JPH04134097A - ラミニン フラグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なヒト　ラミニン　フラグメント、該フ
ラグメント量を指標とする疾病の検出方法、及び該フラ
グメントの免疫学的測定キットに関する。

〔従来の技術〕

基底膜はコラーゲンと非コラーゲンの各成分より成り、
生体内に普遍的に存在する細胞外マトリックスである。

近年、肝疾患、腎疾患、ガンなど不可逆的に進行する諸
疾患と基底膜との関連が注目されてきた。ラミニン（以
下、ＬＮと略記する）は基底膜に特異的に存在する高分
子タンパク質であり、基底膜が分解作用を受けた時に非
フラグメント化ラミニン（以下、ｎＬＮと略記する）又
はフラグメント化ラミニン（以下、ｆＬＮと略記する）
として体液中に遊離してくると考えられ、これら体液中
のｎ　Ｌ　Ｎ又はｆＬＮを測定することは、疾患による
基底膜分解の進展を診断する十で臨床検査上重要であり
、その簡便で迅速な測定法の確立が望まれている。

〔発明が解決しようとする課題〕

最近、ペプシン分解によるｆＬＮに対するウサギ抗血清
を用いたラジオイムノアッセイ法が開発された［：Ｄ、
Ｇ、ブＤ　ックス（Ｄ、（ｉ、［１ｒｏｃｋｓ）、クリ
ニカル　ケミストリ＝（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）第３２巻、第７８７〜７９１頁（Ｉ９８６）
］。

この測定法は、あらかじめ放射能で標識されたペプシン
分解ｆＬＮと試料を競合的に抗ペプシン分解ｆＬＮ抗体
に作用させ、約１１ヨ反応後、抗つサギＩｇＧ抗体と反
応させて免疫沈降物の放射能活性を測ることにより、試
料中のＬ　Ｎ量を測定するものである。該ラジオイムノ
アッセイ法はペプシン分解によるｆＬＮに対するウサギ
抗血清を用い、体液中のｆＬＮを抗原としでいないこと
で特異性の点で問題があり、また１」的抗原に対する抗
体として抗血清を使用する場合、このようにフラグメン
ト化された抗原に対する抗体の結合力が低下するため、
正確な測定が不可能であると考えられており、この点で
も大きな問題を含んでいた。

また、尿中ＬＨの測定は、糖尿病性腎症などの病態解析
といった点で重要な臨床的意義を有しているにもかかわ
らず、血中ＬＮの約１７１０以下という低い濃度で存在
しているなどの理由で、従来の測定法では十分感度よく
定量することは不可能であった。

抗血清の代りに、体液中のｆＬＮをも言忍識しうるモノ
クローナル抗体を使用することにより上記の問題は解決
されうるが、対象抗原となりうる体液中のｆＬＮ分子の
構造は特定されておらず、体液中のｆＬＮを測定するた
めに、該ｆＬＮの特定が必要であった。

本発明の目的は、ヒト体液中のｆＬＮを特定し、このｆ
ＬＮを特異的に、高感度に測定する方法、測定用キット
、及びｆＬＮ量の測定による疾病の検出方法を提供する
ことにある。

〔課題を解決するだめの手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はヒトｆＬＮ
に関し、ヒト体液より得られる、５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法による分子量が約４，２万であり
、下記式Ｉ：Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｔ
ｈｒ−Δ５ｐ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　ｌｙ八へｇ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｍｅｔ−・　・　・　（
Ｉ）（式中、Ｘは未同定アミノ酸残基を示す）で表され
るＮ末端アミノ酸配列を有していることを特徴とする。

また、本発明の第２の発明は、疾病の検出方法に関し、
第１の発明のヒト体液中のｆＬＮ量を正常値と比較測定
し、悪性腫瘍、肝臓疾患、腎臓疾患及び動脈硬化症を検
出することを特徴とする。更に第３の発明は、第１の発
明のヒ）ｆＬＮ測定用キットに関し、第１の発明のヒ）
　ｆ　Ｌ　Ｎをδ忍識するが、抗原認識部位を異にする
一対のモロクローナル抗体を含有することを特徴とする
。

本発明のヒ）ｆＬＮは、例えば、健常人尿中より、例え
ば抗ヒトｎＬＮポリクローナル抗体カラム、イオン交換
樹脂カラム等を用い、精製することができる。精製ヒト
ｆＬＮは、例えば１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により、分子量的４．２万のバンドとして検
出され、ヒ）ｎＬＮ　（分子量約８０万）と比較し、極
めて低分子化されている。該ヒ）ｆＬＮはそのＮ末端に
前記式（Ｉ）のアミノ酸配列を有し、この配列はヒトｎ
ＬＮのアミノ酸配列ＣＴ、　　ピッカライネン（’ｌ’
、　ｐｉｌ（ｋａｒａｉｎｅｎ　）ら、ジャーナル　オ
ブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、第２６３巻、第６７５１頁（
Ｉ９８８）：］の、Ｂ２鎖のＮ末端部から３〜１８番目
のアミノ酸配列と一致する。すなわち、該ｆＬＮはヒト
ｎＬＮのＢ２鎮のドメイン■及び■より構成されると同
定され、ヒト体液中より初めて単離・同定されたヒ）ｆ
ＬＮである。

本発明のヒ）ｆＬＮの測定方法としては、例えばＨＰＬ
Ｃを用いる方法、免疫学的方法等があるが、該ヒ）ｆＬ
Ｎに対する特異的抗体を用いる免疫学的方法により、容
易かつ、高感度に試料中のヒｌ−ｆ　Ｌ　Ｎを測定する
ことができる。

なお、本発明において、試料とはヒト体液、例えば血清
や尿を指す。

本発明のヒトｆＬＮに対する！ｈ異的抗体とは、該ヒト
ｆＬＮに対するポリクロ−リール抗体でも良いが、感度
、操作性等の点から、該ヒ）　ｆ　ＬＮを認識し、かつ
抗原δ混織部位を異にする一対のモノクローナル抗体を
用いるのが好ましい。

該モノクローナル抗体としては、例えば本発明者らが作
成したモノクローナル抗体ＨＬＮ５及びＨＬＮ８２があ
り、該一対の抗体を用い、例えばエンザイム　イノｌ、
アッセイ法により、試料中のヒ）ｆＬＮを感度よく測定
することができる。

例えば悪性腫瘍、肝１藏疾患、腎臓疾患、動脈硬化など
の患者の尿中のｆＬＮを測定ずれば、その尿中ｆＬＮ値
は健常人と比べ高値を示し、これらの疾患の診断が、尿
試料を用い簡便に行うことができる。

また血清試料を用いても、これらの疾患を感度よく検出
できる。

本発明のヒ）ｆＬＮに対する特異抗体は、例えばヒ）ｎ
ＬＮを抗原として調製でき、該抗体を得るためのヒ）ｎ
ＬＮは、例えばヒト胎盤から、それ自体公知の方法によ
り、例えば塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー等の方法を単独で又は
組合せて用いて分離精製することにより取得することが
できるしジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミスト
リー、第２５８巻、第１２６５４〜１２６６０頁（Ｉ９
８３）］。また、ヒトｆＬＮは例えば上記の方法によっ
て取得したヒ）ｎＬＮを、それ自体公知の方法により、
例えばペプシン、トリプシン、スロンビン、プラスミン
、キモトリプシン等のプロテアーゼを単独で又は組合せ
て用いて限定分解又は完全分解し、種々の分離方法、例
えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニディークロマトグラフィー等の方法を用いて分離精製
することにより取得し、抗体調製用の抗原として用いる
こともできる。

また本発明のヒ１ｉＬＮは、例えば肺ガン、胃ガン、結
腸ガン、乳ガン、膵ガンなどの悪性腫瘍患者、腎疾患４
者、動脈硬化患者又は肝疾患４者の血清又は尿を原料と
して精製、回収することも可能である。更に、近年ヒト
ＬＮＯ部アミノ酸配列が決定されたことにより本発明の
ヒ）ｆＬＮのアミノ酸配列を有する合成ペプチドも用い
られる。

本発明のヒ）ｆＬＮに対する特異抗体は、例えば、上記
の患者の尿中より精製した本発明のヒｌ−ｆ　Ｌ　Ｎを
抗原として、ヒト以外のホ乳動物、例えば、モルモット
、ウサギ、ラット、マウス、ヤギなどの抗体産生能のあ
る動物を用い通常の方法に従って免疫した後、採血して
抗血清を得、更に抗体を分離する。抗体を得るに当って
は例えば本発明のヒ）ｆＬＮｏ、１〜１ｍｇを生理食塩
水０．１〜５ｍ１に溶解し、これに同量の完全フロイン
ト・アジュバントを加え、充分乳化した後、用いるホ乳
動物、例えばウサギやマウス等の皮下又は皮内に注射し
、１〜３週間ごとに数回注射して免疫させる。その後、
最終免疫の日より一定期間後、採血し本発明のヒ）　ｆ
　Ｌ、　Ｎに対する抗体を含有する抗血清を得る。

またこの場合に用いる動物としては、抗体生産能のある
動物であればいずれを用いてもよく、大量の抗体を得る
には大型動物を用いるのが好ましく、通常はウサギ、ヤ
ギを用いるが、何ら限定されるものではない。更にこれ
らの動物から得られた抗ヒ）ｆＬＮ抗体を含有する抗血
清から抗ヒ）ｆＬＮ抗体を得るには通常用いられる抗体
の精製手段の方法によって、行えるもので例えば、抗血
清を硫安分画し、次いでイオン交換クロマトグラフィー
、あるいはゲルろ過によって精製採取すれば良い。更に
高純度に精製するにはヒ）ｆＬＮを固定化した不溶化担
体を基材として用いるアフィニティークロマトグラフィ
ーにて吸着し、次いで溶出を行って慴ればよい。更に別
法としては本発明のヒ）ｆＬＮを抗原として免疫させた
ヒト以外のホ乳動物の肺細胞とミエローマ細胞とを用い
て融合させ、この融合細胞から本発明のヒ）ｆＬＮに対
するモノクローナル抗体産生細胞を分離し、この融合細
胞を用いる抗ヒ）ｆＬＮモノクローナル抗体を製造する
方法があり、特にホ乳動物としてマウスを用いる方法が
よく利用されている〔ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、
第２５６巻、第４９５頁（Ｉ９７５）　）。以上のよう
にしてヒトＬＮに対するドメイン特異抗体が得られる。

一方上記のヒ）ｎＬＮを抗原として本発明のヒ）ｆＬＮ
に対するモノクローナル抗体を得ることもできる。すな
わちヒ１−　ｎ　Ｌ　Ｎを抗原として免疫をしたヒト以
外のホ乳動物の肺細胞とミエローマ細胞とを用いて融合
させ、この融合細胞から本発明のヒ）ｆＬＮに対するモ
ノクローナル抗体を生産するクローンを分離する。この
ようにして得られるモノクローナル抗体は本発明のヒト
ｆＬＮと反応するモノクローナル抗体である。動物とし
てはマウスがよく用いられる。

以上のようにして得られた本発明のヒ）ｆＬＮに対する
モノクローナル抗体は、抗原ε混織部位を異にする抗体
を組合せて用いることにより本発明のヒ）ｆＬＮを効果
的に検出することができる。

なお、本発明のヒ）ｆＬＮの測定に用いる該ｆＬＮ特異
的抗体としては、前述のように抗血清のようなポリクロ
ーナル抗体、あるいはモノクローナル抗体のいずれでも
差支えないが、その特異性及び親和性の高さという点に
おいて、特にモノクローナル抗体を使用することが望ま
しい。

本発明のヒ）ｆＬＮに対するモノクローナル抗体を用い
た測定法としては、従来この分野でよく知られた免疫測
定法すなわち、酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ
免疫比濁法、ラテックス凝集法、赤血球凝集法、５ＲＩ
Ｄ法（免疫拡散法）等が用いられる。中でも酵素免疫測
定法が、感度、簡便さ等において最も実用的である。す
なわち抗ヒトｆＬＮモノクローナル抗体をポリスチレン
ビーズ、ガラスピーズ、ポリスチレンマイクロタイター
プレートなどの不溶性担体で処理して、これらの担体に
共有結合又は物理的に吸着させて抗ヒ）ｆＬＮモノクロ
ーナル抗体の結合した不溶性抗体を得る。一方で抗ヒ）
ｆＬＮモノクローナル抗体に従来公知の方法を用いて酵
素標識を行う。例えば、使用する酵素に最適な化合物（
例えばβ−ガラクトシダーゼに対しｍ−マレイミドエス
テル、ペルオキシダーゼに対し過ヨウ素酸）、次いで抗
体をこの反応物に結合させて酵素標識抗し）ｆＬＮモノ
クローナル抗体を得る。

このようにして得られた、抗ヒトｆＬＮモノクローナル
抗体結合担体（不溶性抗体）と酵素標識抗ヒ）ｆＬＮモ
ノクローナル抗体（標識抗体）を用い、血中及び尿中の
ヒトｆＬＮ量を測定したところ、健常人に比べ悪性腫瘍
患者、腎疾患４者、動脈硬化症患ｌ、肝疾患４者の血中
及び尿中では、本発明のヒ）ｆＬＮの濃度が上昇するこ
とが判明し、該ｆＬＮの測定が、これらの疾患の診断に
有用であることが示された。

本発明のヒ）ｆＬＮ量の測定に用いる抗ヒトｆＬＮ抗体
をキットとしておくことで、試料中の本発明のヒ）ｆＬ
Ｎ量を簡便に測定することができる。キットに用いる試
薬は溶液状でも良いし、凍結乾燥品等でも良い。

〔実施例〕

以下に実施例を示し本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。

参考例１ （Ｉ）　　ヒトｎＬＮ抗原の単離 ヒ）ｎＬＮ抗原の抽出のために、ヒト胎盤を０、５　Ｍ
　　ＮａＣ１を含む０．０５Ｍ　　）リス塩酸緩衝液（
ｐ）１７．２）中でホモジナイズし、遠心分離により不
溶化物を除いたのちに、終濃度４ＭとなるようにＮａＣ
ｌを添加して、その際に生じる沈殿側分を集める。集め
た沈殿を０．５　Ｍ　　ＮａＣ］を含む０．０５Ｍ　　
）リス塩酸緩衝液（ｐｆｌ　７．２）に可溶化したもの
を、同緩衝液にて平衡化させたＣＬ６Ｂセファロースカ
ラムにて分画し、最初のピークに溶出されてくるフラク
ションをヒトｎＬＮ標品として集めた。

（２）　　ヒ）ｎＬＮ抗原に対するポリクローナル抗体
の作製 上記（Ｉ）で得られた精製ヒ）ｎＬＮ抗原０．５　ｍｇ
を生理食塩水０．５ｍｅに溶解し、これに等量の完全フ
ロイント・アジュバントを加え、乳化させた後ウサギ皮
下に注射した。２週間置きに、同量の抗原を不完全フロ
イント・アジュバントと乳化させたものを４回皮下注射
し、最終免疫より１０日後にその全血を採取し、６０分
間室温で放置した後、遠心分離することにより抗ヒトｎ
ＬＮ抗体を含有する抗血清を得た。本抗血清から常法に
よりプロティンＡカラムにより抗ヒ）ｎＬＮポリクロー
ナル抗体を精製した。

実施例１ （Ｉ）尿中ヒトｆＬＮの精製・同定 上記参考例１−（２）にて得られた抗ヒ）ｎＬＮポリク
ローナル抗体を常法によりＣＮＢｒ活性化セファロース
（ファルマシア社製）に吸着すせて、健常人尿５１をそ
のカラムに流し、吸着画分を８Ｍ尿素を含むＰＢＳにて
溶出した。カラムより溶出された粗ヒト尿ｆＬＮ画分を
Ｍｏｎ。

Ｑイオン交換カラム（ファルマシア社製）により分画し
て、精製ヒト尿ｆＬＮを得た。１０％５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により精製ヒト尿ｆＬＮを分離
したところ、分子量４２，０００付近に単一バンドとし
て観察され、目的のヒト尿中ｆＬＮがヒ）ｎＬＮ　（分
子量８００．０００＞と比較して、極めて低分子フラグ
メント化されていることが確認された。

このヒト尿中ｆＬＮのＮ末端アミノ酸シークエンス解析
を行ったところ、前記式（Ｉ）の配列が検出され、ヒ）
　ＬＮＢ　２鎮のアミノ酸シクエンス（Ｔ、　　ピッカ
ライネンら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストＩＪ−１第２６３巻、第６７５１頁（Ｉ９８８））
のうちＮ末端部より３−１８番目の配列と完全に合致し
たことから、ヒト尿中ｆ　Ｌ　Ｎ　ｆＪ＜　ヒ）　Ｌ　
Ｎ　Ｂ　２　ｔａＮ末端由来の分子量４２，０００のポ
リペプチド（ドメイン■及び■）により構成されでいる
５−とが確δ忍された。

実施例２ （Ｉ）　　ヒトｆＬＮに対するモノクローナル抗体の作
製 参考例１−（Ｉ）で得たヒトｎＬＮ　　５０Ｍｇを生理
食塩水０．１−に溶解し等量の完全フロイント・アジュ
バントを加え乳化させ、Ｂａ１ｂ／ｃマウスの腹腔内に
注射した。４週間後に抗原５０μｇのみを同マウスの腹
腔内に注射した。その３日後にマウスより摘出した肺臓
より、肺臓細胞を得、マウスミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ
６３Ａｇ８−Ｕｌ）と細胞数１０：１の比で混合し、５
０％ポリエチレングリコール及び２０％ジメチルスルホ
キシドの存在下で１分間放置し、細胞融合を行った。無
血清ＤＭＥＭ培地を加え希釈したのち、遠心分離により
その上清を除き、１０％牛脂児血清含有ＤＭＥＭ培地に
て細胞を懸濁し、９６穴マイクロタイタープレートに１
穴当り２Ｘ１０’細胞となるように分注した。

その後１〜３日ごとに培地の半分量をＨＡ　′Ｆ培地で
交換し、１０〜２０日後に融合細胞（ハイブリドーマ）
の生育してきたウェルの培養上清を採取し、抗体産生の
有無をＥＬ　Ｉ　ＳＡ法等により調べ、ヒ）ｎＬＮに対
する抗体を産生じでいるハイブリドーマを５株選択した
。

以上５株のハイブリドーマのうち、実施例１（Ｉ）にて
得られたヒト尿中ｆＬＮに反応性を有する抗体を産生ず
るものを３株選択した。

これらのハイブリドーマについて限界希釈法により２回
クローニングを行い、最も力価の高い抗体を産生ずるハ
イブリドーマのクローンとして、クローン株ＨＬＮ　５
及びＨＬＮ８２の２株を取得した。

前記クローン株は、各々ｌｌｙｂｒｉｄｏｍａ　ＨＬ　
Ｎ　５と表示し微工研菌寄第１１７２７号（ＦＥＲＭＰ
　−１１７２７）　、ｌｌｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｉ−ＩＬ
Ｎ　８２と表示し微工研菌寄第１０７９９号（ＦＥＲＭ
　　Ｐ１０７９９）として、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている。

この２株のハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗
体が同一フラグメント特異性を有することを確言忍する
ため（こ、ウェスタンフ゛ロッテインクにより、実施例
１（Ｉ）にて司られたヒト尿中ｆ　Ｉ＝　Ｈに両者が反
応し、かつ抗原認識部位を異にすることを確めた。これ
らのモノクローナル抗体を大量に得るために、Ｂａ１ｂ
／ｃマウス腹腔内に約２Ｘ１０７個のハイブリドーマを
注射し、腹水腫瘍を作らせ、１０日後に腹水を採取シ、
抗ヒトｆＬＮモノクローナル抗体ＨＬＮ５及びＨＬＮ８
２を取得した。

（２）抗ヒ）ｆＬＮモノクローナル抗体結合ビーズの作
製 上８２　（Ｉ）で得た抗ヒｌ−ｆ　Ｌ　Ｎモノクローナ
ル抗体ＨＬＮ８２の１ｍｇを含有する０、１Ｍ　リン酸
バッフ　７　　（ｐＨ８，０）２０ｉｌ！にポリスチレ
ンボール（漬水化学社製、粒径６．３５ｍｍ）　　１０
０粒を加え、５℃で１６時間、３７℃で１時間反応させ
、抗体をビーズに固定化させた。ビーズは生理食塩水で
充分洗浄後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）　、０．
０５％アジ化す１〜リウム、０．９％ＮａＣ］を含む１
０ｍＭ　　リン酸バッフ　ｙ　　（ｐ１４７．４）に浸
漬し、５℃で一晩放置し、抗ヒ）ｆＬＮモノクローナル
抗体結合ビーズを得た。

（３）抗ヒ）ｆＬＮモノクローナル抗体酵素標識物の作
成 上記（Ｉ）で得られた抗ヒ）ｆＬＮモノクローナル抗体
ＨＬＮ５にペルオキシダーゼ（ベーリンガーーマンハイ
ム社ＩＭ）をナカネ（Ｎａｋａｎｅ）らの方法〔ジャー
ナル　オブ　ヒストケミストリアンド　シトケミストリ
ー（Ｊ、　ｌ（ｉ３ｔｏｃｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　）第２２巻、第１０８４頁（Ｉ９
７４）：］によって結合させ、標識抗体を得た。すなわ
ち１０ｍｇのペルオキシダーゼを２ｍｌの精製水に溶か
し、０．１Ｍ　過ヨウ素酸カリウムを０．２ｍｌ加える
。室温で２０分反応させた後１ｍＭ　　酢酸バッファー
（ｐＨ４，０）に対し４℃で一晩透析する。

これに０．２Ｍ　炭酸バッファー（ｐＨ９，５）を加え
ｐｔ＋を９〜９．５に調整する。一方、抗ヒＩ−ｆ　Ｌ
　Ｎモノクローナル抗体２ｍｇを１．５証のリン＃緩衝
生理食塩水（ｐＨ７，４）に溶かし、１０ｍＭ　　炭酸
バッファー（ｐＨ９，５）に対し、−晩４℃で透１１ｉ
シーｃおき、これを上記の過ヨウ素酸処理したペルオキ
シダーゼと混合し、室温で２時間反応させた後、水累化
ホウ素すトリウム（４ｍｇ／ｍ１２）を０、１　ｒｄ添
加し、４℃で２時間反応後、リン酸緩衝生理食塩水（ｐ
Ｈ１７，４）で平衡化したウル）ｏゲルＡｃ八２２（Ｌ
ＫＢ社製）を用いゲルろ過により分画した。ペルオキシ
ダーゼ活性と抗体活性の一致する画分を集め、メルチオ
レードナ）　ＩＪウムを終濃度０．０１％となるように
添加し、４℃で保存した。

実施例３ （Ｉ）　　ヒトｆＬＮの測定 ＥＩＡ法は以下のようにして行った。試料２００μｐを
チューブに入れ、不溶化抗体ビズをチューブの中に１つ
ずつ入れ３７℃で１時間第１インキユベーシヨンを行う
。次にビーズを、３　ｍｅの生理食塩水で３回洗い、標
識抗体液（３００倍希釈）２００μｌをビーズの入った
チューブに入れ、３７℃で１時間第２インキユベーシヨ
ンを行う。次にビーズを３　ｍｅの生理食塩水で３回洗
い、ビーズを別のチューブに移し、これに発色試薬３０
０μｊｌ！　（ｏ−フェニレンジアミン１ｍｇ／ｍｌ！
、Ｈ２Ｏ２の０．０１％、０．１Ｍ　クエン酸バッファ
ーｐＨ５，０に溶解したもの）を加え、３７℃で３０分
間反応させ、Ｉ　Ｎ　Ｈ２ＳＯ。

の１−を加え反応を停止させた。波長４９２　ｎｍの吸
光度を測定した。

このような手順で、悪性腫瘍１９例、肝臓疾患２７例、
腎臓疾患１０例、動脈硬化症９例、及び健常人１８例の
血清中、及び悪性腫瘍３２例、肝臓疾患１６例、腎臓疾
患１４例、動脈硬化症１３例、及び健常人２１例の尿中
のヒ）ｆＬＮ量を測定した。尿は同時にクレアチニン量
を市販のキット　（クレアチニンテストワ」和光純薬工
業社製）を用いて測定して、尿量を補正するために、ク
レアチニン量に対するｆ　ｌ−Ｎの量の比＜ｆ　ＬＮμ
ｇ／ｇ−Ｃｒ＞で表した３、第１図は各種患者と健常人
とで血清中ヒｌ−ｆＬＮの分布を比較したグラフであり
、第２図は各種患者と健常人よで尿中ヒ）　ｆ　Ｌ、　
Ｎ量の分布を比較したグラフである。

この結果、モノクローナル抗体ＨＬ　Ｎ　５とＨＬＮ８
２の組合せに：Ｉ６いて、尿、血清中のヒトｆＬＮが測
定でき各種患者の血清中及び尿中ヒ）ｆＬＮ量は健常人
に比べ明らかに高い値を示し、疾患診断において本測定
が有用であることが示された。

実施例４ （Ｉ）　　キットの作成 ＥＩＡキット（Ｉ回分）の組成を以下に示す。

１、　抗体固相化ビーズ　　　　　　　　　１個〔工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されているハイプリ
ドーマ微工研菌寄第１０７９９号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１
０７９９）が産生ずるモノクローナル抗体ＨＬＮ８２が
固相化されたビーズ〕 ２、　ペルオキシダーゼ標識抗体　　　　０３ｍｆ！。

〔工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されているハ
イプリドーマ微工研菌寄第１１７２７号（ＦＥＲＭ　　
Ｐ−１１７２７）が産生ずるモノクローナル抗体ＨＬ　
Ｎ　５をペルオキシダーゼにより標識した〕 ３、　発色試薬　　　　　　　　　　　　０３ｍ１！（
０−フェニレンジアミン１（ＣＩの１０ｍに／誦、過酸
化水素０．０１％を含むクエン酸緩衝液ｐＨ５，０） ４、　反応停止液（ＩＮ硫酸）１．０祿５、　標準品（
本発明のヒトｆＬＮを４．２、■、０．５μｇ／ｎｉｌ
’含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳ）〔発明の効果〕 以上詳細に説明した通り、本発明により生体試料中のＬ
Ｎ測定試薬が提供された。本発明の測定試薬により新規
な悪性腫瘍、肝、腎、動脈硬化疾患の診断が可能となっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は血清中ヒ）ｆＬＮ量を、第２図は尿中ヒ）ｆＬ
Ｎ量をそれぞれ各種患者と健常人別に本測定試薬にて測
定した時の結果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト体液より得られる、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
   ドゲル電気泳動法による分子量が約４．２万であり、下
   記式 I ： Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ
   −Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
   Ａｒｇ−Ｘ−Ｍｅｔ−・・・（ I ）（式中、Ｘは未同
   定アミノ酸残基を示す）で表されるＮ末端アミノ酸配列
   を有していることを特徴とするヒトラミニンフラグメン
   ト。 ２、ヒト体液中の請求項１記載のヒトラミニンフラグメ
   ント量を正常値と比較測定することを特徴とする悪性腫
   瘍、肝臓疾患、腎臓疾患、及び動脈硬化症の検出方法。 ３、請求項１記載のヒトラミニンフラグメントを測定す
   るキットにおいて、請求項１記載のヒトラミニンフラグ
   メントを認識するが、抗原認識部位を異にする一対のモ
   ノクローナル抗体を含有することを特徴とする請求項１
   記載のヒトラミニンフラグメント測定用キット。