WO2007142223A1 - 肝細胞癌の診断方法 - Google Patents
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- G01N2333/91171—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5) general (2.5.1) with definite EC number (2.5.1.-)
Definitions
- the present invention relates to a method for detecting human ex 2,6-sialyltransferase and a method for diagnosing hepatocellular carcinoma.
- liver fibrosis is strong, and in cases, the incidence of hepatocellular carcinoma is high. For this reason, incision is made in the abdominal wall, laparoscopic observation and liver biopsy to collect liver tissue are performed, but the burden on the patient is extremely large.
- the monitoring method using serum is extremely effective as a screening method because it is simple and less burdensome on patients.
- Serum a fetoprotein (AFP) level is used as a marker for hepatocellular carcinoma, but it is difficult to differentiate from chronic hepatitis unless it is markedly high.
- AFP added with a sugar chain called fucose is an excellent marker with high specificity for hepatocellular carcinoma.
- DCP des-gamma-carboxy-prothrombin
- CA 125 interleukin-2 receptor
- HCCR human cervical cancer oncogene protein
- GPC3 glypican-3
- human 13 secretase is known to cleave rat (X 2,6 sialyltransferase V.
- An antibody that detects soluble sialyltransferase, the product produced by this cleavage. Is an antibody that specifically recognizes the newly generated N-terminus (cleavage), and by using this antibody, it is possible to evaluate j8 secretase activity in vitro or at the level of cultured cells.
- a method for diagnosing Alzheimer's disease using such an antibody has also been reported (International Publication WO2005Z047897).
- Non-Patent Document 1 S. Kitazume, Tachida Y, Oka R, Shirotani K, Saido TC and Hashimoto
- Non-Patent Document 2 S. Kitazume, R. Oka, Y. Tachida, K. Ogawa, K. Nakagawa, Y. Luo, M. itron, H. Shitara, C. Taya, H. Yonekawa, JC Paulson, E. Miyoshi, N. Taniguc hi and Y.
- Non-Patent Document 3 S. Kitazume, T.C. Saido and Y. Hashimoto, "Alzheimer's beta-secret asae cleaves a glycosyltransferase as a physiological substrate,” Glycocojugate J., 2 0, 59-62 (2004)
- Non-Patent Document 4 S. Kitazume, Y. Tachida, R. Oka, N. Kotani, K. Ogawa, M. Suzuki, N. Dohmae, K. Takio, TC Saido and Y. Hashimoto, characterization of alpha2,6— sialyltransferase cleavage by Alzheimer's beta-secretase (BACE1), "J. Biol. Chem., 278, 14865-14871 (2003)
- Non-Patent Document 5 J. B. Lopez “Recent Developments in the First Detection of Hepatocellell Carcinoma Clin Biochem Rev. 2005 August; 26 (3): 65? 79.
- Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-334071
- Patent Document 2 International Publication WO2005Z047897 Disclosure of the invention
- An object of the present invention is to provide a method for diagnosing hepatocellular carcinoma. Furthermore, another object of the present invention is to provide a method for detecting human ⁇ 2, 6 sialyltransferase.
- the present inventors have produced a sandwich antibody for producing two or more specific antibodies against sialyltransferase and quantifying human a 2,6 sialyltransferase (ST6Gal I) in serum.
- ST6Gal I human a 2,6 sialyltransferase
- STC antibody human transferase
- Ml antibody and M2 antibody two types of antibodies against the amino acid sequence closer to the N-terminal side than this sequence
- Fig. 1 the present inventors developed a method for quantifying ⁇ 2,6-sialyltransferase secreted from the liver into serum with high sensitivity, and investigated its pathological significance. In patients with hepatocellular carcinoma, we found a significant increase in ⁇ 2,6 sialyltransferase compared to normal controls and cirrhotic patients.
- the present invention has been completed based on these findings.
- An antibody capable of recognizing the sequence and Cys- Asp- Gin- Va ⁇ Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu- Pro- Ser- Lys- in the amino acid sequence of human ex 2,6 sialyltransferase Including performing a sandwich enzyme immunoassay (ELISA) method in combination with an antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by Arg-Lys-Thr-Asp-Val (SEQ ID NO: 3) ⁇
- ELISA sandwich enzyme immunoassay
- the method for detecting human a 2,6 sialyltransferase according to the present invention comprises (1) Cys- Asp- Gin- Va ⁇ Asp- in the amino acid sequence of human a 2, 6 sialyltransferase.
- Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly in the amino acid sequence of human ex 2,6 sialyltransferase -Arg- Glu- lie (SEQ ID NO: 1), or Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser- Leu (Self-sequence number 2)
- An antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by is provided.
- a method for diagnosing hepatocellular carcinoma comprising detecting or measuring human ex 2,6-sialyltransferase contained in a human-derived sample.
- Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser in the amino acid sequence of human ex 2,6-sialic acid transferase is used.
- -Gin- Leu- Gly- A rg-Glu-lle (SEQ ID NO: 1) or Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- L eu-Lys-Asp-Ser-Leu Human a 2,6-sialyltransferase is detected or measured using an antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by (SEQ ID NO: 2).
- Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser in the amino acid sequence of human ex 2,6-sialic acid transferase is used.
- the human-derived sample is a body fluid such as serum, plasma or bile.
- Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- in the amino acid sequence of human a 2, 6 sialyltransferase Gly- Arg- Glu- lie (SEQ ID NO: 1) or Asn- Ser- Gin- Leu- Vato Thr- Thr- (jlu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser- Leu (SEQ ID NO: 2 ) And a Cys- Asp- Gin- Va Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu- Pro in the amino acid sequence of human ⁇ 2, 6 sialyltransferase -A diagnostic kit for hepatocellular carcinoma comprising at least an antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val (SEQ ID NO: 3).
- the present invention there is provided a method for specifically and highly sensitively quantifying ⁇ 2,6-sialyltransferase secreted from liver into serum. Furthermore, according to the method for diagnosing hepatocellular carcinoma of the present invention, early diagnosis of hepatocellular carcinoma is possible, and lifesaving of patients with hepatocellular carcinoma is expected.
- the method for detecting human ⁇ 2,6 sialyltransferase according to the present invention comprises Ser- Ser-Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser-Gin in the amino acid sequence of human 2,6-sialyltransferase.
- an antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is coated on an ELISA plate in advance, and human ⁇ 2,6-sialyltransferase in the sample is added. Trap on the plate. After washing well, the trapped human ⁇ 2,6-sialyltransferase is reacted with an antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
- an antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 used here an antibody labeled with a label such as horseradish peroxidase can be used.
- a chromogenic substrate After reacting human 2,6 sialyltransferase with an antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, a chromogenic substrate is added to cause color development, and the concentration is absorbed. It can be measured using a photometer. A calibration curve is prepared with a standard sample containing human a2,6-sialyltransferase at a known concentration and a quantitative value can be calculated.
- Cys- Asp- Gin- Va ⁇ Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu- in the amino acid sequence of human a 2, 6 sialyltransferase is used.
- Human that is immobilized on a solid phase that captures an antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by Pro-Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val (SEQ ID NO: 3) as a capture antibody
- a sample containing 2,6-sialyltransferase is contacted to bind the human ⁇ 2,6-sialyltransferase to the antibody, and then the human ⁇ 2,6-sialyl captured on the solid phase in the above step.
- the present invention further provides Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Leu-Lys-Ser-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg-Glu- in the amino acid sequence of human a 2,6-sialyltransferase. Recognizes the amino acid sequence represented by Ile (SEQ ID NO: 1) or Asn- Ser- Gin-Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser- Leu (SEQ ID NO: 2) It also relates to antibodies that can be made.
- the antibody of the present invention has, for example, the amino acid sequence Ser- Ser-Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu-lie (SEQ ID NO: 1) or the amino acid sequence Asn. -A complex containing a peptide containing Ser-Gin- Leu- Va ⁇ Thr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu-Lys-Asp- Ser-Leu (SEQ ID NO: 2) conjugated to Ushi serum thyroglobulin It can be obtained by immunizing animals with the body as an antigen.
- the antibody of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
- the antibody of the present invention can be prepared by a conventional method.
- a polyclonal antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 immunizes a mammal with a peptide having the amino acid sequence described above as an antigen, It can be obtained by collecting blood from an animal and separating and purifying the antibody from the collected blood.
- mammals such as mice, mice, musters, guinea pigs, rats, usagis, inu, goats, hidges and ushi can be immunized.
- the immunization method can be performed by, for example, administering an antigen one or more times using a conventional immunization method known to those skilled in the art.
- Antigen administration can be performed, for example, 2 to 3 times at intervals of 7 to 30 days, particularly 12 to 16 days.
- the dosage should be about 0.05 to 2 mg of antigen per administration, for example.
- subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, etc. can be selected as appropriate, but the injection should be intravenous, intraperitoneal or subdermal. Is preferably administered.
- the antigen is usually used in an appropriate buffer, such as complete Freund's adjuvant, RAS (MPL (Monophosphoryl Lipid A) + TDM (Synthetic Trehalose Dicorynomycolate) + CWS (Cell Wall Skeleton) adjuvant system), aluminum hydroxide, etc.
- RAS MPL (Monophosphoryl Lipid A) + TDM (Synthetic Trehalose Dicorynomycolate) + CWS (Cell Wall Skeleton) adjuvant system
- an adjuvant means a substance that, when administered together with an antigen, nonspecifically enhances the immune response to the antigen.
- a small amount of the mammal's serum can be sampled from the ear vein or the like, and the antibody titer can be measured. If the antibody titer rises, administer the antigen as many times as necessary. For example, booster immunization can be performed using an antigen of ⁇ / zg ⁇ : LOOO / zg.
- an antigen peptide immobilized on Affigel or the like can be used as the affinity carrier.
- the blood is separated by a conventional method such as centrifugation, precipitation using ammonium sulfate or polyethylene glycol, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chromatography such as affinity chromatography, etc.
- the polyclonal antibody of the present invention can be obtained as a polyclonal antiserum.
- Serum may inactivate the complement system by, for example, treatment at 56 ° C for 30 minutes.
- the cell line producing the monoclonal antibody of the present invention is not particularly limited. For example, it can be obtained as a hyperidoma by cell fusion between an antibody-producing cell and a myeloma cell line.
- a hyperidoma producing the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by the following cell fusion method.
- antibody-producing cells spleen cells, lymph node cells, B lymphocytes and the like from immunized animals are used.
- antigen the same peptide as in the case of the polyclonal antibody (that is, the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2) can be used.
- animals to be immunized mice, rats and the like are used, and antigens are administered to these animals according to a conventional method.
- Myeloma cell lines used for cell fusion include, for example, P3X63Ag8, P 3U 1 strain, Sp2Z0 strain and so on.
- a fusion promoter such as polyethylene glycol or Sendai virus
- HAT hypoxanthine'aminobuterin-thymidine
- Cells and hybridomas obtained by cell fusion can be cloned by the limiting dilution method or the like.
- a cell line producing a monoclonal antibody capable of specifically recognizing human ⁇ 2,6-sialyltransferase can be obtained.
- the hybridoma is cultured by the usual cell culture method or ascites formation method, and the monoclonal antibody is then cultured from the culture supernatant or ascites. If you refine it. Purification of the monoclonal antibody from the culture supernatant or ascites can be performed by a conventional method. For example, ammonium sulfate fractionation, gel filtration, ion exchange chromatography, and affinity chromatography can be used in appropriate combinations.
- the globulin type of the monoclonal antibody is not particularly limited, and examples thereof include IgG, IgM, IgA, IgE, IgD and the like.
- the monoclonal antibody of the present invention may be a human rabbit antibody or a human antibody.
- antibody fragments include F (ab,) 2 fragment, Fab, fragment and the like.
- the antibody of the present invention can be used as a labeled antibody.
- a labeled antibody human ⁇ 2,6-sialyltransferase can be easily detected and measured.
- a secondary antibody that binds to the antibody of the present invention can be labeled and used.
- the type and labeling method of the antibody of the present invention or its secondary antibody can be appropriately selected from those known to those skilled in the art.
- an enzyme for example, horse radish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, 13 galactosidase, glucoamylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, malate dehydrogenase, Use glucose-6-phosphate dehydrogenase as a label Can do.
- an enzyme for example, horse radish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, 13 galactosidase, glucoamylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, malate dehydrogenase,
- glucose-6-phosphate dehydrogenase as a label Can do.
- the enzyme sugar chain is oxidized with periodate and produced.
- a method of binding an amino acid such as the antibody to the aldehyde group a method of introducing a maleimide group or a pyridylsulfide group or the like into an enzyme, and binding to a thiol group present in the Fab or fragment of the antibody. it can.
- the labeled antibody When an enzyme is used as a label, after incubating the test sample and the labeled antibody, the released labeled antibody is washed away and then reacted with the above-mentioned labeled enzyme substrate to react with color, etc.
- the labeled antibody can be detected by measuring. For example, when labeled with peroxidase, it combines with hydrogen peroxide as a substrate and diaminobenzidine or O-phenylenediamine as a chromogenic reagent to give a brown or yellow color.
- glucose oxidase for example, 2, 2, 1-acid-di- (3-ethylbenzothiazoline-16-sulfonic acid (ABTS) can be used as a substrate.
- ABTS 2, 2, 1-acid-di- (3-ethylbenzothiazoline-16-sulfonic acid
- a fluorescent dye such as FITC (fluorescein isothiocyanate) or TRITC (tetramethylrhodamine B isothiocyanate) can be used.
- the secondary antibody can be labeled. Binding of the antibody of the present invention or its secondary antibody and a fluorescent dye can be performed by a conventional method.
- a colloidal metal and a colored latex can be used as the label.
- colloidal metals include metal colloid particles that are dispersed particles of gold sol, silver sol, selenium sol, tellurium sol, platinum sol, and the like.
- the size of colloidal metal particles is usually about 360 nm in diameter.
- representative examples of the colored latex include synthetic latex such as polystyrene latex colored with pigments such as red and blue. As the size of the colored latex, a force of about several tens to several hundreds of nanometers in diameter can be selected.
- the binding of the antibody of the present invention or its secondary antibody and the color-labeling substance should be performed by a conventional method.
- Can do for example, in the case of gold colloidal particles in which the color labeling substance is a dispersed particle of gold sol, it is usually possible to physically bond the two by mixing the antibody and gold sol at room temperature. .
- a facility label eg, piotin
- an isotope label eg, 125 ⁇
- Detection or measurement of human ⁇ 2,6 sialyltransferase using the antibody of the present invention can be performed by ELISA, Western plot, immunoprecipitation, slot or dot plot assembly, immune fiber and tissue staining, radioimmunoassay. (RIA), fluorescent immunoassay, avidin-piotin or immunoassay using the streptavidin-piotin system, etc., and these analyzes are well known to those skilled in the art.
- the method for diagnosing hepatocellular carcinoma according to the present invention is a method characterized by detecting or measuring human ⁇ 2,6-sialyltransferase contained in a human-derived sample. By detecting or measuring human a 2,6-sialyltransferase by the method of the present invention, it is possible to diagnose hepatocellular carcinoma (including prediction of risk of onset).
- the amount of human «2, 6 sialyltransferase present in a sample derived from a subject is used as the amount of human ⁇ 2, 6 sialyltransferase present in a sample of a control subject.
- the amount of enzyme By comparing with the amount of enzyme, hepatocellular carcinoma can be diagnosed.
- Detection or measurement of human a 2,6 sialyltransferase can be performed by immunoassay using an antibody that specifically recognizes human a 2,6 sialyltransferase. That is, the analysis of the binding between human ⁇ 2,6 sialyltransferase and the above antibody is carried out by labeling the above antibody or a secondary antibody that binds to the above antibody with an enzyme label, a chromogenic label, a radiolabel or a luminescent label. This can be done by binding and detecting or measuring this label.
- the immunoassays that can be performed in the present invention include ELISA, Western blot, immunoprecipitation, slot or dot plot assembly, immunohistochemical staining, radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay, avidin piotin or streptavidin piotin. Forces such as Imnoassey using a system are not limited to these.
- the amino acids of human a 2, 6 sialyltransferase as described herein above Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (SEQ ID NO: 1) or Asn- Ser- Gin- Leu- Va to Thr in the sequence -An antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser -Leu (SEQ ID NO: 2) and human ⁇ 2, 6 sialyltransferase Amino acid sequence represented by Cys- Asp- Gin- Va ⁇ Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu-Pro-Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val (SEQ ID NO: 3) Human a 2, 6 sialyltransferase is detected or measured in human-derived samples by sandwich enzyme immunoassay (EL)
- a human-derived sample can be used.
- the human-derived sample is not particularly limited as long as it is a sample capable of detecting or measuring human ⁇ 2, 6 sialyltransferase, and body fluids such as serum, plasma, urine or bile can be used, but preferably Can use serum.
- the method for diagnosing hepatocellular carcinoma according to the present invention can be used in combination with measurement of other hepatocellular carcinoma markers.
- the ability of hepatocellular carcinoma markers that can be used together in the present invention includes, but is not limited to, ⁇ -fetoprotein (AFP), PIVKA II, and the like.
- the present invention relates to Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Leu-Lys-Ser-Ser-Gin-Leu-Gly-Arg-Glu-lie (sequence) in the amino acid sequence of human ⁇ 2,6-sialyltransferase. No.
- the present invention also relates to a diagnostic kit for hepatocellular carcinoma, comprising at least an antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by Thr-Asp-Val (SEQ ID NO: 3).
- a diagnostic kit for hepatocellular carcinoma comprising at least an antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by Thr-Asp-Val (SEQ ID NO: 3).
- the amino acid sequence of human ⁇ 2,6 sialyltransferase contains ys— Asp— Gin— Vato Asp— lie— Tyr— (jlu— Phe— Leu— Pro— Ser — Lys— Arg— Lvs— Thr— Asp— Val
- the antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by (SEQ ID NO: 3) may be immobilized in advance.
- Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (SEQ ID NO: 1) in the amino acid sequence of human ⁇ 2,6 sialyltransferase Or an antibody capable of recognizing the amino acid sequence represented by Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser- Leu (SEQ ID NO: 2) Pre-labeled, ok.
- the solid phase that can be used in the diagnostic kit of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include polymers such as polystyrene, glass beads, magnetic particles, microplates, immunochromatographic filter paper, glass filters, and other insoluble carriers. Can be mentioned.
- the diagnostic kit of the present invention may further contain other optional components.
- other optional components include, but are not limited to, enzymes used for labeling, substrates thereof, radioisotopes, luminescent materials, fluorescent materials, colored materials, buffers, and plates. Absent.
- the form of the diagnostic kit of the present invention is not particularly limited, but for the purpose of quick and simple diagnosis, an integrated diagnostic kit in which the components of the diagnostic kit of the present invention are integrated. Can be.
- Tissue culture media and reagents such as DMEM and Lipofectin were purchased from Invitrogen.
- the column for DNA purification also obtained Qiagen power. Protein molecular weight standards were purchased from Bio-Rad.
- Antigen synthesis peptides include Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly-Arg- Glu- lie (SEQ ID NO: 1), Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr. -Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Le u- Lys- Asp- Ser- Leu (SEQ ID NO: 2), and Cys- Asp- Gin- Va ⁇ Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- L eu- Pro -A peptide having an amino acid sequence represented by Ser- Lys- Arg- Lys- Thr- Asp- Val (SEQ ID NO: 3) was used.
- Each antigen-synthetic peptide is bound to ushi serum thyroglobulin by the maleimide method. Mix this antigen (100 microgram) with Freund complete adjuvant Then immunize subcutaneously and intradermally in Usagi. For booster immunization, the antigen (lOOmicrogram) is inoculated subcutaneously and intradermally 8 times every 2 weeks with Freund incomplete adjuvant.
- the obtained antiserum is purified with an antigen affinity column.
- the affinity column is an antigen peptide bound to an Activated Thiol Sepharose 4B gel. After adsorption with D-PBS buffer, elute with 0.2M glycine buffer (pH2.5). As a result, a highly specific polyclonal antibody was obtained.
- COS-7 maintained in DMEM / 10% FBS was seeded on a 100 mm tissue culture dish and grown to 50-70% confluence in a 37 ° C 5% C02 incubator.
- Cells were transfected using the Lipofectin method and Opti-MEM I (Colley, K., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 7784-7793). 0 Transformed protein expression is typical For 16-36 hours. Soluble sialyltransferase-FLAG protein in the medium was precipitated using M2 agarose (Sigma).
- the precipitated M2 agarose gel was taken up in Laemmli buffer, subjected to 4-20% gradient SDS / PAGE, and transferred to a nitrocellulose membrane. Plotted membranes were incubated with each purified polyclonal antibody (1: 500), incubated with an appropriate secondary antibody, HRP-labeled anti-rabbit IgG (Cap pel), and visualized using a chemiluminescent substrate (Pierce) . As shown in Figure 2, these antibodies were highly reactive to soluble secreted sialyltransferases.
- a sandwich ELISA method was developed using M2 antibody and STC antibody.
- Select sialyltransferase by preliminarily immobilizing STC antibody (2 microgram / well) on ELISA plate and incubating serum (10-20 microliter) at 37 degrees for 1 hour. To trap. Wash 7 times with a washing solution such as phosphate buffered saline (PBS). hor Incubate for 30 minutes at 4 degrees with Fab fragment of M2 antibody labeled with se radish peroxidate (HRP).
- PBS phosphate buffered saline
- the present invention there is provided a method for specifically and highly sensitively quantifying ⁇ 2,6-sialyltransferase secreted into the serum from the liver. Furthermore, according to the method for diagnosing hepatocellular carcinoma of the present invention, early diagnosis of hepatocellular carcinoma is possible, and lifesaving of patients with hepatocellular carcinoma is expected.
- Fig. 1 shows the amino acid sequence of human a 2,6 sialyltransferase (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), the amino acid sequence of rat ex 2,6 sialyltransferase (sequence in the sequence listing). No. 5) and the amino acid sequence of mouse ex 2,6 sialyltransferase (SEQ ID No. 6 in the sequence listing) are shown respectively. Near the C-terminal side, an antibody against the amino acid sequence (STC antibody) and two antibodies against the amino acid sequence located on the N-terminal side from this sequence (Ml antibody and M2 antibody) were prepared.
- STC antibody an antibody against the amino acid sequence
- Ml antibody and M2 antibody two antibodies against the amino acid sequence located on the N-terminal side from this sequence
- FIG. 2 shows the results of Western blotting. As indicated by the triangles, these antibodies were highly reactive against soluble secretory sialyltransferases of mouse, rat and human.
- FIG. 3 shows the sandwich ELISA method of the present invention.
- STC antibody was immobilized on a plate, and sialyltransferase in serum was selectively trapped as a capture antibody. Thereafter, quantification was performed using a labeled Fab fragment (derived from M2 antibody). The calibration curve for the standard sample is shown on the right side.
- FIG. 4 shows the measured values of serum ST6Gal I in liver diseases. Examples (measurement examples) using STC antibodies and HRP-labeled M2 Fab fragments are shown. A slight increase is observed in cirrhosis patients (30 cases) compared with normal controls (6 cases), but no significant difference is observed. On the other hand, it was shown to increase significantly in hepatocellular carcinoma cases (29 cases). The standard deviation is indicated by the bar.
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Abstract
本発明の目的は、肝細胞癌の診断方法、およびヒトα2,6シアル酸転移酵素の検出方法を提供することである。本発明によれば、ヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のSer-Ser-Ala-Gly-Ser-Leu-Lys-Ser-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg-Glu-Ile(配列番号1)、又はAsn-Ser-Gln-Leu-Val-Thr-Thr-Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu(配列番号2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体と、ヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のCys-Asp-Gln-Val-Asp-Ile-Tyr-Glu-Phe-Leu-Pro-Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val(配列番号3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体とを組み合わせて用いてサンドイッチ酵素免疫測定(ELISA)法を行うことを含む、ヒトα2,6シアル酸転移酵素の検出方法が提供される。
Description
明 細 書
肝細胞癌の診断方法
技術分野
[0001] 本発明は、ヒト ex 2, 6シアル酸転移酵素の検出方法、並びに肝細胞癌の診断方法 に関する。
背景技術
[0002] 肝細胞癌の 90%は肝硬変力 の進展であり、自覚症状や他覚症状は進行した肝 硬変の症状と同一である。つまり全身倦怠感、易疲労感、食欲不振、やせ、腹痛、微 熱などのほかの病気でもみられる漠然とした症状がみられるのみであり、早期診断は きわめてむずかしい。
[0003] 慢性肝炎患者のうち、肝臓の繊維化が強 、症例では肝細胞癌の発症率が高 、こと が知られて ヽる。このため腹壁を切開して腹腔鏡による観察や肝臓組織を採取する 肝生検などが行われるが、患者に対する負担はきわめて大きい。一方、血清を用い たモニター法は、患者に対する負担が少なく簡便なので、スクリーニング方法として 極めて有効である。血清中の aフエト蛋白(AFP)レベルは肝細胞癌のマーカーとし て利用されているが、著しい高値を示す場合以外は慢性肝炎との鑑別が困難である 。AFPのうちフコースという糖鎖が付加したものは肝細胞癌に対する特異性が高い優 れたマーカーである力 フコースの付カ卩を検出するためにレクチン電気泳動法を行う 必要があり多検体のスクリーニングが難し 、。その他にも des-gamma-carboxy-prothr ombin (DCP), CA 125, interleukin- 2 receptor (IL-2R), human cervical cancer oncog ene protein (HCCR), glypican-3 (GPC3)などのマーカーの利用がこころみられている 力 ひろく臨床応用されるには至っていない。
[0004] 他方、 /3ーセクレターゼとシアル酸転移酵素とを接触させた後に、 ーセクレター ゼの酵素活性により切断されたラット由来の分泌型シアル酸転移酵素を、該酵素を 特異的に認識する抗体を用いて検出又は測定することによって βーセクレターゼの シアル酸転移酵素切断活性を測定する方法が報告されて!ヽる (特開 2003 - 33407 1号公報)。特開 2003— 334071号公報にも記載されている通り、ラット血清中の《2
,6シアル酸転移酵素( 13セクレターゼ産物)を定量する方法は開発されていた力 ヒト とラットでは切断部位近傍のアミノ酸配列が異なるために、従来の方法ではヒト試料 の定量は困難であった。
[0005] また、ヒト 13セクレターゼがラット (X 2,6シアル酸転移酵素を切断することが知られて V、る。この切断によって生じた産物である可溶性のシアル酸転移酵素を検出する抗 体は、新たに生じた N-末端 (切断端)を特異的に認識する抗体であり、この抗体を用 いることにより試験管内あるいは培養細胞実験レベルにおいては j8セクレターゼ活 性を評価することが可能であった。このような抗体を用いたアルツハイマー病の診断 方法も報告されて ヽる(国際公開 WO2005Z047897)。
[0006] 非特許文献 1 : S.Kitazume, Tachida Y, Oka R, Shirotani K, Saido TC and Hashimoto
Y: Alzheimer's beta— secretase, beta-site amyloid precursor protein-cleaving enzym e, is responsible for cleavage secretion of a Golgi— resident sialyltransferase . Proceed ings of the National Academy of Sciences, USA, 98(24):13554— 13559, 2001, Nov. 20 非特許文献 2 : S. Kitazume, R. Oka, Y. Tachida, K. Ogawa, K. Nakagawa, Y. Luo, M . itron, H. Shitara, C. Taya, H. Yonekawa, J.C. Paulson, E. Miyoshi, N. Taniguc hi and Y. Hashimoto, "In vivo cleavage of alpha2, 6— sialyltransferase by Alzheimer's beta— secretase (BACE1)," J. Biol. Chem., 280, 8589— 8595 (2005)
非特許文献 3 : S. Kitazume, T.C. Saido and Y. Hashimoto, "Alzheimer's beta-secret asae cleaves a glycosyltransferase as a physiological substrate," Glycocojugate J., 2 0, 59-62 (2004)
非特許文献 4: S. Kitazume, Y. Tachida, R. Oka, N. Kotani, K. Ogawa, M. Suzuki, N . Dohmae, K. Takio, T.C. Saido and Y. Hashimoto, characterization of alpha2,6— sialyltransferase cleavage by Alzheimer's beta- secretase (BACE1)," J. Biol. Chem., 278, 14865-14871 (2003)
非特許文献 5 : J. B. Lopez "Recent Developments in the First Detection of Hepatoc ellular Carcinoma Clin Biochem Rev. 2005 August; 26(3): 65? 79.
特許文献 1:特開 2003-334071号公報
特許文献 2:国際公開 WO2005Z047897
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 日本における肝疾患患者は 200万人に達し、そのうち 10〜20%は肝硬変を経て 肝細胞癌を発症する。肝硬変の患者数は約 20万人と推定されており、年間約 1万 6 000人が死亡している。肝硬変患者のうち、肝細胞癌の発症を早期に診断すること は、患者の救命の観点力も非常に重要である。本発明は、肝細胞癌の診断方法を提 供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、ヒト《2, 6シアル酸転移酵素の 検出方法を提供することを解決すべき課題とした。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、シアル酸転移酵素に対する 2種類以上の特異的な抗体を作製し、 血清中のヒト a 2,6シアル酸転移酵素(ST6Gal I)を定量するためのサンドイッチ ELIS A法を開発した。即ち、本発明者らは、ヒト転移酵素の C末端側に近いアミノ酸配列に 対する抗体 (STC抗体)およびこの配列より N末端側にあるアミノ酸配列に対する 2種 類の抗体 (Ml抗体および M2抗体)を作製した (図 1)。さらに本発明者らは、肝臓から 血清中へ分泌される α 2,6シアル酸転移酵素を高感度に定量する方法を開発し、そ の病理的意義を検討した。肝細胞癌発症例では正常コントロールや肝硬変患者に 比べて《2,6シアル酸転移酵素が有意に増加することを見いだした。本発明はこれら の知見に基づいて完成したものである。
[0009] 即ち、本発明によれば、ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr-Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser- Leu (配列番号 2) で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体と、ヒト ex 2, 6シアル酸転移酵素 のアミノ酸配列中の Cys- Asp- Gin- Va卜 Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu- Pro- Ser- Lys- Arg -Lys-Thr-Asp-Val (配列番号 3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体 とを組み合わせて用いてサンドイッチ酵素免疫測定 (ELISA)法を行うことを含む、ヒ ト《2, 6シアル酸転移酵素の検出方法が提供される。
[0010] 好ましくは、本発明によるヒト a 2, 6シアル酸転移酵素の検出方法は、(1)ヒト a 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Cys- Asp- Gin- Va卜 Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- L
eu- Pro- Ser- Lys- Arg- Lys- Thr- Asp- Val (配列番号 3)で表されるアミノ酸配列を認識 することができる抗体を固定ィ匕した固相にヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を含む試料を 接触させて上記抗体にヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を結合させる工程:及び(2)上 記工程(1)で結合したヒト a 2, 6シアル酸転移酵素にヒト a 2, 6シアル酸転移酵素 のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu -lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- Ly s-Asp-Ser-Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体を 反応させて、結合したヒト α 2, 6シアル酸転移酵素を検出する工程を含む。
[0011] 本発明の別の側面によれば、ヒト ex 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser- Leu (酉己列番 号 2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体が提供される。
[0012] 本発明のさらに別の側面によれば、ヒト由来の試料に含まれるヒト ex 2, 6シアル酸 転移酵素を検出又は測定することを含む、肝細胞癌の診断方法が提供される。
[0013] 好ましくは、本発明による肝細胞癌の診断方法においては、ヒト ex 2, 6シアル酸転 移酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- A rg-Glu-lle (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- L eu-Lys-Asp-Ser-Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗 体を用いてヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を検出又は測定する。
[0014] 好ましくは、本発明による肝細胞癌の診断方法においては、ヒト ex 2, 6シアル酸転 移酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- A rg-Glu-lle (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- L eu-Lys-Asp-Ser-Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗 体と、ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Cys- Asp- Gin- Va卜 Asp- lie- Τ yr- Glu- Phe- Leu- Pro- Ser- Lys- Arg- Lys- Thr- Asp- Val (配列番号 3)で表されるァミノ 酸配列を認識することができる抗体とを組み合わせて用いてサンドイッチ酵素免疫測 定 (ELISA)法を行うことによってヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を検出又は測定する。
[0015] 好ましくは、本発明による肝細胞癌の診断方法においては、(1)ヒト α 2, 6シアル
酸転移酵素のアミノ酸配列中の Cys- Asp- Gin- Va Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu- Pro- Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val (配列番号 3)で表されるアミノ酸配列を認識すること ができる抗体を固定ィ匕した固相にヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を含む試料を接触さ せて上記抗体にヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を結合させる工程:及び(2)上記工程( 1)で結合したヒト α 2, 6シアル酸転移酵素にヒト α 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸 配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配列 番号 1 )、又は Asn- Ser- Gin- Leu- Vaト Thr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser -Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体を反応させて 、結合したヒト α 2, 6シアル酸転移酵素を検出する工程によってヒト a 2, 6シアル酸 転移酵素を検出又は測定する。
[0016] 好ましくは、ヒト由来の試料は血清、血漿あるいは胆汁などの体液である。
[0017] 本発明のさらに別の側面によれば、ヒト a 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中 の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配列番号 1) 、又は Asn- Ser- Gin- Leu- Vaト Thr- Thr- (jlu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser- Leu ( 配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体と、ヒト《2, 6シアル 酸転移酵素のアミノ酸配列中の Cys- Asp- Gin- Va Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu- Pro- Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val (配列番号 3)で表されるアミノ酸配列を認識すること ができる抗体とを少なくとも含む、肝細胞癌の診断キットが提供される。
発明の効果
[0018] 本発明によれば、肝臓から血清中へ分泌される《2,6シアル酸転移酵素を特異的 かつ高感度に定量する方法が提供される。さらに本発明の肝細胞癌の診断方法によ れば、肝細胞癌の早期診断が可能となり、肝細胞癌患者の救命が期待される。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
(1)ヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を認識する抗体、及びそれを用いたヒト a 2, 6シァ ル酸転移酵素の検出方法
本発明によるヒト α 2, 6シアル酸転移酵素の検出方法は、ヒトひ 2, 6シアル酸転移 酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg
-Glu- lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Le u-Lys-Asp-Ser-Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗 体と、ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Cys- Asp- Gin- Va卜 Asp- lie- Τ yr- Glu- Phe- Leu- Pro- Ser- Lys- Arg- Lys- Thr- Asp- Val (配列番号 3)で表されるァミノ 酸配列を認識することができる抗体とを組み合わせて用いてサンドイッチ酵素免疫測 定 (ELISA)法を行うことを特徴とする方法である。
[0020] より具体的には、 ELISA用のプレートに予め配列番号 3で表されるアミノ酸配列を 認識することができる抗体をコートしておき、試料中のヒト α 2, 6シアル酸転移酵素を プレート上にトラップする。よく洗浄した後に、トラップされたヒト α 2, 6シアル酸転移 酵素を、配列番号 1又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列を認識することができる 抗体と反応させる。ここで用いる配列番号 1又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列を 認識することができる抗体としては、ホースラディッシュ 'パーォキシダーゼなどの標 識でラベルした抗体を用いることができる。ヒトひ 2, 6シアル酸転移酵素を、配列番 号 1又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体と反応させた 後に、発色基質を加えて発色させ、その濃度を吸光光度計を用いて測定することが できる。あら力じめ既知の濃度のヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を含む標準試料によつ て検量線作製しておき、これによつて定量値を算出することができる。
[0021] 上記の通り本発明の好ましい態様によれば、ヒト a 2, 6シアル酸転移酵素のァミノ 酸配列中の Cys- Asp- Gin- Va卜 Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu- Pro- Ser- Lys- Arg- Lys- T hr-Asp-Val (配列番号 3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体を捕捉 (capture)抗体として固定ィ匕した固相にヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を含む試料を接 触させて上記抗体にヒト α 2, 6シアル酸転移酵素を結合させ、次いで、上記工程に おいて固相に捕捉されたヒト α 2, 6シアル酸転移酵素にヒト a 2, 6シアル酸転移酵 素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- G lu-lle (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- L ys-Asp-Ser-Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体を 反応させて、固相に捕捉されたヒト α 2, 6シアル酸転移酵素を検出することによって 、ヒト《2, 6シアル酸転移酵素の検出を行うことができる。
[0022] 本発明はさらに、ヒト a 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Ser-Ser-Ala-Gly -Ser-Leu-Lys-Ser-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg-Glu-Ile (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin - Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser- Leu (配列番号 2)で表さ れるアミノ酸配列を認識することができる抗体にも関する。本発明の抗体は、例えば、 アミノ酸配列 Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配 列番号 1 )、又はアミノ酸配列 Asn- Ser- Gin- Leu- Va卜 Thr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Le u-Lys-Asp- Ser-Leu (配列番号 2)を有するペプチドを、ゥシ血清サイログロブリンに 結合させた複合体を抗原として動物に免疫することにより得ることができる。本発明の 抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでもよい。本発明の抗体 の作製は常法により行なうことができる。
[0023] 例えば、上記した配列番号 1又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列を認識すること ができるポリクローナル抗体は、上記したアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として 哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分 離 ·精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ノ、ムスター、モルモット、ラッ ト、ゥサギ、ィヌ、ャギ、ヒッジ、ゥシ等の哺乳動物を免疫することができる。免疫感作 の方法としては、当業者に公知の通常の免疫感作の方法を用いて、例えば抗原を 1 回以上投与することにより行うことができる。
[0024] 抗原投与は、例えば、 7から 30日、特に 12から 16日間隔で 2または 3回投与するこ とができる。投与量は 1回につき、例えば抗原約 0. 05から 2mg程度を目安とすること 力 Sできる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈 内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮 下に注射することにより投与することが好ましい。また、抗原は適当な緩衝液、例えば 完全フロイントアジュバント、 RAS [MPL(Monophosphoryl Lipid A)+TDM(Synthetic T rehalose Dicorynomycolate)+CWS(Cell Wall Skeleton)アジュバントシステム〕 、水酸 化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して 用いることができる力 投与経路や条件等によっては、上記したアジュバントは使用し ない場合もある。ここでアジュバントとは抗原とともに投与したとき、非特異的にその抗 原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
[0025] 免疫感作した哺乳動物を 0. 5から 4ヶ月間飼育した後、該哺乳動物の血清を耳静 脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定することができる。抗体価が上昇してきた ら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば ΙΟ /z g〜: LOOO /z gの抗 原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から 1〜2ヶ月後に免疫感作 した哺乳動物力 通常の方法により血液を採取して、 56°Cで 30分間処理して補体 系を不活性ィ匕した後、ァフィユティークロマトグラフィーで特異抗体の精製を行なう。 ァフィユティー担体としては、例えば、抗原ペプチドを Affigelなどに固相化したものを 用いることができる。該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモ-ゥムまたはポリエチレ ングリコールを用いた沈滅、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー 、ァフィ-ティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離' 精製することにより、ポリクローナル抗血清として、本発明のポリクローナル抗体を得る ことができる。なお血清は、たとえば、 56°Cで 30分間処理することによって補体系を 不活性化してもよい。
[0026] 本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株は特に制限されないが、例えば、 抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイプリドーマとして得ることが できる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、以下のような細胞 融合法によって得ることができる。
[0027] 抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、 Bリンパ球等 を使用する。抗原としては、ポリクローナル抗体の場合と同様のペプチド (即ち、配列 番号 1又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有するペプチド)を使用することがで きる。免疫される動物としてはマウス、ラット等が使用され、これらの動物への抗原の 投与は常法に従って行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジ ュバントなどのアジュバントと抗原ペプチドとの懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを 動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。 免疫化した動物力 抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細 胞とをそれ自体公知の方法(G.Kohler et al .,Nature,256 495(1975))により融合する ことにより、ハイプリドーマを作製することができる。
[0028] 細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスでは P3X63Ag8、 P
3U 1株、 Sp2Z0株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレング リコール、センダイウィルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイプリドーマの 選抜にはヒポキサンチン'アミノブテリン ·チミジン (HAT)培地を常法に従つて使用す ることができる。細胞融合により得られたノ、イブリドーマは限界希釈法等によりクロー ニングすることができる。更に、酵素免疫測定法等によりスクリーニングを行なうことに より、ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素を特異的に認識することができるモノクローナル抗 体を産生する細胞株を得ることができる。
[0029] このようにして得られたノヽイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造す るには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清 あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればょ 、。培養上清もしくは腹水か らのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画 、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィーなどを適 宜組み合わせて使用できる。
[0030] また、本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、該モノクローナル抗体のグロブ リンタイプは特に限定されず、例えば IgG、 IgM、 IgA、 IgE、 IgD等が挙げられる。ま た、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトイ匕抗体又はヒト抗体でもよい。
[0031] また、上記したような各種抗体の断片も本発明の範囲内である。抗体の断片として は、 F (ab,) 2フラグメント、 Fab,フラグメント等が挙げられる。
[0032] 本発明によるサンドイッチ ELISAによるヒト a 2, 6シアル酸転移酵素の検出方法に おいては、本発明の抗体は、標識抗体として使用することができる。標識抗体を作製 することにより、ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素の検出や測定を簡便に行うことができる 。また、本発明の抗体と結合する二次抗体を標識して使用することもできる。本発明 の抗体またはその二次抗体の標識の種類及び標識方法は当業者に知られているも のから適宜選択することができる。
[0033] 標識として酵素を使用する場合には、例えば、西洋ヮサビペルォキシダーゼ、アル カリホスファターゼ、グルコースォキシダーゼ、 13 ガラクトシダーゼ、グルコアミラー ゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲ ナーゼ、グルコースー6—ホスフェートデヒドロゲナーゼ等を標識として使用すること
ができる。これらの酵素を本発明の抗体又はその二次抗体又はその断片 (F (ab' ) 2 フラグメント、 Fab'フラグメント等)に標識する方法としては、酵素の糖鎖を過ヨウ素酸 で酸化し、生成したアルデヒド基に該抗体などのアミノ酸を結合させる方法や、酵素 にマレイミド基あるいはピリジルスルフイド基等を導入し、該抗体の Fab,フラグメントに 存在するチオール基と結合させる方法等を挙げることができる。
[0034] 標識として酵素を使用する場合、試験試料と標識抗体とをインキュベートした後、遊 離した標識抗体を洗浄して除去してから、上記の標識酵素の基質を作用させて発色 等で反応を測定することによって標識抗体を検出することができる。例えば、ペルォ キシダーゼで標識される場合には、基質として過酸化水素、発色試薬としてジァミノ ベンジジンまたは O—フエ-レンジァミンと組み合わさって褐色または黄色を生じる。 グルコースォキシダーゼで標識される場合には、基質として、たとえば 2, 2, 一ァシド —ジ一(3—ェチルベンゾチアゾリン一 6—スルホン酸 (ABTS)等を用いることができ る。
[0035] 標識として蛍光色素を使用する場合には、例えば、 FITC (フルォレセインイソチォ シァネート)又は TRITC (テトラメチルローダミン Bイソチオシァネート)等の蛍光色素 で本発明の抗体又はその二次抗体を標識することができる。本発明の抗体又はその 二次抗体と蛍光色素との結合は常法によって行うことができる。
[0036] 標識として呈色標識物質を使用する場合には、例えば、コロイド金属および着色ラ テックスなどを標識として使用できる。コロイド金属の代表例としては、金ゾル、銀ゾル 、セレンゾル、テルルゾルおよび白金ゾルなどのそれぞれの分散粒子である金属コロ イド粒子を挙げることができる。コロイド金属の粒子の大きさは、通常は、直径 3 60n m程度とされる。また、着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれ ぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスを挙げることが きる。着色ラテックスの大きさは、直径数十 〜数百 nm程度力も選択することができ る。これらの呈色標識物質は市販品をそのまま使用することができるが、場合によりさ らにカ卩ェし、または、それ自体公知の方法で製造することもできる。
[0037] 本発明の抗体又はその二次抗体と呈色標識物質との結合は常法によって行うこと
ができる。例えば、呈色標識物質が金ゾルの分散粒子である金コロイド粒子の場合 には、通常は、抗体と金ゾルとを室温下で混合することによって両者を物理的に結合 することが可能である。
[0038] なお、標識としては、上記以外にもァフィユティー標識 (例えば、ピオチン等)、又は 、同位体標識 (例えば、 125ι等)等を使用することもできる。
[0039] 本発明の抗体を用いたヒト α 2, 6シアル酸転移酵素の検出又は測定は、 ELISA、 ウェスタンプロット、免疫沈降、スロット或いはドットプロットアツセィ、免疫糸且織染色、ラ ジオイムノアッセィ (RIA)、蛍光ィムノアツセィ、アビジン一ピオチン又はストレプトァ ビジン一ピオチン系を用いるィムノアッセィなどにより行うことができ、これらの分析は 当業者に周知の方法である。
[0040] (2)肝細胞癌の診断方法
本発明による肝細胞癌の診断方法は、ヒト由来の試料に含まれるヒト α 2, 6シアル 酸転移酵素を検出又は測定することを特徴とする方法である。本発明の方法により、 ヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を検出又は測定することにより、肝細胞癌の診断 (発症 危険度の予測などを含む)を行うことができる。
[0041] 本発明の診断方法の一例においては、被験者由来の試料中に存在するヒト « 2, 6 シアル酸転移酵素の量を、対照被験者の試料中に存在するヒト α 2, 6シアル酸転移 酵素の量と比較することにより、肝細胞癌の診断を行うことができる。
[0042] ヒト a 2, 6シアル酸転移酵素の検出又は測定は、ヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を特 異的に認識する抗体を用いるィムノアッセィにより行うことができる。即ち、ヒト α 2, 6 シアル酸転移酵素と上記抗体との結合の分析は、上記抗体、あるいは上記抗体と結 合する二次抗体に酵素標識、発色標識、放射標識又は発光標識などの標識を結合 し、この標識を検出又は測定することにより行うことができる。本発明で行うことができ るィムノアッセィとしては、 ELISA、ウェスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはドット プロットアツセィ、免疫組織染色、ラジオィムノアッセィ (RIA)、蛍光ィムノアツセィ、ァ ビジン ピオチン又はストレプトアビジン ピオチン系を用いるィムノアッセィなどが 挙げられる力 これらに限定されるものではない。
[0043] 好ましくは、本明細書中に上記したような、ヒト a 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸
配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配列 番号 1 )、又は Asn- Ser- Gin- Leu- Vaト Thr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser -Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体と、ヒト《2, 6 シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Cys- Asp- Gin- Va卜 Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu -Pro-Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val (配列番号 3)で表されるアミノ酸配列を認識す ることができる抗体とを組み合わせて用いるサンドイッチ酵素免疫測定 (ELISA)法 によってヒト由来の試料に含まれるヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を検出又は測定し、 これにより肝細胞癌の診断を行うことができる。
[0044] 本発明による肝細胞癌の診断方法においては、ヒト由来の試料を使用することがで きる。ヒト由来の試料としては、ヒト《2, 6シアル酸転移酵素を検出又は測定できる試 料であれば特に限定されず、血清、血漿、尿あるいは胆汁などの体液を使用すること もできるが、好ましくは血清を使用することができる。
[0045] また、本発明による肝細胞癌の診断方法にぉ 、ては、他の肝細胞癌のマーカーの 測定を併用することもできる。本発明において併用することができる肝細胞癌のマー カーとしては、 αフエト蛋白 (AFP)、 PIVKA IIなどを挙げることができる力 これらに限 定されるものではない。
[0046] (3)肝細胞癌の診断キット
さらに本発明は、ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Ser-Ser-Ala-Gly -Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin -Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser- Leu (配列番号 2)で表さ れるアミノ酸配列を認識することができる抗体と、ヒト ex 2, 6シアル酸転移酵素のアミ ノ酸配列中の Cys- Asp- Gin- Va卜 Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu- Pro- Ser- Lys- Arg- Lys- Thr-Asp-Val (配列番号 3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体とを少 なくとも含む、肝細胞癌の診断キットにも関する。本発明の診断キットを用いることによ り、ヒト由来の試料に含まれるヒトひ 2, 6シアル酸転移酵素を検出又は測定すること ができ、これにより肝細胞癌を診断することができる。
[0047] 本発明の診断キットにおいては、ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の し ys— Asp— Gin— Vaト Asp— lie— Tyr— (jlu— Phe— Leu— Pro— Ser— Lys— Arg— Lvs— Thr— Asp— Val
(配列番号 3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体はあらかじめ固相 化されていてもよい。また、ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Leu- Lys- Asp- Ser- Leu (配列番号 2) で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体は、予め標識されて 、てもよ 、。 本発明の診断キットにおいて用いることができる固相としては特に限定されず、例え ば、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、ィムノクロ マトグラフィー用濾紙、グラスフィルタ一等の不溶性担体を挙げることができる。
[0048] 本発明の診断キットには、更に他の任意成分を含めることができる。他の任意成分 としては、例えば、標識に用いる酵素、その基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光 物質、着色物質、緩衝液、プレート等を挙げることができるが、これらに限定されるも のではない。
[0049] また、本発明の診断キットの形態も特に限定されないが、迅速かつ簡便に診断を行 うことを目的として、本発明の診断キットの構成成分が一体となった一体型の診断キ ットとすることができる。
[0050] 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力 本発明は実施例によつ て限定されるものではない。
実施例
[0051] (1)材料
DMEM及び Lipofectin等の組織培養培地及び試薬は Invitrogenから購入した。 DNA 精製用カラムは Qiagen力も得た。タンパク質分子量標準は Bio-Radから購入した。
[0052] (2)抗体の作製
抗原合成ペプチドとしては、 Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu- Gly -Arg- Glu- lie (配列番号 1)、 Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg- Phe- Le u- Lys- Asp- Ser- Leu (配列番号 2)、及び Cys- Asp- Gin- Va卜 Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- L eu- Pro- Ser- Lys- Arg- Lys- Thr- Asp- Val (配列番号 3)で表されるアミノ酸配列を有す るペプチドを使用した。それぞれの抗原合成ペプチドをマレイミド法でゥシ血清サイロ グロブリンに結合する。この抗原(100 micro gram)を Freund complete adjuvantと混合
してゥサギの皮下および皮内に免疫する。追加免疫のために抗原(lOOmicro gram) を Freund incomplete adjuvantとともに 2週ごとに 8回皮下および皮内に接種する。得ら れた抗血清を抗原ァフィ二ティカラムで精製する。ァフィユティーカラムは抗原べプチ ドを Activated Thiol Sepharose4Bゲルに結合したものである。 D-PBSバッファーで吸 着後、 0.2Mグリシンバッファー(pH2.5)で溶出する。これよつて特異性の高いポリクロ ーナル抗体を得た。
[0053] (3)細胞培養およびトランスフエクシヨン
一過性トランスフエクシヨン実験のために、ヒト、ラット、マウス ST6Gal I-pSVL及び ST 6Gal I FLAG- pSVLを既報の通り構築した(Kitazume- Kawaguchi,他、(1999) Glycobio logy 9, 1397-1406) o
[0054] DMEM/10%FBS中で維持した COS-7を 100mm組織培養皿上に播種し、 37°Cの 5% C02インキュベーター内で 50〜70%コンフルェントになるまで生育させた。 Lipofectin 法および Opti-MEM Iを用いて細胞をトランスフエクシヨンした(Colley, K.,他、(1992) J. Biol. Chem. 267, 7784-7793) 0トランスフエクシヨンしたタンパク質の発現は典型的 には 16〜36時間持続させた。培地中の可溶性シアル酸転移酵素- FLAGタンパク質 を M2ァガロース(Sigma)を用いて沈降させた。
[0055] (4)ウェスタンブロット法
沈降させた M2ァガロースゲルを Laemmli緩衝液中にとり、 4〜20%勾配 SDS/PAGE に付し、ニトロセルロース膜に移した。プロットした膜をそれぞれの精製ポリクローナル 抗体(1:500)と一緒にインキュベートし、適当な 2次抗体、 HRP標識抗ゥサギ IgG (Cap pel)とインキュベートし、化学発光基質 (Pierce)を用いて可視化した。図 2に示される ようにこれらの抗体は可溶性分泌型シアル酸転移酵素に対して高 、反応性を示した
[0056] (5)サンドイッチ ELISA法の開発
M2抗体と STC抗体を用いてサンドイッチ ELISA法を開発した。 ELISA用のプレートに あらかじめ STC抗体(2 micro gram/ゥエル)を固相化しておき、血清(10〜20 micro lit er)をカ卩えて 37度で 1時間インキュベーションすることによりシアル酸転移酵素を選択 的にトラップする。 phosphate buffered saline (PBS)などの洗浄液で 7回洗浄する。 hor
se radish peroxidate (HRP)でラベル化した M2抗体の Fabフラグメントとともに 4度で 3 0分間インキュベーションする。 (ラベル化 Fabフラグメントはマレイミド法で HRPと結合 しゲル濾過法にて精製した。)洗浄液で 9回洗浄した後に HRPの発色基質 (TMB: Te tra Methyl Benzidineなど)をカ卩えて発色させたのち、 1規定硫酸で反応を停止する。 発色度を吸光光度計を用いて測定する。既知の濃度の α 2,6シアル酸転移酵素含 む標準試料によってあら力じめ検量線を作製しておき、これによつて定量値を算出す る(図 3)。ラット血清中の a 2,6シアル酸転移酵素( /3セクレターゼ産物)を定量する 類似の方法は既報である(特開 2003-334071号公報)。しかし、ヒトとラットでは切断部 位近傍のアミノ酸配列が異なるために従来の方法ではヒト試料の定量は困難であつ た。今回の方法によりはじめてヒト血清中の α 2,6シアル酸転移酵素量を正確に測定 することが可能となった。従来も酵素の活性量を指標として oc 2,6シアル酸転移酵素 量を推測する方法は存在したが、この方法では酵素活性を失った転移酵素の存在を 検出することができない。また、活性測定のためには放射性アイソトープでラベルされ た糖供与体 (CMP-シアル酸)を用いた煩雑な実験操作が必要であり、スクリーニング 方法として利用するのは困難である。さらに、血清中には同じ糖供与体 (CMP-シァ ル酸)を基質とする ex 2,3シアル酸転移酵素が存在し、 a 2,6シアル酸転移酵素の活 性との区別には複雑な実験操作が必要である。すなわち、本発明によって血清《2,6 シアル酸転移酵素のタンパク質量を簡便に測定することが可能となり、肝細胞癌の新 たなスクリーニング法が開発された。
[0057] (6)肝疾患患者の血清中 a 2,6シアル酸転移酵素レベルの定量
STC抗体と HRP-ラベルイ匕 M2 Fabフラグメントを用いた実施例(測定例)を示す(図 4)。正常コントロールに比べて肝硬変患者で若干の増加が認められるが、有意差は 認められない。一方、肝細胞癌発症例では有意に増加することがしめされた (p = 0.0 13)。
[0058] また、慢性肝炎患者の非活動型および活動型 (肝障害マーカーとしての ALT値の 上昇を示す症例)それぞれ 30および 36例の血清 ST6Gal I値は正常コントロールと同 程度であった。この結果は ST6Gal I値が肝障害マーカーである ALT値とは異なる動 態を示すこと、また前癌状態である肝硬変力 肝細胞癌への移行を示す有力なマー
カーになりうることを示している。
産業上の利用可能性
[0059] 本発明によれば、肝臓から血清中へ分泌される《2,6シアル酸転移酵素を特異的 かつ高感度に定量する方法が提供される。さらに本発明の肝細胞癌の診断方法によ れば、肝細胞癌の早期診断が可能となり、肝細胞癌患者の救命が期待される。
図面の簡単な説明
[0060] [図 1]図 1は、ヒト a 2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号 4)、ラッ ト ex 2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号 5)、及びマウス ex 2,6シ アル酸転移酵素のアミノ酸配列 (配列表の配列番号 6)をそれぞれ示す。 C末端側に 近 、アミノ酸配列に対する抗体 (STC抗体)およびこの配列より N末端側にあるアミノ 酸配列に対する 2種類の抗体 (Ml抗体および M2抗体)を作製した。
[図 2]図 2は、ウェスタンブロットの結果を示す。三角印示されるようにこれらの抗体は Mouse, Rat, Humanの可溶性分泌型シアル酸転移酵素に対して高い反応性を示し た。
[図 3]図 3は、本発明のサンドイッチ ELISA法を示す。 STC抗体をプレートに固相化し c apture抗体として血清中のシアル酸転移酵素を選択的にトラップした。その後ラベル 化 Fabフラグメント (M2抗体由来)を用いて定量を行った。標準試料による検量線を 右側に示した。
[図 4]図 4は肝疾患における血清 ST6Gal Iの測定値を示す。 STC抗体と HRP-ラベル 化 M2 Fabフラグメントを用いた実施例(測定例)を示す。正常コントロール (6例)に比 ベて肝硬変患者 (30例)で若干の増加が認められるが、有意差は認められない。一方 、肝細胞癌発症例 (29例)では有意に増加することがしめされた。バーにより標準偏差 を示した。
Claims
[1] ヒト (X 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser - Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr -Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を 認識することができる抗体と、ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Cys-A sp- Gin- Va卜 Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu- Pro- Ser- Lys- Arg- Lys- Thr- Asp- Val (配列 番号 3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体とを組み合わせて用いて サンドイッチ酵素免疫測定 (ELISA)法を行うことを含む、ヒト《2, 6シアル酸転移酵 素の検出方法。
[2] ( 1)ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Cys- Asp- Gin- Va卜 Asp- lie- Tyr - Glu- Phe- Leu- Pro- Ser- Lys- Arg- Lys- Thr- Asp- Val (配列番号 3)で表されるァミノ 酸配列を認識することができる抗体を固定ィ匕した固相にヒト a 2, 6シアル酸転移酵 素を含む試料を接触させて上記抗体にヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を結合させるェ 程:及び(2)上記工程(1)で結合したヒト《2, 6シアル酸転移酵素にヒト《2, 6シァ ル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu -Gly- Arg- Glu- lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg -Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を認識することが できる抗体を反応させて、結合したヒト α 2, 6シアル酸転移酵素を検出する工程を含 む、請求項 1に記載のヒト α 2, 6シアル酸転移酵素の検出方法。
[3] ヒト at 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser -Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr -Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を 認識することができる抗体。
[4] ヒト由来の試料に含まれるヒト《2, 6シアル酸転移酵素を検出又は測定することを含 む、肝細胞癌の診断方法。
[5] ヒト at 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser -Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr -Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を
認識することができる抗体を用いてヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を検出又は測定す る、請求項 4に記載の肝細胞癌の診断方法。
[6] ヒト at 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser - Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr -Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を 認識することができる抗体と、ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Cys-A sp- Gin- Va卜 Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu- Pro- Ser- Lys- Arg- Lys- Thr- Asp- Val (配列 番号 3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体とを組み合わせて用いて サンドイッチ酵素免疫測定 (ELISA)法を行うことによってヒト a 2, 6シアル酸転移酵 素を検出又は測定する、請求項 4又は 5に記載の肝細胞癌の診断方法。
[7] ( 1)ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Cys- Asp- Gin- Va卜 Asp- lie- Tyr - Glu- Phe- Leu- Pro- Ser- Lys- Arg- Lys- Thr- Asp- Val (配列番号 3)で表されるァミノ 酸配列を認識することができる抗体を固定ィ匕した固相にヒト a 2, 6シアル酸転移酵 素を含む試料を接触させて上記抗体にヒト a 2, 6シアル酸転移酵素を結合させるェ 程:及び(2)上記工程(1)で結合したヒト《2, 6シアル酸転移酵素にヒト《2, 6シァ ル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser- Ser- Gin- Leu -Gly- Arg- Glu- lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr- Glu- Lys- Arg -Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を認識することが できる抗体を反応させて、結合したヒト α 2, 6シアル酸転移酵素を検出する工程によ つてヒト α 2, 6シアル酸転移酵素を検出又は測定する、請求項 4力 6の何れかに記 載の肝細胞癌の診断方法。
[8] ヒト由来の試料が血清、血漿あるいは胆汁である、請求項 4から 7の何れかに記載の 肝細胞癌の診断方法。
[9] ヒト at 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Ser- Ser- Ala- Gly- Ser- Leu- Lys- Ser -Ser- Gin- Leu- Gly- Arg- Glu- lie (配列番号 1)、又は Asn- Ser- Gin- Leu- VaKThr- Thr -Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu (配列番号 2)で表されるアミノ酸配列を 認識することができる抗体と、ヒト α 2, 6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中の Cys-A sp- Gin- Va Asp- lie- Tyr- Glu- Phe- Leu- Pro- Ser- Lvs- Arg- Lys- Thr- Asp- Val (配列
番号 3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体とを少なくとも含む、肝細 胞癌の診断キット。
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