JP2003315334A - 体液中のｂｐｉの定量方法 - Google Patents
体液中のｂｐｉの定量方法Info
- Publication number
- JP2003315334A JP2003315334A JP2003117669A JP2003117669A JP2003315334A JP 2003315334 A JP2003315334 A JP 2003315334A JP 2003117669 A JP2003117669 A JP 2003117669A JP 2003117669 A JP2003117669 A JP 2003117669A JP 2003315334 A JP2003315334 A JP 2003315334A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bpi
- plasma
- rbpi
- serum
- levels
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 血液試料についてＢＰＩイムノアッセイを行
う方法に従って、血液試料を包含する体液試料における
ＢＰＩレベルを定量するための方法であって、血液試料
が血漿である方法を提供すること。 【解決手段】 血液試料中のＢＰＩの存在を定量するた
めのイムノアッセイ方法であって、血漿をアッセイする
工程を含むことにより改善された方法。１つの実施形態
では、血漿のイムノアッセイは、ヘパリン及びデキスト
ラン硫酸からなる群より選択された陽イオン性の非特異
的ブロッキング剤の存在下にて行われる。
う方法に従って、血液試料を包含する体液試料における
ＢＰＩレベルを定量するための方法であって、血液試料
が血漿である方法を提供すること。 【解決手段】 血液試料中のＢＰＩの存在を定量するた
めのイムノアッセイ方法であって、血漿をアッセイする
工程を含むことにより改善された方法。１つの実施形態
では、血漿のイムノアッセイは、ヘパリン及びデキスト
ラン硫酸からなる群より選択された陽イオン性の非特異
的ブロッキング剤の存在下にて行われる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本出願は、１９９３年９月２９日出願の米
国特許出願第０８／１２５，６７７号の一部継続出願で
ある、１９９３年１２月２９日出願の米国特許出願第０
８／１７５，２７６号の一部継続出願である。 【０００２】 【発明の属する技術分野】本発明は、血液試料を包含す
る体液試料中の殺菌／浸透性増強タンパク質の存在を調
べるための方法に関する。 【０００３】 【従来の技術】殺菌／浸透性増強タンパク質（ＢＰＩ）
は、ヒト及び動物の好中球のアズール顆粒から精製され
た陽イオン性、抗−微生物性のタンパク質である（Ｗｅ
ｉｓｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５３巻、２６
６４頁（１９７８）、Ｅｌｓｂａｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４巻、１１０００頁（１９７
９））。ＢＰＩはグラム陰性細菌の外膜のリポ多糖（Ｌ
ＰＳ）成分に結合する（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒ
ｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６０巻、４７５４
頁（１９９２））。近年、ヒトＢＰＩの組換え型（ｒＢ
ＰＩ２３）の特徴付けが行われ、天然型のＢＰＩの特徴
との比較がなされている。ｒＢＰＩ２３断片は、ホロ−
ＢＰＩのアミノ末端２３ ｋＤａ部分からなり、天然型
のＢＰＩの ＬＰＳ結合特性、のみならず、抗−微生物
活性を保持している（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９０巻、１１２２
頁（１９９２）、Ｗｅｉｓｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．、９０巻、１１２２頁（１９９２））。 【０００４】ＢＰＩレベルは、いずれの体液において
も、これまでに正確にはアッセイされていない。ｒＢＰ
Ｉ２３ならびに他のＢＰＩタンパク質及びタンパク質産
物が潜在的に臨床上の用途を有しているので、体液中の
ＢＰＩの存在及び量を測定するために、感度が良く且つ
再現性のあるアッセイが必要である。特に、体液中のＢ
ＰＩの測定は、診断目的のために有用であるかもしれな
い。Ｐｅｒｅｉｒａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ、１１７巻、１１５頁（１９８９）には、ヒト好中
球の粗顆粒抽出物においてＢＰＩを調べるための競合Ｅ
ＬＩＳＡアッセイが開示されている。Ｐｅｒｅｉｒａら
は、ヘパリンまたはデキストラン硫酸などのポリアニオ
ン類を用いた処置によって、ＥＬＩＳＡアッセイにおけ
る陽イオン性タンパク質の非特異的相互作用を最小にく
い止めることができることも、開示している。Ｐｅｓｃ
ｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、８７巻、
２１頁（１９８６）も参照されたい。しかしながら、Ｐ
ｅｒｅｉｒａらの競合アッセイは感度に限界があるとい
う特徴を有する。従って、哺乳動物体液中の内在的なＢ
ＰＩレベルを測定することができる、より高感度のＢＰ
Ｉアッセイが、依然として当該技術分野において希求さ
れている。本出願においてさらに興味深いのは、グラム
陰性敗血症の患者及び健常被験者におけるＢＰＩの血清
レベルについてのアッセイの結果を開示している、ｖｏ
ｎ ｄｅｒ Ｍｏｈｉｅｎら、抄録、１３ｔｈ Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｉ
ｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｅｎ
ｃｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ブリュッセル（１９９３年３
月）の開示である。その抄録では、すべての敗血症患者
において体循環しているＢＰＩが検出された一方で、健
常被験者の血清におけるアッセイの条件下ではＢＰＩが
検出されえなかったことを開示していた。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、血液試料に
ついてＢＰＩイムノアッセイを行う方法に従って、血液
試料を包含する体液試料におけるＢＰＩレベルを定量す
るための方法であって、血液試料が血漿である方法を提
供するものである。 【０００６】 【課題を解決するための手段】血漿は、新鮮な凝固して
いない血液から、白血球及び赤血球を分離した後に残存
する血液体である。血清は、凝固した血液が遠心により
分離されて残存する血液体（すなわち、血液の凝塊因子
を含まない血漿）である。本発明の１つの特徴として、
血清中に存在するＢＰＩのレベルは、体循環している血
液中のＢＰＩの内在的なレベルを表すものではなく、一
方、血漿中のＢＰＩのレベルは、前記の内在的なレベル
を表すものであることが、教示される。本発明のさらな
る特徴として、被験者におけるグラム陰性敗血症の存在
を調べるための方法が提供され、かかる方法は、その被
験者から得た血漿試料中の内在的な細胞外ＢＰＩの濃度
を定量すること、及びその濃度をグラム陰性敗血症の指
標たる標準値と比較することを含むものである。かかる
標準値は、１．７ ｎｇ／ｍＬでありえ、これは正常の
ヒト血漿ＢＰＩに対する平均値である０．８ｎｇ／ｍＬ
を標準偏差の２倍分上回る値である。従って、正常ヒト
血漿ＢＰＩ濃度に対する平均値を、標準偏差の２倍分上
回る値を越えた数値が、グラム陰性敗血症の指標であ
る。 【０００７】本発明の好ましい方法により、サンドイッ
チイムノアッセイを用い、そしてさらに、ＢＰＩイムノ
アッセイにおいてヘパリン及びデキストラン硫酸からな
る群より選択された陽イオン性の非特異的ブロッキング
剤を利用して、血液血漿などの体液中の細胞外ＢＰＩの
濃度が調べられる。血清、尿、肺洗浄液（ｌｕｎｇｌａ
ｖａｇｅｓ）、硝子体液、歯肉溝液（ｃｒｅｖｉｃｕｌ
ａｒ ｆｌｕｉｄ）、脳脊髄液、唾液及び滑液を包含す
る他の体液（これらに限定されるものではない）中のＢ
ＰＩの濃度を調べるために、本発明のＢＰＩイムノアッ
セイを用いることもできる。 【０００８】本発明のさらなる特徴として、被験者にお
ける活動性炎症状態の存在を調べるための方法が提供さ
れ、これには、被験者から得た液体試料中の内在的なＢ
ＰＩの濃度を調べること、及びその濃度を活動性炎症状
態の標準指標と比較することが含まれる。活動性炎症状
態の存在を調べるためにアッセイされるべき体液が血液
血漿である場合、活動性炎症状態の標準指標は、１．７
ｎｇ／ｍＬとすることができ、これは、正常のヒト血
漿ＢＰＩに対する０．８ ｎｇ／ｍＬという平均値を標
準偏差の２倍分上回る数値である。従って、正常ヒト血
漿ＢＰＩ濃度に対する平均値を、標準偏差の２倍分上回
る値を越えた数値が、活動性炎症状態の存在の指標であ
る。本発明によって、さらに、被験者から得た滑液の試
料中の内在的なＢＰＩの濃度を調べ、そして、その濃度
を活動性炎症状態の指標たる標準値と比較することによ
って、慢性関節リウマチ及び活動性関節炎からなる群よ
り選択される活動性炎症状態の存在を調べる方法が提供
される。慢性関節リウマチ及び活動性関節炎の滑液の場
合、活動性炎症状態の標準指標は、１５２ ｎｇ／ｍＬ
を越える値でありえ、これは、非炎症状態における滑液
ＢＰＩに対する平均値である２６ ｎｇ／ｍＬを、標準
偏差の２倍分上回る値である。 【０００９】一般に、ＢＰＩについての尿のアッセイで
は、ほとんど、もしくは全く、ＢＰＩを検出しないので
あるが、尿管に感染を有する被験者においては、尿のＢ
ＰＩレベルが高まっているかもしれない。 【００１０】本発明は、以下を提供する： １．血液試料中のＢＰＩの存在を定量するためのイムノ
アッセイ方法であって、血漿をアッセイする工程を含む
ことにより改善された方法。 ２．血漿のイムノアッセイが、ヘパリン及びデキストラ
ン硫酸からなる群より選択された陽イオン性の非特異的
ブロッキング剤の存在下にて行われる、第１項記載の方
法。 ３．被験者におけるグラム陰性敗血症の存在を調べるた
めの方法であって、 該被験者から得た血漿試料中の内
在的なＢＰＩの濃度を調べ、及び その濃度をグラム陰
性敗血症の指標たる標準値と比較する工程を含む方法。 ４．ＢＰＩの濃度が、ＢＰＩイムノアッセイによって調
べられる、第３項記載の方法。 ５．前記イムノアッセイが、サンドイッチイムノアッセ
イである、第３項記載の方法。 ６．前記イムノアッセイが、ヘパリン及びデキストラン
硫酸からなる群より選択された陽イオン性の非特異的ブ
ロッキング剤の存在下にて行われる、第５項記載の方
法。 ７．被験者における活動性炎症状態の存在を調べるため
の方法であって、 該被験者から得た液体試料中の内在
的なＢＰＩの濃度を調べ、及び その濃度を活動性炎症
状態の指標たる標準値と比較する工程を含む方法。 ８．前記活動性炎症状態が、慢性関節リウマチ及び活動
性関節炎からなる群より選択される、第７項記載の方
法。 ９．前記液体試料が滑液である、第８項記載の方法。 １０．前記液体試料が血液血漿である、第７項記載の方
法。 １１．ＢＰＩの濃度が、ＢＰＩイムノアッセイによって
調べられる、第７項記載の方法。 １２．前記イムノアッセイが、サンドイッチイムノアッ
セイである、第１１項記載の方法。 １３．前記イムノアッセイが、ヘパリン及びデキストラ
ン硫酸からなる群より選択された陽イオン性の非特異的
ブロッキング剤の存在下にて行われる、第７項記載の方
法。 【００１１】 【発明の実施の形態】本発明は、血液を包含する体液に
おける細胞外ＢＰＩの存在を定量するための方法に関
し、かかる方法は、該被験者から得た血漿についてＢＰ
Ｉイムノアッセイを行うことを含むものである。このア
ッセイは、治療的に投与された、すなわち外来性の、Ｂ
ＰＩの存在及び量を調べるために有用であるが、かかる
アッセイは、被験者におけるグラム陰性敗血症を包含す
る敗血症の存在の指標として、体循環血液中の内在的な
細胞外ＢＰＩの存在を定量するために、特に好適であ
る。また、体循環血液中の内在的な細胞外ＢＰＩの存在
を定量することは、敗血症患者を評価するための予後の
方法においてもさらに有用であると考えられる。加うる
に、本発明は、被験者から得た液体試料中の内在的なＢ
ＰＩの濃度を調べること、及びその濃度を活動性炎症状
態の指標たる標準値と比較することを含む、被験者にお
ける活動性炎症状態の存在を調べるための方法を提供す
る。 【００１２】本発明は、高いアッセイ感度、高い特異性
及び優れた再現性を呈する、ヒトＢＰＩのためのサンド
イッチＥＬＩＳＡアッセイを提供する。本明細書におい
て用いられる、アッセイ方法で定量される「ＢＰＩ」
は、天然型ＢＰＩ、組換えＢＰＩ、のみならず、ＢＰＩ
の組換えＮ−末端断片（ｒＢＰＩ２３）ならびに、他の
ＢＰＩタンパク質及びタンパク質産物を包含するもので
ある。かかるＢＰＩタンパク質産物が、ｍＬ当たりナノ
グラム以下の領域において、容易に定量されうる。免疫
学的アッセイは、好ましくは、酵素連鎖免疫吸収（ＥＬ
ＩＳＡ）サンドイッチアッセイによって実施されるが、
競合アッセイ及び他のラベル方式を利用した免疫学的ア
ッセイもまた、用いることができる。本発明の好ましい
アッセイでは、モノクローナル抗体及びアフィニティー
精製したウサギポリクローナル抗体を包含する、抗−Ｂ
ＰＩ抗体が利用される。ウサギのポリクローナル抗−Ｂ
ＰＩ抗体は、免疫源としてＢＰＩを用い、旧来の方法に
従って調製すればよい。特に好ましいモノクローナル抗
体は、旧来の方法論に従って溶液中でＢＰＩに結合する
能力に基づき選択された、Ｘｏｍａ ６Ｃ２と称される
モノクローナル抗体である。本発明の好ましい実施態様
の１つによれば、希釈用緩衝液中にヘパリンが利用され
る。ヘパリンは、バックグラウンドを減ずること、及び
アッセイシグナルを増強することの双方によって、アッ
セイ性能を向上させると考えられる。類似の効果が、低
分子量（８ ｋＤａ）のデキストラン硫酸で認められ
る。それとは対照的に、高分子量（５００ ｋＤａ）の
デキストラン硫酸は、アッセイ感度を減じ、事実上、低
分子量ポリアニオンの有益な効果とは逆効果を及ぼす。
初期の研究において、高いバックグラウンドシグナルを
生じる原因である、ミクロタイタープレートとｒＢＰＩ
２３との非特異的な相互作用が明らかになった。１０ユ
ニット／ｍＬ（およそ５５μｇ／ｍＬ）でヘパリンを入
れると、バックグラウンドシグナルが低下し、緩衝液コ
ントロールに比べてアッセイ感度が向上することにもな
った。ヘパリンをさらに高濃度（１００ユニット／ｍ
Ｌ）にしても、１０ユニット／ｍＬを用いた場合に観察
されたと同様の結果が生じた。高分子量のデキストラン
硫酸により惹起こされる阻害は、ＢＰＩの表面上のエピ
トープへの抗体の接近に対する立体的障害に起因するも
のかもしれない。 【００１３】バックグラウンドシグナルを減じるため
に、本発明のイムノアッセイにおいて高濃度の塩（１Ｍ
ＮａＣｌ）を添加することが有用である。高塩濃度を
用いると、ヘパリンよりも優れたアッセイ感度が得られ
るが、いくつかの試料については、塩がヘパリンほど有
効にバックグラウンドシグナルを低下させることはな
い。ヘパリンまたは高濃度塩を含む溶液で試料が希釈さ
れた場合に認められる感度の増強は、イオン性相互作用
が破壊されることに起因すると考えられ、一方、他の、
おそらくは疎水的な力もまた、バックグラウンドシグナ
ルに寄与しているのかもしれない。 【００１４】ＢＰＩ ＥＬＩＳＡの特異性は、２つの方
法で立証している。第１に、血清からＥＬＩＳＡプレー
ト上に免疫反応性タンパク質が「捕獲」されて引き続き
溶出され、電気泳動により分離され、ブロットされて、
抗−ｒＢＰＩ２３抗体をプローブとして用いて調べる
と、検出された唯一の物質は、ヒト好中球から抽出され
た天然型ＢＰＩと挙動を同じくする、約６０ ｋＤａの
ダブレットであった。同様に、ブロットした同じ試料
を、抗−ｒＢＰＩ抗体をプローブとして用いて調べた場
合、先に測定したＥＬＩＳＡシグナルとＢＰＩバンドの
強度とのあいだに、有意な相関性（Ｒ２＝０．８０７、
ｐ＝０．０００１）が見出された。第２に、やはりＬＰ
Ｓに結合し、ＢＰＩとかなりの配列の相同性（４４％）
を示すヒトＬＢＰでは、ｒＢＰＩまたはｒＢＰＩ２３の
それぞれで生じるよりも、３０，０００倍から１００，
０００倍低いシグナルしか生じなかった。ＥＬＩＳＡに
おいて、ｒＬＢＰは、１００μｇ／ｍｌでも、３ ｎｇ
／ｍｌのＢＰＩを下回る場合に等しいシグナルしか生じ
なかった。正常ヒト血清試料中のＬＢＰレベルは、１〜
２４μｇ／ｍｌの間（平均７μｇ／ｍｌ）であると報告
されている（Ｌｅｔｕｒｃｑら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．、１６Ｃ巻、１６１頁（１９９２））ので、
これらのデータにより、ＬＢＰが、ＢＰＩ ＥＬＩＳＡ
において極小の干渉しか惹起こさないことが示唆され
る。 【００１５】本発明の１つの特徴として、ヒト血漿にお
いてアッセイされるか、またはヒト血清においてアッセ
イされるかのいずれであるかに依存して、内在的なＢＰ
Ｉレベルが有意に異なることが見出されている。血漿
は、凝塊を防ぐために抗凝固剤（例えばクエン酸塩、酸
−クエン酸塩−デキストロース（ＡＣＤ）、ＥＤＴＡ、
ヘパリン及びヒルジン）を添加することにより得られ
る、血液の無細胞性の液体部分であり、一方血清は、凝
塊を許容する場合に血液から分離する液体である。正常
な血漿は低レベル（＜０．２〜２．１ ｎｇ／ｍｌ）の
ＢＰＩしか含まないが、同じ個体から同時に採取した血
清試料中のレベルは平均で３７倍高かった（４．９〜７
２．１ ｎｇ／ｍｌ）。さらに、ＢＰＩレベルは、採取
及び処理のための経過時間に依存して変動した。これら
のデータによって、（ｉ）正常な個体におけるＢＰＩの
血漿レベルは極めて低いこと、及び（ｉｉ）凝固のプロ
セスの際に好中球から血清へとＢＰＩが放出されるのか
もしれないことが示唆されるので、正常な個体及び病理
学的状態にある個体におけるＢＰＩレベルの評価及び解
釈において、これらのデータは重要である。かくして、
ＢＰＩの内在的なレベルは、血清ではなく、血漿におい
て測定されるべきであり、そうすることによって、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの放出及び／または好中球の破壊により
惹起こされるアーティファクトが避けられる。同様に、
ＢＰＩの組換え型を含む臨床試料の分析は、血漿におい
て実施されるのが最良である。 【００１６】Ｗｅｉｓｓ及びＯｌｓｓｏｎ、Ｂｌｏｏｄ
６９巻、６５２頁（１９８７）は、好中球１０８細胞
当たり、平均６５μｇのＢＰＩが含まれると報告してい
る。全血がｍｌ当たり５ × １０６の好中球を含むと
仮定すると、１ ｍＬの血液中にはおよそ３．２μｇ／
ｍｌのＢＰＩが存在することになろう。血清中のＢＰＩ
の濃度は低い（＜１００ ｎｇ／ｍＬ）ので、凝固の際
に放出されるＢＰＩの量は、有効態の全物質のうちわず
かな割合（約１％）に過ぎない。このＢＰＩの放出に生
理学的な重要性はなく、損傷を受けた好中球からのＢＰ
Ｉの漏出を表しているに過ぎないかもしれない。さもな
くば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける凝固は、傷害または外傷
に呼応して好中球から抗微生物剤（ＢＰＩを包含する）
を局所的に放出するための一般的なシグナルであるかも
しれないという可能性がある。これらの条件のもとに、
次いでＢＰＩは傷害の部位に局在し、抗細菌の防御機構
として作用するのかもしれない。 【００１７】本発明の他の特徴及び利点は、以下の例示
的な実施例を考慮すれば理解されよう。実施例１は、ア
フィニティー精製したウサギ抗−ＢＰＩ抗体の調製に関
し、実施例２は、かかる抗体のビオチンラベル付けに関
し、実施例３は、かかる抗体を利用したＥＬＩＳＡ法に
関し、そして実施例４は、モノクローナル抗−ＢＰＩ抗
体の調製に関する。実施例５は、ＢＰＩサンドイッチア
ッセイの感度に対する、ヘパリン、デキストラン硫酸及
びＮａＣｌ濃度の効果に関し、実施例６は、ｒＢＰＩ及
びｒＢＰＩ２３の標準曲線の特徴に関する。実施例７
は、プールしたヒト血漿に加えた（ｓｐｉｋｅｄ）ｒＢ
ＰＩ及びｒＢＰＩ２３の測定に関し、実施例８は、ｒＬ
ＢＰ、ｒＢＰＩ及びｒＢＰＩ２３を比較する、免疫反応
性に関し、そして実施例９は、ＥＬＩＳＡアッセイに対
する処理時間及び遠心力の効果に関する。実施例１０
は、血清及び血漿試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタ
ンブロット分析に関し、そして実施例１１は、ヒト血漿
及び血清における内在的なＢＰＩの免疫反応性の測定に
関する。実施例１２は、敗血症患者におけるＢＰＩの臨
床的な相関性に関し、実施例１３は、敗血症小児と敗血
症ではない臨床的疾患を有する小児との血漿における内
在的なＢＰＩレベルの比較に関し、実施例１４は、正常
及び嚢胞性線維症における肺洗浄液試料における内在的
なＢＰＩレベルに関し、実施例１５は、慢性関節リウマ
チに罹患している患者の滑液における内在的なＢＰＩレ
ベルに関し、そして実施例１６は、慢性関節リウマチ、
骨関節炎または活動性関節炎に罹患している患者の滑液
における内在的なＢＰＩレベルに関し、そして実施例１
７は、慢性関節リウマチ患者からの血漿試料における内
在的なＢＰＩレベルに関する。実施例１８は、健常な被
験者へのＬＰＳ投与の、内在的なＢＰＩレベルに対する
効果に関する。 【００１８】 【実施例】（実施例１：アフィニティー精製したウサギ
抗−ＢＰＩ２３抗体の調製）本実施例では、アフィニテ
ィー精製したウサギ抗−ｒＢＰＩ２３抗体を調製した。
詳細には、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０巻、４７５４〜４７６１頁
（１９９２）の方法に従って作製したｒＢＰＩ ２３（２
０ ｍｇ）を、０．５ ＮａＣｌを含む、０．２ Ｍ
重炭酸塩、ｐＨ８．６中で、１０ ｍＬの臭化シアンで
活性化したセファロース４Ｂ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）に
カップリングさせた。およそ９７％のｒＢＰＩ２３が、
樹脂にカップリングした。ｒＢＰＩ２３で高度免疫した
２羽のウサギから集めた抗血清（１５０ ｍＬ）を、等
容量のリン酸緩衝性生理食塩水、ｐＨ ７．２（ＰＢ
Ｓ）で希釈した。希釈した抗血清の一部（５０ ｍＬ）
を、１０ ｍＬのｒＢＰＩ２３−セファロースカラムに
通液し、次いで、カラムをＰＢＳで洗浄して、０．１
Ｍグリシン、ｐＨ２．５を用いて、結合した抗体を溶出
した。収集した画分は、直ちに１ Ｍリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ ８．０で中和した。Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３１２頁
（１９８８）の方法に従って、２８０ ｎｍにおける吸
光度を測定することにより、ピークの画分を同定した。
回収量は、アフィニティー精製した抗−ｒＢＰＩ ２３
抗体４５ ｍｇであり、すなわち、ウサギ抗血清１ ミ
リリットル当たり、抗体３００マイクログラムであっ
た。 【００１９】（実施例２：ビオチンラベルしたウサギ抗
−ＢＰＩ２３抗体の調製）本実施例では、実施例１の方
法に従って作製した、２０マイクログラムのアフィニテ
ィー精製したウサギ抗−ＢＰＩ２３抗体を、１１ ｍＬ
の０．１ Ｍ 重炭酸ナトリウム、ｐＨ ８．３中で、
室温にて２時間、２ ｍｇのビオチンアミドカプロエー
ト Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル（Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、
ミズーリー州）とともにインキュベートした。０．１％
アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０
カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎ
ｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）で
反応混合物を分画することにより、接合しなかったビオ
チンを除去し、アルカリ性の緩衝液を交換した。ビオチ
ンラベルした抗体の最終的な収量は、１７．９ ｍｇで
あった。 【００２０】（実施例３：ＥＬＩＳＡ法）５０μｌのア
フィニティー精製したウサギ抗−ＢＰＩ２３抗体（ＰＢ
Ｓ中、１μｇ／ｍＬ）を、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２（Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｃ
ｈａｎｔｉｌｌｙ、バージニア州）ミクロタイタープレ
ートのウェルの中で、２〜８℃にて一晩（またはその代
わりに、３７℃にて１時間）インキュベートした。抗体
溶液を取り除き、すべてのウェルに脱脂乳１％を含むＰ
ＢＳ（ブロッキング剤）を２００μＬ添加した。室温に
て１時間プレートをブロッキングした後、３００μＬの
洗浄用緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）
で３度、ウェルを洗浄した。 【００２１】個々のヒト提供者から、血液を２本のＶａ
ｃｕｔａｉｎｅｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、
Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ニュージャージー州）チューブ
の中に採取した。チューブの１本は酸 クエン酸塩 デ
キストロースを含んでおり、２本目は、凝塊活性化剤及
び血清分離剤を含んでいた。採取後１時間３０分以内
に、個々の提供者からの血漿及び血清試料の双方を１３
００ ｇにて５分間遠心することにより、同時に処理し
た。適切な画分を集め、０．５ ｍＬのアリコートとし
て−７０℃にて貯蔵した。プールした正常ヒト血清及び
プールしたクエン酸化血漿は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）か
ら得た。 【００２２】標準物質、試料及びコントロールを、別々
の９６−ウェルプレートで、１％ウシ血清アルブミン、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−
ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ）及び１０ユニット／ｍＬのヘパリ
ンナトリウム（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を用いて、３重試験
を行うよう希釈した。ｒＢＰＩまたはｒＢＰＩ２３の標
準溶液は、１００から０．０１２ ｎｇ／ｍＬまで、連
続的に２倍希釈して調製した。標準物質、試料及びコン
トロールの各重複試験検体及び希釈検体（５０μＬ）各
々を、ブロッキングしたミクロタイタープレートに移
し、３７℃にて１時間インキュベートした。第１次のイ
ンキュベーションの後、洗浄用緩衝液を用いて、ウェル
を３度洗浄した。ＰＢＳ−ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎで、ビオ
チンラベルしたウサギ抗−ＢＰＩ ２３抗体を１／４００
０に希釈し、５０μＬをすべてのウェルに加えた。次い
でプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。引
き続き、洗浄用緩衝液を用いてすべてのウェルを３度洗
浄した。アルカリホスファターゼでラベルしたストレプ
トアビジン（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉｎｃ．、ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア
州）をＰＢＳ−ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎで１／２０００に希
釈し、すべてのウェルに５０μＬ加えた。３７℃にて１
５分間インキュベートした後、すべてのウェルを、洗浄
用緩衝液で３度、脱イオン水で３度洗浄し、基質である
ｐ−ニトロフェニルホスフェート（１０％ジエタノール
アミン緩衝液中、１ ｍｇ／ｍＬ）を、すべてのウェル
に５０μＬの容量にて添加した。室温にて１時間、発色
を進行させ、その後、反応を停止するために５０μＬの
１Ｎ ＮａＯＨを加えた。Ｖｍａｘ Ｐｌａｔｅ Ｒｅ
ａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏ
ｒｐ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、カリフォルニア州）を
用いて、すべてのウェルについて４０５ ｎｍにおける
吸光度を測定した。 【００２３】第１次インキュベーション工程において試
料希釈用緩衝液（ＢＰＩ不含）のみを入れたウェルのＡ
４０５の平均値を引くことにより、バックグラウンドに
対するすべての試料及び標準物質（３重試験における）
についての４０５ ｎｍにおける吸光度（Ａ４０５）の
平均値を補正した。次いで、ｒＢＰＩまたはｒＢＰＩ
２３のｎｇ／ｍＬに対するＡ４０５として、標準曲線を
プロットした。直線領域を選択し、直線回帰分析を行っ
て、標準曲線から内挿することにより、試料及びコント
ロールに対する濃度を決定した。 【００２４】（実施例４：マウスモノクローナル抗−Ｂ
ＰＩ抗体の調製）本実施例では、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
１９６頁（１９８８）の標準技術を用いて、マウスモノ
クローナル抗−ｒＢＰＩ抗体 ６Ｃ２を調製した。詳細
には、ハイブリドーマ細胞系は、ＮＳ−１マウスミエロ
ーマ細胞と、ｒＢＰＩホロタンパク質で免疫したＢａｌ
ｂ−Ｃマウスからの脾細胞との化学的融合体に由来する
ものであった。抗−ＢＰＩ抗体を分泌しているハイブリ
ドーマ細胞の同定は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ
により、細胞培養上清をスクリーニングすることにより
成し遂げた。続いて、ハイブリドーマ細胞系６Ｃ２を、
限界希釈により３度クローン化した。該細胞系により生
産されるモノクローナル抗体はＩｇＧ１、ｋイソタイプ
として特徴付けられる。ハイブリドーマ細胞系は、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖ
ｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州 ２８３０２
に寄託され、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ１１５１２として登
録されている。 【００２５】捕獲剤としてウサギポリクローナル抗−Ｂ
ＰＩ抗体または６Ｃ２により生産される抗体のいずれか
を用いた場合のｒＢＰＩ標準曲線によれば、ウサギ抗体
に比較すると、６Ｃ２モノクローナル抗体の方が、わず
かに優れた感度が達成されることが示された。６Ｃ２に
基づいて行ったＥＬＩＳＡにおけるｒＢＰＩ２３の免疫
反応性は、ｒＢＰＩホロタンパク質よりもおよそ１００
０倍低かった。従って、６Ｃ２モノクローナル抗体は、
容易にｒＢＰＩまたは天然型ＢＰＩを捕獲するが、ｒＢ
ＰＩ２３は容易に捕獲しないものである。６Ｃ２ ＢＰ
ＩサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで、ｒＬＢＰとの交
差反応性が極小を呈することも示された。 【００２６】（実施例５：ヘパリン、デキストラン硫酸
及びＮａＣｌの感度に対する効果）本実施例では、ＢＰ
Ｉサンドイッチアッセイの感度に対する、ヘパリン、デ
キストラン硫酸（分子量８ ｋＤａ及び５００ ｋＤ
ａ）または１ Ｍ塩化ナトリウムの効果の比較を行っ
た。図１に示される結果より、ｒＢＰＩ（図１ａ）及び
ｒＢＰＩ２３（図１ｂ）の双方に対して、ヘパリン及び
低分子量デキストラン硫酸（分子量８ ｋＤａ）が、バ
ックグラウンドを減じてアッセイ感度を高めるうえで、
量ベースで同等に有効であることが示唆される。対照的
に、高分子量のデキストラン硫酸（分子量５００ ｋＤ
ａ）は、緩衝液コントロールに比して、アッセイ感度を
低減させた。高濃度塩でアッセイ感度は最も大きく向上
したが、ｒＢＰＩ２３に対しては、ヘパリンを用いた場
合と同じ程度にバックグラウンドシグナルが減じられる
ことはなかった。しかして、以後のアッセイすべてにつ
いて、１０ユニット／ｍＬにてヘパリンを利用した。 【００２７】（実施例６：標準曲線の特徴）本実施例に
おいて、図２ａ及び２ｂに示すように、ｒＢＰＩ及びｒ
ＢＰＩ２３の標準曲線は、いくつかの別個のアッセイ間
で再現性があることが見出された。観察されたＡ４０５
を用いた濃度の直線回帰分析により、ｒＢＰＩ及びｒＢ
ＰＩ ２３の双方に対する直線的な濃度の呼応（それぞ
れ、Ｒ２＝０．９９７及び０．９９９）が立証された。
直線領域は、ｒＢＰＩの標準曲線については１００〜６
０００ ｐｇ／ｍＬであり、ｒＢＰＩ２３の標準曲線に
ついては２５〜８００ｐｇ／ｍＬであった。 【００２８】（実施例７：プールしたヒト血漿に加えた
ｒＢＰＩ及びｒＢＰＩ２３の測定）本実施例では、プー
ルしたクエン酸化ヒト血漿に、異なる濃度のｒＢＰＩま
たはｒＢＰＩ２３を加え、次いで、サンドイッチＥＬＩ
ＳＡアッセイにおける測定前に凍結及び融解を施した。
加えたＢＰＩの回取率は、ＢＰＩを加えたヒト血漿試料
で測定したＢＰＩの量から、ＢＰＩを加えていないコン
トロールにおける濃度を差し引き、それを実際に試料に
加えた量で割った値として決定した。得られた分数に１
００をかけ、その結果を、インプット濃度の百分率とし
て表現した。プールしたヒト血漿試料に加えた、異なる
濃度のｒＢＰＩの回収率は、平均で８３％であり、３０
０ ｎｇ／ｍＬで６５％から、３ ｎｇ／ｍＬで９７％
までの範囲にあった。ｒＢＰＩ２３の回収率は、平均５
６％であり、０．５ ｎｇ／ｍＬで３０％から、５０，
０００ ｎｇ／ｍＬで９０％までの範囲にあった。表Ｉ
及びＩＩに、血漿試料に加えた各ＢＰＩについての回収
率のデータを要約する。 【００２９】 【表１】 【００３０】 【表２】（実施例８：ｒＬＢＰ、ｒＢＰＩ及びｒＢＰＩ２３の免
疫反応性の比較）本実施例では、ＢＰＩサンドイッチＥ
ＬＩＳＡにおいて、ｒＬＢＰ、ｒＢＰＩ及びｒＢＰＩ
２３の免疫反応性を比較し、可能な免疫学的交差反応性
を調べた。ＬＢＰとＢＰＩとの間にかなりの配列の相同
性がある（Ｓｃｈｕｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４
９巻、１４２９頁（１９９０））にもかかわらず、図３
に示される結果により、量ベースで、ｒＬＢＰは、ｒＢ
ＰＩ２３のシグナルよりもおよそ５桁低い強さのシグナ
ル、ｒＢＰＩのシグナルよりも４桁低い強さのシグナル
しか出さないことが示される。例えば、１００，０００
ｎｇ／ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ）の濃度のｒＬＢＰ
は、３ ｎｇ／ｍＬのｒＢＰＩまたは０．６ ｎｇ／ｍ
ＬのｒＢＰＩ２３により出されると同等のシグナルを産
生した。３，１２５ ｎｇ／ｍＬを下回る濃度のｒＬＢ
Ｐでは、ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、定量
可能なシグナルは検出されなかった。これらの結果か
ら、ＬＢＰとの抗体の交差反応性が最少であることが立
証され、ＢＰＩに対するアッセイの特異性が確認され
た。 【００３１】（実施例９：処理時間及び遠心力の効果）
本実施例では、クエン酸化血漿中のＢＰＩの測定に対す
る、処理時間及び遠心力の効果も研究した。概して、ク
エン酸化血漿のための処理時間が増大すると、４００
ｇ（斜平行線を付したバー）または１３００ ｇ（黒塗
りのバー）（図６）のいずれかで遠心が行われた場合、
ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定される内在的
なＢＰＩの量は増大した。採取後３０分以内に、およそ
１３００ｇの遠心力で処理した血漿試料において、最も
低い内在的ＢＰＩレベルが測定された。 【００３２】（実施例１０：血清及び血漿試料のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析）本実施例で
は、血清及び血漿試料について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び
ウェスタンブロット分析を行った。詳細には血清及び血
漿試料を、１０ユニット／ｍＬのヘパリンナトリウムを
含むＰＢＳ−ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ等容量で希釈した。前
記したＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡに関すると同様
に、アフィニティー精製したウサギ抗−ｒＢＰＩ２３抗
体で被覆しておき脱脂乳を用いてブロッキングしておい
たミクロタイタープレートの６重試験を行うようにした
ウェルに、希釈した血清及び血漿試料を５０μＬの容量
で添加した。３７℃にて１時間インキュベートした後、
洗浄用緩衝液を用いて、ウェルを９度洗浄した。捕獲し
た免疫反応性物質は、各試料に対して６重試験を行うよ
うにしたウェルにおいて、続いて６０μＬのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ試料用緩衝液（４％ＳＤＳ、１０％グリセロー
ル、０．００４％ブロモフェノールブルー及び０．０２
％ ＮａＮ３を含む、０．１２５ ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ ６．８）でインキュベート（室温で振盪しな
がら、ウェル当たり３分間）し、移すことによって可溶
化した。各試料について、捕獲され可溶化された免疫反
応性物質の最終容量は、およそ５０μＬであった。 【００３３】各可溶化試料１５μＬを、Ｌａｅｍｍｌ
ｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻、６８０頁（１９７０）の
条件下で、非還元１０％ゲルにおいて流した。タンパク
質を標準技術（Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９）によって、
ニトロセルロースに転写した。ブロットしたタンパク質
は、ビオチンラベルしたウサギ抗−ＢＰＩ２３抗体
（０．２Ｍ ＮａＣｌ及び０．３％ Ｔｗｅｅｎ ２０
を含む、０．０２５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．２（ＴＢＳＴ）で１／２０００に希釈）またはＴＢ
ＳＴで１／１０００に希釈したウサギ抗−ｒＢＰＩ抗血
清との免疫反応性につき、それら抗体をプローブとして
用いて調べた。ビオチンラベルしたウサギ抗−ＢＰＩ
２３抗体に続いては、ＴＢＳＴで１／４０００に希釈し
たアルカリホスファターゼ接合ストレプトアビジン（Ｚ
ｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａ
ｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、カリフォルニア州）を入れ
た。ラベルしていない抗−ｒＢＰＩ抗血清については、
アルカリホスファターゼ接合ストレプトアビジンとイン
キュベートするに先立ち、ＴＢＳＴで１／２０００に希
釈した、ビオチンラベルしたヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｚ
ｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａ
ｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、カリフォルニア州）とのイン
キュベーションを行った。各インキュベーションの後、
ＴＢＳＴで４度、ブロットを洗浄した。０．０１％（重
量／容量）ニトロブルーテトラゾリウム及び４ ｍＭ
ＭｇＣｌ２を含む、０．１２ Ｍベロナール−酢酸緩衝
液、ｐＨ ９．８に溶かした、５０μｇ／ｍＬの基質５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート
（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ、ミズーリー州）の溶液の中に、ブロットを浸漬
した。発色は、室温にて１時間進行させた。ウェスタン
ブロットのレーンは、デンシトメーター（Ｓｈｉｍａｄ
ｚｕ Ｍｏｄｅｌ ＣＳ９０００Ｕ、Ｓｈｉｍａｚｕ
Ｃｏｒｐ．、Ｋｙｏｔｏ、日本国）を反射モードで用い
て走査し、面積の積分計算により定量した。 【００３４】ＥＬＩＳＡの免疫反応性がホロ−ＢＰＩ、
ＢＰＩの断片、または無関係な免疫反応性物質の存在に
よるものかどうかを確認するために、２つの異なる抗体
プローブを利用して、血漿及び血清試料につきウェスタ
ンブロット分析を実施した。これらの実験のために、ア
フィニティー精製した抗−ＢＰＩ２３抗体を被覆したミ
クロタイタープレートを用いて、血漿及び血清から直接
的に免疫反応性物質を捕獲した。アフィニティーで捕獲
した物質は、次いで、試料処置用緩衝液に溶出し、非還
元条件下で電気泳動により分離し、ニトロセルロースに
対してブロットして、その後、抗−ＢＰＩ抗体をプロー
ブとして用いて調べた。図７に言及すると、各ブロット
の上部の番号がレーンを表し、一方、右側の番号は分子
量を示す。ブロットＡ：レーン１ ブランク、レーン２
ｒＬＢＰ（１００μｇ／ｍＬ）、レーン３ ｒＢＰＩ
（１００ ｎｇ／ｍＬ）、レーン４〜１２ ヒト血清試
料、レーン１３ 天然型ＢＰＩ。ブロットＢ：レーン１
〜３ ブロットＡに同じ、レーン４〜１４ ヒト血清試
料、レーン１５ 天然型ＢＰＩ。（ブロットＡのレーン
７、１０及び１２ならびにブロットＢのレーン４、５、
６及び１４に対して、ニトロセルロースブロット上６２
及び６４ ｋＤａに、弱く目視可能なバンドが検出され
たが、図面においてそのバンドはうまく再現されなかっ
た。ブロットＡ及びＢの双方のレーン２に対して、ニト
ロセルロースブロット上６９．５及び１１４．４ ｋＤ
ａにも、バンドが検出されたが、図面において充分に再
現されなかった。）アフィニティー精製した抗−ＢＰＩ
２３抗体をプローブとして用いてブロットを調べた場
合、ＥＬＩＳＡ免疫反応性は、６２，０００及び６４，
０００ Ｄａの見かけの分子量を有する２つのバンドの
存在に相関性を有しているようであった。ヒト好中球か
ら抽出した天然型ＢＰＩもまた、６２，０００及び６
４，０００ Ｄａのバンドとして移動した。好中球から
抽出したＢＰＩ及びいくつかのヒト血清試料由来のＢＰ
Ｉの双方において、５０ ｋＤａでかすかなバンドが検
出された（これは図７では目視不能である）。このバン
ドは、ＢＰＩのグリコシル化されていないフォーム（分
子量５０，６５９）を表すものかもしれず、検出した総
ＢＰＩの７％に満たなかった。ｒＢＰＩは、６４，００
０ Ｄａに単一バンドとして移動した。これらの血漿ま
たは血清試料に対するウェスタンブロットで、他の免疫
反応性を有するバンドは目視されなかった。これらの方
法によって、ヒト血漿に加えたｒＢＰＩ２３も検出さ
れ、ｒＢＰＩと天然型ＢＰＩとが、容易に識別可能であ
った（データは示さない）。１００，０００ ｎｇ／ｍ
Ｌにて、抗−ＢＰＩ２３を被覆したウェルにｒＬＢＰを
加えて、前記と同様に処理した場合、６９，５００及び
１１４，４００ Ｄａの見かけの分子量を有する、２つ
の弱い反応性を示すバンドが識別可能であった（これは
図７では目視不能である）。ｒＬＢＰのバンドを合わせ
た強度（積分計算したピーク面積として測定）は、重量
ベースでｒＢＰＩピーク面積よりもおよそ５，０００倍
低かった。 【００３５】これらと同じ血清試料を、抗−ｒＢＰＩ抗
血清をプローブとして用いて調べた場合、やはり、ＥＬ
ＩＳＡ免疫反応性は６２，０００／６４，０００ Ｄａ
のタンパク質ダブレットの存在に相関性を有しており、
ＥＬＩＳＡシグナルとウェスタンブロットの２つのＢＰ
Ｉバンドに対する積分計算したピーク面積との間に、有
意な相関性（Ｒ２＝０．８０７、ｐ＝０．０００１）が
観察された（図８）。１００μｇ／ｍＬにて加えたｒＬ
ＢＰは、抗−ｒＢＰＩ抗血清をプローブとして用いて調
べた場合、検出不能であった。これらのデータにより、
ＥＬＩＳＡによって検出される血清及び血漿の内在的な
免疫反応性は、ホロ−ＢＰＩによるのであって、ＢＰＩ
の断片または他の交差反応性を有する物質によるのでは
ないことが示唆される。 【００３６】（実施例１１：ヒト血漿及び血清における
内在的なＢＰＩ免疫反応性の測定）本実施例では、ヒト
ＡＣＤ血漿及び血清における内在的なＢＰＩ免疫反応性
を調べた。血漿及び血清試料は、２０名の異なる健常ヒ
ト提供者から採取した。ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡ
及び標準物質としてｒＢＰＩを利用して、これらの各試
料について、ＢＰＩレベル（ｎｇ／ｍＬ）を調べた。試
験を行ったすべての個体につき、図４に示す結果によ
り、血清試料（斜平行線を付したバー）の方が、相対応
する血漿試料（黒塗りのバー）に比較して、ＢＰＩレベ
ルは一貫して高かったことが示される。平均ＢＰＩ濃度
は、血漿において０．８ ｎｇ／ｍＬであり、血清にお
いては２７．１ ｎｇ／ｍＬであった。ＢＰＩの濃度範
囲は、血漿において０．２未満〜２．１ ｎｇ／ｍＬで
あり、血清においては４．９〜７２．１ ｎｇ／ｍＬで
あった。ＡＣＤ血漿を用いて得られたＢＰＩ値と同様の
ＢＰＩ値が、クエン酸化血漿またはＥＤＴＡ血漿におい
て測定された。予備的な結果では、ヘパリン化した血漿
における数値の方がわずかに高いことが示唆されてい
る。 【００３７】次いで、２０名の敗血症患者から採取した
ＥＤＴＡ血漿及び血清試料について、実験を繰り返し
た。図５に示すその結果から、同じ患者について、血漿
及び血清レベルが同様でないことが示される。さらに
は、そのＢＰＩレベルは、血漿ＢＰＩレベルが常に低か
った健常な患者のものとは異なっている。正常及び敗血
症患者の血清におけるＢＰＩレベルの統計的分析によっ
て、双方の間に統計的な有意差はないことが示される
（ｐ＝０．１０）。健常及び敗血症個体の血清における
ＢＰＩレベルを示す散布図を、図９ａに示す。これとは
対照的に、図９ｂの散布図により示されるように、正常
及び敗血症患者の血漿におけるＢＰＩレベルの差は、高
度に統計的有意性を示すものである（ｐ＝０．００１
４）。 【００３８】（実施例１２：敗血症患者のヒト血漿にお
ける、内在的なＢＰＩの免疫反応性の臨床的相関性）本
実施例では、グラム陰性の病因が疑われる６６名の敗血
症患者から採取したヒトＥＤＴＡ血漿試料における、内
在的なＢＰＩの免疫反応性を、ＢＰＩサンドイッチアッ
セイを用いて定量し、同じ試料から得られた種々の臨床
的パラメータ及び測定値と、ＢＰＩのレベルとの相関性
を調べた。加うるに、ＢＰＩレベルと３０日間にわたる
生存との相関性を調べた。生存分析を簡易に行うため
に、これらの試料に対するＢＰＩの中間レベルが４．８
ｎｇ／ｍＬであることを計算し、このレベルを用い
て、高レベル（＞４．８ ｎｇ／ｍＬ）のＢＰＩを有す
る患者、及び低レベルのＢＰＩ（＜４．８ ｎｇ／ｍ
Ｌ）を有する患者とに、患者を分類した。このようにし
て５９名の患者からのデータを分類した場合、ＢＰＩの
内在的なレベルと１４日間の生存との間に明白な相関性
があった。特に、中間値を下回るＢＰＩレベルを有する
被験者は１４日生存レベルがより高く、その相関性は統
計学的には有意でなかったものの、より低いＢＰＩレベ
ルが、より高い生存に相関していることを示唆してい
た。３０日間の生存率に関しては、２つの群の間で差異
は観察されなかった。 【００３９】前処置ＢＰＩレベルと、年齢及びＡＰＡＣ
ＨＥ ＩＩ（急性・生理学的・年齢・慢性・健康評価
（Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｇｅ Ｃｈｒ
ｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ））ス
コアの双方との間の、逆の相関性が、結果により開示さ
れた。ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアは、長期間の生存を予
知するものであり、より低いＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコア
は、生存に対する見込みがより大きいことを示唆してい
る。従って、１４日間の生存について負の相関性を示し
たにもかかわらず、初発の内在的なＢＰＩレベルがより
高いことと、ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアに従う長期間生
存に対する見込みがより大きいこととは相関性を有して
いた。その結果より、初発の内在的なＢＰＩレベルと、
（ｉ）診断以後の時間、（ｉｉ）白血球細胞カウント
数、（ｉｉｉ）絶対的な好中球カウント数、（ｉｖ）血
小板カウント数、（ｖ）罹患率の数値、（ｖｉ）重篤／
軽度の罹患率の数値、（ｖｉｉ）性、（ｖｉｉｉ）人
種、（ｉｘ）感染タイプ、または（ｘ）罹患状態のタイ
プとの間の相関性は示唆されなかった。 【００４０】（実施例１３：敗血症及び臨床的疾患を有
する小児における、内在的なＢＰＩレベル）敗血症に罹
患している９名の小児及び、敗血症ではない臨床的疾患
を有する１３名の小児から得たＡＣＤ血漿試料における
ＢＰＩの免疫反応性を、実施例３のＥＬＩＳＡ法を用い
て求め、図１０に示すように結果を比較した。敗血症の
９名の小児のうち８名が、健常な成人血漿ＢＰＩレベル
の平均値に標準偏差の２倍を加えた、合計で１．７ ｎ
ｇ／ｍＬに比べて、さらに高い血漿ＢＰＩレベルを有し
ていた。敗血症ではない臨床的疾患を有する小児のＢＰ
Ｉ血漿レベルは、試験した被験者の約５０％において高
い数値を示した。 【００４１】（実施例１４：正常及び嚢胞性線維症患者
における肺洗浄液試料中の内在的なＢＰＩレベル）本実
施例では、正常個体及び嚢胞性線維症患者から得られた
肺洗浄液試料における内在的なＢＰＩ免疫反応性を、比
較した。概して、正常ヒト被験者から得た肺洗浄液試料
由来のＢＰＩ濃度は０．０５ ｎｇ／ｍＬを下回り、一
方嚢胞性線維症患者からの肺洗浄液試料は、１０ ｎｇ
／ｍＬから１００ ｎｇ／ｍＬ及びそれ以上の範囲で、
高いＢＰＩ濃度を呈していた。 【００４２】（実施例１５：慢性関節リウマチ患者から
の滑液試料における内在的なＢＰＩレベル）本実施例で
は、慢性関節リウマチ患者の滑液における内在的なＢＰ
Ｉ免疫反応性を、ＢＰＩサンドイッチアッセイを利用し
て調べた。滑液試料は、慢性関節リウマチに罹患してい
る１３名の患者の、関節炎におかされた関節から得た
が、いくつかの試料は、違う日に同じ患者から得たもの
であった。滑液が高粘度であるために、これらの試料
は、３７℃にて１５分間、最終濃度１００ユニット／ｍ
Ｌのヒアルロニダーゼで処置し、次いで１０，０００
ｇで１０分間、遠心をした。図１１にそれらの試料の分
析結果を表すが、試料のうち１つ以外のすべてについ
て、２５ ｎｇ／ｍｌを越える、上昇したＢＰＩ濃度が
示される。滑液中のＢＰＩの濃度は、健常被験者の血漿
中のＢＰＩ濃度を実質的に上回っており、それら濃度が
活動性関節炎状態の存在または重篤さの度合の指標とな
るかもしれない。 【００４３】（実施例１６：慢性関節リウマチ、骨関節
炎または活動性関節炎の患者からの滑液試料における内
在的なＢＰＩレベル）本実施例では、慢性関節リウマ
チ、骨関節炎または活動性関節炎に罹患している患者の
滑液試料における、内在的なＢＰＩ免疫反応性を、ＢＰ
Ｉサンドイッチアッセイを利用して調べた。実施例１５
の方法に従って、慢性関節リウマチに罹患している８名
の患者、骨関節炎に罹患している８名の患者及び活動性
関節炎に罹患している８名の患者の、関節炎におかされ
ている関節から、滑液試料を得た。それら試料の分析の
結果を図１２に表すが、慢性関節リウマチに罹患してい
る患者のすべて及び活動性関節炎に罹患している患者の
ほとんどについてＢＰＩレベルが高くなっていることが
示されており、これらの関節炎はいずれとも、炎症性の
関節疾患である。対照的に、非炎症性の退行変性関節疾
患である骨関節炎に罹患している被験者のほとんどが、
その滑液中におけるＢＰＩのレベルの上昇をともなって
いないようであった。詳しくは、骨関節炎に罹患してい
る被験者における滑液のＢＰＩの濃度の平均値は約２６
ｎｇ／ｍＬであり、その濃度を標準偏差の２倍分上回
るレベルは、約１５２ ｎｇ／ｍＬであった。 【００４４】（実施例１７：慢性関節リウマチ患者から
の血漿試料における内在的なＢＰＩレベル）本実施例で
は、慢性関節リウマチ患者のＥＤＴＡ血漿における内在
的なＢＰＩ免疫反応性を、実施例３のＢＰＩサンドイッ
チアッセイを利用して調べた。図１３に、慢性関節リウ
マチに罹患している患者８０名及び健常被験者２３名に
ついてのＢＰＩ血漿レベルの散布図を表すが、被験者間
での統計学的有意差が示される。慢性関節リウマチ患者
に対する血漿ＢＰＩレベルの平均値は２５．７ ｎｇ／
ｍＬであり、それに比べて健常被験者については、０．
８ ｎｇ／ｍＬであった。 【００４５】（実施例１８：健常被験者におけるＬＰＳ
投与の内在的なＢＰＩレベルに対する効果）本実施例で
は、健常ヒト被験者におけるＬＰＳ投与の、内在的なＢ
ＰＩ免疫反応性に対する効果を調べる。詳細には、４
ｎｇ／ｋｇ ＬＰＳの静脈内投与（被験者８名）または
ＬＰＳ非投与（被験者１４名）後の種々の時点における
ＢＰＩ血漿レベルの変化について、ＢＰＩサンドイッチ
アッセイを利用して、健常被験者をモニターした。その
結果を図１４に表すが、時間に応じて血漿ＢＰＩ濃度の
平均値が変化することが示されている。ＬＰＳを用いて
処置した被験者に関しては、ＬＰＳ投与の後１時間でＢ
ＰＩレベルが上昇し始めた。ＬＰＳ投与後２〜４時間の
間に、ほとんどの被験者でＢＰＩ血漿レベルのピークが
観察された。ＢＰＩレベルのベースラインからピークへ
の平均的な上昇率は、およそ８倍であった。この時間全
体にわたって、コントロールの被験者におけるＢＰＩレ
ベルの平均値は、正常値の領域（＜２．１ ｎｇ／ｍ
Ｌ）内に留まっていた。 【００４６】ＤＩＣ及びＡＲＤＳを包含する敗血症に関
連した状態を包含する、細菌感染、内毒素血症及び敗血
症の症候と、ＢＰＩ血漿レベルとの相関関係が、さらな
る分析によって示されることが予期される。さらに、外
来的に投与したｒＢＰＩ及びｒＢＰＩ２３は速やかに動
物体内の循環系から除去され、そして、ヒトにおいても
ｒＢＰＩ２３の除去が速やかに行われるので、ヒトの体
液中のＢＰＩレベルが高まっていることは、試料採取時
に生じている活動性の炎症プロセスを反映していると考
えられる。 【００４７】当業者であれば、本明細書における本発明
の好ましい実施態様の前記記載を考慮して、本発明を実
施する上で多くの修正や変更を想起することが予測され
る。よって、本発明の範囲は、添付の請求の範囲に登載
される限定のみによってしか、限定を受けるものではな
い。 【００４８】 【発明の効果】本発明により、血液試料についてＢＰＩ
イムノアッセイを行う方法に従って、血液試料を包含す
る体液試料におけるＢＰＩレベルを定量するための方法
であって、血液試料が血漿である方法が提供される。
国特許出願第０８／１２５，６７７号の一部継続出願で
ある、１９９３年１２月２９日出願の米国特許出願第０
８／１７５，２７６号の一部継続出願である。 【０００２】 【発明の属する技術分野】本発明は、血液試料を包含す
る体液試料中の殺菌／浸透性増強タンパク質の存在を調
べるための方法に関する。 【０００３】 【従来の技術】殺菌／浸透性増強タンパク質（ＢＰＩ）
は、ヒト及び動物の好中球のアズール顆粒から精製され
た陽イオン性、抗−微生物性のタンパク質である（Ｗｅ
ｉｓｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５３巻、２６
６４頁（１９７８）、Ｅｌｓｂａｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４巻、１１０００頁（１９７
９））。ＢＰＩはグラム陰性細菌の外膜のリポ多糖（Ｌ
ＰＳ）成分に結合する（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒ
ｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６０巻、４７５４
頁（１９９２））。近年、ヒトＢＰＩの組換え型（ｒＢ
ＰＩ２３）の特徴付けが行われ、天然型のＢＰＩの特徴
との比較がなされている。ｒＢＰＩ２３断片は、ホロ−
ＢＰＩのアミノ末端２３ ｋＤａ部分からなり、天然型
のＢＰＩの ＬＰＳ結合特性、のみならず、抗−微生物
活性を保持している（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９０巻、１１２２
頁（１９９２）、Ｗｅｉｓｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．、９０巻、１１２２頁（１９９２））。 【０００４】ＢＰＩレベルは、いずれの体液において
も、これまでに正確にはアッセイされていない。ｒＢＰ
Ｉ２３ならびに他のＢＰＩタンパク質及びタンパク質産
物が潜在的に臨床上の用途を有しているので、体液中の
ＢＰＩの存在及び量を測定するために、感度が良く且つ
再現性のあるアッセイが必要である。特に、体液中のＢ
ＰＩの測定は、診断目的のために有用であるかもしれな
い。Ｐｅｒｅｉｒａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ、１１７巻、１１５頁（１９８９）には、ヒト好中
球の粗顆粒抽出物においてＢＰＩを調べるための競合Ｅ
ＬＩＳＡアッセイが開示されている。Ｐｅｒｅｉｒａら
は、ヘパリンまたはデキストラン硫酸などのポリアニオ
ン類を用いた処置によって、ＥＬＩＳＡアッセイにおけ
る陽イオン性タンパク質の非特異的相互作用を最小にく
い止めることができることも、開示している。Ｐｅｓｃ
ｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、８７巻、
２１頁（１９８６）も参照されたい。しかしながら、Ｐ
ｅｒｅｉｒａらの競合アッセイは感度に限界があるとい
う特徴を有する。従って、哺乳動物体液中の内在的なＢ
ＰＩレベルを測定することができる、より高感度のＢＰ
Ｉアッセイが、依然として当該技術分野において希求さ
れている。本出願においてさらに興味深いのは、グラム
陰性敗血症の患者及び健常被験者におけるＢＰＩの血清
レベルについてのアッセイの結果を開示している、ｖｏ
ｎ ｄｅｒ Ｍｏｈｉｅｎら、抄録、１３ｔｈ Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｉ
ｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｅｎ
ｃｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ブリュッセル（１９９３年３
月）の開示である。その抄録では、すべての敗血症患者
において体循環しているＢＰＩが検出された一方で、健
常被験者の血清におけるアッセイの条件下ではＢＰＩが
検出されえなかったことを開示していた。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、血液試料に
ついてＢＰＩイムノアッセイを行う方法に従って、血液
試料を包含する体液試料におけるＢＰＩレベルを定量す
るための方法であって、血液試料が血漿である方法を提
供するものである。 【０００６】 【課題を解決するための手段】血漿は、新鮮な凝固して
いない血液から、白血球及び赤血球を分離した後に残存
する血液体である。血清は、凝固した血液が遠心により
分離されて残存する血液体（すなわち、血液の凝塊因子
を含まない血漿）である。本発明の１つの特徴として、
血清中に存在するＢＰＩのレベルは、体循環している血
液中のＢＰＩの内在的なレベルを表すものではなく、一
方、血漿中のＢＰＩのレベルは、前記の内在的なレベル
を表すものであることが、教示される。本発明のさらな
る特徴として、被験者におけるグラム陰性敗血症の存在
を調べるための方法が提供され、かかる方法は、その被
験者から得た血漿試料中の内在的な細胞外ＢＰＩの濃度
を定量すること、及びその濃度をグラム陰性敗血症の指
標たる標準値と比較することを含むものである。かかる
標準値は、１．７ ｎｇ／ｍＬでありえ、これは正常の
ヒト血漿ＢＰＩに対する平均値である０．８ｎｇ／ｍＬ
を標準偏差の２倍分上回る値である。従って、正常ヒト
血漿ＢＰＩ濃度に対する平均値を、標準偏差の２倍分上
回る値を越えた数値が、グラム陰性敗血症の指標であ
る。 【０００７】本発明の好ましい方法により、サンドイッ
チイムノアッセイを用い、そしてさらに、ＢＰＩイムノ
アッセイにおいてヘパリン及びデキストラン硫酸からな
る群より選択された陽イオン性の非特異的ブロッキング
剤を利用して、血液血漿などの体液中の細胞外ＢＰＩの
濃度が調べられる。血清、尿、肺洗浄液（ｌｕｎｇｌａ
ｖａｇｅｓ）、硝子体液、歯肉溝液（ｃｒｅｖｉｃｕｌ
ａｒ ｆｌｕｉｄ）、脳脊髄液、唾液及び滑液を包含す
る他の体液（これらに限定されるものではない）中のＢ
ＰＩの濃度を調べるために、本発明のＢＰＩイムノアッ
セイを用いることもできる。 【０００８】本発明のさらなる特徴として、被験者にお
ける活動性炎症状態の存在を調べるための方法が提供さ
れ、これには、被験者から得た液体試料中の内在的なＢ
ＰＩの濃度を調べること、及びその濃度を活動性炎症状
態の標準指標と比較することが含まれる。活動性炎症状
態の存在を調べるためにアッセイされるべき体液が血液
血漿である場合、活動性炎症状態の標準指標は、１．７
ｎｇ／ｍＬとすることができ、これは、正常のヒト血
漿ＢＰＩに対する０．８ ｎｇ／ｍＬという平均値を標
準偏差の２倍分上回る数値である。従って、正常ヒト血
漿ＢＰＩ濃度に対する平均値を、標準偏差の２倍分上回
る値を越えた数値が、活動性炎症状態の存在の指標であ
る。本発明によって、さらに、被験者から得た滑液の試
料中の内在的なＢＰＩの濃度を調べ、そして、その濃度
を活動性炎症状態の指標たる標準値と比較することによ
って、慢性関節リウマチ及び活動性関節炎からなる群よ
り選択される活動性炎症状態の存在を調べる方法が提供
される。慢性関節リウマチ及び活動性関節炎の滑液の場
合、活動性炎症状態の標準指標は、１５２ ｎｇ／ｍＬ
を越える値でありえ、これは、非炎症状態における滑液
ＢＰＩに対する平均値である２６ ｎｇ／ｍＬを、標準
偏差の２倍分上回る値である。 【０００９】一般に、ＢＰＩについての尿のアッセイで
は、ほとんど、もしくは全く、ＢＰＩを検出しないので
あるが、尿管に感染を有する被験者においては、尿のＢ
ＰＩレベルが高まっているかもしれない。 【００１０】本発明は、以下を提供する： １．血液試料中のＢＰＩの存在を定量するためのイムノ
アッセイ方法であって、血漿をアッセイする工程を含む
ことにより改善された方法。 ２．血漿のイムノアッセイが、ヘパリン及びデキストラ
ン硫酸からなる群より選択された陽イオン性の非特異的
ブロッキング剤の存在下にて行われる、第１項記載の方
法。 ３．被験者におけるグラム陰性敗血症の存在を調べるた
めの方法であって、 該被験者から得た血漿試料中の内
在的なＢＰＩの濃度を調べ、及び その濃度をグラム陰
性敗血症の指標たる標準値と比較する工程を含む方法。 ４．ＢＰＩの濃度が、ＢＰＩイムノアッセイによって調
べられる、第３項記載の方法。 ５．前記イムノアッセイが、サンドイッチイムノアッセ
イである、第３項記載の方法。 ６．前記イムノアッセイが、ヘパリン及びデキストラン
硫酸からなる群より選択された陽イオン性の非特異的ブ
ロッキング剤の存在下にて行われる、第５項記載の方
法。 ７．被験者における活動性炎症状態の存在を調べるため
の方法であって、 該被験者から得た液体試料中の内在
的なＢＰＩの濃度を調べ、及び その濃度を活動性炎症
状態の指標たる標準値と比較する工程を含む方法。 ８．前記活動性炎症状態が、慢性関節リウマチ及び活動
性関節炎からなる群より選択される、第７項記載の方
法。 ９．前記液体試料が滑液である、第８項記載の方法。 １０．前記液体試料が血液血漿である、第７項記載の方
法。 １１．ＢＰＩの濃度が、ＢＰＩイムノアッセイによって
調べられる、第７項記載の方法。 １２．前記イムノアッセイが、サンドイッチイムノアッ
セイである、第１１項記載の方法。 １３．前記イムノアッセイが、ヘパリン及びデキストラ
ン硫酸からなる群より選択された陽イオン性の非特異的
ブロッキング剤の存在下にて行われる、第７項記載の方
法。 【００１１】 【発明の実施の形態】本発明は、血液を包含する体液に
おける細胞外ＢＰＩの存在を定量するための方法に関
し、かかる方法は、該被験者から得た血漿についてＢＰ
Ｉイムノアッセイを行うことを含むものである。このア
ッセイは、治療的に投与された、すなわち外来性の、Ｂ
ＰＩの存在及び量を調べるために有用であるが、かかる
アッセイは、被験者におけるグラム陰性敗血症を包含す
る敗血症の存在の指標として、体循環血液中の内在的な
細胞外ＢＰＩの存在を定量するために、特に好適であ
る。また、体循環血液中の内在的な細胞外ＢＰＩの存在
を定量することは、敗血症患者を評価するための予後の
方法においてもさらに有用であると考えられる。加うる
に、本発明は、被験者から得た液体試料中の内在的なＢ
ＰＩの濃度を調べること、及びその濃度を活動性炎症状
態の指標たる標準値と比較することを含む、被験者にお
ける活動性炎症状態の存在を調べるための方法を提供す
る。 【００１２】本発明は、高いアッセイ感度、高い特異性
及び優れた再現性を呈する、ヒトＢＰＩのためのサンド
イッチＥＬＩＳＡアッセイを提供する。本明細書におい
て用いられる、アッセイ方法で定量される「ＢＰＩ」
は、天然型ＢＰＩ、組換えＢＰＩ、のみならず、ＢＰＩ
の組換えＮ−末端断片（ｒＢＰＩ２３）ならびに、他の
ＢＰＩタンパク質及びタンパク質産物を包含するもので
ある。かかるＢＰＩタンパク質産物が、ｍＬ当たりナノ
グラム以下の領域において、容易に定量されうる。免疫
学的アッセイは、好ましくは、酵素連鎖免疫吸収（ＥＬ
ＩＳＡ）サンドイッチアッセイによって実施されるが、
競合アッセイ及び他のラベル方式を利用した免疫学的ア
ッセイもまた、用いることができる。本発明の好ましい
アッセイでは、モノクローナル抗体及びアフィニティー
精製したウサギポリクローナル抗体を包含する、抗−Ｂ
ＰＩ抗体が利用される。ウサギのポリクローナル抗−Ｂ
ＰＩ抗体は、免疫源としてＢＰＩを用い、旧来の方法に
従って調製すればよい。特に好ましいモノクローナル抗
体は、旧来の方法論に従って溶液中でＢＰＩに結合する
能力に基づき選択された、Ｘｏｍａ ６Ｃ２と称される
モノクローナル抗体である。本発明の好ましい実施態様
の１つによれば、希釈用緩衝液中にヘパリンが利用され
る。ヘパリンは、バックグラウンドを減ずること、及び
アッセイシグナルを増強することの双方によって、アッ
セイ性能を向上させると考えられる。類似の効果が、低
分子量（８ ｋＤａ）のデキストラン硫酸で認められ
る。それとは対照的に、高分子量（５００ ｋＤａ）の
デキストラン硫酸は、アッセイ感度を減じ、事実上、低
分子量ポリアニオンの有益な効果とは逆効果を及ぼす。
初期の研究において、高いバックグラウンドシグナルを
生じる原因である、ミクロタイタープレートとｒＢＰＩ
２３との非特異的な相互作用が明らかになった。１０ユ
ニット／ｍＬ（およそ５５μｇ／ｍＬ）でヘパリンを入
れると、バックグラウンドシグナルが低下し、緩衝液コ
ントロールに比べてアッセイ感度が向上することにもな
った。ヘパリンをさらに高濃度（１００ユニット／ｍ
Ｌ）にしても、１０ユニット／ｍＬを用いた場合に観察
されたと同様の結果が生じた。高分子量のデキストラン
硫酸により惹起こされる阻害は、ＢＰＩの表面上のエピ
トープへの抗体の接近に対する立体的障害に起因するも
のかもしれない。 【００１３】バックグラウンドシグナルを減じるため
に、本発明のイムノアッセイにおいて高濃度の塩（１Ｍ
ＮａＣｌ）を添加することが有用である。高塩濃度を
用いると、ヘパリンよりも優れたアッセイ感度が得られ
るが、いくつかの試料については、塩がヘパリンほど有
効にバックグラウンドシグナルを低下させることはな
い。ヘパリンまたは高濃度塩を含む溶液で試料が希釈さ
れた場合に認められる感度の増強は、イオン性相互作用
が破壊されることに起因すると考えられ、一方、他の、
おそらくは疎水的な力もまた、バックグラウンドシグナ
ルに寄与しているのかもしれない。 【００１４】ＢＰＩ ＥＬＩＳＡの特異性は、２つの方
法で立証している。第１に、血清からＥＬＩＳＡプレー
ト上に免疫反応性タンパク質が「捕獲」されて引き続き
溶出され、電気泳動により分離され、ブロットされて、
抗−ｒＢＰＩ２３抗体をプローブとして用いて調べる
と、検出された唯一の物質は、ヒト好中球から抽出され
た天然型ＢＰＩと挙動を同じくする、約６０ ｋＤａの
ダブレットであった。同様に、ブロットした同じ試料
を、抗−ｒＢＰＩ抗体をプローブとして用いて調べた場
合、先に測定したＥＬＩＳＡシグナルとＢＰＩバンドの
強度とのあいだに、有意な相関性（Ｒ２＝０．８０７、
ｐ＝０．０００１）が見出された。第２に、やはりＬＰ
Ｓに結合し、ＢＰＩとかなりの配列の相同性（４４％）
を示すヒトＬＢＰでは、ｒＢＰＩまたはｒＢＰＩ２３の
それぞれで生じるよりも、３０，０００倍から１００，
０００倍低いシグナルしか生じなかった。ＥＬＩＳＡに
おいて、ｒＬＢＰは、１００μｇ／ｍｌでも、３ ｎｇ
／ｍｌのＢＰＩを下回る場合に等しいシグナルしか生じ
なかった。正常ヒト血清試料中のＬＢＰレベルは、１〜
２４μｇ／ｍｌの間（平均７μｇ／ｍｌ）であると報告
されている（Ｌｅｔｕｒｃｑら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．、１６Ｃ巻、１６１頁（１９９２））ので、
これらのデータにより、ＬＢＰが、ＢＰＩ ＥＬＩＳＡ
において極小の干渉しか惹起こさないことが示唆され
る。 【００１５】本発明の１つの特徴として、ヒト血漿にお
いてアッセイされるか、またはヒト血清においてアッセ
イされるかのいずれであるかに依存して、内在的なＢＰ
Ｉレベルが有意に異なることが見出されている。血漿
は、凝塊を防ぐために抗凝固剤（例えばクエン酸塩、酸
−クエン酸塩−デキストロース（ＡＣＤ）、ＥＤＴＡ、
ヘパリン及びヒルジン）を添加することにより得られ
る、血液の無細胞性の液体部分であり、一方血清は、凝
塊を許容する場合に血液から分離する液体である。正常
な血漿は低レベル（＜０．２〜２．１ ｎｇ／ｍｌ）の
ＢＰＩしか含まないが、同じ個体から同時に採取した血
清試料中のレベルは平均で３７倍高かった（４．９〜７
２．１ ｎｇ／ｍｌ）。さらに、ＢＰＩレベルは、採取
及び処理のための経過時間に依存して変動した。これら
のデータによって、（ｉ）正常な個体におけるＢＰＩの
血漿レベルは極めて低いこと、及び（ｉｉ）凝固のプロ
セスの際に好中球から血清へとＢＰＩが放出されるのか
もしれないことが示唆されるので、正常な個体及び病理
学的状態にある個体におけるＢＰＩレベルの評価及び解
釈において、これらのデータは重要である。かくして、
ＢＰＩの内在的なレベルは、血清ではなく、血漿におい
て測定されるべきであり、そうすることによって、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの放出及び／または好中球の破壊により
惹起こされるアーティファクトが避けられる。同様に、
ＢＰＩの組換え型を含む臨床試料の分析は、血漿におい
て実施されるのが最良である。 【００１６】Ｗｅｉｓｓ及びＯｌｓｓｏｎ、Ｂｌｏｏｄ
６９巻、６５２頁（１９８７）は、好中球１０８細胞
当たり、平均６５μｇのＢＰＩが含まれると報告してい
る。全血がｍｌ当たり５ × １０６の好中球を含むと
仮定すると、１ ｍＬの血液中にはおよそ３．２μｇ／
ｍｌのＢＰＩが存在することになろう。血清中のＢＰＩ
の濃度は低い（＜１００ ｎｇ／ｍＬ）ので、凝固の際
に放出されるＢＰＩの量は、有効態の全物質のうちわず
かな割合（約１％）に過ぎない。このＢＰＩの放出に生
理学的な重要性はなく、損傷を受けた好中球からのＢＰ
Ｉの漏出を表しているに過ぎないかもしれない。さもな
くば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける凝固は、傷害または外傷
に呼応して好中球から抗微生物剤（ＢＰＩを包含する）
を局所的に放出するための一般的なシグナルであるかも
しれないという可能性がある。これらの条件のもとに、
次いでＢＰＩは傷害の部位に局在し、抗細菌の防御機構
として作用するのかもしれない。 【００１７】本発明の他の特徴及び利点は、以下の例示
的な実施例を考慮すれば理解されよう。実施例１は、ア
フィニティー精製したウサギ抗−ＢＰＩ抗体の調製に関
し、実施例２は、かかる抗体のビオチンラベル付けに関
し、実施例３は、かかる抗体を利用したＥＬＩＳＡ法に
関し、そして実施例４は、モノクローナル抗−ＢＰＩ抗
体の調製に関する。実施例５は、ＢＰＩサンドイッチア
ッセイの感度に対する、ヘパリン、デキストラン硫酸及
びＮａＣｌ濃度の効果に関し、実施例６は、ｒＢＰＩ及
びｒＢＰＩ２３の標準曲線の特徴に関する。実施例７
は、プールしたヒト血漿に加えた（ｓｐｉｋｅｄ）ｒＢ
ＰＩ及びｒＢＰＩ２３の測定に関し、実施例８は、ｒＬ
ＢＰ、ｒＢＰＩ及びｒＢＰＩ２３を比較する、免疫反応
性に関し、そして実施例９は、ＥＬＩＳＡアッセイに対
する処理時間及び遠心力の効果に関する。実施例１０
は、血清及び血漿試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタ
ンブロット分析に関し、そして実施例１１は、ヒト血漿
及び血清における内在的なＢＰＩの免疫反応性の測定に
関する。実施例１２は、敗血症患者におけるＢＰＩの臨
床的な相関性に関し、実施例１３は、敗血症小児と敗血
症ではない臨床的疾患を有する小児との血漿における内
在的なＢＰＩレベルの比較に関し、実施例１４は、正常
及び嚢胞性線維症における肺洗浄液試料における内在的
なＢＰＩレベルに関し、実施例１５は、慢性関節リウマ
チに罹患している患者の滑液における内在的なＢＰＩレ
ベルに関し、そして実施例１６は、慢性関節リウマチ、
骨関節炎または活動性関節炎に罹患している患者の滑液
における内在的なＢＰＩレベルに関し、そして実施例１
７は、慢性関節リウマチ患者からの血漿試料における内
在的なＢＰＩレベルに関する。実施例１８は、健常な被
験者へのＬＰＳ投与の、内在的なＢＰＩレベルに対する
効果に関する。 【００１８】 【実施例】（実施例１：アフィニティー精製したウサギ
抗−ＢＰＩ２３抗体の調製）本実施例では、アフィニテ
ィー精製したウサギ抗−ｒＢＰＩ２３抗体を調製した。
詳細には、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０巻、４７５４〜４７６１頁
（１９９２）の方法に従って作製したｒＢＰＩ ２３（２
０ ｍｇ）を、０．５ ＮａＣｌを含む、０．２ Ｍ
重炭酸塩、ｐＨ８．６中で、１０ ｍＬの臭化シアンで
活性化したセファロース４Ｂ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）に
カップリングさせた。およそ９７％のｒＢＰＩ２３が、
樹脂にカップリングした。ｒＢＰＩ２３で高度免疫した
２羽のウサギから集めた抗血清（１５０ ｍＬ）を、等
容量のリン酸緩衝性生理食塩水、ｐＨ ７．２（ＰＢ
Ｓ）で希釈した。希釈した抗血清の一部（５０ ｍＬ）
を、１０ ｍＬのｒＢＰＩ２３−セファロースカラムに
通液し、次いで、カラムをＰＢＳで洗浄して、０．１
Ｍグリシン、ｐＨ２．５を用いて、結合した抗体を溶出
した。収集した画分は、直ちに１ Ｍリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ ８．０で中和した。Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３１２頁
（１９８８）の方法に従って、２８０ ｎｍにおける吸
光度を測定することにより、ピークの画分を同定した。
回収量は、アフィニティー精製した抗−ｒＢＰＩ ２３
抗体４５ ｍｇであり、すなわち、ウサギ抗血清１ ミ
リリットル当たり、抗体３００マイクログラムであっ
た。 【００１９】（実施例２：ビオチンラベルしたウサギ抗
−ＢＰＩ２３抗体の調製）本実施例では、実施例１の方
法に従って作製した、２０マイクログラムのアフィニテ
ィー精製したウサギ抗−ＢＰＩ２３抗体を、１１ ｍＬ
の０．１ Ｍ 重炭酸ナトリウム、ｐＨ ８．３中で、
室温にて２時間、２ ｍｇのビオチンアミドカプロエー
ト Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル（Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、
ミズーリー州）とともにインキュベートした。０．１％
アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０
カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎ
ｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）で
反応混合物を分画することにより、接合しなかったビオ
チンを除去し、アルカリ性の緩衝液を交換した。ビオチ
ンラベルした抗体の最終的な収量は、１７．９ ｍｇで
あった。 【００２０】（実施例３：ＥＬＩＳＡ法）５０μｌのア
フィニティー精製したウサギ抗−ＢＰＩ２３抗体（ＰＢ
Ｓ中、１μｇ／ｍＬ）を、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２（Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｃ
ｈａｎｔｉｌｌｙ、バージニア州）ミクロタイタープレ
ートのウェルの中で、２〜８℃にて一晩（またはその代
わりに、３７℃にて１時間）インキュベートした。抗体
溶液を取り除き、すべてのウェルに脱脂乳１％を含むＰ
ＢＳ（ブロッキング剤）を２００μＬ添加した。室温に
て１時間プレートをブロッキングした後、３００μＬの
洗浄用緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）
で３度、ウェルを洗浄した。 【００２１】個々のヒト提供者から、血液を２本のＶａ
ｃｕｔａｉｎｅｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、
Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ニュージャージー州）チューブ
の中に採取した。チューブの１本は酸 クエン酸塩 デ
キストロースを含んでおり、２本目は、凝塊活性化剤及
び血清分離剤を含んでいた。採取後１時間３０分以内
に、個々の提供者からの血漿及び血清試料の双方を１３
００ ｇにて５分間遠心することにより、同時に処理し
た。適切な画分を集め、０．５ ｍＬのアリコートとし
て−７０℃にて貯蔵した。プールした正常ヒト血清及び
プールしたクエン酸化血漿は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）か
ら得た。 【００２２】標準物質、試料及びコントロールを、別々
の９６−ウェルプレートで、１％ウシ血清アルブミン、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−
ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ）及び１０ユニット／ｍＬのヘパリ
ンナトリウム（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を用いて、３重試験
を行うよう希釈した。ｒＢＰＩまたはｒＢＰＩ２３の標
準溶液は、１００から０．０１２ ｎｇ／ｍＬまで、連
続的に２倍希釈して調製した。標準物質、試料及びコン
トロールの各重複試験検体及び希釈検体（５０μＬ）各
々を、ブロッキングしたミクロタイタープレートに移
し、３７℃にて１時間インキュベートした。第１次のイ
ンキュベーションの後、洗浄用緩衝液を用いて、ウェル
を３度洗浄した。ＰＢＳ−ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎで、ビオ
チンラベルしたウサギ抗−ＢＰＩ ２３抗体を１／４００
０に希釈し、５０μＬをすべてのウェルに加えた。次い
でプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。引
き続き、洗浄用緩衝液を用いてすべてのウェルを３度洗
浄した。アルカリホスファターゼでラベルしたストレプ
トアビジン（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉｎｃ．、ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア
州）をＰＢＳ−ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎで１／２０００に希
釈し、すべてのウェルに５０μＬ加えた。３７℃にて１
５分間インキュベートした後、すべてのウェルを、洗浄
用緩衝液で３度、脱イオン水で３度洗浄し、基質である
ｐ−ニトロフェニルホスフェート（１０％ジエタノール
アミン緩衝液中、１ ｍｇ／ｍＬ）を、すべてのウェル
に５０μＬの容量にて添加した。室温にて１時間、発色
を進行させ、その後、反応を停止するために５０μＬの
１Ｎ ＮａＯＨを加えた。Ｖｍａｘ Ｐｌａｔｅ Ｒｅ
ａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏ
ｒｐ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、カリフォルニア州）を
用いて、すべてのウェルについて４０５ ｎｍにおける
吸光度を測定した。 【００２３】第１次インキュベーション工程において試
料希釈用緩衝液（ＢＰＩ不含）のみを入れたウェルのＡ
４０５の平均値を引くことにより、バックグラウンドに
対するすべての試料及び標準物質（３重試験における）
についての４０５ ｎｍにおける吸光度（Ａ４０５）の
平均値を補正した。次いで、ｒＢＰＩまたはｒＢＰＩ
２３のｎｇ／ｍＬに対するＡ４０５として、標準曲線を
プロットした。直線領域を選択し、直線回帰分析を行っ
て、標準曲線から内挿することにより、試料及びコント
ロールに対する濃度を決定した。 【００２４】（実施例４：マウスモノクローナル抗−Ｂ
ＰＩ抗体の調製）本実施例では、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
１９６頁（１９８８）の標準技術を用いて、マウスモノ
クローナル抗−ｒＢＰＩ抗体 ６Ｃ２を調製した。詳細
には、ハイブリドーマ細胞系は、ＮＳ−１マウスミエロ
ーマ細胞と、ｒＢＰＩホロタンパク質で免疫したＢａｌ
ｂ−Ｃマウスからの脾細胞との化学的融合体に由来する
ものであった。抗−ＢＰＩ抗体を分泌しているハイブリ
ドーマ細胞の同定は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ
により、細胞培養上清をスクリーニングすることにより
成し遂げた。続いて、ハイブリドーマ細胞系６Ｃ２を、
限界希釈により３度クローン化した。該細胞系により生
産されるモノクローナル抗体はＩｇＧ１、ｋイソタイプ
として特徴付けられる。ハイブリドーマ細胞系は、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖ
ｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州 ２８３０２
に寄託され、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ１１５１２として登
録されている。 【００２５】捕獲剤としてウサギポリクローナル抗−Ｂ
ＰＩ抗体または６Ｃ２により生産される抗体のいずれか
を用いた場合のｒＢＰＩ標準曲線によれば、ウサギ抗体
に比較すると、６Ｃ２モノクローナル抗体の方が、わず
かに優れた感度が達成されることが示された。６Ｃ２に
基づいて行ったＥＬＩＳＡにおけるｒＢＰＩ２３の免疫
反応性は、ｒＢＰＩホロタンパク質よりもおよそ１００
０倍低かった。従って、６Ｃ２モノクローナル抗体は、
容易にｒＢＰＩまたは天然型ＢＰＩを捕獲するが、ｒＢ
ＰＩ２３は容易に捕獲しないものである。６Ｃ２ ＢＰ
ＩサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで、ｒＬＢＰとの交
差反応性が極小を呈することも示された。 【００２６】（実施例５：ヘパリン、デキストラン硫酸
及びＮａＣｌの感度に対する効果）本実施例では、ＢＰ
Ｉサンドイッチアッセイの感度に対する、ヘパリン、デ
キストラン硫酸（分子量８ ｋＤａ及び５００ ｋＤ
ａ）または１ Ｍ塩化ナトリウムの効果の比較を行っ
た。図１に示される結果より、ｒＢＰＩ（図１ａ）及び
ｒＢＰＩ２３（図１ｂ）の双方に対して、ヘパリン及び
低分子量デキストラン硫酸（分子量８ ｋＤａ）が、バ
ックグラウンドを減じてアッセイ感度を高めるうえで、
量ベースで同等に有効であることが示唆される。対照的
に、高分子量のデキストラン硫酸（分子量５００ ｋＤ
ａ）は、緩衝液コントロールに比して、アッセイ感度を
低減させた。高濃度塩でアッセイ感度は最も大きく向上
したが、ｒＢＰＩ２３に対しては、ヘパリンを用いた場
合と同じ程度にバックグラウンドシグナルが減じられる
ことはなかった。しかして、以後のアッセイすべてにつ
いて、１０ユニット／ｍＬにてヘパリンを利用した。 【００２７】（実施例６：標準曲線の特徴）本実施例に
おいて、図２ａ及び２ｂに示すように、ｒＢＰＩ及びｒ
ＢＰＩ２３の標準曲線は、いくつかの別個のアッセイ間
で再現性があることが見出された。観察されたＡ４０５
を用いた濃度の直線回帰分析により、ｒＢＰＩ及びｒＢ
ＰＩ ２３の双方に対する直線的な濃度の呼応（それぞ
れ、Ｒ２＝０．９９７及び０．９９９）が立証された。
直線領域は、ｒＢＰＩの標準曲線については１００〜６
０００ ｐｇ／ｍＬであり、ｒＢＰＩ２３の標準曲線に
ついては２５〜８００ｐｇ／ｍＬであった。 【００２８】（実施例７：プールしたヒト血漿に加えた
ｒＢＰＩ及びｒＢＰＩ２３の測定）本実施例では、プー
ルしたクエン酸化ヒト血漿に、異なる濃度のｒＢＰＩま
たはｒＢＰＩ２３を加え、次いで、サンドイッチＥＬＩ
ＳＡアッセイにおける測定前に凍結及び融解を施した。
加えたＢＰＩの回取率は、ＢＰＩを加えたヒト血漿試料
で測定したＢＰＩの量から、ＢＰＩを加えていないコン
トロールにおける濃度を差し引き、それを実際に試料に
加えた量で割った値として決定した。得られた分数に１
００をかけ、その結果を、インプット濃度の百分率とし
て表現した。プールしたヒト血漿試料に加えた、異なる
濃度のｒＢＰＩの回収率は、平均で８３％であり、３０
０ ｎｇ／ｍＬで６５％から、３ ｎｇ／ｍＬで９７％
までの範囲にあった。ｒＢＰＩ２３の回収率は、平均５
６％であり、０．５ ｎｇ／ｍＬで３０％から、５０，
０００ ｎｇ／ｍＬで９０％までの範囲にあった。表Ｉ
及びＩＩに、血漿試料に加えた各ＢＰＩについての回収
率のデータを要約する。 【００２９】 【表１】 【００３０】 【表２】（実施例８：ｒＬＢＰ、ｒＢＰＩ及びｒＢＰＩ２３の免
疫反応性の比較）本実施例では、ＢＰＩサンドイッチＥ
ＬＩＳＡにおいて、ｒＬＢＰ、ｒＢＰＩ及びｒＢＰＩ
２３の免疫反応性を比較し、可能な免疫学的交差反応性
を調べた。ＬＢＰとＢＰＩとの間にかなりの配列の相同
性がある（Ｓｃｈｕｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４
９巻、１４２９頁（１９９０））にもかかわらず、図３
に示される結果により、量ベースで、ｒＬＢＰは、ｒＢ
ＰＩ２３のシグナルよりもおよそ５桁低い強さのシグナ
ル、ｒＢＰＩのシグナルよりも４桁低い強さのシグナル
しか出さないことが示される。例えば、１００，０００
ｎｇ／ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ）の濃度のｒＬＢＰ
は、３ ｎｇ／ｍＬのｒＢＰＩまたは０．６ ｎｇ／ｍ
ＬのｒＢＰＩ２３により出されると同等のシグナルを産
生した。３，１２５ ｎｇ／ｍＬを下回る濃度のｒＬＢ
Ｐでは、ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、定量
可能なシグナルは検出されなかった。これらの結果か
ら、ＬＢＰとの抗体の交差反応性が最少であることが立
証され、ＢＰＩに対するアッセイの特異性が確認され
た。 【００３１】（実施例９：処理時間及び遠心力の効果）
本実施例では、クエン酸化血漿中のＢＰＩの測定に対す
る、処理時間及び遠心力の効果も研究した。概して、ク
エン酸化血漿のための処理時間が増大すると、４００
ｇ（斜平行線を付したバー）または１３００ ｇ（黒塗
りのバー）（図６）のいずれかで遠心が行われた場合、
ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定される内在的
なＢＰＩの量は増大した。採取後３０分以内に、およそ
１３００ｇの遠心力で処理した血漿試料において、最も
低い内在的ＢＰＩレベルが測定された。 【００３２】（実施例１０：血清及び血漿試料のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析）本実施例で
は、血清及び血漿試料について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び
ウェスタンブロット分析を行った。詳細には血清及び血
漿試料を、１０ユニット／ｍＬのヘパリンナトリウムを
含むＰＢＳ−ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ等容量で希釈した。前
記したＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡに関すると同様
に、アフィニティー精製したウサギ抗−ｒＢＰＩ２３抗
体で被覆しておき脱脂乳を用いてブロッキングしておい
たミクロタイタープレートの６重試験を行うようにした
ウェルに、希釈した血清及び血漿試料を５０μＬの容量
で添加した。３７℃にて１時間インキュベートした後、
洗浄用緩衝液を用いて、ウェルを９度洗浄した。捕獲し
た免疫反応性物質は、各試料に対して６重試験を行うよ
うにしたウェルにおいて、続いて６０μＬのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ試料用緩衝液（４％ＳＤＳ、１０％グリセロー
ル、０．００４％ブロモフェノールブルー及び０．０２
％ ＮａＮ３を含む、０．１２５ ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ ６．８）でインキュベート（室温で振盪しな
がら、ウェル当たり３分間）し、移すことによって可溶
化した。各試料について、捕獲され可溶化された免疫反
応性物質の最終容量は、およそ５０μＬであった。 【００３３】各可溶化試料１５μＬを、Ｌａｅｍｍｌ
ｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻、６８０頁（１９７０）の
条件下で、非還元１０％ゲルにおいて流した。タンパク
質を標準技術（Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９）によって、
ニトロセルロースに転写した。ブロットしたタンパク質
は、ビオチンラベルしたウサギ抗−ＢＰＩ２３抗体
（０．２Ｍ ＮａＣｌ及び０．３％ Ｔｗｅｅｎ ２０
を含む、０．０２５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．２（ＴＢＳＴ）で１／２０００に希釈）またはＴＢ
ＳＴで１／１０００に希釈したウサギ抗−ｒＢＰＩ抗血
清との免疫反応性につき、それら抗体をプローブとして
用いて調べた。ビオチンラベルしたウサギ抗−ＢＰＩ
２３抗体に続いては、ＴＢＳＴで１／４０００に希釈し
たアルカリホスファターゼ接合ストレプトアビジン（Ｚ
ｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａ
ｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、カリフォルニア州）を入れ
た。ラベルしていない抗−ｒＢＰＩ抗血清については、
アルカリホスファターゼ接合ストレプトアビジンとイン
キュベートするに先立ち、ＴＢＳＴで１／２０００に希
釈した、ビオチンラベルしたヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｚ
ｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａ
ｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、カリフォルニア州）とのイン
キュベーションを行った。各インキュベーションの後、
ＴＢＳＴで４度、ブロットを洗浄した。０．０１％（重
量／容量）ニトロブルーテトラゾリウム及び４ ｍＭ
ＭｇＣｌ２を含む、０．１２ Ｍベロナール−酢酸緩衝
液、ｐＨ ９．８に溶かした、５０μｇ／ｍＬの基質５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート
（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ、ミズーリー州）の溶液の中に、ブロットを浸漬
した。発色は、室温にて１時間進行させた。ウェスタン
ブロットのレーンは、デンシトメーター（Ｓｈｉｍａｄ
ｚｕ Ｍｏｄｅｌ ＣＳ９０００Ｕ、Ｓｈｉｍａｚｕ
Ｃｏｒｐ．、Ｋｙｏｔｏ、日本国）を反射モードで用い
て走査し、面積の積分計算により定量した。 【００３４】ＥＬＩＳＡの免疫反応性がホロ−ＢＰＩ、
ＢＰＩの断片、または無関係な免疫反応性物質の存在に
よるものかどうかを確認するために、２つの異なる抗体
プローブを利用して、血漿及び血清試料につきウェスタ
ンブロット分析を実施した。これらの実験のために、ア
フィニティー精製した抗−ＢＰＩ２３抗体を被覆したミ
クロタイタープレートを用いて、血漿及び血清から直接
的に免疫反応性物質を捕獲した。アフィニティーで捕獲
した物質は、次いで、試料処置用緩衝液に溶出し、非還
元条件下で電気泳動により分離し、ニトロセルロースに
対してブロットして、その後、抗−ＢＰＩ抗体をプロー
ブとして用いて調べた。図７に言及すると、各ブロット
の上部の番号がレーンを表し、一方、右側の番号は分子
量を示す。ブロットＡ：レーン１ ブランク、レーン２
ｒＬＢＰ（１００μｇ／ｍＬ）、レーン３ ｒＢＰＩ
（１００ ｎｇ／ｍＬ）、レーン４〜１２ ヒト血清試
料、レーン１３ 天然型ＢＰＩ。ブロットＢ：レーン１
〜３ ブロットＡに同じ、レーン４〜１４ ヒト血清試
料、レーン１５ 天然型ＢＰＩ。（ブロットＡのレーン
７、１０及び１２ならびにブロットＢのレーン４、５、
６及び１４に対して、ニトロセルロースブロット上６２
及び６４ ｋＤａに、弱く目視可能なバンドが検出され
たが、図面においてそのバンドはうまく再現されなかっ
た。ブロットＡ及びＢの双方のレーン２に対して、ニト
ロセルロースブロット上６９．５及び１１４．４ ｋＤ
ａにも、バンドが検出されたが、図面において充分に再
現されなかった。）アフィニティー精製した抗−ＢＰＩ
２３抗体をプローブとして用いてブロットを調べた場
合、ＥＬＩＳＡ免疫反応性は、６２，０００及び６４，
０００ Ｄａの見かけの分子量を有する２つのバンドの
存在に相関性を有しているようであった。ヒト好中球か
ら抽出した天然型ＢＰＩもまた、６２，０００及び６
４，０００ Ｄａのバンドとして移動した。好中球から
抽出したＢＰＩ及びいくつかのヒト血清試料由来のＢＰ
Ｉの双方において、５０ ｋＤａでかすかなバンドが検
出された（これは図７では目視不能である）。このバン
ドは、ＢＰＩのグリコシル化されていないフォーム（分
子量５０，６５９）を表すものかもしれず、検出した総
ＢＰＩの７％に満たなかった。ｒＢＰＩは、６４，００
０ Ｄａに単一バンドとして移動した。これらの血漿ま
たは血清試料に対するウェスタンブロットで、他の免疫
反応性を有するバンドは目視されなかった。これらの方
法によって、ヒト血漿に加えたｒＢＰＩ２３も検出さ
れ、ｒＢＰＩと天然型ＢＰＩとが、容易に識別可能であ
った（データは示さない）。１００，０００ ｎｇ／ｍ
Ｌにて、抗−ＢＰＩ２３を被覆したウェルにｒＬＢＰを
加えて、前記と同様に処理した場合、６９，５００及び
１１４，４００ Ｄａの見かけの分子量を有する、２つ
の弱い反応性を示すバンドが識別可能であった（これは
図７では目視不能である）。ｒＬＢＰのバンドを合わせ
た強度（積分計算したピーク面積として測定）は、重量
ベースでｒＢＰＩピーク面積よりもおよそ５，０００倍
低かった。 【００３５】これらと同じ血清試料を、抗−ｒＢＰＩ抗
血清をプローブとして用いて調べた場合、やはり、ＥＬ
ＩＳＡ免疫反応性は６２，０００／６４，０００ Ｄａ
のタンパク質ダブレットの存在に相関性を有しており、
ＥＬＩＳＡシグナルとウェスタンブロットの２つのＢＰ
Ｉバンドに対する積分計算したピーク面積との間に、有
意な相関性（Ｒ２＝０．８０７、ｐ＝０．０００１）が
観察された（図８）。１００μｇ／ｍＬにて加えたｒＬ
ＢＰは、抗−ｒＢＰＩ抗血清をプローブとして用いて調
べた場合、検出不能であった。これらのデータにより、
ＥＬＩＳＡによって検出される血清及び血漿の内在的な
免疫反応性は、ホロ−ＢＰＩによるのであって、ＢＰＩ
の断片または他の交差反応性を有する物質によるのでは
ないことが示唆される。 【００３６】（実施例１１：ヒト血漿及び血清における
内在的なＢＰＩ免疫反応性の測定）本実施例では、ヒト
ＡＣＤ血漿及び血清における内在的なＢＰＩ免疫反応性
を調べた。血漿及び血清試料は、２０名の異なる健常ヒ
ト提供者から採取した。ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡ
及び標準物質としてｒＢＰＩを利用して、これらの各試
料について、ＢＰＩレベル（ｎｇ／ｍＬ）を調べた。試
験を行ったすべての個体につき、図４に示す結果によ
り、血清試料（斜平行線を付したバー）の方が、相対応
する血漿試料（黒塗りのバー）に比較して、ＢＰＩレベ
ルは一貫して高かったことが示される。平均ＢＰＩ濃度
は、血漿において０．８ ｎｇ／ｍＬであり、血清にお
いては２７．１ ｎｇ／ｍＬであった。ＢＰＩの濃度範
囲は、血漿において０．２未満〜２．１ ｎｇ／ｍＬで
あり、血清においては４．９〜７２．１ ｎｇ／ｍＬで
あった。ＡＣＤ血漿を用いて得られたＢＰＩ値と同様の
ＢＰＩ値が、クエン酸化血漿またはＥＤＴＡ血漿におい
て測定された。予備的な結果では、ヘパリン化した血漿
における数値の方がわずかに高いことが示唆されてい
る。 【００３７】次いで、２０名の敗血症患者から採取した
ＥＤＴＡ血漿及び血清試料について、実験を繰り返し
た。図５に示すその結果から、同じ患者について、血漿
及び血清レベルが同様でないことが示される。さらに
は、そのＢＰＩレベルは、血漿ＢＰＩレベルが常に低か
った健常な患者のものとは異なっている。正常及び敗血
症患者の血清におけるＢＰＩレベルの統計的分析によっ
て、双方の間に統計的な有意差はないことが示される
（ｐ＝０．１０）。健常及び敗血症個体の血清における
ＢＰＩレベルを示す散布図を、図９ａに示す。これとは
対照的に、図９ｂの散布図により示されるように、正常
及び敗血症患者の血漿におけるＢＰＩレベルの差は、高
度に統計的有意性を示すものである（ｐ＝０．００１
４）。 【００３８】（実施例１２：敗血症患者のヒト血漿にお
ける、内在的なＢＰＩの免疫反応性の臨床的相関性）本
実施例では、グラム陰性の病因が疑われる６６名の敗血
症患者から採取したヒトＥＤＴＡ血漿試料における、内
在的なＢＰＩの免疫反応性を、ＢＰＩサンドイッチアッ
セイを用いて定量し、同じ試料から得られた種々の臨床
的パラメータ及び測定値と、ＢＰＩのレベルとの相関性
を調べた。加うるに、ＢＰＩレベルと３０日間にわたる
生存との相関性を調べた。生存分析を簡易に行うため
に、これらの試料に対するＢＰＩの中間レベルが４．８
ｎｇ／ｍＬであることを計算し、このレベルを用い
て、高レベル（＞４．８ ｎｇ／ｍＬ）のＢＰＩを有す
る患者、及び低レベルのＢＰＩ（＜４．８ ｎｇ／ｍ
Ｌ）を有する患者とに、患者を分類した。このようにし
て５９名の患者からのデータを分類した場合、ＢＰＩの
内在的なレベルと１４日間の生存との間に明白な相関性
があった。特に、中間値を下回るＢＰＩレベルを有する
被験者は１４日生存レベルがより高く、その相関性は統
計学的には有意でなかったものの、より低いＢＰＩレベ
ルが、より高い生存に相関していることを示唆してい
た。３０日間の生存率に関しては、２つの群の間で差異
は観察されなかった。 【００３９】前処置ＢＰＩレベルと、年齢及びＡＰＡＣ
ＨＥ ＩＩ（急性・生理学的・年齢・慢性・健康評価
（Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｇｅ Ｃｈｒ
ｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ））ス
コアの双方との間の、逆の相関性が、結果により開示さ
れた。ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアは、長期間の生存を予
知するものであり、より低いＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコア
は、生存に対する見込みがより大きいことを示唆してい
る。従って、１４日間の生存について負の相関性を示し
たにもかかわらず、初発の内在的なＢＰＩレベルがより
高いことと、ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアに従う長期間生
存に対する見込みがより大きいこととは相関性を有して
いた。その結果より、初発の内在的なＢＰＩレベルと、
（ｉ）診断以後の時間、（ｉｉ）白血球細胞カウント
数、（ｉｉｉ）絶対的な好中球カウント数、（ｉｖ）血
小板カウント数、（ｖ）罹患率の数値、（ｖｉ）重篤／
軽度の罹患率の数値、（ｖｉｉ）性、（ｖｉｉｉ）人
種、（ｉｘ）感染タイプ、または（ｘ）罹患状態のタイ
プとの間の相関性は示唆されなかった。 【００４０】（実施例１３：敗血症及び臨床的疾患を有
する小児における、内在的なＢＰＩレベル）敗血症に罹
患している９名の小児及び、敗血症ではない臨床的疾患
を有する１３名の小児から得たＡＣＤ血漿試料における
ＢＰＩの免疫反応性を、実施例３のＥＬＩＳＡ法を用い
て求め、図１０に示すように結果を比較した。敗血症の
９名の小児のうち８名が、健常な成人血漿ＢＰＩレベル
の平均値に標準偏差の２倍を加えた、合計で１．７ ｎ
ｇ／ｍＬに比べて、さらに高い血漿ＢＰＩレベルを有し
ていた。敗血症ではない臨床的疾患を有する小児のＢＰ
Ｉ血漿レベルは、試験した被験者の約５０％において高
い数値を示した。 【００４１】（実施例１４：正常及び嚢胞性線維症患者
における肺洗浄液試料中の内在的なＢＰＩレベル）本実
施例では、正常個体及び嚢胞性線維症患者から得られた
肺洗浄液試料における内在的なＢＰＩ免疫反応性を、比
較した。概して、正常ヒト被験者から得た肺洗浄液試料
由来のＢＰＩ濃度は０．０５ ｎｇ／ｍＬを下回り、一
方嚢胞性線維症患者からの肺洗浄液試料は、１０ ｎｇ
／ｍＬから１００ ｎｇ／ｍＬ及びそれ以上の範囲で、
高いＢＰＩ濃度を呈していた。 【００４２】（実施例１５：慢性関節リウマチ患者から
の滑液試料における内在的なＢＰＩレベル）本実施例で
は、慢性関節リウマチ患者の滑液における内在的なＢＰ
Ｉ免疫反応性を、ＢＰＩサンドイッチアッセイを利用し
て調べた。滑液試料は、慢性関節リウマチに罹患してい
る１３名の患者の、関節炎におかされた関節から得た
が、いくつかの試料は、違う日に同じ患者から得たもの
であった。滑液が高粘度であるために、これらの試料
は、３７℃にて１５分間、最終濃度１００ユニット／ｍ
Ｌのヒアルロニダーゼで処置し、次いで１０，０００
ｇで１０分間、遠心をした。図１１にそれらの試料の分
析結果を表すが、試料のうち１つ以外のすべてについ
て、２５ ｎｇ／ｍｌを越える、上昇したＢＰＩ濃度が
示される。滑液中のＢＰＩの濃度は、健常被験者の血漿
中のＢＰＩ濃度を実質的に上回っており、それら濃度が
活動性関節炎状態の存在または重篤さの度合の指標とな
るかもしれない。 【００４３】（実施例１６：慢性関節リウマチ、骨関節
炎または活動性関節炎の患者からの滑液試料における内
在的なＢＰＩレベル）本実施例では、慢性関節リウマ
チ、骨関節炎または活動性関節炎に罹患している患者の
滑液試料における、内在的なＢＰＩ免疫反応性を、ＢＰ
Ｉサンドイッチアッセイを利用して調べた。実施例１５
の方法に従って、慢性関節リウマチに罹患している８名
の患者、骨関節炎に罹患している８名の患者及び活動性
関節炎に罹患している８名の患者の、関節炎におかされ
ている関節から、滑液試料を得た。それら試料の分析の
結果を図１２に表すが、慢性関節リウマチに罹患してい
る患者のすべて及び活動性関節炎に罹患している患者の
ほとんどについてＢＰＩレベルが高くなっていることが
示されており、これらの関節炎はいずれとも、炎症性の
関節疾患である。対照的に、非炎症性の退行変性関節疾
患である骨関節炎に罹患している被験者のほとんどが、
その滑液中におけるＢＰＩのレベルの上昇をともなって
いないようであった。詳しくは、骨関節炎に罹患してい
る被験者における滑液のＢＰＩの濃度の平均値は約２６
ｎｇ／ｍＬであり、その濃度を標準偏差の２倍分上回
るレベルは、約１５２ ｎｇ／ｍＬであった。 【００４４】（実施例１７：慢性関節リウマチ患者から
の血漿試料における内在的なＢＰＩレベル）本実施例で
は、慢性関節リウマチ患者のＥＤＴＡ血漿における内在
的なＢＰＩ免疫反応性を、実施例３のＢＰＩサンドイッ
チアッセイを利用して調べた。図１３に、慢性関節リウ
マチに罹患している患者８０名及び健常被験者２３名に
ついてのＢＰＩ血漿レベルの散布図を表すが、被験者間
での統計学的有意差が示される。慢性関節リウマチ患者
に対する血漿ＢＰＩレベルの平均値は２５．７ ｎｇ／
ｍＬであり、それに比べて健常被験者については、０．
８ ｎｇ／ｍＬであった。 【００４５】（実施例１８：健常被験者におけるＬＰＳ
投与の内在的なＢＰＩレベルに対する効果）本実施例で
は、健常ヒト被験者におけるＬＰＳ投与の、内在的なＢ
ＰＩ免疫反応性に対する効果を調べる。詳細には、４
ｎｇ／ｋｇ ＬＰＳの静脈内投与（被験者８名）または
ＬＰＳ非投与（被験者１４名）後の種々の時点における
ＢＰＩ血漿レベルの変化について、ＢＰＩサンドイッチ
アッセイを利用して、健常被験者をモニターした。その
結果を図１４に表すが、時間に応じて血漿ＢＰＩ濃度の
平均値が変化することが示されている。ＬＰＳを用いて
処置した被験者に関しては、ＬＰＳ投与の後１時間でＢ
ＰＩレベルが上昇し始めた。ＬＰＳ投与後２〜４時間の
間に、ほとんどの被験者でＢＰＩ血漿レベルのピークが
観察された。ＢＰＩレベルのベースラインからピークへ
の平均的な上昇率は、およそ８倍であった。この時間全
体にわたって、コントロールの被験者におけるＢＰＩレ
ベルの平均値は、正常値の領域（＜２．１ ｎｇ／ｍ
Ｌ）内に留まっていた。 【００４６】ＤＩＣ及びＡＲＤＳを包含する敗血症に関
連した状態を包含する、細菌感染、内毒素血症及び敗血
症の症候と、ＢＰＩ血漿レベルとの相関関係が、さらな
る分析によって示されることが予期される。さらに、外
来的に投与したｒＢＰＩ及びｒＢＰＩ２３は速やかに動
物体内の循環系から除去され、そして、ヒトにおいても
ｒＢＰＩ２３の除去が速やかに行われるので、ヒトの体
液中のＢＰＩレベルが高まっていることは、試料採取時
に生じている活動性の炎症プロセスを反映していると考
えられる。 【００４７】当業者であれば、本明細書における本発明
の好ましい実施態様の前記記載を考慮して、本発明を実
施する上で多くの修正や変更を想起することが予測され
る。よって、本発明の範囲は、添付の請求の範囲に登載
される限定のみによってしか、限定を受けるものではな
い。 【００４８】 【発明の効果】本発明により、血液試料についてＢＰＩ
イムノアッセイを行う方法に従って、血液試料を包含す
る体液試料におけるＢＰＩレベルを定量するための方法
であって、血液試料が血漿である方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにお
けるｒＢＰＩの検出に対する、ヘパリン、８ ｋＤａデ
キストラン硫酸、５００ ｋＤａデキストラン硫酸、１
Ｍ ＮａＣｌ及び緩衝液コントロールによる効果を示
す。 【図１ｂ】ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにお
けるｒＢＰＩ２３の検出に対する、ヘパリン、８ ｋＤ
ａデキストラン硫酸、５００ ｋＤａデキストラン硫
酸、１ Ｍ ＮａＣｌ及び緩衝液コントロールによる効
果を示す。 【図２ａ】ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの、
３つの別個のアッセイに対する、ｒＢＰＩの標準曲線の
再現性を示す。 【図２ｂ】ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの、
４つの別個のアッセイに対する、ｒＢＰＩ２３の標準曲
線の再現性を示す。 【図３】ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおけ
る、ｒＬＢＰ、ｒＢＰＩ及びｒＢＰＩ２３の用量依存性
曲線を示す。 【図４】２０名の異なる健常ヒト提供者について、相対
応する（ｍａｔｃｈｅｄ）血漿及び血清試料における、
内在的なＢＰＩレベルを示す。 【図５】敗血症に罹患している２０名の異なるヒト提供
者について、相対応する血漿及び血清試料における、内
在的なＢＰＩレベルを示す。 【図６】ヒト血漿におけるＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳ
Ａによって測定した、内在的なＢＰＩレベルに対する、
処理時間及び１３００ ｇまたは４００ ｇの遠心力の
効果を示す。 【図７】アフィニティー精製した抗−ＢＰＩ２３抗体を
被覆したミクロタイターウェルによって捕獲された物質
の、ウェスタンブロットでの免疫反応性を示す。 【図８】２０名のヒト血清試料に対するＢＰＩサンドイ
ッチＥＬＩＳＡでの免疫反応性と、ウェスタンブロット
での２つのＢＰＩバンド（分子量６２及び６４ ｋＤ
ａ）に対する積分計算したピーク面積との相関を示す。 【図９ａ】健常及び敗血症のヒト提供者の血清中のＢＰ
Ｉレベルの散布図を示す。 【図９ｂ】健常及び敗血症のヒト提供者の血漿中のＢＰ
Ｉレベルの散布図を示す。 【図１０】敗血症小児、及び敗血症ではない臨床的疾患
を有する小児の血漿中のＢＰＩレベルの散布図を示す。 【図１１】慢性関節リウマチ患者から得た滑液中のＢＰ
Ｉレベルを示す。 【図１２】慢性関節リウマチ、骨関節炎及び活動性関節
炎に罹患している被験者から得た滑液中のＢＰＩレベル
の散布図を示す。 【図１３】健常ヒト提供者及び慢性関節リウマチに罹患
しているヒト提供者の血漿中のＢＰＩレベルの散布図を
示す。 【図１４】ＬＰＳで処置した健常被験者におけるＢＰＩ
レベルを示す。
けるｒＢＰＩの検出に対する、ヘパリン、８ ｋＤａデ
キストラン硫酸、５００ ｋＤａデキストラン硫酸、１
Ｍ ＮａＣｌ及び緩衝液コントロールによる効果を示
す。 【図１ｂ】ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにお
けるｒＢＰＩ２３の検出に対する、ヘパリン、８ ｋＤ
ａデキストラン硫酸、５００ ｋＤａデキストラン硫
酸、１ Ｍ ＮａＣｌ及び緩衝液コントロールによる効
果を示す。 【図２ａ】ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの、
３つの別個のアッセイに対する、ｒＢＰＩの標準曲線の
再現性を示す。 【図２ｂ】ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの、
４つの別個のアッセイに対する、ｒＢＰＩ２３の標準曲
線の再現性を示す。 【図３】ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおけ
る、ｒＬＢＰ、ｒＢＰＩ及びｒＢＰＩ２３の用量依存性
曲線を示す。 【図４】２０名の異なる健常ヒト提供者について、相対
応する（ｍａｔｃｈｅｄ）血漿及び血清試料における、
内在的なＢＰＩレベルを示す。 【図５】敗血症に罹患している２０名の異なるヒト提供
者について、相対応する血漿及び血清試料における、内
在的なＢＰＩレベルを示す。 【図６】ヒト血漿におけるＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳ
Ａによって測定した、内在的なＢＰＩレベルに対する、
処理時間及び１３００ ｇまたは４００ ｇの遠心力の
効果を示す。 【図７】アフィニティー精製した抗−ＢＰＩ２３抗体を
被覆したミクロタイターウェルによって捕獲された物質
の、ウェスタンブロットでの免疫反応性を示す。 【図８】２０名のヒト血清試料に対するＢＰＩサンドイ
ッチＥＬＩＳＡでの免疫反応性と、ウェスタンブロット
での２つのＢＰＩバンド（分子量６２及び６４ ｋＤ
ａ）に対する積分計算したピーク面積との相関を示す。 【図９ａ】健常及び敗血症のヒト提供者の血清中のＢＰ
Ｉレベルの散布図を示す。 【図９ｂ】健常及び敗血症のヒト提供者の血漿中のＢＰ
Ｉレベルの散布図を示す。 【図１０】敗血症小児、及び敗血症ではない臨床的疾患
を有する小児の血漿中のＢＰＩレベルの散布図を示す。 【図１１】慢性関節リウマチ患者から得た滑液中のＢＰ
Ｉレベルを示す。 【図１２】慢性関節リウマチ、骨関節炎及び活動性関節
炎に罹患している被験者から得た滑液中のＢＰＩレベル
の散布図を示す。 【図１３】健常ヒト提供者及び慢性関節リウマチに罹患
しているヒト提供者の血漿中のＢＰＩレベルの散布図を
示す。 【図１４】ＬＰＳで処置した健常被験者におけるＢＰＩ
レベルを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ステファン， フィッツフォウ キャロル
アメリカ合衆国 94596 カリフォルニア
ウォルナット クリーク ミルトン ア
ベニュー 1308
(72)発明者 ジェレミー， カム−クエン マ
アメリカ合衆国 94583 カリフォルニア
サン レイモン スプリングヴュー サ
ークル 978
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 血液試料中のＢＰＩの存在を定量するた
めのイムノアッセイ方法であって、血漿をアッセイする
工程を含むことにより改善された方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/125,677 US5466580A (en) | 1993-09-22 | 1993-09-22 | Method for quantifying BPI in body fluids |
| US08/125,677 | 1993-09-22 | ||
| US08/175,276 US5466581A (en) | 1993-09-22 | 1993-12-29 | Method for quantifying BPI in body fluids |
| US08/175,276 | 1993-12-29 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7509960A Division JPH09503296A (ja) | 1993-09-22 | 1994-09-22 | 体液中のｂｐｉの定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003315334A true JP2003315334A (ja) | 2003-11-06 |
Family
ID=26823820
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7509960A Ceased JPH09503296A (ja) | 1993-09-22 | 1994-09-22 | 体液中のｂｐｉの定量方法 |
| JP2003117669A Pending JP2003315334A (ja) | 1993-09-22 | 2003-04-22 | 体液中のｂｐｉの定量方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7509960A Ceased JPH09503296A (ja) | 1993-09-22 | 1994-09-22 | 体液中のｂｐｉの定量方法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5821064A (ja) |
| EP (1) | EP0720745B1 (ja) |
| JP (2) | JPH09503296A (ja) |
| CN (1) | CN1133634A (ja) |
| AT (1) | ATE173830T1 (ja) |
| AU (1) | AU697356B2 (ja) |
| CA (1) | CA2172243C (ja) |
| DE (1) | DE69414871T2 (ja) |
| DK (1) | DK0720745T3 (ja) |
| ES (1) | ES2126151T3 (ja) |
| HK (1) | HK1014207A1 (ja) |
| NZ (1) | NZ274083A (ja) |
| WO (1) | WO1995008773A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5652332A (en) * | 1993-03-12 | 1997-07-29 | Xoma | Biologically active peptides from functional domains of bactericidal/permeability-increasing protein and uses thereof |
| EP0839156A1 (en) * | 1995-07-20 | 1998-05-06 | Xoma Corporation | Anti-fungal peptides |
| US5741779A (en) * | 1996-05-10 | 1998-04-21 | Xoma Corporation | Antithrombotic materials and methods |
| ATE198050T1 (de) | 1996-05-10 | 2000-12-15 | Xoma Technology Ltd | Therapeutische anwendungen von bpi-protein- produkten zur behandlung von humaner meningococcämia |
| JP2000511190A (ja) * | 1996-05-23 | 2000-08-29 | ゾーマ コーポレイション | 外傷に起因する出血に見舞われたヒトにおけるｂｐｉタンパク質産物の治療用途 |
| US5888973A (en) | 1996-08-09 | 1999-03-30 | Xoma Corporation | Anti-chlamydial uses of BPI protein products |
| US6482796B2 (en) | 1996-11-01 | 2002-11-19 | Xoma Corporation | Therapeutic uses of N-terminal BPI protein products in ANCA-positive patients |
| US6093573A (en) * | 1997-06-20 | 2000-07-25 | Xoma | Three-dimensional structure of bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) |
| US6013631A (en) | 1998-06-19 | 2000-01-11 | Xoma Corporation | Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) deletion analogs |
| JP6651794B2 (ja) * | 2015-11-05 | 2020-02-19 | 富士レビオ株式会社 | 心筋トロポニンｉ測定試薬及び方法 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5245013A (en) * | 1985-04-30 | 1993-09-14 | Richard Ulevitch | Acute phase protein modulating endotoxic activity of lipopolysaccharides, assay methods and polypeptides |
| US5198541A (en) * | 1987-08-11 | 1993-03-30 | New York University | Dna encoding bactericidal/permeability-increasing proteins |
| US5308834A (en) * | 1989-02-14 | 1994-05-03 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of endotoxin-associated shock and prevention thereof using a BPI protein |
| US5089274A (en) * | 1989-02-14 | 1992-02-18 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Use of bactericidal/permeability increasing protein or biologically active analogs thereof to treat endotoxin-related disorders |
| US5334584A (en) * | 1989-02-14 | 1994-08-02 | Incyte Pharamaceuticals, Inc. | Recombinant, non-glycosylated bpi protein and uses thereof |
| US5171739A (en) * | 1989-02-14 | 1992-12-15 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of endotoxin-associated shock and preventation thereof using a BPI protein |
| US5234912A (en) * | 1989-02-14 | 1993-08-10 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical compositions comprising recombinant BPI proteins and a lipid carrier and uses thereof |
| EP0563222B1 (en) * | 1990-12-03 | 1998-02-25 | New York University | Biologically active bactericidal/permeability-increasing protein fragments |
| AU2872792A (en) * | 1991-09-26 | 1993-04-27 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | A new form of liposaccharide binding protein (lbp) |
| US5643570A (en) * | 1992-05-19 | 1997-07-01 | Xoma Corporation | BPI-immunoglobulin fusion proteins |
| DK0642579T3 (da) * | 1992-05-19 | 1999-10-18 | Xoma Corp | Forbedrede fremgangsmåder til fremstilling af endotoxin-bindende proteiner |
| US5420019A (en) * | 1993-02-02 | 1995-05-30 | Xoma Corporation | Stable bactericidal/permeability-increasing protein muteins |
| DE69428521T2 (de) * | 1993-02-02 | 2002-05-23 | Xoma Technology Ltd | Arzneizusammensetzungen enthaltend ein bakterizides permeabilität erhöhendes protein und ein tensid |
| NZ263057A (en) * | 1993-03-12 | 2000-12-22 | Xoma Corp | Use of bactericidal permeability increasing proteins or derivative for treating chronic inflammatory diseases, neutralising heparin, inhibiting angiogenesis, tumour and epithelial cell proliferation |
| ATE165976T1 (de) * | 1993-03-12 | 1998-05-15 | Xoma Corp | Behandlung von mycobakteriellen erkrankungen durch verabreichung von bakrerientötende, durchlässigkeitserhöhende proteinfragmente |
| US5348942A (en) * | 1993-03-12 | 1994-09-20 | Xoma Corporation | Therapeutic uses of bactericidal/permeability increasing protein products |
| WO1994021280A1 (en) * | 1993-03-22 | 1994-09-29 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Use of bactericidal/permeability increasing protein and lipopolysaccharide binding protein levels and ratios thereof in diagnosis |
-
1994
- 1994-09-02 CN CN94193898A patent/CN1133634A/zh active Pending
- 1994-09-22 AT AT94928653T patent/ATE173830T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-22 DK DK94928653T patent/DK0720745T3/da active
- 1994-09-22 DE DE69414871T patent/DE69414871T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-22 ES ES94928653T patent/ES2126151T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-22 NZ NZ274083A patent/NZ274083A/en unknown
- 1994-09-22 US US08/310,961 patent/US5821064A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-22 CA CA002172243A patent/CA2172243C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-22 WO PCT/US1994/010793 patent/WO1995008773A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-22 JP JP7509960A patent/JPH09503296A/ja not_active Ceased
- 1994-09-22 EP EP94928653A patent/EP0720745B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-22 AU AU78010/94A patent/AU697356B2/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-12-24 HK HK98115455A patent/HK1014207A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-04-22 JP JP2003117669A patent/JP2003315334A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU7801094A (en) | 1995-04-10 |
| EP0720745A1 (en) | 1996-07-10 |
| WO1995008773A1 (en) | 1995-03-30 |
| ES2126151T3 (es) | 1999-03-16 |
| DE69414871T2 (de) | 1999-06-10 |
| CA2172243A1 (en) | 1995-03-30 |
| EP0720745B1 (en) | 1998-11-25 |
| DK0720745T3 (da) | 1999-06-23 |
| NZ274083A (en) | 1998-02-26 |
| US5821064A (en) | 1998-10-13 |
| CN1133634A (zh) | 1996-10-16 |
| JPH09503296A (ja) | 1997-03-31 |
| AU697356B2 (en) | 1998-10-01 |
| HK1014207A1 (en) | 1999-09-24 |
| DE69414871D1 (de) | 1999-01-07 |
| ATE173830T1 (de) | 1998-12-15 |
| CA2172243C (en) | 2002-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Coremans et al. | Antilactoferrin antibodies in patients with rheumatoid arthritis are associated with vasculitis | |
| Golden et al. | Calprotectin as a marker of inflammation in cystic fibrosis. | |
| US6274328B1 (en) | Method for quantifying LBP in body fluids | |
| DE69737870T2 (de) | Medikamente für die diagnostik von autoimmunerkrankungen | |
| US4492753A (en) | Method and means for assessment and prediction of risk of subsequent ischemic cardiac events | |
| US5466581A (en) | Method for quantifying BPI in body fluids | |
| US6033862A (en) | Marker and immunological reagent for dialysis-related amyloidosis, diabetes mellitus and diabetes mellitus complications | |
| WO1993003381A1 (en) | Assay for free secretory component and methods for monitoring organ rejection | |
| JP2003315334A (ja) | 体液中のｂｐｉの定量方法 | |
| White et al. | Measurement of bactericidal/permeability-increasing protein in human body fluids by sandwich ELISA | |
| US6660482B1 (en) | Inter-alpha-trypsin inhibitor as a marker for sepsis | |
| DE69733957T2 (de) | Verfahren zur bestimmung der gegenwart des gehirnspezifischen proteins s-100 beta | |
| RU2739607C2 (ru) | Специфически очищенные антитела против пресепсина | |
| JP3976848B2 (ja) | 血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体の測定法および測定キット | |
| US6759203B1 (en) | Method for quantifying BPI in body fluids | |
| CA2202913C (en) | Antibody reagent for detecting dissecting aortic aneurysm and uses thereof | |
| US7081334B2 (en) | Method for quantifying LBP in body fluids | |
| CA2772032C (en) | Antibodies to disulfated heparin disaccharide in the diagnosis of neuropathy | |
| JP4217717B2 (ja) | 血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体の測定法および測定キット | |
| JP4217716B2 (ja) | 血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体の測定法および測定キット | |
| US20070202549A1 (en) | Assessing risk of cerebrovascular thrombosis by measuring C4d on platelets | |
| JP2925684B2 (ja) | 血小板及び血管内皮細胞の疾病の測定方法 | |
| KR100586567B1 (ko) | 체액내lbp의정량방법 | |
| JPH04134097A (ja) | ラミニン フラグメント | |
| Sprenger | Circulating immune complexes in acute rheumatic carditis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040629 |