JPH1082784A - 血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体の測定法および測定キット - Google Patents
血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体の測定法および測定キットInfo
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- JPH1082784A JPH1082784A JP20545897A JP20545897A JPH1082784A JP H1082784 A JPH1082784 A JP H1082784A JP 20545897 A JP20545897 A JP 20545897A JP 20545897 A JP20545897 A JP 20545897A JP H1082784 A JPH1082784 A JP H1082784A
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Abstract
−ヒアルロン酸結合体(SHAP−HA結合体)濃度を
簡易に測定する方法およびその方法に使用する測定キッ
トの提供。 【解決手段】 検体中のSHAP−HA結合体を抗イン
ター−α−トリプシンインヒビター(抗ITI)抗体を
使用して抗ITI抗体−(SHAP−HA結合体)の複
合体を形成し、その含量を測定することによって定量す
る方法。抗ITI抗体を含む測定キット。固相体に固着
されたヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質に、S
HAP−HA結合体を結合させ、そこに抗ITI抗体を
反応させて、抗ITI抗体−(SHAP−HA結合体)
−(ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質)−固相
体の複合体を形成し、その含量を測定することによって
SHAP−HA結合体を定量する方法及び測定キット。
検体として血液、血清または血漿を用いることによりS
HAP−HA結合体濃度を測定し、リウマチ性関節炎、
肝疾患等の診断に用いることができる。
Description
ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体
を、抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体(抗
ITI抗体)を用いて測定する方法、この方法を行うた
めの測定キット、この方法を用いて関節炎または肝疾患
を診断する方法およびこの診断に使用するための診断用
キットに関する。
は軟骨、関節腔の滑液、臍帯、血清、尿、眼の硝子体等
の全身組織に広く分布し、組織構築の安定化や関節の円
滑な運動性の維持に寄与している。健常人の関節液中の
ヒアルロン酸はほぼ単独で存在しているが、変形性関節
炎やリウマチ性関節炎などの炎症性疾患患部の関節液中
にはある種のタンパク質と結合した形態で存在してい
る。また、ウシ血清から従来知られているものとは異な
る性質を示すヒアルロン酸結合性タンパク質が単離さ
れ、このタンパク質は血清由来ヒアルロナン結合性タン
パク質(SHAP; Serum-derived hyaluronan associated
protein)と命名された(J.Biol.Chem., 265, 5247-5257
(1990)) 。また、ヒト血清由来ヒアルロナン結合性タン
パク質−ヒアルロン酸(SHAP−HA; Serum-deriv
ed hyaluronan associated protein−hyaluronic acid)
結合体は関節炎患者の関節液より分離精製され、非還元
条件下のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により分子量約 85kDaと約 83kDaの2本
の主バンドを示し、各バンドのプロテアーゼV8処理に
よって得られるペプチドフラグメントの一次構造が明ら
かにされた(特開平7-157500号公報)。
SHAPがヒトインター−α−トリプシンインヒビター
(ITI:Inter-α-Trypsin Inhibitor)の長鎖 HC1と
HC2に相当することが明らかとなった(J.Biol.Chem.,
268, 26725-26730 (1993))。さらに、SHAP−HA結
合体をプロテアーゼとコンドロイチナーゼACIIで分解
して得られた結合部分のマススペクトリー解析により、
C末端アスパラギン酸残基のαカルボキシル基にヒアル
ロン酸のN−アセチルグルコサミン残基の6位水酸基が
エステル結合していることが明らかにされた(J.Biol.C
hem., 270, 26657-26663 (1995))。また、ヒト関節液由
来のSHAPに対する抗体を作成し、この抗SHAP抗
体とプロテオグリカン由来のヒアルロン酸結合性タンパ
ク質とを用いたELISA系による測定法で関節液中の
SHAP−HA結合体を定量することにより関節炎の診
断ができることが報告されている(特開平7ー157500号公
報) 。しかし、従来の測定法では抗SHAP抗体の作成
のために抗原であるSHAPのヒト関節液からの分離精
製が必要であり、原料としてヒト関節液の確保が容易で
ない点、また、SHAP−HA結合体測定の対象が関節
液であり、関節液の採取の際に患者に苦痛を与えること
等多くの欠点があった。
てヒアルロン酸量が増加することが知られており(Laur
ent AE, Loof L, Nyberg A, et al,Hepatology, 5, 638
-642,1985)、血中ヒアルロン酸量を固相に結合させた
ヒアルロン酸結合タンパク質(HABP)に結合させた
後、更に標識したHABPを加えてヒアルロン酸に結合
した標識HABP量からヒアルロン酸量を測定すること
により肝疾患を診断する方法が知られているが、ヒアル
ロン酸が低分子化され、HABPとの結合部位を複数カ
所有さない場合には、検体中のヒアルロン酸量を検出す
ることができず、正確な診断は不可能であった。
Iが豊富に存在する(健常人で約0.4mg/ml) ことから抗
原確保が容易であること、およびITIとSHAPとに
共通構造が存在することから抗ITI抗体がSHAPと
反応することに着目してなされたものである。すなわ
ち、本発明の目的は、患者からの試料採取が容易な血液
を測定対象として、この試料中のSHAP−HA結合体
を、抗ITI抗体を用いてより正確に測定する方法を提
供するものである。また、本発明の他の目的は、この測
定系を利用して関節炎または肝疾患を診断する方法およ
び診断用キットを提供することである。
結合体として存在するSHAPが抗ITI抗体と反応す
ること、および上記結合体中のHAがヒアルロン酸と結
合能を有するタンパク質、特にCD44等のヒアルロン
酸受容体あるいはヒアルロン酸結合性タンパク質と反応
することを利用して、SHAP−HA結合体を測定する
ことができること、および血液中にSHAPとHAとの
結合体が存在することを見出した。また、変形性膝関節
炎とリウマチ性膝関節炎とを鑑別する方法として関節液
中のSHAP−HA結合体を測定する方法が報告(特開
平7-157500号公報)されているが、本発明者らは血液中
の該結合体を測定することにより簡便にこれら関節炎を
識別できることを明らかにした。また、肝疾患患者にお
いても血液中のSHAP−HA複合体量が大きく増加す
ることを見出し、上記リウマチ性膝関節症の他に肝疾患
の診断を行うことが可能であることを明らかにした。
HA結合体を、抗ITI抗体と反応させて抗ITI抗体
−(SHAP−HA結合体)の複合体を形成させること
によって検体中のSHAP−HA結合体を測定する方
法、この測定方法を用いて関節炎または肝疾患を診断す
る方法およびこれらの診断に使用する診断用キットに関
する。本発明の測定方法は、好ましくは、SHAP−H
A結合体を含む検体を、固相体に固着されたヒアルロン
酸と結合能を有するタンパク質、好ましくはCD44あ
るいはヒアルロン酸結合性タンパク質と接触させ、つい
で標識物質で標識されたまたは標識され得る抗ITI抗
体とを接触させることにより、標識された抗ITI抗体
−(SHAP−HA結合体)−(ヒアルロン酸と結合能
を有するタンパク質)−固相体からなる複合体を形成さ
せ、該複合体を複合体を形成しなかった未反応の抗IT
I抗体から分離し、該複合体中の標識物質または未反応
の標識物質を検出することにより検体中のSHAP−H
A結合体を測定することを特徴とする。
−HA結合体との複合体を形成させることによりSHA
P−HA結合体を測定する方法に使用するキットであっ
て、構成成分として抗ITI抗体を含むことを特徴とす
るSHAP−HA結合体測定用キットに関する。好まし
くは、本発明のSHAP−HA結合体測定用キットは、
抗ITI抗体とヒアルロン酸と結合能を有するタンパク
質、好ましくはCD44あるいはヒアルロン酸結合性タ
ンパク質とから構成され、かつ抗ITI抗体、ヒアルロ
ン酸と結合能を有するタンパク質のいずれかが、標識物
質で標識されたもしくは標識され得るものであり、さら
に好ましくは、主としてヒアルロン酸と結合能を有する
タンパク質が固着された固相体と抗ITI抗体と標識物
質で標識された抗イムノグロブリン抗体から構成される
ものである。
関節炎、肝疾患等を診断する方法に関する。
HC1およびHC2 の一方もしくは両方と反応するポリクロ
ーナル抗体またはモノクローナル抗体等である。また、
本発明でいうヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質
とはヒアルロン酸結合性タンパク質およびヒアルロン酸
受容体から選択される少なくとも1種のタンパク質であ
る。ヒアルロン酸結合タンパク質とは、後述するよう
に、ヒアルロン酸結合性プロテオグリカン、ヒアルロン
酸結合性プロテオグリカンのコアタンパク質、リンクプ
ロテイン、ヒアルロネクチン、それらのヒアルロン酸結
合領域を含む部分タンパク質等である。一方、ヒアルロ
ン酸受容体とは、CD44、CD44のヒアルロン酸結
合領域を含む部分タンパク質またはそれらの融合タンパ
ク質も含まれる。また、Turleyらが報告しているRHA
MM(Receptor for hyaluronan-mediated motility)、
RHAMMのヒアルロン酸結合領域を含む部分タンパク
質またはそれらの融合タンパク質もヒアルロン酸受容体
に含まれる。
のSHAP−HA結合体との複合体を形成させる工程を
含むことを特徴とする。ITIは寒天ゲル電気泳動にお
いて、α1とα2グロブリン領域の中間に泳動され、ト
リプシン阻害活性を有することで定義されている。ヒト
ITIは正常血清中に約0.4mg/mlの濃度で存在し、分子
量23万の複合体で、3種類の異なるペプチド鎖、 HC1、
HC2およびHI−30からなる。HC1 とHC2 とはそれぞれ
80kDa と85kDa の分子量を持ち、分子量の大きさから長
鎖と呼ばれる。一方、45〜55kDaの分子量を示すHI−3
0は短鎖と呼ばれ、2個の Kunitz 型トリプシンインヒ
ビタードメインからなり、プロテアーゼ阻害活性能はこ
れに起因する。この2個のKunitz型ドメインよりHI−
30をビクニン(bikunin)とも呼ぶ。ビクニンのN末端か
ら10番目のセリン残基にはコンドロイチン−4−硫酸が
結合し、このペプチド鎖はプロテオグリカンでもある。
また、米田らはウシ胎児血清中にヒアルロン酸と強く結
合する 85kDaおよび83kDa のペプチド鎖から成るタンパ
ク質を発見し、これをSHAP(Serum Derived Hyaluro
nan Associated Protein) と命名した(J.Biol.Chem.,
265, 5247-5257 (1990))。その後の研究によりSHAP
のペプチド鎖はITIの長鎖と同一で(J.Biol.Chem.,
268, 26725-26730 (1993))、ヒアルロン酸と共有結合し
ていることが明らかにされた(J.Biol.Chem., 270, 266
57-26663 (1995))。
すべきSHAP−HA結合体がヒト由来のものであると
きは、ヒトSHAP−HA結合体を構成するSHAP、
すなわちヒトITIの長鎖であるHC1 およびHC2 の一方
または両方と反応するものであればよく、市販の抗ヒト
ITI抗体(バイオピュア社、ダコ社、バインディング
サイト社等)、市販のヒトITI(バイオピュア社)を
ウサギ等に免疫して得られるポリクローナル抗体あるい
はマウス、ラット、ハムスター等に免役して得られるモ
ノクローナル抗体でもよい。また、HAとの結合体とし
て得られたSHAPを免疫して得られるポリクローナル
抗体あるいはモノクローナル抗体でもよい。また、ヒト
以外の動物由来ITIあるいはSHAPを抗原として
も、得られた抗体がヒトITIの長鎖を認識する抗体で
あれば本発明の抗ITI抗体として使用できる。前述の
市販の抗ヒトITI抗体は入手が容易であるので好まし
い。
しては、CD44、CD44のヒアルロン酸結合領域を
含む部分タンパク質あるいはそれらの融合タンパク質が
挙げられる。また、RHAMM(Receptor for hyaluro
nan-mediated motility)と呼ばれる膜タンパク質(Bioch
em. Biophys. Res. Commun. 108, 1016-1024 (1982))お
よびRHAMMのヒアルロン酸結合領域を含む部分タン
パク質あるいはそれらの融合タンパク質もヒアルロン酸
受容体として例示できる。
ルロン酸をリガンドとする接着分子であること、抗CD
44抗体との反応性等により定義されている。CD44
は細胞膜貫通型のタンパク質であり、多数の異性体(ア
イソフォーム)が存在することが知られている。例え
ば、ヒトの標準型のCD44(CD44H)は、248 ア
ミノ酸残基からなる細胞外領域、21アミノ酸残基からな
る膜貫通領域および72アミノ酸残基からなる細胞質内
領域からなり、分子量は85〜90kDa であることが知られ
ている。CD44の細胞外領域は、アミノ末端側に軟骨
プロテオグリカンコアタンパク質とリンクプロテインに
相同性(例えば、CD44Hの場合、約30%の相同性)
のあるヒアルロン酸結合領域(例えばCD44Hの場
合、アミノ末端から12〜101 番目のアミノ酸残基からな
る領域等)(以下、「CD44のヒアルロン酸結合領
域」という。)が存在し、さらにカルボキシル末端側の
膜近位領域にコンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸等のグ
リコサミノグリカンあるいはそのオリゴ糖が結合したも
のも知られている。CD44は、細胞と細胞、細胞と細
胞間基質(ヒアルロン酸、コラーゲンI型、コラーゲン
IV型、フィブロネクチン)等の接着を司る分子であり、
白血球全般、繊維芽細胞、上皮細胞等の細胞膜上に発現
していることが知られている。CD44は、フィブロネ
クチン、コラーゲンI型およびコラーゲンIV型のレセプ
ター機能、癌転移への関与等多様の機能を有し、その一
つとしてヒアルロン酸のレセプターとしての機能を有す
る。
rmes抗原、gp90HERMES、H−CAM、ln(Lu)-related a
ntigen、 Hutch-1、ln(Lu)-related p80、p80A3D8 およ
びp85等とも呼ばれている(Cell,61,1303-1313 (199
0)、J. Exp. Med., 172, 69-75(1990)、細胞工学別冊・
ハンドブックシリーズ「接着分子ハンドブック」、第29
8-3076頁、1994年発行)。
D44をコードするcDNAが知られており、遺伝子工
学的手法によって得られたCD44の細胞外領域のアミ
ノ末端とヒトIgG1のFcフラグメント(すなわちヒ
ンジ部、不変部のCH2 部分およびCH3 部分)のカルボキ
シル末端とが結合した融合タンパク質が知られている
(Cell,61,1303-1313(1990))。
酸との結合能を有し、CD44のヒアルロン酸結合領域
を有するものであれば特に限定されないが、例えば標準
型CD44(CD44H)、CD44変異分子(CD4
4V)、CD44E、可溶性CD44等が挙げられる。
また、CD44のヒアルロン酸結合領域を含むCD44
の部分タンパク質(例えば、CD44の細胞外領域全体
もしくはその一部分等)、またはCD44、CD44の
部分タンパク質もしくはCD44のヒアルロン酸結合領
域のアミノ酸配列を有するタンパク質と免疫グロブリ
ン、グルタチオンS−トランスフェラーゼ等のタンパク
質を結合させた融合タンパク質等が挙げられる。好まし
い融合タンパク質としては、例えば、CD44の細胞外
領域のカルボキシル末端と免疫グロブリンのアミノ末端
とが結合したものが挙げられ、さらに好ましくは、CD
44の細胞外領域のカルボキシル末端とIgGのFcフ
ラグメントのアミノ末端とが結合した融合タンパク質等
が挙げられる。
能を有していれば多量体(例えば2量体等)を形成して
いてもよい。例えばIgGまたはそのFcフラグメント
を含む上記融合タンパク質であれば、通常、非還元条件
下でジスルフィド結合によってIgG様の2量体を形成
することができる。
分タンパク質または融合タンパク質の製造方法として
は、以下に示す1)〜3)の方法を例示することができる。 1) CD44を、タンパク分解酵素(例えばトリプシ
ン、キモトリプシン、ペプシン等)で消化する等の公知
の手段で分解後、ヒアルロン酸を結合した担体等を用い
てヒアルロン酸との結合能を有する部分タンパク質を分
離精製する方法。 2) 上記1)の操作において、さらに糖分解酵素(例えば
コンドロイチナーゼABC、ヘパリチナーゼ、N−グリ
コシダーゼ、O−グリコシダーゼ等)を作用させる等の
方法で部分的にあるいは完全に糖鎖が除かれた部分タン
パク質を得る方法。 3) 公知の融合方法(例えば、遺伝子工学的方法やハイ
ブリッドタンパクを得る方法等)を用いて融合タンパク
質を得る方法。
ンパク質としては、ヒアルロン酸結合性プロテオグリカ
ン(例えば、軟骨プロテオグリカン(アグリカン)、バ
ーシカン、ニューロカン等)、ヒアルロン酸結合性プロ
テオグリカンのコアタンパク質(例えば、軟骨プロテオ
グリカンのコアタンパク質等)、これらの部分タンパク
質、リンクプロテイン、ヒアルロネクチン等が挙げられ
る。
しては、公知の方法(Leurent et al, Anal.Biochem.,
109, 386-394(1980)、特開平 4-26279号公報、Anal.Bio
chem., 149, 555-565 (1985)等)を用いればよい。例え
ば軟骨プロテオグリカンの部分タンパク質は、上記 Leu
rentらの方法、特開平 4-26279号公報に記載の方法等に
したがって調製することができる。即ち、例えば軟骨か
ら塩酸グアニジン等を用いてプロテオグリカンを可溶化
して抽出し、透析したものにタンパク分解酵素(トリプ
シン等)を作用させてコアタンパク質を分解し、ヒアル
ロン酸結合担体(例えば、ヒアルロン酸を結合させた球
状セルロース等)等を用いるアフィニティークロマトグ
ラフィーにより前記部分タンパク質を得る方法等が挙げ
られる。
合体を抗ITI抗体を用いて測定するには、通常いわゆ
るサンドイッチ法(特公平6-41952 等参照)が用いられ
る。すなわち、結合体中のSHAPと抗ITI抗体との
免疫学的親和性とHAのヒアルロン酸と結合能を有する
タンパク質に対する親和性を利用し、三者のサンドイッ
チ状複合体を形成させて複合体を測定する方法であり、
通常、ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質または
抗ITI抗体の一方を固相体に固着させ、該サンドイッ
チ状複合体を分離して測定する方法である。例えば、S
HAP−HA結合体を含む検体を、固相体に固着された
CD44と接触させ、次いで標識物質で標識された抗I
TI抗体と接触させることによって、検体中のSHAP
−HA結合体と該CD44と該標識物質で標識された抗
ITI抗体とを反応させて、抗ITI抗体−(SHAP
−HA結合体)−CD44−固相体からなる複合体を形
成させ、前記複合体と遊離の該標識された抗ITI抗体
とを分離し、前記複合体中の標識物質を検出することに
より検体中のSHAP−HA結合体を測定する方法が挙
げられる。
P−HA結合体)−CD44−固相体の前記複合体に、
抗ITI抗体に特異的に結合する標識された抗イムノグ
ロブリン抗体を接触させることによって、前記複合体と
該標識抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させ、そ
の標識物質を検出することにより、検体中のSHAP−
HA結合体を測定することもできる。前記の抗ITI抗
体を直接標識する方法に比べ、入手の容易な標識された
抗イムノグロブリン抗体を使用する方法の方が簡便であ
り、好ましい。なお、この方法で使用する抗イムノグロ
ブリン抗体は、抗ITI抗体を製造するためにITIを
免疫した動物と同種の動物のイムノグロブリンを認識す
る抗体である。
ては、固相体に固着する物質としてCD44の代わりに
ヒアルロン酸結合性タンパク質を使用することもでき
る。さらに、CD44、ヒアルロン酸結合性タンパク質
以外のヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質を用い
ることもできる。前記サンドイッチ法において、抗IT
I抗体−(SHAP−HA結合体)−(ヒアルロン酸と
結合能を有するタンパク質)の複合体形成順序は、いわ
ゆるフォワード、リバース、同時のいずれも可能である
(「蛋白核酸酵素」別冊 No.31、酵素免疫測定法、共立
出版(株)発行、1987年、p13-26 参照)。
定方法において、CD44等のヒアルロン酸受容体また
はヒアルロン酸結合性タンパク質等のヒアルロン酸と結
合能を有するタンパク質を固着させる固相体としては、
プレート、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等が挙
げられる。材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレ
ン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が好ましい。これ
らの固相体にCD44またはヒアルロン酸結合性タンパ
ク質等のヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質を固
着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包
括法等固定化酵素の調製法として一般的な方法(固定化
酵素、1975年、講談社発行、第9〜75頁参照)を応用す
ることができる。特に物理的吸着が、操作が簡便な点で
好ましい。
パク質を固着させた固相体の表面には、これらが固着し
ていない表面部分が残存している場合があり、そこへ検
体中のSHAP−HA結合体や他の分子種が固着する
と、正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よ
って、検体を固相体と接触させる前にブロッキング物質
を添加してヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質が
固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。こ
のようなブロッキング物質としては、ウシ等から採取で
きる血清アルブミン、カゼイン、ミルク蛋白等が挙げら
れ、また、ブロッキング物質として市販されているもの
を使用することもできる。
結合能を有するタンパク質に検体中のSHAP−HA結
合体を結合させた後に、固相体の表面を洗浄液で洗浄し
て非特異吸着物を除去することが好ましい。洗浄液とし
ては、例えば、トゥイーン(Tween) 系界面活性剤等の界
面活性剤を添加した緩衝液(例えば、リン酸緩衝液、リ
ン酸緩衝生理食塩水(PBS)、トリス塩酸緩衝液)等
が挙げられる。
性を有する抗イムノグロブリン抗体の標識に使用される
標識物質としては、酵素(ペルオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等)、アイソトープ
(125 I、131 I 、3 H等) 、蛍光色素(ルミノール、
フルオレセインイソチオシアネート(FITC))、化
学発光物質、ハプテン、ビオチン、アビジン(例えば、
ストレプトアビジン等)が挙げられるが、通常タンパク
質の標識に可能なものであれば、特に限定されない。な
お、ここで標識物質とは、ビオチンのようにそれ自体を
直接検出せず、その物質と特異的結合能を有する物質
(例えばアビジン)に検出可能な標識を結合したものを
組み合わせて用いる方法に使用する物質も包含する。
た公知の方法、例えば、酵素を標識する際にはグルタル
アルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、
カルボジイミド法、活性化エステル法等、放射性同位元
素で標識する際にはクロラミンT法、ラクトペルオキシ
ダーゼ法等(続生化学実験講座2「タンパク質の化学
(下)」、東京化学同人、1987年発行参照)から適宜選
択することができる。
質により異なるが、例えば、標識物質にビオチンを使用
する場合には、ストレプトアビジン等を結合させた酵素
を添加して、このストレプトアビジン等を介してペルオ
キシダーゼ等の酵素を標識物質としてビオチンを含む複
合体へ結合させ、該酵素の基質としてテトラメチルベン
ジジン等の発色基質および過酸化水素水を加え、酵素反
応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定す
る方法等を挙げることができる。また、例えば、標識物
質として蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、
反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられ
る。
HAP−HA結合体の濃度は、予め既知濃度のSHAP
−HA結合体標準液を用いてSHAP−HA結合体濃度
と標識物質の検出結果との関係について検量線を作成
し、未知濃度の検体についての検出結果と前記検量線と
を用いる方法によって、定量することができる。
液、血清、血漿、尿等の体液、細胞もしくは微生物の培
養液等の液状試料中のSHAP−HA結合体を定量する
ことができる。特に、後述の関節炎または肝疾患の診断
に本測定法を用いる場合、血液、血清、血漿等を検体と
することができ、患者の負担を軽減することができる。
なお、本発明の測定方法に用いるSHAP−HA結合体
を含む検体は、予め精製されている必要はない。すなわ
ち、検体中にヒアルロン酸以外のグリコサミノグリカ
ン、ITIおよびその他の各種タンパク質が含まれてい
ても、SHAP−HA結合体を選択的に測定することが
できるため、それらによって測定結果が影響されること
はない。
定用キットは、少なくとも抗ITI抗体をキットの構成
成分として含むものである。しかし、一般的には、標識
物質で標識されたまたは標識されうる抗ITI抗体とヒ
アルロン酸と結合能を有するタンパク質(例えばCD4
4等のヒアルロン酸受容体もしくはヒアルロン酸結合性
タンパク質)とから構成されるものである。このような
キットにおいて、ヒアルロン酸と結合能を有するタンパ
ク質を予め固相体に固着されたものを使用すれば、上述
した測定方法において、固相体に固着する操作を省くこ
とができる。
結合体測定キットを用いて、固相体に固着させたCD4
4にSHAP−HA結合体を含む検体を接触させ、次い
で抗ITI抗体と接触させることによって、抗ITI抗
体−(SHAP−HA結合体)−CD44−固相体から
なる複合体を形成させ、さらにペルオキシダーゼ標識抗
イムノグロブリン抗体を接触させることによって、前記
複合体と該標識抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成
させ、その複合体に含まれる標識物質(ペルオキシダー
ゼ)を検出することにより、検体中のSHAP−HA結
合体濃度を測定することができる。
の標準となる既知濃度のSHAP−HA結合体標準品、
標識物質の検出試薬、抗ITI抗体を標識する試薬、抗
ITI抗体を検出する試薬(標識された抗イムノグロブ
リン抗体等)等を加えることができる。また、これらの
成分の他に、前記ブロッキング物質、前記洗浄液、検体
希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。ま
た、これらの成分は、それぞれ別体の容器に収容してお
き、使用時に上記処方に従って使えるキットとして保存
しておくことができる。
トを用いて関節液、血液、血清、血漿、尿、骨髄液等の
検体中のSHAP−HA結合体を特異的に測定すること
ができ、測定範囲も広く、かつ高感度である。
トを用いてヒトの血清中のSHAP−HA結合体を測定
した場合、健常人は低値であり、変形性膝関節炎患者で
はやや高く、リウマチ性関節炎患者では著しく高い値を
示すことより、関節炎の診断を簡便に行うことができ
る。特に、リウマチ性関節炎か変形性膝関節炎かを正確
に識別する診断法として非常に有効な診断用キットとな
り得る。また、肝疾患患者では著しく高い値を示す傾向
が見られることにより、肝疾患の診断法として非常に有
効な診断用キットともなり得る。
明する。本発明のサンドイッチ法による測定方法の好ま
しい一形態を以下に説明する。まず、固相体にCD44
を固着(コーティング)させる。固着方法としては、例
えば、CD44をpH7〜9程度の緩衝液(例えば、リン
酸緩衝液、PBS、炭酸緩衝液等)に溶解して固相体
(例えばマイクロプレートのウェル)に加え、37℃程度
で1〜2時間保存するか、4℃程度で一晩保存して固着
させる方法等を挙げることができる。
ング物質を添加して、37℃程度で30分〜2時間保存する
か、常温(15〜25℃) で1〜2時間保存して、該CD4
4が固着していない部分を被覆しておくことが好まし
い。次いで、上記CD44が固着した固相体に、SHA
P−HA結合体を含む検体試料を添加し、例えば、37℃
で20〜80分間の最適な時間静置あるいは撹拌し、上記C
D44にSHAP−HA結合体を結合させる。
トゥイーン系界面活性剤等を添加した緩衝液(例えばリ
ン酸緩衝液、PBS、トリス塩酸緩衝液等)等の洗浄液
で洗浄する。さらに、前記固相体に、標識物質で標識さ
れた抗ITI抗体または抗ITI抗体と標識物質で標識
された抗イムノグロブリン抗体を添加して、例えば、37
℃で20〜80分間の最適な時間静置あるいは撹拌し、SH
AP−HA結合体に前記抗ITI抗体(または抗ITI
抗体−抗イムノグロブリン抗体)を結合させる。この操
作によって、抗ITI抗体−(SHAP−HA結合体)
−CD44−固相体からなる複合体を形成させる。次
に、前記複合体の標識物質を検出してSHAP−HA結
合体を測定する。
と標識物質の検出結果(例えば吸光度)との関係につい
て検量線を作成し、未知試料についての検出結果と前記
検量線とを用いて、未知試料中のSHAP−HA結合体
を定量する。
るが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
免疫グロブリン(Ig)のFcフラグメントとの融合タンパ
ク質(以下、単に「融合タンパク質」ということがあ
る)を、シード(B.Seed)らの方法(Cell, 61, 1303-1
313(1990))に従って調製した。すなわち、CD44の細
胞外領域をコードするcDNAに、その細胞内領域側
(カルボキシル末端側)にヒトIgG1のFcフラグメント
をコードするcDNAとそのアミノ末端側にCD5のシ
グナル配列をコードするcDNAとをそれぞれ連結した
cDNA断片を作成し、これをCDM8ベクターに組み
込み、DEAEデキストランを用いる公知の方法でCO
S細胞に移入して、融合タンパク質をCOS細胞に一過
性に発現させた。COS細胞は無血清培地で培養し、細
胞外に分泌した融合タンパク質を含む培養上清を回収し
た。融合タンパク質の精製は、その分子中のイムノグロ
ブリン部位を利用し、プロテインA結合樹脂を用いたア
フィニティーカラムクロマトグラフィーにより行った。
結合性タンパク質を、特開平4-262797号公報に記載の製
造例(ヒアルロン酸結合性蛋白)の項に準じて調製し
た。即ち、牛鼻中隔軟骨から4M塩酸グアニジン溶液を
用いて抽出操作を行い、次いで抽出物の上清を採取し、
これを脱イオン水で透析した後、凍結乾燥して粗抽出物
を得た。この粗抽出物をトリプシン消化後、ヒアルロン
酸結合樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィー
により精製した。
を、特開平7-157500号公報に記載の実施例(ヒアルロナ
ン結合性タンパク質の調製)の項に準じて調製した。即
ち、リウマチ性膝関節炎患者の関節液を採取し、軽く遠
心分離して不溶物を取り除き、ハンクス液によって5〜
6倍に希釈した。これに1/10体積の4M グアニジン塩
酸塩溶液を加え、アジ化ナトリウムを微量加えた後、塩
化セシウムを加えて50%(W/V) とした。超遠心チューブ
に入れて4℃に静置後、4℃、123,000 ×g の超遠心
(タンパク質非解離条件下での超遠心;アソシエイティ
ブ超遠心)を48時間行うことにより精製した。
血液3mlを、4℃に1時間静置した後、1,000 ×g、10
分間遠心処理することにより血清を得、これを血清検体
とした。
CD44の細胞外領域を含む融合タンパク質をリン酸緩
衝生理食塩水(pH7.2〜7.5 、二価イオン不含)(以下、
PBS(−)と略す)で、それぞれ2μg/mlに希釈し、
この溶液50μl (100ng/ウエル)ずつをヌンクイムノプ
レート(商品名:マキシソープ、ヌンク社製)の各ウエ
ルに加え、4℃で16時間保存することにより、均一にコ
ーティングした。このプレートをPBS(−)で2回洗
浄し、ウエルの融合タンパク質が被覆されていない部分
を被覆するために、ブロッキング物質として3%ウシ血
清アルブミン(BSA、生化学工業(株)販売)を含む
PBS(−)溶液を加え、室温で2時間静置した。
ゥイーン20(和光純薬工業(株)製)を含むPBS
(−))で3回洗浄後、調製例3で精製された各濃度のS
HAP−HA結合体標準液 (16〜4000ng/ml の各濃度)
50μl を前記プレートに加え、37℃で60分間静置して
反応させた。なお、SHAP−HA結合体標準液の溶媒
としては、1%BSAを含むPBS (−) (以下、「反
応希釈液」という)を用いた。
回洗浄し、反応液で希釈した1μg/ml抗ITI抗体(ダ
コ社製)25μl および反応液で 1,250倍に希釈したペル
オキシダーゼ標識抗ウサギイムノグロブリン抗体(生化
学工業(株)販売)25μl を加え、37℃で60分間静置し
て反応させた。さらに、このプレートを前記洗浄液で3
回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチル
ベンジジン溶液(モス社製:以下、TMBと略す)を50
μl 加え、37℃で15分間反応させ、発色させた。
えて反応を停止させ、TMBの分解による着色液の波長
450nmでの吸光度(対照波長630nm)(A450/630)をウェル
リーダーSK601(生化学工業(株)販売)にて測定した。
得られた結果を図1に示す。これにより、本発明の測定
法によれば、16〜4,000ng/mlのSHAP−HA結合体の
定量が可能であることがわかる。また、該測定法で用い
たCD44の代わりに調製例2で精製したヒアルロン酸
結合性タンパク質の溶液をPBS (−) で10μg/mlに希
釈して使用することも可能である。得られた結果を図2
に示す。この方法では64〜4,000ng/mlのSHAP−HA
結合体の定量が可能であり、CD44を用いた場合より
やや感度が劣る。
響)20μg/mlのヒアルロン酸を共存させた10倍希釈血清
検体中のSHAP−HA結合体含量を実施例1の方法で
測定し、測定結果へのヒアルロン酸(HA)共存の影響
を検討した。また、100mU/mlのヒアルロニダーゼで10倍
希釈血清検体を37℃で60分間処理した後、実施例1の方
法で測定し、測定結果への影響を検討した。無処理の血
清検体を測定して得られたSHAP−HA結合体濃度を
100%としてヒアルロン酸存在下あるいはヒアルロニダ
ーゼ処理した血清検体から得られた測定値を百分率
(%)に換算した。ヒアルロン酸結合性タンパク質を固
着したプレートを用いた測定方法で得られた結果を図3
に、CD44を固着したプレートを用いた測定方法で得
られた結果を図4に示した。これらの結果から、本発明
の測定方法はヒアルロン酸の共存あるいはヒアルロニダ
ーゼ処理により著しく阻害を受ける。このことはヒアル
ロン酸結合性タンパク質あるいはCD44を固着したプ
レートと検体との反応でSHAP−HA結合体のヒアル
ロン酸部分を特異的に検出していることが示された。
体の定量)健常人(10例)、変形性膝関節炎(以下OA
と略す)患者(10例)、リウマチ性関節炎(以下RAと
略す)患者(10例)の各血清中に存在するSHAP−H
A結合体の定量を実施例1に記載した方法にて行った。
ヒアルロン酸結合性タンパク質を固着したプレートを用
いた測定方法で得られた結果を図5に、CD44を固着
したプレートを用いた測定方法で得られた結果を図6に
示した。また、これらの測定結果を表1に示した。表
1、図5および図6より、RA患者の血清中のSHAP
−HA結合体の平均値は、健常人に比べ、ヒアルロン酸
結合性タンパク質法で約320 倍、CD44法で約560 倍
の高値を示した。さらにOA患者の血清に対してもRA
患者の血清は前者の方法で約115 倍、後者の方法で約38
0 倍の高値を示した。これらの結果より、血清中のSH
AP−HA結合体の値はRAとOAとの識別が可能な診
断マーカーとして有用であることが示された。
−HA結合体の定量と比較)健常人(87例)、関節炎患
者(OA:42 例、RA:82 例)及び肝疾患患者(54例)の各
血清中に存在するSHAP−HA結合体の定量を、実施
例1に記載した方法に準じ、ヒアルロン酸結合タンパク
質を固着したプレートを用いた測定方法によって行っ
た。なお、測定値はunitに変換して結果を図7に示
した。図中に記載の unit/mlとは、450nm における吸光
度が0.5となる標準検体のSHAP−HA濃度を1un
it/ml としたとき、測定検体のこの標準検体に対する希
釈率の逆数として表した値である。当該単位を用いて標
準検体の検量線を作成した後、検体の測定値のunitへの
変換を前記検量線を用いて行った。RA患者群同様に肝
疾患患者群も血清中SHAP−HA量が高値を示す傾向
が見られた。この結果より、本発明測定法はRAの識別
と同様に肝疾患の識別が可能な診断マーカーとしても有
用であることが示唆された。また、仮に2unit/ml を血
中SHAP−HA濃度の正常値と異常値の臨界値とした
場合の各検体の異常値を示す割合は、正常(健常人)が
1.10%(87検体中1検体)、OA患者が 19.00%(42検
体中8検体)、RA患者が 74.40%(82検体中61検体)
及び肝疾患患者が 42.59%(54検体中23検体)となり、
診断マーカーとしての有用性が裏付けられた。
法によりITIに対する抗体およびヒアルロン酸と結合
能を有するタンパク質を用いた方法で血液等に含まれる
SHAP−HA結合体を簡便に測定することが可能であ
り、かつ、関節炎の診断においてOAかRAかを正確に
識別し、また肝疾患の検出を行う診断法として有効な方
法である。また、SHAP−HA結合体の生理的意義は
不明であるが高転移性ガン細胞は多量にヒアルロン酸を
持ち、血清存在下で培養すると細胞周囲のヒアルロン酸
にSHAPが結合し、SHAP−HA結合体が形成する
ことが報告されている (生化学、67, 458-465 (199
5))。このことより、癌の転移にSHAP−HA結合体
が関与している可能性が考えられ、本発明のSHAP−
HA結合体測定法は癌転移機構の解明および医薬品開発
の有用な評価方法となる。
−HA結合体含量の標準曲線を示す。
いて測定したSHAP−HA結合体含量の標準曲線を示
す。
合体含量測定におけるヒアルロン酸およびヒアルロニダ
ーゼの阻害作用(ヒアルロン酸結合性タンパク質使用)
を示す。
合体含量測定におけるヒアルロン酸およびヒアルロニダ
ーゼの阻害作用(CD44使用)を示す。
血清中のSHAP−HA結合体の濃度を示す(ヒアルロ
ン酸結合性タンパク質使用)。
血清中のSHAP−HA結合体の濃度を示す(CD44
使用)。
肝疾患患者の血清中のSHAP−HA結合体の濃度(uni
t/ml) の比較を示す(ヒアルロン酸結合性タンパク質使
用)。
Claims (12)
- 【請求項1】 検体中の血清由来ヒアルロナン結合性タ
ンパク質−ヒアルロン酸(SHAP−HA)結合体を、
抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体(抗IT
I抗体)と反応させて抗ITI抗体−(SHAP−HA
結合体)の複合体を形成させ、この複合体を測定するこ
とを特徴とする検体中の血清由来ヒアルロナン結合性タ
ンパク質−ヒアルロン酸結合体の測定方法。 - 【請求項2】 検体中のSHAP−HA結合体と、ヒア
ルロン酸と結合能を有するタンパク質とを反応させてヒ
アルロン酸と結合能を有するタンパク質とSHAP−H
A結合体との複合体を形成させ、この複合体を抗ITI
抗体と反応させて、抗ITI抗体−(SHAP−HA結
合体)−(ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質)
の複合体を形成させ、この複合体を測定することを特徴
とする検体中の血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質
−ヒアルロン酸結合体の測定方法。 - 【請求項3】 ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク
質がヒアルロン酸結合性タンパク質およびヒアルロン酸
受容体から選択される少なくとも1種のタンパク質であ
る請求項2記載の測定方法。 - 【請求項4】 ヒアルロン酸結合性タンパク質がヒアル
ロン酸結合性プロテオグリカン、ヒアルロン酸結合性プ
ロテオグリカンのコアタンパク質、リンクプロティン、
ヒアルロネクチンおよびそれらタンパク質のヒアルロン
酸結合領域を含む部分タンパク質よりなる群から選択さ
れる少なくとも1種のタンパク質である請求項3記載の
測定方法。 - 【請求項5】 ヒアルロン酸受容体がCD44、そのヒ
アルロン酸結合領域を含む部分タンパク質またはそれら
の融合タンパク質である請求項3記載の測定方法。 - 【請求項6】 抗ITI抗体がITIの長鎖である HC1
および/またはHC2と反応するポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体である請求項1〜3のいずれかに
記載の測定方法。 - 【請求項7】 キットの構成成分として、抗ITI抗体
を含むことを特徴とし、検体中のSHAP−HA結合体
と抗ITI抗体とを結合させて抗ITI抗体−(SHA
P−HA結合体)の複合体を形成させ、SHAP−HA
結合体を測定する方法に使用するための測定キット。 - 【請求項8】 抗ITI抗体がITIの長鎖である HC1
および/またはHC2と反応するポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体である請求項7記載の測定キッ
ト。 - 【請求項9】 請求項1〜6のいずれかの測定方法を用
いて検体中のSHAP−HA結合体を測定し、それによ
って関節炎を診断することを特徴とする関節炎の診断方
法。 - 【請求項10】 請求項1〜6のいずれかの測定方法を
用いて検体中のSHAP−HA結合体を測定し、それに
よって肝疾患を診断することを特徴とする肝疾患の診断
方法。 - 【請求項11】 検体が血液、血清または血漿である請
求項9又は10記載の診断方法。 - 【請求項12】 キットの構成成分として抗ITI抗体
を含み、検体中のSHAP−HA結合体と抗ITI抗体
とを結合させて抗ITI抗体−(SHAP−HA結合
体)の複合体を形成させ、SHAP−HA結合体を測定
することを特徴とする関節炎又は肝疾患の診断用キッ
ト。
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