JP3023103B2 - ラミニンフラグメント測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なヒトラミニ
ンフラグメント量を指標とする該フラグメントの測定用
キット、及び該キットを使用する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】基底膜はコラーゲンと非コラーゲンの各
成分より成り、生体内に普遍的に存在する細胞外マトリ
ックスである。近年、肝疾患、腎疾患、ガンなど不可逆
的に進行する諸疾患と基底膜との関連が注目されてき
た。ラミニン（以下、ＬＮと略記する）は基底膜に特異
的に存在する高分子タンパク質であり、基底膜が分解作
用を受けた時に非フラグメント化ラミニン（以下、ｎＬ
Ｎと略記する）又はフラグメント化ラミニン（以下、ｆ
ＬＮと略記する）として体液中に遊離してくると考えら
れ、これら体液中のｎＬＮ又はｆＬＮを測定すること
は、疾患による基底膜分解の進展を診断する上で臨床検
査上重要であり、その簡便で迅速な測定法の確立が望ま
れている。

【０００３】最近、ペプシン分解によるｆＬＮに対する
ウサギ抗血清を用いたラジオイムノアッセイ法が開発さ
れた［Ｄ．Ｇ．ブロックス（D．G． Brocks）、クリニ
カルケミストリー（Clinical Chemistry）、第３２巻、
第７８７〜７９１頁（１９８６）］。この測定法は、あ
らかじめ放射能で標識されたペプシン分解ｆＬＮと試料
を競合的に抗ペプシン分解ｆＬＮ抗体に作用させ、約１
日反応後、抗ウサギIgG 抗体と反応させて免疫沈降物の
放射能活性を測ることにより、試料中のＬＮ量を測定す
るものである。該ラジオイムノアッセイ法はペプシン分
解によるｆＬＮに対するウサギ抗血清を用い、体液中の
ｆＬＮを抗原としていないことで特異性の点で問題があ
り、また目的抗原に対する抗体として抗血清を使用する
場合、このようにフラグメント化された抗原に対する抗
体の結合力が低下するため、正確な測定が不可能である
と考えられており、この点でも大きな問題を含んでい
た。また、尿中ＬＮの測定は、糖尿病性腎症などの病態
解析といった点で重要な臨床的意義を有しているにもか
かわらず、血中ＬＮの約１/１０以下という低い濃度で
存在しているなどの理由で、従来の測定法では十分感度
よく定量することは不可能であった。抗血清の代りに、
体液中のｆＬＮをも認識しうるモノクローナル抗体を使
用することにより上記の問題は解決されうるが、対象抗
原となりうる体液中のｆＬＮ分子の構造は特定されてお
らず、体液中のｆＬＮを測定するために、該ｆＬＮの特
定が必要であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
体液中のｆＬＮを特定し、このｆＬＮを特異的に、高感
度に測定する測定用キット、及びｆＬＮ量の測定による
疾病の検出方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は下記の性質を有するヒトラミニンフ
ラグメントを測定するキットにおいて、下記の性質を有
するヒトラミニンフラグメントを認識するが、抗原認識
部位を異にする一対のモノクローナル抗体を含有するこ
とを特徴とするヒトラミニンフラグメント測定用キット
に関する。 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミトゲル電気泳動法によ
る分子量が、約４．２万である。 （２）Ｎ末端アミノ酸残基が下記式Ｉで表される。 A１a−Met−Asp−G１u−Ｘ−Thr−Asp−G１u−G１y −G１y−Arg−Pro−G１n−Arg−Ｘ−Met…（Ｉ） （式中、Ｘは未同定アミノ酸残基を示す） また、本発明の第２の発明は、上記第１の発明のキット
を使用する方法において、第１の発明における性質を有
するヒトラミニンフラグメント量を第１の発明のキット
を用いて測定し、その値を正常値と比較測定することを
特徴とする悪性腫瘍、肝臓疾患、腎臓疾患、及び動脈硬
化症の検出方法に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本発明のヒトｆＬＮは、例えば、健常人尿中より、
例えば抗ヒトｎＬＮポリクローナル抗体カラム、イオン
交換樹脂カラム等を用い、精製することができる。精製
ヒトｆＬＮは、例えば１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により、分子量約４．２万のバンドとし
て検出され、ヒトｎＬＮ（分子量約８０万）と比較し、
極めて低分子化されている。該ヒトｆＬＮはそのＮ末端
に前記式（Ｉ）のアミノ酸配列を有し、この配列はヒト
ｎＬＮのアミノ酸配列〔Ｔ．ピッカライネン（ T． Pik
karainen）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリー（ J．Biol． Chem．）、第２６３巻、第６
７５１頁 （１９８８）〕の、Ｂ２鎖のＮ末端部から
３〜１８番目のアミノ酸配列と一致する。すなわち、該
ｆＬＮはヒトｎＬＮのＢ２鎖のドメインＶ及びＶＩより
構成されると同定され、ヒト体液中より初めて単離・同
定されたヒトｆＬＮである。

【０００７】本発明のヒトｆＬＮの測定方法としては、
例えばＨＰＬＣを用いる方法、免疫学的方法等がある
が、該ヒトｆＬＮに対する特異的抗体を用いる免疫学的
方法により、容易かつ、高感度に試料中のヒトｆＬＮを
測定することができる。なお、本発明において、試料と
はヒト体液、例えば血清や尿を指す。

【０００８】本発明のヒトｆＬＮに対する特異的抗体と
は、該ヒトｆＬＮに対するポリクローナル抗体でも良い
が、感度、操作性等の点から、該ヒトｆＬＮを認識し、
かつ抗原認識部位を異にする一対のモノクローナル抗体
を用いるのが好ましい。該モノクローナル抗体として
は、例えば本発明者らが作成したモノクローナル抗体Ｈ
ＬＮ５及びＨＬＮ８２があり、該一対の抗体を用い、例
えばエンザイム イムノアッセイ法により、試料中のヒ
トｆＬＮを感度よく測定することができる。例えば悪性
腫瘍、肝臓疾患、腎臓疾患、動脈硬化などの患者の尿中
のｆＬＮを測定すれば、その尿中ｆＬＮ値は健常人と比
べ高値を示し、これらの疾患の診断が、尿試料を用い簡
便に行うことができる。また血清試料を用いても、これ
らの疾患を感度よく検出できる。

【０００９】本発明のヒトｆＬＮに対する特異抗体は、
例えばヒトｎＬＮを抗原として調製でき、該抗体を得る
ためのヒトｎＬＮは、例えばヒト胎盤から、それ自体公
知の方法により、例えば塩沈殿、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法
を単独で又は組合せて用いて分離精製することにより取
得することができる〔ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー、第２５８巻、第１２６５４〜１２６
６０頁（１９８３）〕。また、ヒトｆＬＮは例えば上記
の方法によって取得したヒトｎＬＮを、それ自体公知の
方法により、例えばペプシン、トリプシン、スロンビ
ン、プラスミン、キモトリプシン等のプロテアーゼを単
独で又は組合せて用いて限定分解又は完全分解し、種々
の分離方法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を
用いて分離精製することにより取得し、抗体調製用の抗
原として用いることもできる。

【００１０】また本発明のヒトｆＬＮは、例えば肺ガ
ン、胃ガン、結腸ガン、乳ガン、膵ガンなどの悪性腫瘍
患者、腎疾患々者、動脈硬化患者又は肝疾患々者の血清
又は尿を原料として精製、回収することも可能である。
更に、近年ヒトＬＮの一部アミノ酸配列が決定されたこ
とにより本発明のヒトｆＬＮのアミノ酸配列を有する合
成ペプチドも用いられる。

【００１１】本発明のヒトｆＬＮに対する特異抗体は、
例えば、上記の患者の尿中より精製した本発明のヒトｆ
ＬＮを抗原として、ヒト以外のホ乳動物、例えば、モル
モット、ウサギ、ラット、マウス、ヤギなどの抗体産生
能のある動物を用い通常の方法に従って免疫した後、採
血して抗血清を得、更に抗体を分離する。抗体を得るに
当っては例えば本発明のヒトｆＬＮ０．１〜１mgを生理
食塩水０．１〜５ｍｌに溶解し、これに同量の完全フロ
イント・アジュバントを加え、充分乳化した後、用いる
ホ乳動物、例えばウサギやマウス等の皮下又は皮内に注
射し、１〜３週間ごとに数回注射して免疫させる。その
後、最終免疫の日より一定期間後、採血し本発明のヒト
ｆＬＮに対する抗体を含有する抗血清を得る。

【００１２】またこの場合に用いる動物としては、抗体
生産能のある動物であればいずれを用いてもよく、大量
の抗体を得るには大型動物を用いるのが好ましく、通常
はウサギ、ヤギを用いるが、何ら限定されるものではな
い。更にこれらの動物から得られた抗ヒトｆＬＮ抗体を
含有する抗血清から抗ヒトｆＬＮ抗体を得るには通常用
いられる抗体の精製手段の方法によって、行えるもので
例えば、抗血清を硫安分画し、次いでイオン交換クロマ
トグラフィー、あるいはゲルろ過によって精製採取すれ
ば良い。更に高純度に精製するにはヒトｆＬＮを固定化
した不溶化担体を基材として用いるアフィニティークロ
マトグラフィーにて吸着し、次いで溶出を行って得れば
よい。更に別法としては本発明のヒトｆＬＮを抗原とし
て免疫させたヒト以外のホ乳動物の脾細胞とミエローマ
細胞とを用いて融合させ、この融合細胞から本発明のヒ
トｆＬＮに対するモノクローナル抗体産生細胞を分離
し、この融合細胞を用いる抗ヒトｆＬＮモノクローナル
抗体を製造する方法があり、特にホ乳動物としてマウス
を用いる方法がよく利用されている〔ネーチャー（Natu
re）、第２５６巻、第４９５頁（ １９７５）〕。以上
のようにしてヒトＬＮに対するドメイン特異抗体が得ら
れる。

【００１３】一方上記のヒトｎＬＮを抗原として本発明
のヒトｆＬＮに対するモノクローナル抗体を得ることも
できる。すなわちヒトｎＬＮを抗原として免疫をしたヒ
ト以外のホ乳動物の脾細胞とミエローマ細胞とを用いて
融合させ、この融合細胞から本発明のヒトｆＬＮに対す
るモノクローナル抗体を生産するクローンを分離する。
このようにして得られるモノクローナル抗体は本発明の
ヒトｆＬＮと反応するモノクローナル抗体である。動物
としてはマウスがよく用いられる。

【００１４】以上のようにして得られた本発明のヒトｆ
ＬＮに対するモノクローナル抗体は、抗原認識部位を異
にする抗体を組合せて用いることにより本発明のヒトｆ
ＬＮを効果的に検出することができる。なお、本発明の
ヒトｆＬＮの測定に用いる該ｆＬＮ特異的抗体として
は、前述のように抗血清のようなポリクローナル抗体、
あるいはモノクローナル抗体のいずれでも差支えない
が、その特異性及び親和性の高さという点において、特
にモノクローナル抗体を使用することが望ましい。

【００１５】本発明のヒトｆＬＮに対するモノクローナ
ル抗体を用いた測定法としては、従来この分野でよく知
られた免疫測定法すなわち、酵素免疫測定法、ラジオイ
ムノアッセイ免疫比濁法、ラテックス凝集法、赤血球凝
集法、ＳＲＩＤ法（免疫拡散法）等が用いられる。中で
も酵素免疫測定法が、感度、簡便さ等において最も実用
的である。すなわち抗ヒトｆＬＮモノクローナル抗体を
ポリスチレンビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンマイ
クロタイタープレートなどの不溶性担体で処理して、こ
れらの担体に共有結合又は物理的に吸着させて抗ヒトｆ
ＬＮモノクローナル抗体の結合した不溶性抗体を得る。
一方で抗ヒトｆＬＮモノクローナル抗体に従来公知の方
法を用いて酵素標識を行う。例えば、使用する酵素に最
適な化合物（例えばβ−ガラクトシダーゼに対しｍ−マ
レイミドエステル、ペルオキシダーゼに対し過ヨウ素
酸）、次いで抗体をこの反応物に結合させて酵素標識抗
ヒトｆＬＮモノクローナル抗体を得る。

【００１６】このようにして得られた、抗ヒトｆＬＮモ
ノクローナル抗体結合担体（不溶性抗体）と酵素標識抗
ヒトｆＬＮモノクローナル抗体（標識抗体）を用い、血
中及び尿中のヒトｆＬＮ量を測定したところ、健常人に
比べ悪性腫瘍患者、腎疾患々者、動脈硬化症患者、肝疾
患々者の血中及び尿中では、本発明のヒトｆＬＮの濃度
が上昇することが判明し、該ｆＬＮの測定が、これらの
疾患の診断に有用であることが示された。本発明のヒト
ｆＬＮ量の測定に用いる抗ヒトｆＬＮ抗体をキットとし
ておくことで、試料中の本発明のヒトｆＬＮ量を簡便に
測定することができる。キットに用いる試薬は溶液状で
も良いし、凍結乾燥品等でも良い。

【００１７】

【実施例】以下に実施例を示し本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。 参考例１ （１）ヒトｎＬＮ抗原の単離 ヒトｎＬＮ抗原の抽出のために、ヒト胎盤を０．５Ｍ
NaClを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．２）中
でホモジナイズし、遠心分離により不溶化物を除いたの
ちに、終濃度４ＭとなるようにNaClを添加して、その際
に生じる沈殿画分を集める。集めた沈殿を０．５Ｍ Na
Clを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（pH７．２）に
可溶化したものを、同緩衝液にて平衡化させたＣＬ−６
Ｂセファロースカラムにて分画し、最初のピークに溶出
されてくるフラクションをヒトｎＬＮ標品として集め
た。

【００１８】（２）ヒトｎＬＮ抗原に対するポリクロー
ナル抗体の作製 上記（１）で得られた精製ヒトｎＬＮ抗原０．５mgを生
理食塩水０．５ｍｌに溶解し、これに等量の完全フロイ
ント・アジュバントを加え、乳化させた後ウサギ皮下に
注射した。２週間置きに、同量の抗原を不完全フロイン
ト・アジュバントと乳化させたものを４回皮下注射し、
最終免疫より１０日後にその全血を採取し、６０分間室
温で放置した後、遠心分離することにより抗ヒトｎＬＮ
抗体を含有する抗血清を得た。本抗血清から常法により
プロティンＡカラムにより抗ヒトｎＬＮポリクローナル
抗体を精製した。

【００１９】実施例１ （１）尿中ヒトｆＬＮの精製・同定 上記参考例１−（２）にて得られた抗ヒトｎＬＮポリク
ローナル抗体を常法によりＣＮＢｒ活性化セファロース
（ファルマシア社製）に吸着させて、健常人尿５リット
ルをそのカラムに流し、吸着画分を８Ｍ尿素を含むＰＢ
Ｓにて溶出した。カラムより溶出された粗ヒト尿ｆＬＮ
画分をMono−Ｑイオン交換カラム（ファルマシア社製）
により分画して、精製ヒト尿ｆＬＮを得た。１０％ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製ヒト尿
ｆＬＮを分離したところ、分子量４２,０００付近に単
一バンドとして観察され、目的のヒト尿中ｆＬＮがヒト
ｎＬＮ（分子量８００,０００）と比較して、極めて低
分子フラグメント化されていることが確認された。この
ヒト尿中ｆＬＮのＮ末端アミノ酸シークエンス解析を行
ったところ、前記式（Ｉ）の配列が検出され、ヒトＬＮ
Ｂ２鎖のアミノ酸シークエンス〔Ｔ．ピッカライネン
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２６３巻、第６７５１頁（１９８８）〕のうちＮ
末端部より３−１８番目の配列と完全に合致したことか
ら、ヒト尿中ｆＬＮがヒトＬＮＢ２鎖 Ｎ末端由来の分
子量４２,０００のポリペプチド （ドメインＶ及びＶ
Ｉ）により構成されていることが確認された。

【００２０】実施例２ （１）ヒトｆＬＮに対するモノクローナル抗体の作製 参考例１−（１）で得たヒトｎＬＮ５０μｇを生理食塩
水０．１ｍｌに溶解し等量の完全フロイント・アジュバ
ントを加え乳化させ、Balb／cマウスの腹腔内に注射し
た。４週間後に抗原５０μｇのみを同マウスの腹腔内に
注射した。その３日後にマウスより摘出した脾臓より、
脾臓細胞を得、マウスミエロ−マ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ８−Ｕ１）と細胞数１０：１の比で混合し、５０％
ポリエチレングリコ−ル及び２０％ジメチルスルホキシ
ドの存在下で１分間放置し、細胞融合を行った。無血清
DMEM培地を加え希釈したのち、遠心分離によりその上清
を除き、１０％牛胎児血清含有DMEM培地にて細胞を懸濁
し、９６穴マイクロタイタープレートに１穴当り２×１
０⁴細胞となるように分注した。その後１〜３日ごとに
培地の半分量をＨＡＴ培地で交換し、１０〜２０日後に
融合細胞（ハイブリドーマ）の生育してきたウエルの培
養上清を採取し、抗体産生の有無をELISA法等により調
べ、ヒトnＬＮに対する抗体を産生しているハイブリド
ーマを５株選択した。以上５株のハイブリドーマのう
ち、実施例１−（１）にて得られたヒト尿中ｆＬＮに反
応性を有する抗体を産生するものを３株選択した。これ
らのハイブリドーマについて限界希釈法により２回クロ
−ニングを行い、最も力価の高い抗体を産生するハイブ
リドーマのクローンとして、クローン株ＨＬＮ５及びＨ
ＬＮ８２の２株を取得した。前記クローン株は、各々Hy
bridoma ＨＬＮ５と表示し微工研菌寄第１１７２７号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１１７２７）〔受託日：平成２年９月
１１日〕、HybridomaＨＬＮ８２と表示し微工研菌寄第
１０７９９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０７９９）〔受託日：
平成元年６月３０日〕として、工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。この２株のハイブリドーマ
が産生するモノクローナル抗体が同一フラグメント特異
性を有することを確認するために、ウェスタンブロッテ
ィングにより、実施例１−（１）にて得られたヒト尿中
ｆＬＮに両者が反応し、かつ抗原認識部位を異にするこ
とを確めた。これらのモノクローナル抗体を大量に得る
ために、Balb／cマウス腹腔内に約２×１０⁷個のハイブ
リド−マを注射し、腹水腫瘍を作らせ、１０日後に腹水
を採取し、抗ヒトｆＬＮモノクローナル抗体ＨＬＮ５及
びＨＬＮ８２を取得した。

【００２１】（２）抗ヒトｆＬＮモノクローナル抗体結
合ビーズの作製 上記（１）で得た抗ヒトｆＬＮモノクローナル抗体ＨＬ
Ｎ８２の１mgを含有する０．１Ｍ リン酸バッファー
（pH８．０）２０ｍｌにポリスチレンボール（積水化学
社製、粒径６．３５mm）１００粒を加え、５℃で１６時
間、３７℃で１時間反応させ、抗体をビーズに固定化さ
せた。ビーズは生理食塩水で充分洗浄後、１％牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％アジ化ナトリウム、
０．９％ NaCl を含む１０mM リン酸バッファー（pH
７．４）に浸漬し、５℃で一晩放置し、抗ヒトｆＬＮモ
ノクローナル抗体結合ビーズを得た。

【００２２】（３）抗ヒトｆＬＮモノクローナル抗体酵
素標識物の作成 上記（１）で得られた抗ヒトｆＬＮモノクローナル抗体
ＨＬＮ５にペルオキシダーゼ（ベーリンガー−マンハイ
ム社製）をナカネ（Nakane）らの方法〔ジャーナルオブ
ヒストケミストリーアンド シトケミストリー（ J．
Histochem．Cytochem．）第２２巻、第１０８４頁（１
９７４）〕によって結合させ、標識抗体を得た。すなわ
ち１０mgのペルオキシダーゼを２ｍｌの精製水に溶か
し、０．１Ｍ 過ヨウ素酸カリウムを０．２ｍｌ加え
る。室温で２０分反応させた後１mM酢酸バッファー（pH
４．０）に対し４℃で一晩透析する。これに０．２Ｍ炭
酸バッファー（pH９．５）を加えpHを９〜９．５に調整
する。一方、抗ヒトｆＬＮモノクローナル抗体２mgを
１．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（pH７．４）に溶か
し、１０mM 炭酸バッファー（pH９．５）に対し、一晩
４℃で透析しておき、これを上記の過ヨウ素酸処理した
ペルオキシダーゼと混合し、室温で２時間反応させた
後、水素化ホウ素ナトリウム（４mg／ｍｌ）を０．１ｍ
ｌ添加し、４℃で２時間反応後、リン酸緩衝生理食塩水
（pH７．４）で平衡化したウルトロゲル AcA２２（ＬＫ
Ｂ社製）を用いゲルろ過により分画した。ペルオキシダ
ーゼ活性と抗体活性の一致する画分を集め、メルチオレ
ートナトリウムを終濃度０．０１％となるように添加
し、４℃で保存した。

【００２３】実施例３ （１）ヒトｆＬＮの測定 ＥＩＡ法は以下のようにして行った。試料 ２００μｌ
をチューブに入れ、不溶化抗体ビーズをチューブの中に
１つずつ入れ３７℃で１時間第１インキュベーションを
行う。次にビーズを、３ｍｌの生理食塩水で３回洗い、
標識抗体液（３００倍希釈）２００μｌをビーズの入っ
たチューブに入れ、３７℃で１時間第２インキュベーシ
ョンを行う。次にビーズを３ｍｌの生理食塩水で３回洗
い、ビーズを別のチューブに移し、これに発色試薬３０
０μＩ（ｏ−フェニレンジアミン１mg／ｍｌ、H₂O₂の
０．０１％、０．１Ｍ クエン酸バッファー pH５．０
に溶解したもの）を加え、３７℃で３０分間反応させ、
１Ｎ H₂SO₄の１ｍｌを加え反応を停止させた。波長４９
２nmの吸光度を測定した。このような手順で、悪性腫瘍
１９例、肝臓疾患２７例、腎臓疾患１０例、動脈硬化症
９例、及び健常人１８例の血清中、及び悪性腫瘍３２
例、肝臓疾患１６例、腎臓疾患１４例、動脈硬化症１３
例、及び健常人２１例の尿中のヒトｆＬＮ量を測定し
た。尿は同時にクレアチニン量を市販のキット（クレア
チニンテストワコー：和光純薬工業社製）を用いて測定
して、尿量を補正するために、クレアチニン量に対する
ｆＬＮの量の比（ｆＬＮμｇ／ｇ・Cr）で表した。図１
は各種患者と健常人とで血清中ヒトｆＬＮの分布を比較
したグラフであり、図２は各種患者と健常人とで尿中ヒ
トｆＬＮ量の分布を比較したグラフである。この結果、
モノクローナル抗体ＨＬＮ５とＨＬＮ８２の組合せにお
いて、尿、血清中のヒトｆＬＮが測定でき各種患者の血
清中及び尿中ヒトｆＬＮ量は健常人に比べ明らかに高い
値を示し、疾患診断において本測定が有用であることが
示された。

【００２４】実施例４ （１）キットの作成 ＥＩＡキット（１回分）の組成を以下に示す。 １．抗体固相化ビーズ １個 〔工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されているハイブリドーマ微工研菌 寄第１０７９９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０７９９）が産生するモノクローナル抗体 ＨＬＮ８２が固相化されたビーズ〕 ２．ペルオキシダーゼ標識抗体 ０．３ｍｌ 〔工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されているハイブリドーマ微工研菌 寄第１１７２７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１７２７）が産生するモノクローナル抗体 ＨＬＮ５をペルオキシダーゼにより標識した〕 ３．発色試薬 ０．３ｍｌ （ｏ−フェニレンジアミンHCl の１０mg／ｍｌ、過酸化水素０．０１％を含む クエン酸緩衝液 pH ５．０） ４．反応停止液（１Ｎ硫酸） １．０ｍｌ ５． 標準品（本発明のヒトｆＬＮを４、２、１、０．５μｇ／ｍｌ含む１％Ｂ ＳＡ／ＴＢＳ）

【００２５】

【発明の効果】以上詳細に説明した通り、本発明により
生体試料中のＬＮ測定試薬が提供された。本発明の測定
試薬により新規な悪性腫瘍、肝、腎、動脈硬化疾患の診
断が可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】各種患者と健常人とで血清中ヒトｆＬＮの分布
を比較したグラフ。

【図２】各種患者と健常人とで尿中ヒトｆＬＮの分布を
比較したグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社 中央研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/577 C07K 14/78 C07K 16/18 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の性質を有するヒトラミニンフラグ
   メントを測定するキットにおいて、下記の性質を有する
   ヒトラミニンフラグメントを認識するが、抗原認識部位
   を異にする一対のモノクローナル抗体を含有することを
   特徴とするヒトラミニンフラグメント測定用キット。 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
   る分子量が、約４．２万である。 （２）Ｎ末端アミノ酸残基が下記式Ｉで表される。 A１a−Met−Asp−G１u−Ｘ−Thr−Asp−G１u−G１y −G１y−Arg−Pro−G１n−Arg−Ｘ−Met・・・（Ｉ） （式中、Ｘは未同定アミノ酸残基を示す）
2. 【請求項２】 請求項１記載のキットを使用する方法に
   おいて、請求項１記載の性質を有するヒトラミニンフラ
   グメント量を請求項１記載のキットを用いて測定し、そ
   の値を正常値と比較測定することを特徴とする悪性腫
   瘍、肝臓疾患、腎臓疾患、及び動脈硬化症の検出方法。