに関与するが、ＰＳＡにｆＰＳＡ特異的抗体が結合した場合には実質的にＰＳＡに結合することができない特性を有するように選択された、第２の抗ＰＳＡ抗体（好ましくは、モノクロ−ナル抗体）（この第２の抗体をここでは時によって「ＭＭ１」と称する）、および
（ｃ）ｆＰＳＡ特異的で、好ましくはモノクローナル抗体である、第３の抗ＰＳＡ抗体。
【００１７】
イムノアッセイに関与させる場合、第１および第２の抗ＰＳＡ抗体の１つを検出目的で標識し（これを「標識」または「検出」抗体と称することができる）、他方を試験混合物から分離する目的で固定化するかまたは固定化することができるものにする（「捕捉」抗体）。これによって、血液サンプル中のｆＰＳＡがｆＰＳＡ特異的（第３）抗体と結合して、サンプル中のｆＰＳＡを前述のＭＭ１（第２）抗体と結合できないようにするアッセイ条件を確立することができる。２部位イムノアッセイは前述の第１および第２抗体（「標識」および「捕捉」抗体）の両者のＰＳＡへの結合に依存するので、ｆＰＳＡ特異的抗体の結合は結果的にｆＰＳＡ形態を２部位イムノアッセイによる検出ができないものにする。この特別の独特なアッセイ系において使用する３抗体はすべて１以上のＰＳＡの形態に特異的である（すなわち、どれもｃＰＳＡに含まれるいかなるプロテアーゼインヒビターに対しても特異的ではない）という事実にもかかわらず、これらの抗体の特別の特性によって、ｃＰＳＡの特異的測定がなされるということに留意すベきである。
【００１８】
ｃＰＳＡ血中値の測定が前立腺ガン（ＣａＰ）の検出のための高感度で高度に特異的な方法を提供することがわかった。またｃＰＳＡアッセイはｆＰＳＡの測定が関与するアッセイに比較して分析の精度が上昇するという利点を有する。なぜならば、ｃＰＳＡはＰＳＡの主要な形態であり、ｆＰＳＡとｃＰＳＡとの間のＰＳＡの分配に影響する環境および分析因子（例えばサンプルの年令）はｆＰＳＡの測定に比較してｃＰＳＡ測定の精度に対してずっと低い影響をもたらすからである。
【００１９】
ｃＰＳＡは主としてプロテアーゼインヒビターα1-抗キモトリプシン（ＡＣＴ）と複合体化したＰＳＡからなるので、ＰＳＡ−ＡＣＴ特異的アッセイもまたｃＰＳＡアッセイの有利な感度、特異性およびその他の特徴を与えることになる。図１Ａは、ＰＳＡのＥエピトープに対する３つの異なるモノクローナル抗体の存在下での、ｔＰＳＡに関する２部位イムノアッセイにおける、ｆＰＳＡの免疫反応性の阻害を示すグラフである。５０ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡを含有するサンプルを各抗ｆＰＳＡ ＭＡｂとともに３０−６０分間 プレインキュベートし、Bayer Immuno１TMｔＰＳＡアッセイを実施した。図１Ｂは２つの抗Ｅ抗体、ＰＳＡ２０およびＭＥ２がｔＰＳＡアッセイにおいてｆＰＳＡの免疫反応性の濃度依存性阻害を示す、同様の実験を示す。１０ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡを含有するサンプルをＰＳＡ２０またはＭＥ２ ＭＡｂのいずれかとともに３０−６０分間プレインキュベートし、Bayer Immuno１ｔＰＳＡアッセイを実施した。
【００２０】
図２Ａは、ｔＰＳＡアッセイへの抗Ｅ抗体ＰＳＡ２０の添加がｃＰＳＡの測定のためのイムノアッセイの１フォーマットを提供することを示すグラフである。 Bayer Immuno 1 Analyzerを使用し、ＭＡｂ ＰＳＡ２０ ３００μｇ／ｍｌの存在下で、遊離および複合体化ＰＳＡの割合を変えた約１１ｎｇ／ｍＬの総ＰＳＡを含有するサンプルを測定した。図２Ｂは、ＭＥ２ ＭＡｂもまたｃＰＳＡの定量測定のためのイムノアッセイフォーマットを提供することができることを示す同様のグラフである。 Bayer Immuno 1 analyzerを使用し、ＭＡｂ ＭＥ２ ２５μg/mLの存在下 で、遊離および複合体化ＰＳＡの比率を変えた約１１ｎｇ／ｍｌの総ＰＳＡを含有するサンプルを測定した。
【００２１】
図３は自動化イムノアナライザーにおいてｃＰＳＡアッセイを自動化するために、ＰＳＡ２０を使用することができることを示す表である。アッセイフォーマット１は総インキュベート時間を３８分とし、ＭＡｂ ＰＳＡ２０をＭＭ１−フルオレセインコンジュゲート（Ｒ１）に添加して使用した。アッセイフォーマット２は総インキュベート時間を７８分とし、ＰＳＡ ＭＡｂ２０とサンプルとのオンボード(on-board)プレインキュベートを使用した。すべての結果を発色率で示している。
【００２２】
図４Ａおよび４Ｂは、前立腺ガン、ＢＰＨまたは同年代の健康な対照男性の血清中の全遊離および複合体化ＰＳＡの測定結果を要約した表である。“全”で表示する非選択患者集団には、ｔＰＳＡ値にかかわりなく、ＣａＰ，ＢＰＨ，または同年代の健康な対照男性由来の患者サンプルが含まれる。患者グループをｔＰＳＡ値に従って分類する場合は、図４Ａに示す分析および図４Ｂに示す分析のｃＰＳＡ部分において、追加の患者サンプルを含ませた。この場合、下記の明細書において記載するように、診断のグレイゾーンに含ませるｔＰＳＡ値によって追加のサンプルを選択した。
【００２３】
図５は、前立腺ガンおよび良性前立腺疾患の男性から採取した患者サンプルに関する、好ましいｃＰＳＡアッセイを使用して得られた結果に比較した、市販のアッセイを使用して得られた結果の回帰分析のグラフである。
図６−８は、ガン、ＢＰＨおよび正常集団の男性の血清の試験から得られた、ｃＰＳＡアッセイ値およびＰＳＡ−ＡＣＴアッセイ値間の相関関係を示すグラフである。
【００２４】
図９は前立腺ガン、ＢＰＨまたは同年代の健康な対照男性の血清中のｃＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴの測定結果を要約する表である。非選択集団（「全」で表示）およびｔＰＳＡ値による患者グループの分類は図４Ａおよび４Ｂに要約した研究と同一とした。
図１０は、市販のｔＰＳＡアッセイ，好ましいｃＰＳＡアッセイ、およびｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比の計算によって得られたアッセイ値間の、カットオフ値（すなわち正常上限値）および選択された感度における特異性の相関関係を示す表である。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本明細書で使用する場合、以下の用語は指示された意味を持つものとする。
ＰＳＡは前立腺特異的抗原を意味するものとする。
ｔＰＳＡまたは総ＰＳＡとは、血液サンプル中の免疫学的に測定可能なＰＳＡ、すなわち、通常のイムノアッセイによる測定に応答することができる複合体化または遊離形態のＰＳＡ、の総量を意味するものとする。現状の知見を基準として、（ＡＣＴ、α1-抗トリプシン、およびインター−αトリプシンインヒビタ ーを含む）ある種のプロテアーゼインヒビターと複合体化した血液ＰＳＡは免疫学的に測定可能であるが、α2-マクログロブリンなどの別のプロテアーゼイン ヒビターと複合体化したときには、ＰＳＡは測定不可能であると理解される。
【００２６】
ｆＰＳＡまたは遊離ＰＳＡとは、複合体化していない遊離のＰＳＡを意味するものとする。
ｃＰＳＡまたは複合体化ＰＳＡとは、ｆＰＳＡ以外のｔＰＳＡを意味するものとする。
Ｅエピトープとは、ｆＰＳＡに結合するがｃＰＳＡには結合しない抗体のための結合部位である、ＰＳＡ上のエピトープの集合を意味するものとする。
【００２７】
抗Ｅ抗体とは、Ｅエピトープに結合する抗体、したがってｆＰＳＡの結合について特異的な抗体を意味するものとする。
抗体とは、完全イムノグロブリン、例えばＩｇＧ若しくはＩｇＭ、または抗体結合部位を含んでいるイムノグロブリン断片、例えばFab，Fab'，およびF(ab')2断片、あるいはこれらの凝集体を意味するものとする。
【００２８】
本発明は、血液サンプル中のｆＰＳＡを検出不可能にさせた後、イムノアッセイによってｔＰＳＡを測定することによる、血液サンプル中のｃＰＳＡを測定する方法を提供する。ｔＰＳＡを測定するために各種のイムノアッセイ法を使用することができること、および血液サンプル中のｆＰＳＡを検出不可能にさせるために各種の方法を利用できることは、当業者にとって明らかであろう。
【００２９】
一般的に、ｔＰＳＡイムノアッセイ法は競合または非競合性のいずれかである。前者の方法は典型的には固定化または固定化し得るＰＳＡに対する抗体（抗ＰＳＡ）および標識形態のＰＳＡを利用する。サンプルＰＳＡおよび標識ＰＳＡは抗ＰＳＡへの結合について競合する。生成した、抗ＰＳＡに結合した標識ＰＳＡ（結合画分）を結合しないまま残っているもの（非結合画分）から分離した後、結合または非結合画分のいずれかの中の標識の量を測定し、任意の通常の方法、例えば標準曲線との比較によって試験サンプル中のＰＳＡの量に対比させることができる。
【００３０】
ｔＰＳＡの測定のためには非競合方法がより一般的に使用される。最も一般的な方法は２部位イムノアッセイ法（ときには「サンドイッチ」法と称される）である。イムノアッセイにおいては、２つの抗ＰＳＡ抗体が使用される。抗ＰＳＡ抗体の１つは標識され（ときには「検出抗体」と称される）、他方は固定化するかまたは固定化し得るものである（ときには「捕捉抗体」と称される）。当業界で知られているように、捕捉および検出抗体は試験サンプルに同時にまたは順次接触させることができる。順次法は、捕捉抗体をサンプルとともにインキュベートし、その後あらかじめ定めた時間に標識抗体を添加することによって実施される（ときには「前進(forward) 」法と称される）か、または最初に検出抗体をサンプルとともにインキュベートし、その後標識抗体を添加することもできる（ときには「逆行(reverse) 」法と称される）。１回以上の必要なインキュベーションを行なった後、アッセイを完了させるために、捕捉抗体を液体試験混合物から分離し、少なくとも１つの分離した捕捉抗体相の少なくとも一部について、または液体試験混合物に残存するものについて標識を測定する。通常は前者である。その理由は捕捉および検出抗体によって（その間に“サンドイッチ”されて）結合したＰＳＡを含むからである。
【００３１】
ＰＳＡのための典型的な２部位イムノアッセイにおいて、捕捉および検出抗体の１つまたは両方がモノクローナル抗体である。検出抗体に使用する標識は当業界で通常既知のどれをも選択することができる。普通は、標識は酵素または化学ルミネセンス部分であるが、放射性同位元素、発蛍光団、検出可能なリガンド（例えば、そのリガンドに対する標識結合相手に二次的に結合することによって検出可能なもの）などでもよい。捕捉抗体の重要な特性は、試験混合物の残余から分離される方法を提供することである。したがって、当業界で理解されているように、捕捉抗体はあらかじめ固定化または不溶化された形態でアッセイ中に導入することもできるし、または固定化し得る形態、すなわち、アッセイへの捕捉抗体の導入の後に固定化を達成することができるような形態でもよい。固定化捕捉抗体の例は、磁性粒子、ラテックス粒子、マイクロタイタープレートウェル、ビーズ、キュベットまたは他の反応容器などの固相に共有結合または非共有結合的に接着された抗体である。固定化し得る捕捉抗体の例は、リガンド部分分子、例えばハプテン、ビオチンなどで化学的に修飾された抗体であって、その後、（直接に固定化された捕捉抗体について上述したような）固定化形態のそのリガンドの結合相手、例えば抗体、アビジンなどと接触させることによって固定化することができる抗体である。
【００３２】
本発明においてはいかなるイムノアッセイ方法またはフォーマットをも使用し得るものと一般的に理解されるベきであるから、上記のイムノアッセイ法およびフォーマットは例示として意図するものであって、これらに限定されるものではない。
また、特定のイムノアッセイにおいてサンプルｆＰＳＡを検出不可能にさせるために使用する方法は幅広く変更することができるものと理解される。１つの態様において、こうした方法として、イムノアッセイを実施する血液サンプル中の残余物からサンプルｆＰＳＡを単離または分離することが含まれる。こうした分離の結果、液体試験混合物からのｆＰＳＡ画分の物理的分離または試験混合物中のin situ のｆＰＳＡの単離または隔離が可能である。例として、イオン交換吸着、モレキュラーシーブ濾過、親和性結合などによってｆＰＳＡを選択的に除去することができる物質のカラムまたはその他のマトリックスにサンプルを通すことによって、あるいは磁性またはラテックス粒子に固定した抗ｆＰＳＡなどのｆＰＳＡ特異的抗体の固定化したまたは固定化し得る形態とサンプルとを接触させることによって、ｆＰＳＡを分離して検出不可能にさせることができる。
【００３３】
別の態様において、ｆＰＳＡがＰＳＡイムノアッセイに関与する抗体と実質的に結合することができなくなるほどに、関連する（１またはそれ以上の）抗原決定基を変換または修飾する、物理的、化学的（生化学を含む）またはその他の方法による試験サンプルの処理によって、ｆＰＳＡをイムノアッセイで検出不可能にする。その後、この結果生成した試験混合物中で直接ＰＳＡイムノアッセイを実施することができる。例をあげると、こうした処理として、加熱または冷却によるｆＰＳＡおよびｃＰＳＡの示差的変性；Ｅエピトープ領域に独特なペプチドに対して特異的なプロテアーゼなどの、複合体化によって保護されたｃＰＳＡ決定基には影響を与えないが、ｆＰＳＡ抗原決定基（Ｅエピトープ）は変性する化学的変性剤の添加；タンパク質または脂質結合剤、基質疑似物（例えばＥエピトープ領域の酵素部位によって認識される正常な基質に類似しているが、結合しても酵素的切断または反応は伴わないペプチド）などの、Ｅエピトープ領域に結合するかまたはこれをブロックする生化学剤の添加；などが含まれる。ｆＰＳＡの所望の免疫学的不活性化を達成するための上記の方法がすべてではなく、当業者にとってはその他の有効な方法が明らかであろう。
【００３４】
本発明が提供する特に独特なｃＰＳＡの測定方法として、通常の２部位イムノアッセイの巧妙な改変が含まれる。この新しい方法において、捕捉および検出抗体の１つとして、ｔＰＳＡと結合する（すなわち、ｆＰＳＡおよびｃＰＳＡの両方にあるエピトープに結合する）が、ＰＳＡにｆＰＳＡ特異的抗体（すなわち、抗Ｅ抗体）が結合している場合には実質的にＰＳＡに結合することができないものが選択される。この独特の抗体をここでＭＭ１と称する。こうして、第３の抗体として抗Ｅを添加することによって、抗Ｅが結合したｆＰＳＡは実質的にＭＭ１に結合することができなくなり、そして実質的にＭＭ１に基づく２部位イムノアッセイにおいて検出することができなくなる。
【００３５】
この特に好ましい方法において、第２抗体（ＭＭ１抗体）および第３抗体（抗Ｅ抗体）は好ましくはそれぞれ独立した単一特異的抗体（例えば、抗体画分が基本的に対象となる特定のエピトープに結合する抗体のみで構成されるように調製された、通常の抗血清法によって得られるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）であり、最も好ましくはモノクローナル抗体である。さらに、所望ならば、抗Ｅ抗体は所望のＭＭ１阻害を獲得するために、２以上の抗体、例えば２以上のモノクローナル抗体を含むこともできる。抗Ｅ抗体（または複数の抗体）の結合の結果として生じるｆＰＳＡに対するＭＭ１抗体の結合阻害の所望の程度は、普通は約９０％を超え、より一般的には約９５％を超え、最も好ましくは約９９％を超えるものと、さらに理解されるべきである。
【００３６】
特に好ましいモノクローナルＭＭ１抗体は多数の方法によって調製することができる。主として、ハイブリドーマ細胞系の選択の結果ＭＭ１の明確な結合特性を有するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを単離するためのスクリーニング方法を使用する、通常の体細胞ハイブリダイゼーション技術を適用することによって、このモノクローナル抗体が製造される。こうしたスクリーニングのための戦略は、ｆＰＳＡには接近し得るがｃＰＳＡには接近できないエピトープ、例えばＥエピトープに対する別の抗体の結合をブロックするけれども、それ自体は本質的にｆＰＳＡおよびｃＰＳＡに等価に結合する抗体を選択するものである。
【００３７】
体細胞ハイブリダイゼーションは現在周知の方法論であり、好適な、そして所望のすべての変更を含めて、本発明に適用することができる。一般に、骨髄腫細胞と分析物に対して免疫感作させた動物から取ったリンパ球との融合によってハイブリドーマの集団を製造する。ここで使用する宿主動物の免疫感作とは、対象とする分析物上の１以上のエピトープに結合する抗体を産生するように、その動物の免疫系をチャレンジしたことを意味する。これらの結果が、天然の分析物、合成ペプチド免疫原、表面に分析物のエピトープを発現するトランスフェクトされた細胞などを宿主動物の血流中への投与を含む（但し，これに限定されるわけではない）多数の方法のどれによっても得られることは、当業者にとって明らかであろう。同様に、クローン化されたハイブリドーマ細胞系からのモノクローナル抗体の製造および採取は当業界の通常の技術範囲であり、一般的に本発明を実施する時に、既知のどの方法も使用することができる。
【００３８】
上述のように、ＭＭ１特性を有するモノクローナル抗体を製造するためにハイブリドーマをスクリーニングするための主要な基準は、（ｉ）実質的にｆＰＳＡおよびｃＰＳＡに等価に結合するが、（ii）ＰＳＡにｆＰＳＡ特異的抗体（抗Ｅ抗体）が結合した場合はＰＳＡに実質的に結合することができない、モノクローナル抗体を製造することである。あるいは、あまり好ましくはないが、スクリーニングの基準として、（ｉ）実質的にｆＰＳＡおよびｃＰＳＡに等価に結合するが、（ii）ＰＳＡに結合することによって、ＰＳＡをｆＰＳＡに特異的な抗体、すなわちｆＰＳＡには結合することができるがｃＰＳＡには結合することができない抗体に対して結合することができなくする、モノクローナル抗体を製造することである。上記の結果を与えるために本発明のＭＭ１モノクローナル抗体が作用する機構は明確には理解されていない。しかし、ｆＰＳＡに対するモノクローナル抗体（すなわち、抗Ｅ抗体）の結合が、エピトープに対する抗体または複数の抗体の結合に際してｆＰＳＡおよびｃＰＳＡの両方の上で利用することができるエピトープ（１つまたは複数）をブロック、マスク、妨害または変更するものと推察される。本発明において利用するＭＭ１モノクローナル抗体の代表は、Bayer Immuno 1TMＰＳＡアッセイ（Bayer Corporation,Tarrytown,New York,USA）において使用するＭＭ１抗体；本出願人（Bayer Corporation ）によってAmerican Type Culture Collection,Rockville,Maryland,USA,に１９９７年４月１０日寄託され、それぞれ受託番号ＨＢ−１２３３８およびＨＢ−１２３３７を指定されたハイブリドーマ細胞系 ３５６．７．４および３４６．７．２６によって製造されたモノクローナル抗体；および上記の抗体のいずれかと実質的に同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体である。
【００３９】
ｃＰＳＡを測定するための上記の特に好ましい方法の実施に必要な試薬およびその他のアッセイ構成要素は試験キット、すなわち使用者の需要に適合する包装集合体または配合体の形態で、分析操作法をも含めて好都合に供給される。最小限、この試験キットは特定の特性を有する捕捉および検出抗体ならびに１以上の抗Ｅ抗体を含むものとなる。
【００４０】
男性患者のｃＰＳＡ血中値は、先行技術のｔＰＳＡ値およびｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比数値に比較して実質的な臨床上の意義を提供することが今回発見された。具体的には、５０才を超える、ＣａＰの患者５３名、ＢＰＨの患者７５名および健康な男性対照者８８名を含む２１６名の患者からの血清サンプルを使用して最初の研究を実施した（下記、データは図４Ａに示す）。この最初の研究において、ｔＰＳＡの測定に比較してＣａＰの検出について同等の感度を提供する、ｃＰＳＡアッセイの正常上限値が確立された（それぞれ８８％に対して８５％）。試験した全患者について、正常およびＢＰＨ集団における特異性もまた、ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比に比較したｃＰＳＡと同等であった。これらの知見は、ＣａＰ患者７５名および生検でＣａＰでないことがわかった患者２２５名を含む、泌尿器科に配された生検患者３００名からの血清サンプルを使用した次の研究によって確認された（下記、データを図４Ｂに示す）。ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比と関連させて使用するｔＰＳＡアッセイの感度および特異性がｃＰＳＡのみの場合と同等であるという発見は、患者集団が診断のグレイゾーンに属する場合にも正当だった。診断のグレイゾーンの正確な範囲は明確にされていないが、この研究において比較したすべての範囲において、ｃＰＳＡアッセイの感度および特異性は総および遊離ＰＳＡアッセイの両方を使用して得られたものに匹敵した。これらのデータは単独試験、ｃＰＳＡ、が総ＰＳＡと同等の有効性で前立腺ガンを検出することができ、その上、２つのアッセイ、ｆＰＳＡおよびｔＰＳＡを使用して得られることが示された改善された特異性を有することを証明している。
【００４１】
上に引用した研究において、ｃＰＳＡアッセイデータについて選択した正常上限値（ときにはカットオフ値と称される）は（ＰＳＡ当量濃度として表現して）３．７５ng/mL であった。この正常上限値は組織学的にガンと確認された男性グループにおける、ｔＰＳＡアッセイでカットオフ値４．０ng/mLを使用して提供される感度と実質的に同様のＣａＰ検出の感度（最初の研究において８８％に対して８５％、次の研究において８３％に対して８１％）を達成させるように選択した。当技術分野では、より大きなサンプル集団を試験するとｃＰＳＡ値に関する最適正常上限値は幾分移動するかも知れないことはもちろん理解されるが、こうした最適正常上限値はいずれにせよ約３−４ｎｇ／ｍＬ（ＰＳＡ−ＡＣＴ約９−１２ｎｇ／ｍＬと同等）の間に落ち着くと予想されるはずである。正常上限値を４ｎｇ／ｍＬより上に選択することは一般に臨床上許容できない感度数値の結果をもたらすと理解され、一方、正常上限値を３ｎｇ／ｍＬより下に選択すると、特異性は許容し得る損失で増大した感度をもたらすものと、臨床医の中には考えるものもいる。しかし、感度のどのレベルにおいても、本発明のｃＰＳＡ法は単独アッセイの結果で、従来のｔＰＳＡ法に比較して有意に改善された特異性レベル、および２つのアッセイ結果の比較、例えばｆＰＳＡ／ｔＰＳＡに基づく最近の文献の方法に比較して同等または改善された特異性レベルを提供するものと認識される。さらに、連続ｔＰＳＡ測定について示された（29）ような経時的連続ｃＰＳＡ測定によって、無症候性男性患者における前立腺ガンの検出が増強されることが期待される。
【００４２】
上に述べた前立腺ガンの検出における使用の他に、ｃＰＳＡの測定は、前立腺ガンと診断された患者、特に前立腺ガンの第一次治療を受けた後における病気の経過を監視するのに有用となる。こうした患者のｔＰＳＡ測定による長期的監視は再発性前立腺ガンの早期検出に有用であることが証明された。ｃＰＳＡはＰＳＡのガン特異的形態であると理解され、そして潜在的ガン細胞が遠隔転移部位を確立して増殖するにつれて血清中で増加するものと予想される形態である。したがって、ｃＰＳＡ血中レベルの経時変化は病状の変化と相関性があり、そして特に治療後のｃＰＳＡ血中レベルの上昇は病気の再発を示すことになる。
【００４３】
さらに、ｃＰＳＡは主としてＰＳＡ−ＡＣＴからなっていると理解されるので、ｃＰＳＡ測定の臨床的意義および利点は、（図９に示すデータが得られた研究において証明されたように）ＰＳＡ−ＡＣＴ測定にまで拡張される。原則として、現在利用し得る計測手段で最も実施しやすいＰＳＡ−ＡＣＴ測定用のイムノアッセイ方法は、抗ＰＳＡ抗体と１つの抗ＡＣＴ抗体またはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に特異的な１つの抗体とを組み合わせて使用する２部位イムノアッセイである。こうした後者の抗体を獲得する方法の１つは、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体上の、例えばＡＣＴおよびＰＳＡ成分が出会う複合体表面上の点上またはその近くの立体配座エピトープに対する抗体のモノクローナル選択によるものである。しかし、現在のところ、こうした方法は十分には開発されていなく、そして／または分析実施上の問題に悩まされており、したがって、さらなる改良が生まれるまで、ＰＳＡ−ＡＣＴ測定にはもっと煩わしい手法が必要である。例えば、Leinonenらによって示されたように、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体をゲル濾過（モレキュラーシーブ）クロマトグラフィーによって分離し、ｔＰＳＡを検出するアッセイまたはＰＳＡ−ＡＣＴに特異的なアッセイのいずれかによって測定する（15）のもよい。
【００４４】
本発明を以下の実施例によって説明するが、これに限定されるわけではない。
【００４５】
【実施例】
材料物質
これらの研究で使用する抗ＰＳＡ抗体には遊離ＰＳＡおよびプロテナーゼインヒビターと複合体化したＰＳＡ上に発現されたエピトープを認識するモノクローナル抗体であるＭＭ１が含まれる。この抗体をマウス腹水中で製造し、標準的操作法を使用してタンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ＭＰ２はヤギ中で製造し、固定化ＰＳＡ上のアフィニティクロマトグラフィーによって精製したポリクローナル抗ＰＳＡ抗体である。ＰＳＡ１９、ＰＳＡ２０、ＰＳＡ３０（CanAg Diagnostics AB,Gothenburg,Sweden）およびＭＥ２（Biospacific,Emeryville,CA,USA ）はＰＳＡのＥエピトープを認識するモノクローナル抗体である。ＡＣＴ５３（CanAg Diagnostics ）はＡＣＴ特異的モノクローナル抗体である。遊離前立腺特異的抗原（Scripps Laboratories,San Diego,CA,USA ）をヒト精液からドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって９８％の純度まで精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１％アジ化ナトリウムを含有する緩衝液 、ｐＨ８．０ 中で保存した。ＰＳＡ−ＡＣＴ（Scripps Laboratories,San Diego,CA,USA ）はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって＞９６％の純度を示し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％アジ化ナトリウムを含有する緩衝液、ｐＨ５．６中で保存した。
【００４６】
Bayer Immuno １ TM ＰＳＡアッセイ
Bayer Immuno１総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）アッセイはＰＳＡの捕捉用のモノクローナル抗体および検出用ポリクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイである。モノクローナル抗ＰＳＡ抗体（ＭＭ１）はフルオレセインとコンジュゲート化（Ｒ１）し、アフィニティ−アフィニティ精製したポリクローナル抗体（ＭＰ２）はアルカリホスファターゼとコンジュゲート化（Ｒ２）している。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含有する緩衝液、ｐＨ７．４および５％熱不活性化正常ヤギ血清（Biocell Laboratories,Carson,CA,USA）中で抗体を、Ｒ１については１．５μｇ／ｍｌに、そしてＲ２については６．１５μｇ／ｍｌに希釈する。２つの抗体６５μｌずつをそれぞれ試験検体２０μｌとともに反応キュベット中で３７℃で２０分間インキュベー トし、生成した免疫複合体（Ｒ１−ＰＳＡ−Ｒ２）をモノクローナル抗フルオレセイン抗体で被覆した磁性粒子（２０μＬ）の添加によって捕捉する。過剰の試薬およびサンプル成分を除去するための洗浄段階の後、２３ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート３００μｌを添加する。発色の程度を４０５および４５０ｎｍでの吸光度測定によってモニターするが、この発色の程度は試験検体中のＰＳＡの濃度に直接比例する。これ以上の詳細は J.Clin.Lab.Anal.(1996),10:155-159中に提示されている。濃度 0,2,10,25,50 および１００ｎｇ／ｍＬの遊離ＰＳＡで調製したBayer Immuno 1 SET point（登録商標）ＰＳＡ検量剤(calibrator)を使用して、Bayer Immuno 1 Analyzerの検量化を実施する。標準検量線を作成するために、０点を通 る三次式に適合させるアルゴリズムを使用する。
【００４７】
Bayer Immuno 1 遊離ＰＳＡアッセイ
遊離ＰＳＡの測定については、Ｒ１捕捉抗体をフルオレセインとコンジュゲート化した遊離ＰＳＡ（ＰＳＡ１９、CanAg ）特異的モノクローナル抗体とに置換することによって、上記の Bayer Immuno 1 総ＰＳＡアッセイで使用したプロトコールを適用した。このモノクローナル抗遊離ＰＳＡ Ｒ１を総ＰＳＡアッセイにおいて使用したものと同一のポリクローナル抗ＰＳＡアルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｒ２）とともに使用した。Ｒ１コンジュゲートを２．５μｇ／ｍＬに希釈し、Ｒ２は６．１５μｇ／ｍＬで使用した。サンプル容積を１試験当たり３５μｌとし、添加した磁性粒子の容積を１試験当たり１５μＬとした以外のその他の条件はｔＰＳＡアッセイで使用したものと同様とした。
【００４８】
Bayer Immuno 1 ＰＳＡ−ＡＣＴ法
Bayer Immuno 1ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイフォーマットは以下の変更の他は Bayer Immuno 1 ｔＰＳＡアッセイのものと同一である：（１）ＡＣＴ特異的モノクローナル抗体であるＡＣＴ５３をアルカリホスファターゼにコンジュゲートさせ、２μｇ／ｍＬで検出に使用する；（２）ＰＳＡ−ＡＣＴを検量剤および対照抗原として５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、６％ＢＳＡ、ｐＨ５．８とともに使用する；そして（３）抗原を最初に捕捉抗体とともにインキュベートし、生成する複合体を洗浄して非結合抗原およびその他の血清成分を除去し、その後に検出抗体を添加するという２回洗浄プロトコールを使用する。
【００４９】
結果
総ＰＳＡアッセイにおける遊離ＰＳＡの免疫反応性の阻害のための特異的抗体の選択および最適化
本発明は、ＰＳＡのＥエピトープに対する抗体の添加によって、総ＰＳＡアッセイをＰＳＡ−プロテアーゼインヒビター複合体に特異的に実施することができるという観察に基づいている。ＰＳＡ分子上のＥエピトープに特異的な４つのモノクローナル抗体、ＰＳＡ１９、ＰＳＡ２０、ＰＳＡ３０およびＭＥ２を、総ＰＳＡアッセイにおける遊離ＰＳＡの反応性を減少させる能力について試験した。精液から精製した１００％遊離ＰＳＡを使用して総ＰＳＡアッセイにおいて用いる検量剤を製造した。抗Ｅ抗体、ＰＳＡ１９、ＰＳＡ２０およびＰＳＡ３０を濃度 0，10，25，50，100 および２００μｇ／ｍＬで５０ｎｇ／ｍｌのＰＳＡ検量剤に添加した。室温で３０から６０分間インキュベートした後、総ＰＳＡアッセイを使用して、これらの混合物を未知サンプルとして試験し、ＰＳＡの回収を測定した。図１Ａに示すように、３つのモノクローナル抗体、ＰＳＡ１９、ＰＳＡ２０およびＰＳＡ３０のそれぞれが総ＰＳＡアッセイにおいて遊離ＰＳＡの反応性の有意な阻害を示した。この遊離ＰＳＡの免疫反応性の減少は各抗体について濃度に依存するが、ＰＳＡ２０のみが飽和に近かった。これらの３つの抗Ｅ抗体の中で、ＰＳＡ２０が遊離ＰＳＡについての信号の最大の減少を与えた。
【００５０】
別々の実験において、ｔＰＳＡアッセイ中の遊離ＰＳＡの結合を阻害する能力について、ＰＳＡ２０およびＭＥ２を比較した。モノクローナル抗体を０から４０μｇ／ｍｌの濃度範囲で１０ｎｇ／ｍｌの検量剤に添加した。図１Ｂでわかるように、ＭＥ２ ＭＡｂは総ＰＳＡ中の遊離ＰＳＡの結合を定量的に阻害し、６．１２５μｇ／ｍＬよ りも低濃度で飽和に到達する。これらのデータはいくつかのＥエピトープ抗体が遊離ＰＳＡへのＭＭ１抗体の結合を阻害する能力を有することを証明している。しかし、ＭＥ２ ＭＡｂは他のＥエピトープ抗体よりもずっと低い濃度でより大きな程度まで総ＰＳＡアッセイ中の遊離ＰＳＡの結合を阻害する。この阻害はＥエピトープに対するＭＥ２抗体のより高い親和性によるものと考えられる。あるいは、Ｅエピトープは別個の微小のエピトープ特異性を有するエピトープ群の集合体を表すのかも知れない。
【００５１】
Bayer Immuno 1 Analyzer での複合体化ＰＳＡの測定
総ＰＳＡアッセイへの ＭＡｂ、ＰＳＡ２０およびＭＥ２の添加は遊離ＰＳＡに関係する大部分の免疫反応性を消失させる。複合体化ＰＳＡの定量的測定を証明するために、約１１ｎｇ／ｍＬの総ＰＳＡ濃度で遊離およびＡＣＴと複合体化したＰＳＡの各種割合の混合物を調製した。混合物の内容は遊離：複合体化ＰＳＡの比を100:0, 80:20，50:50，20:80，および0:100 とした。これらの混合物を Bay er Immuno 1 Analyzerで３つのイムノアッセイフォーマット：総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）の市販アッセイ、Bayer Immuno 1遊離ＰＳＡアッセイ（ｆＰＳＡ）、およびBayer Immuno 1複合体化ＰＳＡアッセイ（ｃＰＳＡ）、を使用して測定した。Bayer Immuno 1複合体化ＰＳＡアッセイは、図２Ａに示す結果について、各サンプルにＰＳＡ２０ＭＡｂを最終濃度３００μｇ／ｍｌとなるように添加し、そしてＭＭ１−フルオレセインコンジュゲートを１．５μｇ／ｍｌから０．５μｇ／ｍｌに減量した以外には、ｔＰＳＡアッセイと同一とした。図２Ｂに示す実験については、各サンプルにＭＡｂ ＭＥ２を最終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように添加し、そしてＭＭ１−フルオレセインコンジュゲートをやはり０．５μｇ／ｍｌで使用した。総ＰＳＡおよび遊離ＰＳＡの測定のために、Bayer Immuno 1総ＰＳＡアッセイ用に市販されて使用されている Bayer Immuno 1 SET point ＰＳＡ検量剤で Bayer Immuno 1 Analyzerを検量化した。複合体化ＰＳＡ（ｃＰＳＡ）を測定するために、５０ｍＭ ＭＥＳ 、６％ ＢＳＡ，ｐＨ５．８中のＡＣＴと複合体化したＰＳＡを使用して、０−１００ｎｇ／ｍＬの範囲の検量剤を調製した。
【００５２】
総ＰＳＡアッセイへのＭＡｂ ＰＳＡ２０の添加は、複合体化ＰＳＡについてほぼ定量的反応性を有する方法を提供する（図２Ａ）。ｃＰＳＡアッセイにおける各種混合物の応答は直線性であり、総ＰＳＡおよび複合体化ＰＳＡの測定濃度は期待されたように試験したすべてのサンプルについておよそ１０ｎｇ／ｍＬの回収を与えた。同様に、ＭＡｂ ＭＥ２は、遊離および複合体化ＰＳＡの割合の全範囲にわたって複合体化ＰＳＡについて定量的反応性を有する方法を提供する（図２Ｂ）。その上、ＭＡｂ ＭＥ２での複合体化ＰＳＡアッセイはＰＳＡ２０ＭＡｂについて必要とされる濃度（３００μｇ／ｍＬ）に比較して著しく低い濃度のＭＥ２ ＭＡｂ（２５μｇ／ｍＬ）を使用する。これらのデータは、ＰＳＡ分子上の異なるエピトープと反応する３つの抗体（ＭＭ１，ＭＰ２およびＰＳＡ２０またはＭＥ２のいずれか）を組み合わせることによって、複合体化ＰＳＡを正確に測定する方法を作り上げることができることを証明している。
【００５３】
ｃＰＳＡアッセイの自動化
Ｅエピトープに対するＭＡｂによる患者サンプルの前処理は臨床実験環境下での適用としては実用的でない。サンプルへのＭＡｂの正確な分配は困難であって時間がかかり、またその結果として容認し得ない程度の高確率な不正確性をもたらす。したがって、ｃＰＳＡアッセイの完全自動化方法が開発された。
【００５４】
自動化ＭＡｂ ＰＳＡ２０法
アッセイフォーマット１において、Ｒ１、ＭＭ１−フルオレセイン、試薬にＭＡｂ ＰＳＡ２０を濃度５００μｇ／ｍＬで添加し、アッセイは検量用にＰＳＡ−ＡＣＴを使用してｔＰＳＡと同様に実施した。このアッセイは完了まで３８分を要する。アッセイフォーマット２において、反応液中でサンプルをＭＡｂ ＰＳＡ２０を用いて前処理する。このフォーマットにおいては、反応キュベットに患者サンプルとともにＰＳＡ２０抗体を添加し、５０分間インキュベートした。その後、ＭＭ１−フルオレセインを濃度０．５μｇ／ｍＬで、ＭＰ２−ＡＬＰを濃度６．１５μｇ／ｍＬで、お よび抗フルオレセイン抗体で被覆した磁性粒子を添加し、さらに２８分間インキュベートした。過剰の試薬および未反応の血清を洗浄除去した後、ｔＰＳＡアッセイと同一の様式で基質を添加し、発色をモニターした。濃度範囲２ｎｇ／ｍｌ−２５ｎｇ／ｍｌにわたる遊離ＰＳＡを含有するサンプルを使用した。図３の結果は、これらの手法のいずれを使用しても、遊離ＰＳＡにともなう信号を非常に低レベルまで効果的に減少させることができることを示している。これらの結果は、この方法を Bayer Immuno 1 Analyzerで完全に自動化することができることを示唆している。
【００５５】
自動化ＭＡｂ ＭＥ２法
ＭＥ２ ＭＡｂはｔＰＳＡアッセイ中のｆＰＳＡへのＭＭ１ ＭＡｂの結合を顕著な低濃度で、またＰＳＡ２０ ＭＡｂよりも大きな程度で阻害する。その上、アッセイフォーマット２はより長時間を要し、そして２つの試薬カセットを必要とする。したがって、ｃＰＳＡアッセイの自動化のために使用する第３の抗体としてＭＥ２ ＭＡｂを選択し、２つの方法（試薬１（Ｒ１）または試薬２（Ｒ２）のいずれかにＭＥ２を濃度５０および１００ ng/mL を添加）でｔＰＳＡアッセイ中に添加した。結果は、ＭＥ２をＲ１およびＲ２中に添加したとき、ｆＰＳＡの反応性がそれぞれ９７％および９８％阻害されることを示した。これらのデータに基づき、Ｒ２試薬中にＭＥ２ ＭＡｂを最終濃度１００μｇ／ｍＬで使用するｃＰＳＡアッセイが方式化されることが判定された。
【００５６】
血清中の複合体化ＰＳＡの測定
パイロット研究
前立腺ガン患者５３名、ＢＰＨ患者７５名、および健康な同年代の対照者からの８８サンプルを３つのアッセイ：ｔＰＳＡ、ｆＰＳＡおよびｃＰＳＡ、を使用して分析した。ｃＰＳＡアッセイで試験するサンプルは２５μｇ／ｍｌのＭＥ２抗体で前処理し、ｆＰＳＡおよびｔＰＳＡアッセイで試験するサンプルは処理しなかった。アッセイを上述のように遊離ＰＳＡまたはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のいずれかを使用して検量化した。この試験の結果を図４Ａに示す。組織学的にガンと確認された男性群のＣａＰ検出について、ｔＰＳＡアッセイで４．０ｎｇ／ｍＬのカットオフ値を使用して得られた感度と実質的に同様の感度を達成する（８８％に比較して８５％）ために、３．７５ｎｇ／ｍＬ（ＰＳＡ当量濃度として表示）の正常値の上限を選択した。この正常上限値を使用して、この研究で試験した正常およびＢＰＨ集団の特異性もまた、陽性ｔＰＳＡ結果に引き続きｆＰＳＡアッセイを実施してｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比を計算した２段階試験と比較したｃＰＳＡと同等であった。ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比と関連させて使用するｔＰＳＡアッセイの感度および特異性がｃＰＳＡのみの場合と同等であるという発見は、患者集団が診断のグレイゾーンに分類される場合にも正当であった。診断のグレイゾーンの明確な範囲は決定されていないが、この研究で比較したすべての範囲について、ｃＰＳＡアッセイの感度および特異性は総および遊離ＰＳＡアッセイの両方を使用して得られたものに匹敵した。これらのデータは、単独試験、ｃＰＳＡが総ＰＳＡと同等の有効性で前立腺ガンを検出することができ、その上、２つのアッセイ、ｆＰＳＡおよびｔＰＳＡを使用して得ることができることが示された、改善された特異性を有することを証明している。
【００５７】
臨床研究
３つのアッセイ：ｔＰＳＡ（Hybritech Tandem（登録商標）ＰＳＡアッセイ、San Diego,California,USA、を使用）、ｆＰＳＡ（Hybritech Tandem（登録商標）遊離ＰＳＡアッセイを使用）、およびｃＰＳＡ（上述の自動化ＭＡｂ ＭＥ２法を使用）、を使用して、Seattle VA Hospital,Seattle,Washington,USA、において、生検患者３００名（７５名は前立腺ガンが確認された）からの血清サンプルを分析した。上述のように遊離ＰＳＡまたはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のいずれかを使用して、アッセイを検量化した。この試験の結果を図４Ｂに表形式で、図５に回帰分析として示す。組織学的にガンと確認された男性群のCaP 検出について、ｔＰＳＡアッセイで４．０ｎｇ／ｍＬのカットオフ値を使用して得られた感度と実質的に同様の感度を達成する（８３％に比較して８１％）ために、３．７５ｎｇ／ｍＬ（ＰＳＡ当量濃度として表示）の正常値の上限を選択した。この正常上限値を使用して、この研究で試験した正常およびＢＰＨ集団の特異性もまた、２段階試験（上記、ｔＰＳＡ＋ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ）と比較したｃＰＳＡと同等であった。図５において、グラフの右下象限に見られる小円データポイントは、医学的判定の基準としてｔＰＳＡではなくｃＰＳＡ値を使用していたならば、生検の危険、不快感および出費を回避することができたはずの非ガン患者（１１７名の内３４名、または２９％）を表している。また、パイロット研究と同様に、ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比と関連させて使用するｔＰＳＡアッセイの感度および特異性がｃＰＳＡのみの場合と同等であるという発見は、患者集団が診断のグレイゾーン層に入る場合にも正当であった（上記）。
【００５８】
独立したパイロットおよび臨床研究からのデータは、単独試験、ｃＰＳＡが総ＰＳＡと同等の有効性で前立腺ガンを検出することができ、その上、２つのアッセイ、ｆＰＳＡおよびｔＰＳＡを使用して得ることができることが示された、改善された特異性を有することを証明している。
ｃＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ間の相関関係
ｃＰＳＡアッセイにおいて複合体化ＰＳＡのどの種類が測定されるのかを決定するため、ＡＣＴと複合体化したＰＳＡを測定するアッセイが開発された。この種類の複合体化ＰＳＡは血清中の複合体化ＰＳＡの主要な形態に相当することが報告されている。手動方法を使用するＰＳＡ−ＡＣＴ測定のこれまでの試みは上述のような技術上の難点があった。したがって、Bayer Immuno 1TMシステムでＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を測定するための自動化イムノアッセイが開発された。ＰＳＡ−ＡＣＴのためのこの自動化アッセイを使用してＰＳＡ−ＡＣＴについて、上述のパイロット研究と同一集団の患者を試験した。結果を図６−８に示す。ここでは、自動化ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイを使用して得られた結果を自動化ｃＰＳＡアッセイを使用して得られた結果に対して回帰させている。各患者集団、すなわち正常、前立腺ガン、および良性前立腺疾患（ＢＰＨ）集団について、すべての患者サンプル、および患者の試験結果の大多数を含む範囲を回帰分析した。これは少数の大きな数値に起因する回帰分析の偏りをさけるためである。いずれの場合も、回帰線の傾斜は０．９３から０．９８の範囲であった。これらのデータはｃＰＳＡアッセイによって測定した物質の約９３−９８％がＰＳＡ−ＡＣＴであることを示唆している。残存の２−７％のｃＰＳＡの生化学的性質は現在のところわかってい ない。
【００５９】
選択された感度におけるＰＳＡアッセイの特異性
ｃＰＳＡアッセイで使用する正常上限値をｔＰＳＡアッセイと同様の感度を与えるようにして、決定した。このカットオフ値を使用して、ｃＰＳＡアッセイが現在医療現場で使用されている方法、すなわちｔＰＳＡよりも改善された特異性を提供することが証明された。正常上限値について異なる数値を使用したｃＰＳＡアッセイの特異性も測定した。上述の臨床研究から得られたすべての結果をReceiver Operator Characteristic（ＲＯＣ）分析に使用した。その後、感度レベルを８０−１００％の範囲に変化させてＲＯＣ分析から特異性を判定した。８０％未満 の感度は、現在実用されている診断方法が少なくともこの感度レベルを提供するので、ほとんど医学的価値がない。図１０に示す結果は、すべての感度レベルにおいて、ｃＰＳＡアッセイはｔＰＳＡより大きい特異性を提供し、２つのアッセイ、ｔＰＳＡおよびｆＰＳＡの使用とほぼ同等かまたは少し良好な特異性を提供することを証明している。その上、患者サンプルが診断のグレイゾーンに入っている場合でも、特異性の改善は正当である。これらの結果は、ｃＰＳＡアッセイについての正常上限値は感度および特異性の所望のレベルに応じて広い範囲から選択することができるが、約３−４ｎｇ／ｍＬの範囲の正常上限のすべての値において、ｃＰＳＡはｔＰＳＡよりも改善された特異性を、そしてｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比とほぼ同等の特異性を与えることを証明している。
【００６０】
以上、本発明を詳細に記述し、例示した。明らかに、これらの精神および範囲から離れることなく、本発明の多くの他の変更および改変を行なうことが可能である。
【００６１】
【発明の効果】
本発明により、サンプル中のＰＳＡへのｆＰＳＡ特異的抗体の結合によって、イムノアッセイにおいてｃＰＳＡのみを測定することができる。ｃＰＳＡの血中レベルの測定により、前立腺ガンの診断および監視の補助となる、高感度で高度に特異的な方法を提供され、そして多数の患者にとって不必要な前立腺の生検を実施する必要がなくなる。
【００６２】
引用文献
１．Wang MC,Valenzuela LA,Murphy GP,Chu TM. ヒト前立腺特異的抗原の精製。
Invest Urol 1979;17:159-63.
２．Watt WK,Lee PJ,Timkulu TM,Chan WP,Loor R. ヒト前立腺特異的抗原：構造およびセリンプロテアーゼとの機能的類似性。Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:3166-70.
３．Akiyama k,Nakamura T,Iwanaga S,Hara M.ヒト前立腺特異的抗原、r-セミノプロテインのキモトリプシン様活性。FEBS Letters 1987;225:168-72.
４．Christensson A,Laurel CB,Lilja H. 前立腺特異的抗原の酵素活性および細胞外セリンプロテイナーゼインヒビターとの反応。Eur J Biochem 1990;194:755-763.
５．Lilja H.前立腺液中のカリクレイン様セリンプロテアーゼは主要精嚢タンパク質を切断する。J Clin Invest 1985;76:1899-903.
６．Lilja H,Abrahamsson PA. ヒト前立腺によって分泌される３つの主要なタンパク質。Prostate 1980;12:29-38.
７．Papsidero LD,Wang MC,Valenzuela LA,Murphy GP,Chu TM.前立腺ガン患者の血清中の前立腺抗原。Cancer Res 1980;40:2428-2432.
８．Lange PH. 前立腺ガンの診断および管理における前立腺特異的抗原。Supplement to Urology 1990;XXXVI:25-29.
９．Oesterling JE.前立腺特異的抗原：前立腺ガンのための最も有用な腫瘍マーカーの臨界評価。J Urol 1991;145:907-923.
１０．Armbruster DA.前立腺特異的抗原：生化学、分析方法および臨床応用。Clin Chem 1993;39:181-195.
１１．American Cancer Society:ガンの事例および実像−1995。American Cancer Society,Inc., Atlanta,GA.Page 11.
１２．Catalona WJ,Richie JP,Ahmann FR,Hudson MA,Scardino PT,Flanigan RC,de Kernion JB,Ratliff TL,Kavoussi LR,Dalkin BL,Waters,WB,MacFarlane MT and Southwick PC.前立腺ガンの早期検出における直腸指診と血清前立腺特異的抗原の比較：男性 6,630名の多施設臨床試験の結果。J Urol 1994;151:1283-1290.
１３．Stenman UH,Leinonen J,Alfthan H,Rannikko S,Tuhkanen K,Alfthan O.前立腺特異的抗原とα121-抗キモトリプシンとの複合体は前立腺ガン患者の血清中の前立腺特異的抗原の主要な形態である：この複合体のアッセイはガンの臨床上の感度を改善する。Cancer Res 1991;51:222-226.
１４．Zhou AM,Tewari PC,Bluestein BL,Caldwell,GW,Larsen FL. 血清中の前立腺特異的抗原の多種の形態：モノクローナルおよびポリクローナルアッセイによる免疫認識の差異。Clin Chem 1993;39:2483-91.
１５．Leinonen J,Lovgren T,Vornanen T,Stenman UH. 前立腺特異的抗原およびそのα1-抗キモトリプシンとの複合体の二重標識時間分解免疫蛍光測定。Clin C
hem 1993;39:2098-2103.
１６．Christensson A,Bjork T,Nilsson O,Nilsson O,Dahlen U,Matikainen MT,Cockett AT,Abrahamssion PA. 前立腺ガンの指示薬としての、α1-抗キモトリプシンと複合体化した血清前立腺ガン特異的抗原。J Urol 1993;150:100-105.
１７．Lilja H.血清ＰＳＡの異なる分子形態の意義：α1-抗キモトリプシンと複合体化したものに対する遊離の、非複合体化形態のＰＳＡ。Urol Clin North Am 1993;20(4):681-686.
１８．Lilja H,Christensson A,Dahlen U,Matikainen M-T,Nilsson O,Pettersson K and Lovgren T:ヒト血清中の前立腺特異的抗原は主としてアルファ抗キモトリプシンとの複合体として存在する。Clin Chem 1991;37:1618-1625.
１９．Bjork T,Hulkko S,Bjartell A,Santagnese AD,Abrahamsson P-A,Lilja H.ＰＳＡ産生細胞中のアルファ1-抗キモトリプシンの産生は前立腺ガンに共通するが良性前立腺肥大症ではまれである。Urology 1994;43:427-434.
２０．Pettersson K,Piironen T,Seppala M,Liukkonen L,Christensson A,Matikainen M-T,Suonpaa M,Lovgren T,Lilja H.遊離および複合体前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）：遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−α1-抗キモトリプシン複合体の in vitro 安定性、エピトープマップ、ならびに特異的および好感度検出のための免疫蛍光アッセイ。Clin Chem 1995;41:1480-1488.
２１．Wu JT,Wilson L,Zhang P,Meikle AW,Stephenson R.ＢＰＨおよび前立腺ガン患者からの無作為または系列検体におけるＰＳＡ−ＡＣＴ複合体と総ＰＳＡの血清中濃度の相関関係。J Clin Lab Anal 1995 9:15-24.
２２．Mitrunen K,Pettersson K,Piironen T,Bjork T,Lilja H,Lovgren T.(1995) 血清中の遊離および総前立腺特異的抗原の濃度および比率の同時測定のための二重標識一段階イムノアッセイ。Clin Chem 1995 41(8):1115-1120.
２３．Catalona WJ,Smith DS,Wolfert RL,Wang TJ,Rittenhouse HG,Ratliff TL,Nadler RB:前立腺ガンスクリーニングの特異性を改善するための遊離の血清前立腺特異的抗原の割合の評価。JAMA 1995 274(15):1214-1220.
２４．Prestigiacomo AF,Stamey TA. 遊離および複合体ＰＳＡの臨床上の有用性
。
【００６３】
Scan J Clin Lab Invest 1995 55 Supple 221:32-34.
２５．Wang TJ,Hill TM,Sokoloff RL,Frankenne F,Rittenhouse HG,Wolfert RL.遊離前立腺特異的抗原のための二重モノクローナル抗体イムノアッセイ。Prostate 1996 28:10-16.
２６．Jung K,Stephan C,Lein M,Henkne W,Schnorr D,Brux B,Schurenkamper P,Loening SA. ２つの遊離前立腺特異的抗原アッセイを比較した分析の実施および臨床上の妥当性。Clin Chem 1996 42(7):1026-1033.
２７．Wang TJ,Hill T,Sokoloff R,Frankenne F,Wolfert R,and Rittenhouse H.良性肥大症および前立腺ガンにおける遊離ＰＳＡを定量するためのモノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ。1994 ISOBM会議におけるポスター発表(poster presentation) 。
２８．Chan D,Kelley CA,Partin AW,Linton J,Wang TJ,Sokoloff RL,Rittenhouse HG,and Wolfert RL.Clin Chem (1996)42(6):S255.
２９．Wang TJ,Linton J,Payne J,Rittenhouse HG,Wolfert RL,Chan DW,Kelley CA and Partin AW. ＰＳＡ−ＡＣＴに対する特異的モノクローナル抗体による複合体ＰＳＡイムノアッセイの臨床的有用性。J Urology (1997)157(4)Suppl:147.
３０．Wang TJ,Linton HJ,Payne J,Liu R-S,Kuus-Reichel K,Rittenhouse HG,Ke lley C,Cox J,Chan DW, and Wolfert RL. ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に特異的なモノクローナル抗体の開発およびイムノアッセイへのそれらの組み込み。Clin Chem (1997)43(6):S225.
３１．Zhang P and Wu,JT.非特異的吸着の妨害をともなわない、血清中のＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のためのイムノアッセイの開発。Clin Chem (1997)43(6):S236.
３２．Bjork T,Bjartell A,Abrahamsson P-A,Hulkko S,Di Sant'agnese A,Lilja H. ＰＳＡ産生細胞中のアルファ1-抗キモトリプシンの産生は前立腺ガンに共通するが、良性前立腺肥大症ではまれである。Urol 1994 43(4):427-434.
３３．Carter HB,Pearson JD,Metter J,Brant LJ,Chan DW,Andres R,Fozard JL and Walsh PC. 前立腺疾患を有するおよび有しない男性における前立腺特異的抗原の長期的評価。JAMA 1992 267(16):2215.
【図面の簡単な説明】
【図１】遊離ＰＳＡ抗体濃度とｆＰＳＡの阻害との関係を表す図である。
【図２】遊離および複合体化ＰＳＡの相対比と測定濃度との関係を表す図である。
【図３】自動化イムノアナライザーにおいて、ｃＰＳＡアッセイを自動化するためにＰＳＡ２０を使用することができることを示す図である。
【図４】前立腺ガン、ＢＰＨ又は同年代の健康な対照男性の血清中の全遊離及び複合体化ＰＳＡの測定結果を示す図である。
【図５】総ＰＳＡ対ｃＰＳＡの回帰分析の結果を表す図である。
【図６】ｃＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴ間の相関関係を表す図である。
【図７】ｃＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴ間の相関関係を表す図である。
【図８】ｃＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴ間の相関関係を表す図である。
【図９】前立腺ガン、ＢＰＨ又は同年代の健康な対照男性の血清中のｃＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴの測定結果を示す図である。
【図１０】選択された感度におけるＰＳＡアッセイの特異性を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液サンプル中の免疫学的に測定可能な複合体形態の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の測定に関する。より特定すると、本発明は、２部位免疫測定アッセイによる複合体化ＰＳＡの測定および複合体化ＰＳＡアッセイの数値の臨床上の意義に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）はヒトカリクレインファミリーに高度にアミノ酸相同性の約３３，０００ダルトンの糖タンパク質であり（１，２）、トリプシンおよびキモトリプシン様活性を有するセリンプロテアーゼであることが示されている（３，４，５）。ＰＳＡは前立腺の上皮細胞から分泌され、精液中に見出だされる主要なタンパク質の１つである（６）。前立腺ガンの患者の血清中でＰＳＡの濃度が上昇するという発見に続く多数の報告により、このタンパク質が前立腺ガン患者を治療する上で重要かつ臨床上有用なバイオマーカーであることが立証された（７，８，９，１０）。最近の努力は、無症状者の前立腺ガンの早期検出のための血清ＰＳＡ試験の利用に注がれている。実際、アメリカガン学会（American Cancer Society ）およびアメリカ泌尿器学会（American Urological Society ）は最近、５０才を超えたすべての男性は毎年直腸指診（ＤＲＥ）とともに血清ＰＳＡを使用してスクリーニングを受けるべきであると勧告した（11）。
【０００３】
前立腺ガンの早期検出の臨床的価値はいくつかの理由によって論争の的となっている。第１に、早期段階での前立腺ガンの治療が発症集団における生存率を改善するかどうかが明白でない。この論点を目的として計画された臨床試験は現在実施中である。第２に、最近、５０才を超えた男性における前立腺ガンの早期検出のために、血清ＰＳＡ測定の有効性について、直腸指診（ＤＲＥ）とあわせて臨床試験で測定した（12）。異常ＤＲＥまたは上昇したＰＳＡ試験値のいずれかを有した１０６０人の患者の内、２２％のみが前立腺ガンであった。これらのデータは全前立腺生検の７０−８０％がガンでない男性に実施されることを示している。５０才を超えた男性の３０−５０％が剖検上前立腺ガンの徴候を示すから、上昇ＰＳＡアッセイによって標的とされる不必要な前立腺生検の数は非常に高いということができる。このことは、医療コストの増大および生検操作に関連した罹病率の増大の両方の結果を招く。
【０００４】
ＰＳＡがα1-抗キモトリプシン（ＡＣＴ）、α2-マクログロブリンおよび α1-抗トリプシンなどのプロテアーゼインヒビターとの複合体を形成すること を、いくつかの研究室が別々に示した（13−19）。ＡＣＴ若しくはα1-抗トリ プシンとの複合体、または遊離の非複合体形態のＰＳＡはイムノアッセイ技術によって血清中で検出可能である。実際、血清中の免疫反応性ＰＳＡの大部分はＡＣＴと複合体化し、ＡＣＴに結合したＰＳＡおよび総血清ＰＳＡ濃度間には有意な相関性が証明されている（13）。しかし、α2-マクログロブリンに結合した ＰＳＡは、このプロテアーゼとの複合体化にともなう抗体のＰＳＡへの結合の立体障害によって、血清中で測定することができない。初期の研究において、ＰＳＡ−ＡＣＴレベルおよび総ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣＴの割合は前立腺ガン診断において有用であることが示唆された（13，15，16，17）が、種々の理由（その中のいくつかについて以下に論述する）によって、ＰＳＡ−ＡＣＴの血清測定の臨床上の有用性の結論を下すことは困難だった。
【０００５】
Lilja，Stenmanおよび共同研究者たちは１９９１年に、血清ＰＳＡが遊離形態ならびにＡＣＴおよびα1-抗トリプシンとの複合体で存在することを発表した（13，18）。その後の研究において、Stenman らは、遊離プラス複合体化ＰＳＡ（通常のＰＳＡアッセイではα2-マクログロブリンとの複合体化ＰＳＡは測定さ れないが、これを総ＰＳＡと称する）と関連させたＰＳＡ−ＡＣＴの測定が、前立腺ガンの男性と良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）などの良性の前立腺疾患の男性との鑑別を改善するらしいことを表明した。しかし、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の正確な測定は、この複合体の正確な測定における技術的問題のため、達成されていない。Stenman らは、ＰＳＡ−ＡＣＴ数値と総ＰＳＡの測定との相関関係は低濃度末端では良好でなく、ｙ軸交点が上昇して、複合体化ＰＳＡの過剰回収を示すことを発見した（13および米国特許第５，５０１，９８３ 号）。実際に、彼らは、試験した大部分の患者について、ＰＳＡ−ＡＣＴの濃度が総ＰＳＡよりも高いことを発見した（米国特許第５，５０１，９８３号）。その後の複合体および遊離のＰＳＡの相関関係の分析は、勾配１．１２を示し、これはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の過剰回収を示した（16）。Petterssonらは、メスの血清中で上昇したＰＳＡ−ＡＣＴ数値を発見した時、この過剰回収に注目した（20）。ヘパリンの添加はメス血清における偽陽性値の率を減少させたが、前立腺ガンおよびＢＰＨ患者におけるＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の測定の最近の試みでは、複合体の有意な過剰回収が示され続けている（21）。
【０００６】
ＰＳＡ−ＡＣＴ測定において遭遇するこの問題点のため、文献中の関心は総ＰＳＡの測定とともに複合体化していない遊離のＰＳＡの測定に移った。総ＰＳＡ値の範囲が約４−１０ｎｇ／ｍＬの場合に改善された特異性が要求されることは、現在 明白である。血清総ＰＳＡが＜４．０ｎｇ／ｍＬの場合、前立腺ガンのリスクは低い；同様に、総ＰＳＡが＞１０ｎｇ／ｍＬの場合、前立腺ガンのリスクは＞５０％であり、前立腺生検が必要となる。診断のグレイゾーン内（一般的に２−２０ｎｇ／ｍＬ、普通は ４−１０ｎｇ／ｍＬ）において、ガンのリスクは高いが偽陽性の割合もまた高い。遊離 ＰＳＡ／総ＰＳＡ比の遡及適用(retrospective application) によって、４−１０ｎｇ／ｍＬグレイゾーンにおける総ＰＳＡの特異性をおよそ５０−６０％から７０−８０％に改善することができることが示された（22−26）。この改善された特異性の結果、不必要な生検を２０−３０％減少させることができる。ＰＣＴ国際公開公報第９６−２６４４１号および国際公開公報第９７−１２２４５号には総ＰＳＡレベルが ２．５と２０ｎｇ／ｍＬの間の患者におけるＢＰＨおよびガンのそれぞれの鑑別を改善するための、遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡ比の使用について同様に記載されている。
【０００７】
しかし、遊離ＰＳＡの測定にはそれ自体に技術上の困難性がある。第１に、診断のグレイゾーン内において、遊離ＰＳＡの割合は典型的にはかなり低く、５−３０％の範囲である。したがって遊離ＰＳＡアッセイを成功させるためには、０．２−３．０ｎｇ／ｍＬの範囲内を正確に測定しなければならない。また、遊離ＰＳＡの濃 度はＢＰＨおよびガン患者において有意な差異がなく、遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡ比はＡＣＴと複合体化したＰＳＡの割合の増加によって減少する。その上、遊離ＰＳＡは血清中で安定ではなく、遊離ＰＳＡレベルは時間が経つと、おそらくα2 -マクログロブリンとの複合体化によって、減少することが知られている。
【０００８】
この間に、こうした問題を克服するための試みにともなって、血液中のＰＳＡ−ＡＣＴの正確な測定に関連する問題のさらに別の認識が得られた。１９９４年、Hybritech の研究者らは、抗ＰＳＡおよび抗ＡＣＴ抗体を使用したＰＳＡ−ＡＣＴのためのサンドイッチイムノアッセイの開発を報告した。彼らは、測定したＰＳＡ−ＡＣＴ値が前立腺ガンの診断における改善された臨床上の特異性を証明することができないと結論づけた（27）。後に、このグループはJohns Hopkins Medical Institutionsの研究者らと共同して、抗ＰＳＡ／抗ＡＣＴサンドイッチイムノアッセイ法は有意の非特異的結合およびＰＳＡ−ＡＣＴの過剰回収の難点があるという知見を報告した。彼らは、解決することなく、これらの問題がＰＳＡ−ＡＣＴの測定を臨床的に無意味なものとしていると結論づけた（28）。続いて、この共同グループは、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に特異的なモノクローナル抗体を基礎とするＰＳＡ−ＡＣＴのサンドイッチイムノアッセイの開発を通してこの非特異的結合の問題を克服したと報告した（29，30）。しかし、彼らの臨床研究では、総ＰＳＡの測定または総ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣＴの計算上の比に比較して、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のみの測定による前立腺ガンに対する特異性の何らかの改善を示すことができなかった（29）。ブロック試薬の使用を含む、ＰＳＡ−ＡＣＴ測定に関連する問題を克服するその他の研究方法が提案されてきた（31）。
【０００９】
前立腺ガンの患者において、なぜＡＣＴと複合体化したＰＳＡの割合が増大するかは不明のままであるが、ＡＣＴに対する抗体がＢＰＨ患者からの前立腺上皮を染色(stain) しないとともに、この組織においてｍＲＮＡの転写が見られないという観察に関係があるかもしれない。反対に、前立腺ガンの患者からの前立腺上皮において抗ＡＣＴの免疫反応性およびｍＲＮＡ合成が検出される（32）。これらの結果は、前立腺腫瘍中で、ＰＳＡは血清中に放出される前にin situ でＡＣＴと複合体化するらしいことを示唆している。活性ＰＳＡの血流への移行には別の機構が関与するようである。健康な男性からの血清中に見られる遊離ＰＳＡはタンパク質分解によって切断され、酵素的に不活性である。しかし、腫瘍は血管原性因子を合成し、これが腫瘍組織の血管新生の増加を導く。腫瘍中では、より大きな割合の酵素的に活性なＰＳＡが血流へ移行できるようである。この活性ＰＳＡはＡＣＴなどのプロテアーゼインヒビターと複合体化するものと予想され、これによって前立腺ガン患者からの血清中でのＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のより高い割合がもたらされると考えられる。
【００１０】
したがって、前立腺ガンに関する男性患者のスクリーニングに関連して、複合体化ＰＳＡの正確な測定方法が必要であるとともに、複合体化ＰＳＡの血中レベルの臨床上の意義を評価する必要がある。
欧州特許第６３５，５７５号には、遊離ＰＳＡには結合するがＰＳＡ−ＡＣＴには結合しないモノクローナル抗体の調製について記載されている。
【００１１】
ＰＣＴ国際公開公報第９５／１８３８１号は、遊離ＰＳＡには結合するが複合体化ＰＳＡには結合しなし抗体の添加によって、遊離および複合体化ＰＳＡに対して等モルの応答性を提供することができるようにした、ＰＳＡ測定のためのモノクローナル／ポリクローナルイムノアッセイ法に関係している。
米国特許出願番号第０８／５９５，１５５号およびZhou Z,Ng PC,Very DL,Allard WJ,Yeung KK,J.Clin.Lab.Anal.(1996),10:155-159,には、モノクローナル／ポリクローナルイムノアッセイにおいて遊離および複合体化ＰＳＡに対して等モルの応答性を提供するモノクローナル抗体の調製方法が記載されている。記載されているモノクローナル抗体は、ＰＳＡに結合して、遊離ＰＳＡには結合するが複合体化ＰＳＡには結合しない抗体にＰＳＡが結合するのを実質的に不可能にするという、独特の特性を有している。
【００１２】
日本特許公告公報第６２−４６２６３号にはプロテアーゼインヒビターとの複合体化ＰＳＡの測定のためのサンドイッチイムノアッセイが記載されている。
ドイツ特許出願公開公報第４，３２２，３４２号には、総ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣＴの比率を計算するための数値を提供する目的で、単一のアッセイにおいて総ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴの両方を測定する方法が記載されている。
【００１３】
Chichibuらは、Journal of Medicine and Pharmaceutical Science(Japan,1996)36(3):477-483,において、ビーズに結合させた抗ＰＳＡおよび酵素標識抗ＡＣＴを使用したＰＳＡ−ＡＣＴのためのサンドイッチイムノアッセイを記述している。血液サンプル中のＰＳＡ−ＡＣＴを正確に測定する能力を確定するデータは含まれていない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、複合体化ＰＳＡ（ここではｃＰＳＡと称する）を測定するための方法を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明の方法は、複合体化していない、すなわち遊離のＰＳＡ（ｆＰＳＡ）がイムノアッセイで検出されなくなるように血液サンプルを処理し、その後にイムノアッセイによって処理血液中のＰＳＡを測定してｃＰＳＡのみを検出するものである。イムノアッセイは通常のどんな様式でも実施することができるが、より一般的には競合イムノアッセイまたは二部位イムノアッセイ(two-site immunometric assay) である。本発明は以下により詳細に記載するような各種の方法によって達成することができる。一般的に、こうした方法として、イムノアッセイ試験混合物からｆＰＳＡを物理的に除去するかまたは残存させる分離方法、およびｆＰＳＡをイムノアッセイ法において使用する抗体に基本的に結合することができなくさせることによって、アッセイから効果的にｆＰＳＡを取り去るために、ｆＰＳＡ中の抗原決定基または決定基群を化学的相互作用などによって修飾する方法が含まれる。
【００１６】
３抗体試薬系を基礎として、特に有利な二部位イムノアッセイ法が考案された：
（ａ）ｔＰＳＡに結合し、イムノアッセイに関与する、第１の抗ＰＳＡ抗体（モノクローナルまたはポリクローナル抗体）、
（ｂ）同じくｔＰＳＡに結合し、同じくイムノアッセイに関与するが、ＰＳＡにｆＰＳＡ特異的抗体が結合した場合には実質的にＰＳＡに結合することができない特性を有するように選択された、第２の抗ＰＳＡ抗体（好ましくは、モノクロ−ナル抗体）（この第２の抗体をここでは時によって「ＭＭ１」と称する）、および
（ｃ）ｆＰＳＡ特異的で、好ましくはモノクローナル抗体である、第３の抗ＰＳＡ抗体。
【００１７】
イムノアッセイに関与させる場合、第１および第２の抗ＰＳＡ抗体の１つを検出目的で標識し（これを「標識」または「検出」抗体と称することができる）、他方を試験混合物から分離する目的で固定化するかまたは固定化することができるものにする（「捕捉」抗体）。これによって、血液サンプル中のｆＰＳＡがｆＰＳＡ特異的（第３）抗体と結合して、サンプル中のｆＰＳＡを前述のＭＭ１（第２）抗体と結合できないようにするアッセイ条件を確立することができる。２部位イムノアッセイは前述の第１および第２抗体（「標識」および「捕捉」抗体）の両者のＰＳＡへの結合に依存するので、ｆＰＳＡ特異的抗体の結合は結果的にｆＰＳＡ形態を２部位イムノアッセイによる検出ができないものにする。この特別の独特なアッセイ系において使用する３抗体はすべて１以上のＰＳＡの形態に特異的である（すなわち、どれもｃＰＳＡに含まれるいかなるプロテアーゼインヒビターに対しても特異的ではない）という事実にもかかわらず、これらの抗体の特別の特性によって、ｃＰＳＡの特異的測定がなされるということに留意すベきである。
【００１８】
ｃＰＳＡ血中値の測定が前立腺ガン（ＣａＰ）の検出のための高感度で高度に特異的な方法を提供することがわかった。またｃＰＳＡアッセイはｆＰＳＡの測定が関与するアッセイに比較して分析の精度が上昇するという利点を有する。なぜならば、ｃＰＳＡはＰＳＡの主要な形態であり、ｆＰＳＡとｃＰＳＡとの間のＰＳＡの分配に影響する環境および分析因子（例えばサンプルの年令）はｆＰＳＡの測定に比較してｃＰＳＡ測定の精度に対してずっと低い影響をもたらすからである。
【００１９】
ｃＰＳＡは主としてプロテアーゼインヒビターα1-抗キモトリプシン（ＡＣＴ）と複合体化したＰＳＡからなるので、ＰＳＡ−ＡＣＴ特異的アッセイもまたｃＰＳＡアッセイの有利な感度、特異性およびその他の特徴を与えることになる。図１Ａは、ＰＳＡのＥエピトープに対する３つの異なるモノクローナル抗体の存在下での、ｔＰＳＡに関する２部位イムノアッセイにおける、ｆＰＳＡの免疫反応性の阻害を示すグラフである。５０ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡを含有するサンプルを各抗ｆＰＳＡ ＭＡｂとともに３０−６０分間 プレインキュベートし、Bayer Immuno１TMｔＰＳＡアッセイを実施した。図１Ｂは２つの抗Ｅ抗体、ＰＳＡ２０およびＭＥ２がｔＰＳＡアッセイにおいてｆＰＳＡの免疫反応性の濃度依存性阻害を示す、同様の実験を示す。１０ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡを含有するサンプルをＰＳＡ２０またはＭＥ２ ＭＡｂのいずれかとともに３０−６０分間プレインキュベートし、Bayer Immuno１ｔＰＳＡアッセイを実施した。
【００２０】
図２Ａは、ｔＰＳＡアッセイへの抗Ｅ抗体ＰＳＡ２０の添加がｃＰＳＡの測定のためのイムノアッセイの１フォーマットを提供することを示すグラフである。 Bayer Immuno 1 Analyzerを使用し、ＭＡｂ ＰＳＡ２０ ３００μｇ／ｍｌの存在下で、遊離および複合体化ＰＳＡの割合を変えた約１１ｎｇ／ｍＬの総ＰＳＡを含有するサンプルを測定した。図２Ｂは、ＭＥ２ ＭＡｂもまたｃＰＳＡの定量測定のためのイムノアッセイフォーマットを提供することができることを示す同様のグラフである。 Bayer Immuno 1 analyzerを使用し、ＭＡｂ ＭＥ２ ２５μg/mLの存在下 で、遊離および複合体化ＰＳＡの比率を変えた約１１ｎｇ／ｍｌの総ＰＳＡを含有するサンプルを測定した。
【００２１】
図３は自動化イムノアナライザーにおいてｃＰＳＡアッセイを自動化するために、ＰＳＡ２０を使用することができることを示す表である。アッセイフォーマット１は総インキュベート時間を３８分とし、ＭＡｂ ＰＳＡ２０をＭＭ１−フルオレセインコンジュゲート（Ｒ１）に添加して使用した。アッセイフォーマット２は総インキュベート時間を７８分とし、ＰＳＡ ＭＡｂ２０とサンプルとのオンボード(on-board)プレインキュベートを使用した。すべての結果を発色率で示している。
【００２２】
図４Ａおよび４Ｂは、前立腺ガン、ＢＰＨまたは同年代の健康な対照男性の血清中の全遊離および複合体化ＰＳＡの測定結果を要約した表である。“全”で表示する非選択患者集団には、ｔＰＳＡ値にかかわりなく、ＣａＰ，ＢＰＨ，または同年代の健康な対照男性由来の患者サンプルが含まれる。患者グループをｔＰＳＡ値に従って分類する場合は、図４Ａに示す分析および図４Ｂに示す分析のｃＰＳＡ部分において、追加の患者サンプルを含ませた。この場合、下記の明細書において記載するように、診断のグレイゾーンに含ませるｔＰＳＡ値によって追加のサンプルを選択した。
【００２３】
図５は、前立腺ガンおよび良性前立腺疾患の男性から採取した患者サンプルに関する、好ましいｃＰＳＡアッセイを使用して得られた結果に比較した、市販のアッセイを使用して得られた結果の回帰分析のグラフである。
図６−８は、ガン、ＢＰＨおよび正常集団の男性の血清の試験から得られた、ｃＰＳＡアッセイ値およびＰＳＡ−ＡＣＴアッセイ値間の相関関係を示すグラフである。
【００２４】
図９は前立腺ガン、ＢＰＨまたは同年代の健康な対照男性の血清中のｃＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴの測定結果を要約する表である。非選択集団（「全」で表示）およびｔＰＳＡ値による患者グループの分類は図４Ａおよび４Ｂに要約した研究と同一とした。
図１０は、市販のｔＰＳＡアッセイ，好ましいｃＰＳＡアッセイ、およびｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比の計算によって得られたアッセイ値間の、カットオフ値（すなわち正常上限値）および選択された感度における特異性の相関関係を示す表である。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本明細書で使用する場合、以下の用語は指示された意味を持つものとする。
ＰＳＡは前立腺特異的抗原を意味するものとする。
ｔＰＳＡまたは総ＰＳＡとは、血液サンプル中の免疫学的に測定可能なＰＳＡ、すなわち、通常のイムノアッセイによる測定に応答することができる複合体化または遊離形態のＰＳＡ、の総量を意味するものとする。現状の知見を基準として、（ＡＣＴ、α1-抗トリプシン、およびインター−αトリプシンインヒビタ ーを含む）ある種のプロテアーゼインヒビターと複合体化した血液ＰＳＡは免疫学的に測定可能であるが、α2-マクログロブリンなどの別のプロテアーゼイン ヒビターと複合体化したときには、ＰＳＡは測定不可能であると理解される。
【００２６】
ｆＰＳＡまたは遊離ＰＳＡとは、複合体化していない遊離のＰＳＡを意味するものとする。
ｃＰＳＡまたは複合体化ＰＳＡとは、ｆＰＳＡ以外のｔＰＳＡを意味するものとする。
Ｅエピトープとは、ｆＰＳＡに結合するがｃＰＳＡには結合しない抗体のための結合部位である、ＰＳＡ上のエピトープの集合を意味するものとする。
【００２７】
抗Ｅ抗体とは、Ｅエピトープに結合する抗体、したがってｆＰＳＡの結合について特異的な抗体を意味するものとする。
抗体とは、完全イムノグロブリン、例えばＩｇＧ若しくはＩｇＭ、または抗体結合部位を含んでいるイムノグロブリン断片、例えばFab，Fab'，およびF(ab')2断片、あるいはこれらの凝集体を意味するものとする。
【００２８】
本発明は、血液サンプル中のｆＰＳＡを検出不可能にさせた後、イムノアッセイによってｔＰＳＡを測定することによる、血液サンプル中のｃＰＳＡを測定する方法を提供する。ｔＰＳＡを測定するために各種のイムノアッセイ法を使用することができること、および血液サンプル中のｆＰＳＡを検出不可能にさせるために各種の方法を利用できることは、当業者にとって明らかであろう。
【００２９】
一般的に、ｔＰＳＡイムノアッセイ法は競合または非競合性のいずれかである。前者の方法は典型的には固定化または固定化し得るＰＳＡに対する抗体（抗ＰＳＡ）および標識形態のＰＳＡを利用する。サンプルＰＳＡおよび標識ＰＳＡは抗ＰＳＡへの結合について競合する。生成した、抗ＰＳＡに結合した標識ＰＳＡ（結合画分）を結合しないまま残っているもの（非結合画分）から分離した後、結合または非結合画分のいずれかの中の標識の量を測定し、任意の通常の方法、例えば標準曲線との比較によって試験サンプル中のＰＳＡの量に対比させることができる。
【００３０】
ｔＰＳＡの測定のためには非競合方法がより一般的に使用される。最も一般的な方法は２部位イムノアッセイ法（ときには「サンドイッチ」法と称される）である。イムノアッセイにおいては、２つの抗ＰＳＡ抗体が使用される。抗ＰＳＡ抗体の１つは標識され（ときには「検出抗体」と称される）、他方は固定化するかまたは固定化し得るものである（ときには「捕捉抗体」と称される）。当業界で知られているように、捕捉および検出抗体は試験サンプルに同時にまたは順次接触させることができる。順次法は、捕捉抗体をサンプルとともにインキュベートし、その後あらかじめ定めた時間に標識抗体を添加することによって実施される（ときには「前進(forward) 」法と称される）か、または最初に検出抗体をサンプルとともにインキュベートし、その後標識抗体を添加することもできる（ときには「逆行(reverse) 」法と称される）。１回以上の必要なインキュベーションを行なった後、アッセイを完了させるために、捕捉抗体を液体試験混合物から分離し、少なくとも１つの分離した捕捉抗体相の少なくとも一部について、または液体試験混合物に残存するものについて標識を測定する。通常は前者である。その理由は捕捉および検出抗体によって（その間に“サンドイッチ”されて）結合したＰＳＡを含むからである。
【００３１】
ＰＳＡのための典型的な２部位イムノアッセイにおいて、捕捉および検出抗体の１つまたは両方がモノクローナル抗体である。検出抗体に使用する標識は当業界で通常既知のどれをも選択することができる。普通は、標識は酵素または化学ルミネセンス部分であるが、放射性同位元素、発蛍光団、検出可能なリガンド（例えば、そのリガンドに対する標識結合相手に二次的に結合することによって検出可能なもの）などでもよい。捕捉抗体の重要な特性は、試験混合物の残余から分離される方法を提供することである。したがって、当業界で理解されているように、捕捉抗体はあらかじめ固定化または不溶化された形態でアッセイ中に導入することもできるし、または固定化し得る形態、すなわち、アッセイへの捕捉抗体の導入の後に固定化を達成することができるような形態でもよい。固定化捕捉抗体の例は、磁性粒子、ラテックス粒子、マイクロタイタープレートウェル、ビーズ、キュベットまたは他の反応容器などの固相に共有結合または非共有結合的に接着された抗体である。固定化し得る捕捉抗体の例は、リガンド部分分子、例えばハプテン、ビオチンなどで化学的に修飾された抗体であって、その後、（直接に固定化された捕捉抗体について上述したような）固定化形態のそのリガンドの結合相手、例えば抗体、アビジンなどと接触させることによって固定化することができる抗体である。
【００３２】
本発明においてはいかなるイムノアッセイ方法またはフォーマットをも使用し得るものと一般的に理解されるベきであるから、上記のイムノアッセイ法およびフォーマットは例示として意図するものであって、これらに限定されるものではない。
また、特定のイムノアッセイにおいてサンプルｆＰＳＡを検出不可能にさせるために使用する方法は幅広く変更することができるものと理解される。１つの態様において、こうした方法として、イムノアッセイを実施する血液サンプル中の残余物からサンプルｆＰＳＡを単離または分離することが含まれる。こうした分離の結果、液体試験混合物からのｆＰＳＡ画分の物理的分離または試験混合物中のin situ のｆＰＳＡの単離または隔離が可能である。例として、イオン交換吸着、モレキュラーシーブ濾過、親和性結合などによってｆＰＳＡを選択的に除去することができる物質のカラムまたはその他のマトリックスにサンプルを通すことによって、あるいは磁性またはラテックス粒子に固定した抗ｆＰＳＡなどのｆＰＳＡ特異的抗体の固定化したまたは固定化し得る形態とサンプルとを接触させることによって、ｆＰＳＡを分離して検出不可能にさせることができる。
【００３３】
別の態様において、ｆＰＳＡがＰＳＡイムノアッセイに関与する抗体と実質的に結合することができなくなるほどに、関連する（１またはそれ以上の）抗原決定基を変換または修飾する、物理的、化学的（生化学を含む）またはその他の方法による試験サンプルの処理によって、ｆＰＳＡをイムノアッセイで検出不可能にする。その後、この結果生成した試験混合物中で直接ＰＳＡイムノアッセイを実施することができる。例をあげると、こうした処理として、加熱または冷却によるｆＰＳＡおよびｃＰＳＡの示差的変性；Ｅエピトープ領域に独特なペプチドに対して特異的なプロテアーゼなどの、複合体化によって保護されたｃＰＳＡ決定基には影響を与えないが、ｆＰＳＡ抗原決定基（Ｅエピトープ）は変性する化学的変性剤の添加；タンパク質または脂質結合剤、基質疑似物（例えばＥエピトープ領域の酵素部位によって認識される正常な基質に類似しているが、結合しても酵素的切断または反応は伴わないペプチド）などの、Ｅエピトープ領域に結合するかまたはこれをブロックする生化学剤の添加；などが含まれる。ｆＰＳＡの所望の免疫学的不活性化を達成するための上記の方法がすべてではなく、当業者にとってはその他の有効な方法が明らかであろう。
【００３４】
本発明が提供する特に独特なｃＰＳＡの測定方法として、通常の２部位イムノアッセイの巧妙な改変が含まれる。この新しい方法において、捕捉および検出抗体の１つとして、ｔＰＳＡと結合する（すなわち、ｆＰＳＡおよびｃＰＳＡの両方にあるエピトープに結合する）が、ＰＳＡにｆＰＳＡ特異的抗体（すなわち、抗Ｅ抗体）が結合している場合には実質的にＰＳＡに結合することができないものが選択される。この独特の抗体をここでＭＭ１と称する。こうして、第３の抗体として抗Ｅを添加することによって、抗Ｅが結合したｆＰＳＡは実質的にＭＭ１に結合することができなくなり、そして実質的にＭＭ１に基づく２部位イムノアッセイにおいて検出することができなくなる。
【００３５】
この特に好ましい方法において、第２抗体（ＭＭ１抗体）および第３抗体（抗Ｅ抗体）は好ましくはそれぞれ独立した単一特異的抗体（例えば、抗体画分が基本的に対象となる特定のエピトープに結合する抗体のみで構成されるように調製された、通常の抗血清法によって得られるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）であり、最も好ましくはモノクローナル抗体である。さらに、所望ならば、抗Ｅ抗体は所望のＭＭ１阻害を獲得するために、２以上の抗体、例えば２以上のモノクローナル抗体を含むこともできる。抗Ｅ抗体（または複数の抗体）の結合の結果として生じるｆＰＳＡに対するＭＭ１抗体の結合阻害の所望の程度は、普通は約９０％を超え、より一般的には約９５％を超え、最も好ましくは約９９％を超えるものと、さらに理解されるべきである。
【００３６】
特に好ましいモノクローナルＭＭ１抗体は多数の方法によって調製することができる。主として、ハイブリドーマ細胞系の選択の結果ＭＭ１の明確な結合特性を有するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを単離するためのスクリーニング方法を使用する、通常の体細胞ハイブリダイゼーション技術を適用することによって、このモノクローナル抗体が製造される。こうしたスクリーニングのための戦略は、ｆＰＳＡには接近し得るがｃＰＳＡには接近できないエピトープ、例えばＥエピトープに対する別の抗体の結合をブロックするけれども、それ自体は本質的にｆＰＳＡおよびｃＰＳＡに等価に結合する抗体を選択するものである。
【００３７】
体細胞ハイブリダイゼーションは現在周知の方法論であり、好適な、そして所望のすべての変更を含めて、本発明に適用することができる。一般に、骨髄腫細胞と分析物に対して免疫感作させた動物から取ったリンパ球との融合によってハイブリドーマの集団を製造する。ここで使用する宿主動物の免疫感作とは、対象とする分析物上の１以上のエピトープに結合する抗体を産生するように、その動物の免疫系をチャレンジしたことを意味する。これらの結果が、天然の分析物、合成ペプチド免疫原、表面に分析物のエピトープを発現するトランスフェクトされた細胞などを宿主動物の血流中への投与を含む（但し，これに限定されるわけではない）多数の方法のどれによっても得られることは、当業者にとって明らかであろう。同様に、クローン化されたハイブリドーマ細胞系からのモノクローナル抗体の製造および採取は当業界の通常の技術範囲であり、一般的に本発明を実施する時に、既知のどの方法も使用することができる。
【００３８】
上述のように、ＭＭ１特性を有するモノクローナル抗体を製造するためにハイブリドーマをスクリーニングするための主要な基準は、（ｉ）実質的にｆＰＳＡおよびｃＰＳＡに等価に結合するが、（ii）ＰＳＡにｆＰＳＡ特異的抗体（抗Ｅ抗体）が結合した場合はＰＳＡに実質的に結合することができない、モノクローナル抗体を製造することである。あるいは、あまり好ましくはないが、スクリーニングの基準として、（ｉ）実質的にｆＰＳＡおよびｃＰＳＡに等価に結合するが、（ii）ＰＳＡに結合することによって、ＰＳＡをｆＰＳＡに特異的な抗体、すなわちｆＰＳＡには結合することができるがｃＰＳＡには結合することができない抗体に対して結合することができなくする、モノクローナル抗体を製造することである。上記の結果を与えるために本発明のＭＭ１モノクローナル抗体が作用する機構は明確には理解されていない。しかし、ｆＰＳＡに対するモノクローナル抗体（すなわち、抗Ｅ抗体）の結合が、エピトープに対する抗体または複数の抗体の結合に際してｆＰＳＡおよびｃＰＳＡの両方の上で利用することができるエピトープ（１つまたは複数）をブロック、マスク、妨害または変更するものと推察される。本発明において利用するＭＭ１モノクローナル抗体の代表は、Bayer Immuno 1TMＰＳＡアッセイ（Bayer Corporation,Tarrytown,New York,USA）において使用するＭＭ１抗体；本出願人（Bayer Corporation ）によってAmerican Type Culture Collection,Rockville,Maryland,USA,に１９９７年４月１０日寄託され、それぞれ受託番号ＨＢ−１２３３８およびＨＢ−１２３３７を指定されたハイブリドーマ細胞系 ３５６．７．４および３４６．７．２６によって製造されたモノクローナル抗体；および上記の抗体のいずれかと実質的に同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体である。
【００３９】
ｃＰＳＡを測定するための上記の特に好ましい方法の実施に必要な試薬およびその他のアッセイ構成要素は試験キット、すなわち使用者の需要に適合する包装集合体または配合体の形態で、分析操作法をも含めて好都合に供給される。最小限、この試験キットは特定の特性を有する捕捉および検出抗体ならびに１以上の抗Ｅ抗体を含むものとなる。
【００４０】
男性患者のｃＰＳＡ血中値は、先行技術のｔＰＳＡ値およびｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比数値に比較して実質的な臨床上の意義を提供することが今回発見された。具体的には、５０才を超える、ＣａＰの患者５３名、ＢＰＨの患者７５名および健康な男性対照者８８名を含む２１６名の患者からの血清サンプルを使用して最初の研究を実施した（下記、データは図４Ａに示す）。この最初の研究において、ｔＰＳＡの測定に比較してＣａＰの検出について同等の感度を提供する、ｃＰＳＡアッセイの正常上限値が確立された（それぞれ８８％に対して８５％）。試験した全患者について、正常およびＢＰＨ集団における特異性もまた、ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比に比較したｃＰＳＡと同等であった。これらの知見は、ＣａＰ患者７５名および生検でＣａＰでないことがわかった患者２２５名を含む、泌尿器科に配された生検患者３００名からの血清サンプルを使用した次の研究によって確認された（下記、データを図４Ｂに示す）。ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比と関連させて使用するｔＰＳＡアッセイの感度および特異性がｃＰＳＡのみの場合と同等であるという発見は、患者集団が診断のグレイゾーンに属する場合にも正当だった。診断のグレイゾーンの正確な範囲は明確にされていないが、この研究において比較したすべての範囲において、ｃＰＳＡアッセイの感度および特異性は総および遊離ＰＳＡアッセイの両方を使用して得られたものに匹敵した。これらのデータは単独試験、ｃＰＳＡ、が総ＰＳＡと同等の有効性で前立腺ガンを検出することができ、その上、２つのアッセイ、ｆＰＳＡおよびｔＰＳＡを使用して得られることが示された改善された特異性を有することを証明している。
【００４１】
上に引用した研究において、ｃＰＳＡアッセイデータについて選択した正常上限値（ときにはカットオフ値と称される）は（ＰＳＡ当量濃度として表現して）３．７５ng/mL であった。この正常上限値は組織学的にガンと確認された男性グループにおける、ｔＰＳＡアッセイでカットオフ値４．０ng/mLを使用して提供される感度と実質的に同様のＣａＰ検出の感度（最初の研究において８８％に対して８５％、次の研究において８３％に対して８１％）を達成させるように選択した。当技術分野では、より大きなサンプル集団を試験するとｃＰＳＡ値に関する最適正常上限値は幾分移動するかも知れないことはもちろん理解されるが、こうした最適正常上限値はいずれにせよ約３−４ｎｇ／ｍＬ（ＰＳＡ−ＡＣＴ約９−１２ｎｇ／ｍＬと同等）の間に落ち着くと予想されるはずである。正常上限値を４ｎｇ／ｍＬより上に選択することは一般に臨床上許容できない感度数値の結果をもたらすと理解され、一方、正常上限値を３ｎｇ／ｍＬより下に選択すると、特異性は許容し得る損失で増大した感度をもたらすものと、臨床医の中には考えるものもいる。しかし、感度のどのレベルにおいても、本発明のｃＰＳＡ法は単独アッセイの結果で、従来のｔＰＳＡ法に比較して有意に改善された特異性レベル、および２つのアッセイ結果の比較、例えばｆＰＳＡ／ｔＰＳＡに基づく最近の文献の方法に比較して同等または改善された特異性レベルを提供するものと認識される。さらに、連続ｔＰＳＡ測定について示された（29）ような経時的連続ｃＰＳＡ測定によって、無症候性男性患者における前立腺ガンの検出が増強されることが期待される。
【００４２】
上に述べた前立腺ガンの検出における使用の他に、ｃＰＳＡの測定は、前立腺ガンと診断された患者、特に前立腺ガンの第一次治療を受けた後における病気の経過を監視するのに有用となる。こうした患者のｔＰＳＡ測定による長期的監視は再発性前立腺ガンの早期検出に有用であることが証明された。ｃＰＳＡはＰＳＡのガン特異的形態であると理解され、そして潜在的ガン細胞が遠隔転移部位を確立して増殖するにつれて血清中で増加するものと予想される形態である。したがって、ｃＰＳＡ血中レベルの経時変化は病状の変化と相関性があり、そして特に治療後のｃＰＳＡ血中レベルの上昇は病気の再発を示すことになる。
【００４３】
さらに、ｃＰＳＡは主としてＰＳＡ−ＡＣＴからなっていると理解されるので、ｃＰＳＡ測定の臨床的意義および利点は、（図９に示すデータが得られた研究において証明されたように）ＰＳＡ−ＡＣＴ測定にまで拡張される。原則として、現在利用し得る計測手段で最も実施しやすいＰＳＡ−ＡＣＴ測定用のイムノアッセイ方法は、抗ＰＳＡ抗体と１つの抗ＡＣＴ抗体またはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に特異的な１つの抗体とを組み合わせて使用する２部位イムノアッセイである。こうした後者の抗体を獲得する方法の１つは、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体上の、例えばＡＣＴおよびＰＳＡ成分が出会う複合体表面上の点上またはその近くの立体配座エピトープに対する抗体のモノクローナル選択によるものである。しかし、現在のところ、こうした方法は十分には開発されていなく、そして／または分析実施上の問題に悩まされており、したがって、さらなる改良が生まれるまで、ＰＳＡ−ＡＣＴ測定にはもっと煩わしい手法が必要である。例えば、Leinonenらによって示されたように、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体をゲル濾過（モレキュラーシーブ）クロマトグラフィーによって分離し、ｔＰＳＡを検出するアッセイまたはＰＳＡ−ＡＣＴに特異的なアッセイのいずれかによって測定する（15）のもよい。
【００４４】
本発明を以下の実施例によって説明するが、これに限定されるわけではない。
【００４５】
【実施例】
材料物質
これらの研究で使用する抗ＰＳＡ抗体には遊離ＰＳＡおよびプロテナーゼインヒビターと複合体化したＰＳＡ上に発現されたエピトープを認識するモノクローナル抗体であるＭＭ１が含まれる。この抗体をマウス腹水中で製造し、標準的操作法を使用してタンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ＭＰ２はヤギ中で製造し、固定化ＰＳＡ上のアフィニティクロマトグラフィーによって精製したポリクローナル抗ＰＳＡ抗体である。ＰＳＡ１９、ＰＳＡ２０、ＰＳＡ３０（CanAg Diagnostics AB,Gothenburg,Sweden）およびＭＥ２（Biospacific,Emeryville,CA,USA ）はＰＳＡのＥエピトープを認識するモノクローナル抗体である。ＡＣＴ５３（CanAg Diagnostics ）はＡＣＴ特異的モノクローナル抗体である。遊離前立腺特異的抗原（Scripps Laboratories,San Diego,CA,USA ）をヒト精液からドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって９８％の純度まで精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１％アジ化ナトリウムを含有する緩衝液 、ｐＨ８．０ 中で保存した。ＰＳＡ−ＡＣＴ（Scripps Laboratories,San Diego,CA,USA ）はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって＞９６％の純度を示し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％アジ化ナトリウムを含有する緩衝液、ｐＨ５．６中で保存した。
【００４６】
Bayer Immuno １ TM ＰＳＡアッセイ
Bayer Immuno１総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）アッセイはＰＳＡの捕捉用のモノクローナル抗体および検出用ポリクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイである。モノクローナル抗ＰＳＡ抗体（ＭＭ１）はフルオレセインとコンジュゲート化（Ｒ１）し、アフィニティ−アフィニティ精製したポリクローナル抗体（ＭＰ２）はアルカリホスファターゼとコンジュゲート化（Ｒ２）している。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含有する緩衝液、ｐＨ７．４および５％熱不活性化正常ヤギ血清（Biocell Laboratories,Carson,CA,USA）中で抗体を、Ｒ１については１．５μｇ／ｍｌに、そしてＲ２については６．１５μｇ／ｍｌに希釈する。２つの抗体６５μｌずつをそれぞれ試験検体２０μｌとともに反応キュベット中で３７℃で２０分間インキュベー トし、生成した免疫複合体（Ｒ１−ＰＳＡ−Ｒ２）をモノクローナル抗フルオレセイン抗体で被覆した磁性粒子（２０μＬ）の添加によって捕捉する。過剰の試薬およびサンプル成分を除去するための洗浄段階の後、２３ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート３００μｌを添加する。発色の程度を４０５および４５０ｎｍでの吸光度測定によってモニターするが、この発色の程度は試験検体中のＰＳＡの濃度に直接比例する。これ以上の詳細は J.Clin.Lab.Anal.(1996),10:155-159中に提示されている。濃度 0,2,10,25,50 および１００ｎｇ／ｍＬの遊離ＰＳＡで調製したBayer Immuno 1 SET point（登録商標）ＰＳＡ検量剤(calibrator)を使用して、Bayer Immuno 1 Analyzerの検量化を実施する。標準検量線を作成するために、０点を通 る三次式に適合させるアルゴリズムを使用する。
【００４７】
Bayer Immuno 1 遊離ＰＳＡアッセイ
遊離ＰＳＡの測定については、Ｒ１捕捉抗体をフルオレセインとコンジュゲート化した遊離ＰＳＡ（ＰＳＡ１９、CanAg ）特異的モノクローナル抗体とに置換することによって、上記の Bayer Immuno 1 総ＰＳＡアッセイで使用したプロトコールを適用した。このモノクローナル抗遊離ＰＳＡ Ｒ１を総ＰＳＡアッセイにおいて使用したものと同一のポリクローナル抗ＰＳＡアルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｒ２）とともに使用した。Ｒ１コンジュゲートを２．５μｇ／ｍＬに希釈し、Ｒ２は６．１５μｇ／ｍＬで使用した。サンプル容積を１試験当たり３５μｌとし、添加した磁性粒子の容積を１試験当たり１５μＬとした以外のその他の条件はｔＰＳＡアッセイで使用したものと同様とした。
【００４８】
Bayer Immuno 1 ＰＳＡ−ＡＣＴ法
Bayer Immuno 1ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイフォーマットは以下の変更の他は Bayer Immuno 1 ｔＰＳＡアッセイのものと同一である：（１）ＡＣＴ特異的モノクローナル抗体であるＡＣＴ５３をアルカリホスファターゼにコンジュゲートさせ、２μｇ／ｍＬで検出に使用する；（２）ＰＳＡ−ＡＣＴを検量剤および対照抗原として５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、６％ＢＳＡ、ｐＨ５．８とともに使用する；そして（３）抗原を最初に捕捉抗体とともにインキュベートし、生成する複合体を洗浄して非結合抗原およびその他の血清成分を除去し、その後に検出抗体を添加するという２回洗浄プロトコールを使用する。
【００４９】
結果
総ＰＳＡアッセイにおける遊離ＰＳＡの免疫反応性の阻害のための特異的抗体の選択および最適化
本発明は、ＰＳＡのＥエピトープに対する抗体の添加によって、総ＰＳＡアッセイをＰＳＡ−プロテアーゼインヒビター複合体に特異的に実施することができるという観察に基づいている。ＰＳＡ分子上のＥエピトープに特異的な４つのモノクローナル抗体、ＰＳＡ１９、ＰＳＡ２０、ＰＳＡ３０およびＭＥ２を、総ＰＳＡアッセイにおける遊離ＰＳＡの反応性を減少させる能力について試験した。精液から精製した１００％遊離ＰＳＡを使用して総ＰＳＡアッセイにおいて用いる検量剤を製造した。抗Ｅ抗体、ＰＳＡ１９、ＰＳＡ２０およびＰＳＡ３０を濃度 0，10，25，50，100 および２００μｇ／ｍＬで５０ｎｇ／ｍｌのＰＳＡ検量剤に添加した。室温で３０から６０分間インキュベートした後、総ＰＳＡアッセイを使用して、これらの混合物を未知サンプルとして試験し、ＰＳＡの回収を測定した。図１Ａに示すように、３つのモノクローナル抗体、ＰＳＡ１９、ＰＳＡ２０およびＰＳＡ３０のそれぞれが総ＰＳＡアッセイにおいて遊離ＰＳＡの反応性の有意な阻害を示した。この遊離ＰＳＡの免疫反応性の減少は各抗体について濃度に依存するが、ＰＳＡ２０のみが飽和に近かった。これらの３つの抗Ｅ抗体の中で、ＰＳＡ２０が遊離ＰＳＡについての信号の最大の減少を与えた。
【００５０】
別々の実験において、ｔＰＳＡアッセイ中の遊離ＰＳＡの結合を阻害する能力について、ＰＳＡ２０およびＭＥ２を比較した。モノクローナル抗体を０から４０μｇ／ｍｌの濃度範囲で１０ｎｇ／ｍｌの検量剤に添加した。図１Ｂでわかるように、ＭＥ２ ＭＡｂは総ＰＳＡ中の遊離ＰＳＡの結合を定量的に阻害し、６．１２５μｇ／ｍＬよ りも低濃度で飽和に到達する。これらのデータはいくつかのＥエピトープ抗体が遊離ＰＳＡへのＭＭ１抗体の結合を阻害する能力を有することを証明している。しかし、ＭＥ２ ＭＡｂは他のＥエピトープ抗体よりもずっと低い濃度でより大きな程度まで総ＰＳＡアッセイ中の遊離ＰＳＡの結合を阻害する。この阻害はＥエピトープに対するＭＥ２抗体のより高い親和性によるものと考えられる。あるいは、Ｅエピトープは別個の微小のエピトープ特異性を有するエピトープ群の集合体を表すのかも知れない。
【００５１】
Bayer Immuno 1 Analyzer での複合体化ＰＳＡの測定
総ＰＳＡアッセイへの ＭＡｂ、ＰＳＡ２０およびＭＥ２の添加は遊離ＰＳＡに関係する大部分の免疫反応性を消失させる。複合体化ＰＳＡの定量的測定を証明するために、約１１ｎｇ／ｍＬの総ＰＳＡ濃度で遊離およびＡＣＴと複合体化したＰＳＡの各種割合の混合物を調製した。混合物の内容は遊離：複合体化ＰＳＡの比を100:0, 80:20，50:50，20:80，および0:100 とした。これらの混合物を Bay er Immuno 1 Analyzerで３つのイムノアッセイフォーマット：総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）の市販アッセイ、Bayer Immuno 1遊離ＰＳＡアッセイ（ｆＰＳＡ）、およびBayer Immuno 1複合体化ＰＳＡアッセイ（ｃＰＳＡ）、を使用して測定した。Bayer Immuno 1複合体化ＰＳＡアッセイは、図２Ａに示す結果について、各サンプルにＰＳＡ２０ＭＡｂを最終濃度３００μｇ／ｍｌとなるように添加し、そしてＭＭ１−フルオレセインコンジュゲートを１．５μｇ／ｍｌから０．５μｇ／ｍｌに減量した以外には、ｔＰＳＡアッセイと同一とした。図２Ｂに示す実験については、各サンプルにＭＡｂ ＭＥ２を最終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように添加し、そしてＭＭ１−フルオレセインコンジュゲートをやはり０．５μｇ／ｍｌで使用した。総ＰＳＡおよび遊離ＰＳＡの測定のために、Bayer Immuno 1総ＰＳＡアッセイ用に市販されて使用されている Bayer Immuno 1 SET point ＰＳＡ検量剤で Bayer Immuno 1 Analyzerを検量化した。複合体化ＰＳＡ（ｃＰＳＡ）を測定するために、５０ｍＭ ＭＥＳ 、６％ ＢＳＡ，ｐＨ５．８中のＡＣＴと複合体化したＰＳＡを使用して、０−１００ｎｇ／ｍＬの範囲の検量剤を調製した。
【００５２】
総ＰＳＡアッセイへのＭＡｂ ＰＳＡ２０の添加は、複合体化ＰＳＡについてほぼ定量的反応性を有する方法を提供する（図２Ａ）。ｃＰＳＡアッセイにおける各種混合物の応答は直線性であり、総ＰＳＡおよび複合体化ＰＳＡの測定濃度は期待されたように試験したすべてのサンプルについておよそ１０ｎｇ／ｍＬの回収を与えた。同様に、ＭＡｂ ＭＥ２は、遊離および複合体化ＰＳＡの割合の全範囲にわたって複合体化ＰＳＡについて定量的反応性を有する方法を提供する（図２Ｂ）。その上、ＭＡｂ ＭＥ２での複合体化ＰＳＡアッセイはＰＳＡ２０ＭＡｂについて必要とされる濃度（３００μｇ／ｍＬ）に比較して著しく低い濃度のＭＥ２ ＭＡｂ（２５μｇ／ｍＬ）を使用する。これらのデータは、ＰＳＡ分子上の異なるエピトープと反応する３つの抗体（ＭＭ１，ＭＰ２およびＰＳＡ２０またはＭＥ２のいずれか）を組み合わせることによって、複合体化ＰＳＡを正確に測定する方法を作り上げることができることを証明している。
【００５３】
ｃＰＳＡアッセイの自動化
Ｅエピトープに対するＭＡｂによる患者サンプルの前処理は臨床実験環境下での適用としては実用的でない。サンプルへのＭＡｂの正確な分配は困難であって時間がかかり、またその結果として容認し得ない程度の高確率な不正確性をもたらす。したがって、ｃＰＳＡアッセイの完全自動化方法が開発された。
【００５４】
自動化ＭＡｂ ＰＳＡ２０法
アッセイフォーマット１において、Ｒ１、ＭＭ１−フルオレセイン、試薬にＭＡｂ ＰＳＡ２０を濃度５００μｇ／ｍＬで添加し、アッセイは検量用にＰＳＡ−ＡＣＴを使用してｔＰＳＡと同様に実施した。このアッセイは完了まで３８分を要する。アッセイフォーマット２において、反応液中でサンプルをＭＡｂ ＰＳＡ２０を用いて前処理する。このフォーマットにおいては、反応キュベットに患者サンプルとともにＰＳＡ２０抗体を添加し、５０分間インキュベートした。その後、ＭＭ１−フルオレセインを濃度０．５μｇ／ｍＬで、ＭＰ２−ＡＬＰを濃度６．１５μｇ／ｍＬで、お よび抗フルオレセイン抗体で被覆した磁性粒子を添加し、さらに２８分間インキュベートした。過剰の試薬および未反応の血清を洗浄除去した後、ｔＰＳＡアッセイと同一の様式で基質を添加し、発色をモニターした。濃度範囲２ｎｇ／ｍｌ−２５ｎｇ／ｍｌにわたる遊離ＰＳＡを含有するサンプルを使用した。図３の結果は、これらの手法のいずれを使用しても、遊離ＰＳＡにともなう信号を非常に低レベルまで効果的に減少させることができることを示している。これらの結果は、この方法を Bayer Immuno 1 Analyzerで完全に自動化することができることを示唆している。
【００５５】
自動化ＭＡｂ ＭＥ２法
ＭＥ２ ＭＡｂはｔＰＳＡアッセイ中のｆＰＳＡへのＭＭ１ ＭＡｂの結合を顕著な低濃度で、またＰＳＡ２０ ＭＡｂよりも大きな程度で阻害する。その上、アッセイフォーマット２はより長時間を要し、そして２つの試薬カセットを必要とする。したがって、ｃＰＳＡアッセイの自動化のために使用する第３の抗体としてＭＥ２ ＭＡｂを選択し、２つの方法（試薬１（Ｒ１）または試薬２（Ｒ２）のいずれかにＭＥ２を濃度５０および１００ ng/mL を添加）でｔＰＳＡアッセイ中に添加した。結果は、ＭＥ２をＲ１およびＲ２中に添加したとき、ｆＰＳＡの反応性がそれぞれ９７％および９８％阻害されることを示した。これらのデータに基づき、Ｒ２試薬中にＭＥ２ ＭＡｂを最終濃度１００μｇ／ｍＬで使用するｃＰＳＡアッセイが方式化されることが判定された。
【００５６】
血清中の複合体化ＰＳＡの測定
パイロット研究
前立腺ガン患者５３名、ＢＰＨ患者７５名、および健康な同年代の対照者からの８８サンプルを３つのアッセイ：ｔＰＳＡ、ｆＰＳＡおよびｃＰＳＡ、を使用して分析した。ｃＰＳＡアッセイで試験するサンプルは２５μｇ／ｍｌのＭＥ２抗体で前処理し、ｆＰＳＡおよびｔＰＳＡアッセイで試験するサンプルは処理しなかった。アッセイを上述のように遊離ＰＳＡまたはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のいずれかを使用して検量化した。この試験の結果を図４Ａに示す。組織学的にガンと確認された男性群のＣａＰ検出について、ｔＰＳＡアッセイで４．０ｎｇ／ｍＬのカットオフ値を使用して得られた感度と実質的に同様の感度を達成する（８８％に比較して８５％）ために、３．７５ｎｇ／ｍＬ（ＰＳＡ当量濃度として表示）の正常値の上限を選択した。この正常上限値を使用して、この研究で試験した正常およびＢＰＨ集団の特異性もまた、陽性ｔＰＳＡ結果に引き続きｆＰＳＡアッセイを実施してｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比を計算した２段階試験と比較したｃＰＳＡと同等であった。ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比と関連させて使用するｔＰＳＡアッセイの感度および特異性がｃＰＳＡのみの場合と同等であるという発見は、患者集団が診断のグレイゾーンに分類される場合にも正当であった。診断のグレイゾーンの明確な範囲は決定されていないが、この研究で比較したすべての範囲について、ｃＰＳＡアッセイの感度および特異性は総および遊離ＰＳＡアッセイの両方を使用して得られたものに匹敵した。これらのデータは、単独試験、ｃＰＳＡが総ＰＳＡと同等の有効性で前立腺ガンを検出することができ、その上、２つのアッセイ、ｆＰＳＡおよびｔＰＳＡを使用して得ることができることが示された、改善された特異性を有することを証明している。
【００５７】
臨床研究
３つのアッセイ：ｔＰＳＡ（Hybritech Tandem（登録商標）ＰＳＡアッセイ、San Diego,California,USA、を使用）、ｆＰＳＡ（Hybritech Tandem（登録商標）遊離ＰＳＡアッセイを使用）、およびｃＰＳＡ（上述の自動化ＭＡｂ ＭＥ２法を使用）、を使用して、Seattle VA Hospital,Seattle,Washington,USA、において、生検患者３００名（７５名は前立腺ガンが確認された）からの血清サンプルを分析した。上述のように遊離ＰＳＡまたはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のいずれかを使用して、アッセイを検量化した。この試験の結果を図４Ｂに表形式で、図５に回帰分析として示す。組織学的にガンと確認された男性群のCaP 検出について、ｔＰＳＡアッセイで４．０ｎｇ／ｍＬのカットオフ値を使用して得られた感度と実質的に同様の感度を達成する（８３％に比較して８１％）ために、３．７５ｎｇ／ｍＬ（ＰＳＡ当量濃度として表示）の正常値の上限を選択した。この正常上限値を使用して、この研究で試験した正常およびＢＰＨ集団の特異性もまた、２段階試験（上記、ｔＰＳＡ＋ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ）と比較したｃＰＳＡと同等であった。図５において、グラフの右下象限に見られる小円データポイントは、医学的判定の基準としてｔＰＳＡではなくｃＰＳＡ値を使用していたならば、生検の危険、不快感および出費を回避することができたはずの非ガン患者（１１７名の内３４名、または２９％）を表している。また、パイロット研究と同様に、ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比と関連させて使用するｔＰＳＡアッセイの感度および特異性がｃＰＳＡのみの場合と同等であるという発見は、患者集団が診断のグレイゾーン層に入る場合にも正当であった（上記）。
【００５８】
独立したパイロットおよび臨床研究からのデータは、単独試験、ｃＰＳＡが総ＰＳＡと同等の有効性で前立腺ガンを検出することができ、その上、２つのアッセイ、ｆＰＳＡおよびｔＰＳＡを使用して得ることができることが示された、改善された特異性を有することを証明している。
ｃＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ間の相関関係
ｃＰＳＡアッセイにおいて複合体化ＰＳＡのどの種類が測定されるのかを決定するため、ＡＣＴと複合体化したＰＳＡを測定するアッセイが開発された。この種類の複合体化ＰＳＡは血清中の複合体化ＰＳＡの主要な形態に相当することが報告されている。手動方法を使用するＰＳＡ−ＡＣＴ測定のこれまでの試みは上述のような技術上の難点があった。したがって、Bayer Immuno 1TMシステムでＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を測定するための自動化イムノアッセイが開発された。ＰＳＡ−ＡＣＴのためのこの自動化アッセイを使用してＰＳＡ−ＡＣＴについて、上述のパイロット研究と同一集団の患者を試験した。結果を図６−８に示す。ここでは、自動化ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイを使用して得られた結果を自動化ｃＰＳＡアッセイを使用して得られた結果に対して回帰させている。各患者集団、すなわち正常、前立腺ガン、および良性前立腺疾患（ＢＰＨ）集団について、すべての患者サンプル、および患者の試験結果の大多数を含む範囲を回帰分析した。これは少数の大きな数値に起因する回帰分析の偏りをさけるためである。いずれの場合も、回帰線の傾斜は０．９３から０．９８の範囲であった。これらのデータはｃＰＳＡアッセイによって測定した物質の約９３−９８％がＰＳＡ−ＡＣＴであることを示唆している。残存の２−７％のｃＰＳＡの生化学的性質は現在のところわかってい ない。
【００５９】
選択された感度におけるＰＳＡアッセイの特異性
ｃＰＳＡアッセイで使用する正常上限値をｔＰＳＡアッセイと同様の感度を与えるようにして、決定した。このカットオフ値を使用して、ｃＰＳＡアッセイが現在医療現場で使用されている方法、すなわちｔＰＳＡよりも改善された特異性を提供することが証明された。正常上限値について異なる数値を使用したｃＰＳＡアッセイの特異性も測定した。上述の臨床研究から得られたすべての結果をReceiver Operator Characteristic（ＲＯＣ）分析に使用した。その後、感度レベルを８０−１００％の範囲に変化させてＲＯＣ分析から特異性を判定した。８０％未満 の感度は、現在実用されている診断方法が少なくともこの感度レベルを提供するので、ほとんど医学的価値がない。図１０に示す結果は、すべての感度レベルにおいて、ｃＰＳＡアッセイはｔＰＳＡより大きい特異性を提供し、２つのアッセイ、ｔＰＳＡおよびｆＰＳＡの使用とほぼ同等かまたは少し良好な特異性を提供することを証明している。その上、患者サンプルが診断のグレイゾーンに入っている場合でも、特異性の改善は正当である。これらの結果は、ｃＰＳＡアッセイについての正常上限値は感度および特異性の所望のレベルに応じて広い範囲から選択することができるが、約３−４ｎｇ／ｍＬの範囲の正常上限のすべての値において、ｃＰＳＡはｔＰＳＡよりも改善された特異性を、そしてｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比とほぼ同等の特異性を与えることを証明している。
【００６０】
以上、本発明を詳細に記述し、例示した。明らかに、これらの精神および範囲から離れることなく、本発明の多くの他の変更および改変を行なうことが可能である。
【００６１】
【発明の効果】
本発明により、サンプル中のＰＳＡへのｆＰＳＡ特異的抗体の結合によって、イムノアッセイにおいてｃＰＳＡのみを測定することができる。ｃＰＳＡの血中レベルの測定により、前立腺ガンの診断および監視の補助となる、高感度で高度に特異的な方法を提供され、そして多数の患者にとって不必要な前立腺の生検を実施する必要がなくなる。
【００６２】
引用文献
１．Wang MC,Valenzuela LA,Murphy GP,Chu TM. ヒト前立腺特異的抗原の精製。
Invest Urol 1979;17:159-63.
２．Watt WK,Lee PJ,Timkulu TM,Chan WP,Loor R. ヒト前立腺特異的抗原：構造およびセリンプロテアーゼとの機能的類似性。Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:3166-70.
３．Akiyama k,Nakamura T,Iwanaga S,Hara M.ヒト前立腺特異的抗原、r-セミノプロテインのキモトリプシン様活性。FEBS Letters 1987;225:168-72.
４．Christensson A,Laurel CB,Lilja H. 前立腺特異的抗原の酵素活性および細胞外セリンプロテイナーゼインヒビターとの反応。Eur J Biochem 1990;194:755-763.
５．Lilja H.前立腺液中のカリクレイン様セリンプロテアーゼは主要精嚢タンパク質を切断する。J Clin Invest 1985;76:1899-903.
６．Lilja H,Abrahamsson PA. ヒト前立腺によって分泌される３つの主要なタンパク質。Prostate 1980;12:29-38.
７．Papsidero LD,Wang MC,Valenzuela LA,Murphy GP,Chu TM.前立腺ガン患者の血清中の前立腺抗原。Cancer Res 1980;40:2428-2432.
８．Lange PH. 前立腺ガンの診断および管理における前立腺特異的抗原。Supplement to Urology 1990;XXXVI:25-29.
９．Oesterling JE.前立腺特異的抗原：前立腺ガンのための最も有用な腫瘍マーカーの臨界評価。J Urol 1991;145:907-923.
１０．Armbruster DA.前立腺特異的抗原：生化学、分析方法および臨床応用。Clin Chem 1993;39:181-195.
１１．American Cancer Society:ガンの事例および実像−1995。American Cancer Society,Inc., Atlanta,GA.Page 11.
１２．Catalona WJ,Richie JP,Ahmann FR,Hudson MA,Scardino PT,Flanigan RC,de Kernion JB,Ratliff TL,Kavoussi LR,Dalkin BL,Waters,WB,MacFarlane MT and Southwick PC.前立腺ガンの早期検出における直腸指診と血清前立腺特異的抗原の比較：男性 6,630名の多施設臨床試験の結果。J Urol 1994;151:1283-1290.
１３．Stenman UH,Leinonen J,Alfthan H,Rannikko S,Tuhkanen K,Alfthan O.前立腺特異的抗原とα121-抗キモトリプシンとの複合体は前立腺ガン患者の血清中の前立腺特異的抗原の主要な形態である：この複合体のアッセイはガンの臨床上の感度を改善する。Cancer Res 1991;51:222-226.
１４．Zhou AM,Tewari PC,Bluestein BL,Caldwell,GW,Larsen FL. 血清中の前立腺特異的抗原の多種の形態：モノクローナルおよびポリクローナルアッセイによる免疫認識の差異。Clin Chem 1993;39:2483-91.
１５．Leinonen J,Lovgren T,Vornanen T,Stenman UH. 前立腺特異的抗原およびそのα1-抗キモトリプシンとの複合体の二重標識時間分解免疫蛍光測定。Clin C
hem 1993;39:2098-2103.
１６．Christensson A,Bjork T,Nilsson O,Nilsson O,Dahlen U,Matikainen MT,Cockett AT,Abrahamssion PA. 前立腺ガンの指示薬としての、α1-抗キモトリプシンと複合体化した血清前立腺ガン特異的抗原。J Urol 1993;150:100-105.
１７．Lilja H.血清ＰＳＡの異なる分子形態の意義：α1-抗キモトリプシンと複合体化したものに対する遊離の、非複合体化形態のＰＳＡ。Urol Clin North Am 1993;20(4):681-686.
１８．Lilja H,Christensson A,Dahlen U,Matikainen M-T,Nilsson O,Pettersson K and Lovgren T:ヒト血清中の前立腺特異的抗原は主としてアルファ抗キモトリプシンとの複合体として存在する。Clin Chem 1991;37:1618-1625.
１９．Bjork T,Hulkko S,Bjartell A,Santagnese AD,Abrahamsson P-A,Lilja H.ＰＳＡ産生細胞中のアルファ1-抗キモトリプシンの産生は前立腺ガンに共通するが良性前立腺肥大症ではまれである。Urology 1994;43:427-434.
２０．Pettersson K,Piironen T,Seppala M,Liukkonen L,Christensson A,Matikainen M-T,Suonpaa M,Lovgren T,Lilja H.遊離および複合体前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）：遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−α1-抗キモトリプシン複合体の in vitro 安定性、エピトープマップ、ならびに特異的および好感度検出のための免疫蛍光アッセイ。Clin Chem 1995;41:1480-1488.
２１．Wu JT,Wilson L,Zhang P,Meikle AW,Stephenson R.ＢＰＨおよび前立腺ガン患者からの無作為または系列検体におけるＰＳＡ−ＡＣＴ複合体と総ＰＳＡの血清中濃度の相関関係。J Clin Lab Anal 1995 9:15-24.
２２．Mitrunen K,Pettersson K,Piironen T,Bjork T,Lilja H,Lovgren T.(1995) 血清中の遊離および総前立腺特異的抗原の濃度および比率の同時測定のための二重標識一段階イムノアッセイ。Clin Chem 1995 41(8):1115-1120.
２３．Catalona WJ,Smith DS,Wolfert RL,Wang TJ,Rittenhouse HG,Ratliff TL,Nadler RB:前立腺ガンスクリーニングの特異性を改善するための遊離の血清前立腺特異的抗原の割合の評価。JAMA 1995 274(15):1214-1220.
２４．Prestigiacomo AF,Stamey TA. 遊離および複合体ＰＳＡの臨床上の有用性
。
【００６３】
Scan J Clin Lab Invest 1995 55 Supple 221:32-34.
２５．Wang TJ,Hill TM,Sokoloff RL,Frankenne F,Rittenhouse HG,Wolfert RL.遊離前立腺特異的抗原のための二重モノクローナル抗体イムノアッセイ。Prostate 1996 28:10-16.
２６．Jung K,Stephan C,Lein M,Henkne W,Schnorr D,Brux B,Schurenkamper P,Loening SA. ２つの遊離前立腺特異的抗原アッセイを比較した分析の実施および臨床上の妥当性。Clin Chem 1996 42(7):1026-1033.
２７．Wang TJ,Hill T,Sokoloff R,Frankenne F,Wolfert R,and Rittenhouse H.良性肥大症および前立腺ガンにおける遊離ＰＳＡを定量するためのモノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ。1994 ISOBM会議におけるポスター発表(poster presentation) 。
２８．Chan D,Kelley CA,Partin AW,Linton J,Wang TJ,Sokoloff RL,Rittenhouse HG,and Wolfert RL.Clin Chem (1996)42(6):S255.
２９．Wang TJ,Linton J,Payne J,Rittenhouse HG,Wolfert RL,Chan DW,Kelley CA and Partin AW. ＰＳＡ−ＡＣＴに対する特異的モノクローナル抗体による複合体ＰＳＡイムノアッセイの臨床的有用性。J Urology (1997)157(4)Suppl:147.
３０．Wang TJ,Linton HJ,Payne J,Liu R-S,Kuus-Reichel K,Rittenhouse HG,Ke lley C,Cox J,Chan DW, and Wolfert RL. ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に特異的なモノクローナル抗体の開発およびイムノアッセイへのそれらの組み込み。Clin Chem (1997)43(6):S225.
３１．Zhang P and Wu,JT.非特異的吸着の妨害をともなわない、血清中のＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のためのイムノアッセイの開発。Clin Chem (1997)43(6):S236.
３２．Bjork T,Bjartell A,Abrahamsson P-A,Hulkko S,Di Sant'agnese A,Lilja H. ＰＳＡ産生細胞中のアルファ1-抗キモトリプシンの産生は前立腺ガンに共通するが、良性前立腺肥大症ではまれである。Urol 1994 43(4):427-434.
３３．Carter HB,Pearson JD,Metter J,Brant LJ,Chan DW,Andres R,Fozard JL and Walsh PC. 前立腺疾患を有するおよび有しない男性における前立腺特異的抗原の長期的評価。JAMA 1992 267(16):2215.
【図面の簡単な説明】
【図１】遊離ＰＳＡ抗体濃度とｆＰＳＡの阻害との関係を表す図である。
【図２】遊離および複合体化ＰＳＡの相対比と測定濃度との関係を表す図である。
【図３】自動化イムノアナライザーにおいて、ｃＰＳＡアッセイを自動化するためにＰＳＡ２０を使用することができることを示す図である。
【図４】前立腺ガン、ＢＰＨ又は同年代の健康な対照男性の血清中の全遊離及び複合体化ＰＳＡの測定結果を示す図である。
【図５】総ＰＳＡ対ｃＰＳＡの回帰分析の結果を表す図である。
【図６】ｃＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴ間の相関関係を表す図である。
【図７】ｃＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴ間の相関関係を表す図である。
【図８】ｃＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴ間の相関関係を表す図である。
【図９】前立腺ガン、ＢＰＨ又は同年代の健康な対照男性の血清中のｃＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴの測定結果を示す図である。
【図１０】選択された感度におけるＰＳＡアッセイの特異性を示す図である。
Claims (18)
- 血液サンプル中の複合体化前立腺特異的抗原（ｃＰＳＡ）の測定方法であって、
（ａ）血液サンプル中の総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）を処理して、遊離ＰＳＡ（ｆＰＳＡ）をイムノアッセイにおいて実質的に検出不可能にする工程、及び
（ｂ）処理した血液サンプル中のＰＳＡをイムノアッセイによって測定する工程、
を含んでなり、その結果として実質的にｃＰＳＡのみが検出可能であることを特徴とする方法。 - 工程（ａ）がｆＰＳＡを血液サンプル中の残余、すなわちｆＰＳＡ以外の血液サンプルの成分、から分離することによって実施され、工程（ｂ）が血液サンプル中の該残余について実施される、請求項１記載の方法。
- 前記イムノアッセイが２部位イムノアッセイである、請求項１−２のいずれか１項に記載の方法。
- ２部位イムノアッセイにおいて使用する２つの抗体の両方がモノクローナル抗体である、請求項３記載の方法。
- （ａ）血液サンプルを以下の３つの抗ＰＳＡ抗体と接触させて、液体試験混合物を形成させる工程、
(i) 総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）に結合する第１の抗ＰＳＡ抗体、
(ii) ｔＰＳＡに結合するが、遊離ＰＳＡ（ｆＰＳＡ）には結合するがｃＰＳＡには結合しない抗体がＰＳＡに結合している場合には実質的にＰＳＡに結合することができない、第２の抗体、
ここで、前記第１又は第２の抗体の一方が標識され（「標識抗体」）、そして他方は液体混合物から分離するために、固定化されるか又は固定化が可能である（「捕捉抗体」）、
(iii) ｆＰＳＡには結合するがｃＰＳＡには結合しない第３の抗体、
（前記第３の抗体のｆＰＳＡへの結合によって、ｆＰＳＡがこの方法において実質的に検出不可能になる）、
（ｂ）液体試験混合物から前記捕捉抗体を分離する工程、及び
（ｃ）分離された捕捉抗体相又は液体混合物の残余中の標識を測定する工程、
を含んでなることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 前記第２の抗ＰＳＡ抗体がモノクローナル抗体である、請求項５記載の方法。
- 前記第３の抗ＰＳＡ抗体がモノクローナル抗体である、請求項６記載の方法。
- 前記第３のモノクローナル抗体が細胞系ＡＴＣＣ ＨＢ−１２３３７又はＨＢ−１２３３８によって産生されるモノクローナル抗体と実質的に同一のエピトープに結合する、請求項７記載の方法。
- 前記第１の抗ＰＳＡ抗体がモノクローナル抗体である、請求項５−８のいずれか１項に記載の方法。
- ヒト男性患者における前立腺ガンの検出補助方法であって、
（ａ）ヒト男性患者から得られた血液サンプル中の複合体化前立腺特異的抗原（ｃＰＳＡ）の量を請求項１−９のいずれか１項に記載の方法により測定する工程、及び
（ｂ）患者のｃＰＳＡ血中レベルが３ｎｇ／ｍＬの正常上限値を超えているかどうかを判定する工程、
を含んでなることを特徴とする方法。 - 正常上限値が３．７５ｎｇ／ｍＬである、請求項１０記載の方法。
- 前立腺ガンと診断された男性から得られた血液サンプル中の複合体化前立腺特異的抗原（ｃＰＳＡ）レベルの変化を測定するために、請求項１−９のいずれか１項に記載の方法による一連のイムノアッセイを経時的に実施し、そのｃＰＳＡ血中レベルの変化を病状の変化に相関させることを含む、前立腺ガンと診断された男性患者における疾病の経過を監視する方法。
- 前立腺ガンの治療を受けてきた患者から得られた血液サンプル中の複合体化前立腺特異的抗原（ｃＰＳＡ）レベルの変化を測定するために、請求項１−９のいずれか１項に記載の方法による一連のイムノアッセイを経時的に実施し、そのｃＰＳＡ血中レベルの上昇が疾病の再発を示すことを含む、前立腺ガンの治療を受けてきた患者における疾病の経過を監視する方法。
- 以下の抗体：
(1) 総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）に結合する第１の抗ＰＳＡ抗体、
(2) ｔＰＳＡに結合するが、遊離ＰＳＡには結合するがｃＰＳＡには結合しない抗体がＰＳＡに結合している場合には実質的にＰＳＡに結合することができない、第２の抗体、
ここで、前記第１又は第２の抗体の一方が標識され、そして他方は水性液体混合物から分離するために、固定化されるか又は固定化が可能である、
及び、
(3) ｆＰＳＡには結合するがｃＰＳＡには結合しない第３の抗体、
を含む、血液サンプル中の複合体化前立腺特異的抗原（ｃＰＳＡ）の測定に使用するための試験キット。 - 前記第２の抗ＰＳＡ抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４記載の試験キット。
- 前記第３の抗ＰＳＡ抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４記載の試験キット。
- 前記第３のモノクローナル抗体が細胞系ＡＴＣＣ ＨＢ−１２３３７又はＨＢ−１２３３８によって産生されるモノクローナル抗体と実質的に同一のエピトープに結合する、請求項１６記載の試験キット。
- 前記第１の抗ＰＳＡ抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４−１７のいずれか１項に記載の試験キット。
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| EP1507147A1 (en) * | 2003-08-12 | 2005-02-16 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Method for detecting low levels of a fusion protein |
| DE602005010548D1 (de) * | 2004-01-28 | 2008-12-04 | Turun Yliopisto | Verbessertes verfahren zur diagnose des akuten koronarsyndroms |
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