JP2000028607A - 新規なモノクローナル抗体及びニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生体試料中のニックβ２グリコプロテインＩ
を、試料中に同時に含まれると考えられるインタクトβ
２グリコプロテインＩの量に影響を受けることなく、迅
速かつ正確に測定することのできるニックβ２グリコプ
ロテインＩの免疫学的分析方法、及びそれに使用するモ
ノクロナール抗体を提供する。 【解決手段】 第１のモノクロナール抗体は、β２グリ
コプロテインＩと反応しないが、プロテアーゼにより一
部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩとは反応し、
第２のモノクロナール抗体は、β２グリコプロテイン
Ｉ、及びプロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グ
リコプロテインＩと反応する。前記免疫学的分析方法で
は、第１のモノクローナル抗体少なくとも１種類と、別
種の第１のモノクローナル抗体又は第２のモノクローナ
ル抗体を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プロテアーゼによ
り一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩ（以下、
ニックβ２グリコプロテインＩと称することがある）に
特異的に反応する各種の新規モノクローナル抗体及びそ
の抗体フラグメント、前記モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ、ニックβ２グリコプロテインＩの免
疫学的分析方法、並びに生体内凝固線溶異常の検出法に
関する。ニックβ２グリコプロテインＩは、生体内凝固
線溶異常の予知マーカーとして有用である。

【０００２】本明細書において、「ニックβ２グリコプ
ロテインＩ」とは、プロテアーゼによりアミノ酸配列の
一部に開裂を受けて２本のポリペプチド鎖からなるもの
の、それらがジスルフィド結合により結合しているβ２
グリコプロテインＩを意味する。また、本明細書におい
ては、プロテアーゼによる開裂を受けていないβ２グリ
コプロテインＩを、前記の「ニックβ２グリコプロテイ
ンＩ」と区別する必要がある場合には、「インタクトβ
２グリコプロテインＩ」と称することがある。従って、
本明細書において、単に「β２グリコプロテインＩ」と
称する場合には、特に断わらない限り、「インタクトβ
２グリコプロテインＩ」を指すものとする。

【０００３】

【従来の技術】β２グリコプロテインＩは、５つの繰り
返しドメイン構造（第Ｉドメイン〜第Ｖドメイン）を有
する糖タンパク質であり、例えば、ヒトβ２グリコプロ
テインＩは、３２６個のアミノ酸からなり、分子量が約
５０，０００である。インタクトβ２グリコプロテイン
Ｉは、血液中に約２００μｇ／ｍｌの濃度で存在し、陰
性荷電リン脂質（例えば、カルジオリピン又はホスファ
チジルセリンなど）、ヘパリン、又はＤＮＡなどの負電
荷物質と結合することができる。インタクトβ２グリコ
プロテインＩの生理的な機能としては、陰性荷電リン脂
質への結合による内因系凝固反応の阻害作用、及び血小
板膜上でのリン脂質依存性プロトロンビナーゼ活性の阻
害作用を示すことから、凝固制御因子としての役割が示
唆されている。

【０００４】一方、β２グリコプロテインＩにおける第
Ｖドメイン内の一部に、プロテアーゼにより開裂（例え
ば、ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１７
番目のリジン残基と第３１８番目のトレオニン残基との
間での開裂、あるいは、第３１４番目のアラニン残基と
第３１５番目のフェニルアラニン残基との間での開裂）
を受けたニックβ２グリコプロテインＩは、前記の陰性
荷電リン脂質との結合親和性が約１／１００に低下する
ことが報告されている［Ｊ．Ｅ．Ｈｕｎｔら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９０巻，
第２１４１頁〜第２１４５頁，（１９９３年）］。ま
た、第３１７番目のリジン残基と第３１８番目のトレオ
ニン残基との間での開裂は、プラスミンの作用により生
じることが報告されている［大蔵ら，Ｂｌｏｏｄ，第９
１巻，第４１７３頁〜第４１７９頁，（１９９８
年）］。このように、インタクトβ２グリコプロテイン
Ｉは、生体内で凝固制御因子としての役割を担っている
が、様々な病態（例えば、癌、白血病、又は炎症など）
において血管内凝固系が活性化されると、それに引き続
き活性化される線溶系酵素であるプラスミンにより開裂
を受け、陰性荷電リン脂質との結合親和性が低下し、ニ
ックβ２グリコプロテインＩとして血中に遊離するもの
と考えられる。

【０００５】また、全身性炎症性自己免疫疾患の一つで
ある全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者の一部に
おいては、陰性荷電リン脂質に結合したβ２グリコプロ
テインＩに対して反応する抗リン脂質抗体が血中に出現
する。この抗リン脂質抗体の存在により、血管内皮細胞
膜上において免疫複合体が形成されることで、補体系の
活性化、ひいては全身炎症反応に発展する。炎症反応に
伴い、局所で活性化された顆粒球より放出されたエラス
ターゼにより、β２グリコプロテインＩが開裂を受ける
ことも考えられる。実際、前記のＪ．Ｅ．Ｈｕｎｔらの
報告では、顆粒球エラスターゼの特異性に一致するβ２
グリコプロテインＩの第Ｖドメイン内の第３１４番目の
アラニン残基と第３１５番目のフェニルアラニン残基と
の間での開裂が示されている。また、生体内においては
プラスミンだけでなく、顆粒球エラスターゼも線溶に関
与している可能性が示唆されている［Ｂｌｏｏｄ Ｃｏ
ａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉ
ｓ，第６巻，２５９頁，（１９９５年）］。

【０００６】これらの事実及び報告から明らかなよう
に、生体試料中のニックβ２グリコプロテインＩの存在
の有無を検出するか、あるいは、その存在量を測定する
ことができれば、生体内凝固線溶異常の有無又は程度を
判断することができる。しかしながら、ニックβ２グリ
コプロテインＩの免疫学的分析方法は、従来全く知られ
ていなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、生体試料中のニックβ２グリコプロテインＩを、前
記試料中に同時に含まれると考えられるインタクトβ２
グリコプロテインＩの量に影響を受けることなく、迅速
かつ正確に測定することのできるニックβ２グリコプロ
テインＩの免疫学的分析方法を提供することにある。ま
た、本発明の課題は、前記免疫学的分析方法に用いるこ
とのできる新規モノクローナル抗体、そのモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ、並びに生体内凝固線
溶異常の検出法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前記の課題は、本発明に
よる、β２グリコプロテインＩ（すなわち、インタクト
β２グリコプロテインＩ）と反応しないが、プロテアー
ゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩ
（すなわち、ニックβ２グリコプロテインＩ）とは反応
することを特徴とする、モノクローナル抗体（以下、
「本発明による第１のモノクローナル抗体」と称するこ
とがある）又はその抗体フラグメントによって達成する
ことができる。また、本発明は、β２グリコプロテイン
Ｉ（すなわち、インタクトβ２グリコプロテインＩ）及
びニックβ２グリコプロテインＩと反応することを特徴
とする、モノクローナル抗体（以下、「本発明による第
２のモノクローナル抗体」と称することがある）又はそ
の抗体フラグメントに関する。また、本発明は、前記モ
ノクローナル抗体（すなわち、前記の本発明による第１
のモノクローナル抗体、又は前記の本発明による第２の
モノクローナル抗体）を産生することを特徴とする、ハ
イブリドーマに関する。

【０００９】また、本発明は、本発明による第１のモノ
クローナル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体と
して不溶性担体に固定化し、この固定化された第１抗体
と被検試料とを接触させ、続いて、前記の第１抗体とは
別種の本発明による第１のモノクローナル抗体若しくは
その抗体フラグメントに標識を付した第２抗体、又は本
発明による第２のモノクローナル抗体若しくはその抗体
フラグメントに標識を付した第２抗体と接触させ、前記
の固定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合
体と結合した前記第２抗体の前記標識からの信号、又は
前記の固定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ
複合体と結合しなかった前記第２抗体の前記標識からの
信号を検出することを特徴とする、プロテアーゼにより
一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの免疫学的
分析方法に関する。

【００１０】また、本発明は、不溶性担体に固定化され
た、本発明による第１のモノクローナル抗体又はその抗
体フラグメント少なくとも１種類と、不溶性担体に固定
化された、別種の本発明による第１のモノクローナル抗
体若しくはその抗体フラグメント又は本発明による第２
のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント１
種類と、被検試料とを接触させ、凝集反応を観察するこ
とを特徴とする、プロテアーゼにより一部に開裂を受け
たβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法に関す
る。更に、本発明は、ニックβ２グリコプロテインＩを
分析することを特徴とする、生体内凝固線溶異常の検出
法に関する。

【００１１】本明細書において、「ニックβ２グリコプ
ロテインＩ」とは、前記のとおり、プロテアーゼにより
アミノ酸配列の一部に開裂を受けて２本のポリペプチド
鎖からなるものの、それらがジスルフィド結合により結
合しているβ２グリコプロテインＩを意味する。具体的
には、前記「ニックβ２グリコプロテインＩ」には、
（１）プラスミンにより第Ｖドメインに開裂（ヒトβ２
グリコプロテインＩにおいては、第３１７番目のリジン
残基と第３１８番目のトレオニン残基との間で開裂）を
受けたニックβ２グリコプロテインＩ（以下、Ｐ−ニッ
クβ２グリコプロテインＩと称することがある）、及び
（２）顆粒球エラスターゼにより第Ｖドメインに開裂
（ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１４番
目のアラニン残基と第３１５番目のフェニルアラニン残
基との間で開裂）を受けたニックβ２グリコプロテイン
Ｉ（以下、Ｅ−ニックβ２グリコプロテインＩと称する
ことがある）が含まれる。

【００１２】また、本明細書において、β２グリコプロ
テインＩ（インタクトβ２グリコプロテインＩ及びニッ
ク２グリコプロテインＩの両方を含む）における「第Ｉ
ドメイン〜第IVドメインからなる領域」とは、ヒトβ２
グリコプロテインＩにおいては、３２６個のアミノ酸か
ら構成されるヒトβ２グリコプロテインＩにおける（ア
ミノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２
４１番目のアミノ酸残基からなる領域を意味する。

【００１３】更に、β２グリコプロテインＩ（インタク
トβ２グリコプロテインＩ及びニック２グリコプロテイ
ンＩの両方を含む）における「第Ｖドメイン」とは、ヒ
トβ２グリコプロテインＩにおいては、３２６個のアミ
ノ酸から構成されるβ２グリコプロテインＩにおける
（アミノ末端側から数えて）第２４２番目のアミノ酸残
基〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域を意味す
る。

【００１４】なお、ニックβ２グリコプロテインＩにお
ける「第Ｖドメイン」は、その一部に開裂（ヒトβ２グ
リコプロテインＩにおいては、第３１７番目のリジン残
基と第３１８番目のトレオニン残基との間での開裂、あ
るいは、第３１４番目のアラニン残基と第３１５番目の
フェニルアラニン残基との間での開裂）を受け、ジスル
フィド結合により結合した２本のポリペプチド鎖からな
る。一方、インタクトβ２グリコプロテインＩにおける
「第Ｖドメイン」は、ヒトβ２グリコプロテインＩにお
いては、３２６個のアミノ酸から構成されるβ２グリコ
プロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第２
４２番目のアミノ酸残基〜第３２６番目のアミノ酸残基
からなる、開裂を受けていないドメインである。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明による第１のモノクローナ
ル抗体は、インタクトβ２グリコプロテインＩ（特に
は、ヒトインタクトβ２グリコプロテインＩ）とは反応
せず、プロテアーゼ（特には、プラスミン又は顆粒球エ
ラスターゼ）により一部（特には、第Ｖドメイン）に開
裂を受けたβ２グリコプロテインＩ［特には、プロテア
ーゼ（特には、プラスミン又は顆粒球エラスターゼ）に
より一部（特には、第Ｖドメイン）に開裂を受けたヒト
β２グリコプロテインＩ］とのみ反応する。本発明によ
る好ましい第１のモノクローナル抗体は、（１）インタ
クトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、プロテアー
ゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩと
反応し、しかも、プロテアーゼにより一部に開裂を受け
たβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに反応する
（以下、「本発明によるモノクローナル抗体１Ａ」と称
することがある）か、あるいは、（２）インタクトβ２
グリコプロテインＩとは反応せず、プロテアーゼにより
一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩと反応し、
しかも、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グ
リコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからな
る領域に反応する（以下、「本発明によるモノクローナ
ル抗体１Ｂ」と称することがある）。

【００１６】本発明によるモノクローナル抗体１Ａのエ
ピトープは、ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメ
イン［例えば、ヒトニックβ２グリコプロテインＩにお
ける（アミノ末端側から数えて）第２４２番目のアミノ
酸残基〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域］に
存在する。本発明によるモノクローナル抗体１Ａのエピ
トープとしては、非還元状態のインタクトβ２グリコプ
ロテインＩ及び非還元状態のインタクトβ２グリコプロ
テインＩ第Ｖドメインにおいて分子内に隠れているが、
還元状態のインタクトβ２グリコプロテインＩ及び非還
元状態のインタクトβ２グリコプロテインＩ第Ｖドメイ
ンにおいて露出するエピトープであることが好ましい。
本発明によるモノクローナル抗体１Ａとしては、後述す
る実施例で得られるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９
を挙げることができる。

【００１７】本発明によるモノクローナル抗体１Ｂのエ
ピトープは、ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメ
イン〜第IVドメインからなる領域［例えば、ヒトニック
β２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数
えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４１番目のアミノ
酸残基からなる領域］に存在する。本発明によるモノク
ローナル抗体１Ｂのエピトープとしては、立体構造依存
的なエピトープ、すなわち、非還元状態のニックβ２グ
リコプロテインＩではエピトープの構造を保持し、還元
状態のニックβ２グリコプロテインＩではエピトープの
構造を保持しないエピトープであることが好ましい。本
発明によるモノクローナル抗体１Ｂとしては、後述する
実施例で得られるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を
挙げることができる。

【００１８】本発明による第２のモノクローナル抗体
は、インタクトβ２グリコプロテインＩ（特には、ヒト
インタクトβ２グリコプロテインＩ）、及びプロテアー
ゼ（特には、プラスミン又は顆粒球エラスターゼ）によ
り一部（特には、第Ｖドメイン）に開裂を受けたβ２グ
リコプロテインＩ［特には、プロテアーゼ（特には、プ
ラスミン又は顆粒球エラスターゼ）により一部（特に
は、第Ｖドメイン）に開裂を受けたヒトβ２グリコプロ
テインＩ］と反応する。

【００１９】本発明による第２のモノクローナル抗体の
エピトープは、β２グリコプロテインＩ（インタクトβ
２グリコプロテインＩ及びニック２グリコプロテインＩ
の両方を含む）の第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる
領域［例えば、ヒトニックβ２グリコプロテインＩにお
ける（アミノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残
基〜第２４１番目のアミノ酸残基からなる領域］に存在
することが好ましく、立体構造非依存的なエピトープ、
すなわち、非還元状態のβ２グリコプロテインＩにおい
ても、還元状態のβ２グリコプロテインＩにおいても、
エピトープとして機能するエピトープであることがより
好ましい。本発明による第２のモノクローナル抗体とし
ては、後述する実施例で得られるモノクローナル抗体Ｎ
ＧＰＩ−２３を挙げることができる。

【００２０】本発明のモノクローナル抗体は、例えば、
近年各方面で行われている細胞融合法で作成されたハイ
ブリドーマによるモノクローナル抗体産生法により得る
ことができる。すなわち、ニックβ２グリコプロテイン
Ｉ（好ましくは、ヒトニックβ２グリコプロテインＩ）
を抗原として使用し、種々のニックβ２グリコプロテイ
ンＩ、インタクトβ２グリコプロテインＩ、及び／又は
それらのフラグメントを用いてスクリーニングを実施す
ることによって、本発明のモノクローナル抗体を産生す
る本発明のハイブリドーマを調製することができ、その
ハイブリドーマから本発明のモノクローナル抗体を調製
することができる。本発明のハイブリドーマ及びモノク
ローナル抗体の調製は、常法、例えば、続生化学実験講
座（日本生化学会編）又は免疫生化学研究法（日本生化
学会編）に記載の方法に従って行うことができる。

【００２１】本発明のモノクローナル抗体は、そのモノ
クローナル抗体を産生することのできる本発明のハイブ
リドーマ（例えば、マウス・ハイブリドーマ）を、例え
ば、適当な培地又は哺乳動物（例えば、マウス）の腹腔
内で培養することにより製造することができる。本発明
のハイブリドーマは、一般的には、例えば、ニックβ２
グリコプロテインＩで免疫した哺乳動物又は鳥類（例え
ば、マウス）の脾臓細胞と哺乳動物（例えば、マウス）
のミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを、Ｎａｔｕｒｅ，
第２５６巻，４９５頁（１９７５年）に記載の方法によ
り細胞融合して製造することが可能である。詳細には、
下記実施例に記載の方法によって製造することができ
る。

【００２２】前記のハイブリドーマを培養することので
きる培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地
であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最
小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｅｅａｇｌｅ'ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａ
ｌ ｍｅｄｉｕｍ：以下、ＤＭＥと称する）にウシ胎児
血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸、及び抗生物質
（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用
いられる。前記のハイブリドーマの培養は、培地中で行
う場合には、例えば、５％ＣＯ₂濃度及び３７℃の条件
下で約３日間行う。あるいは、マウスの腹腔内で行う場
合には、例えば、約１４日間行う。

【００２３】このようにして製造された培養液又は哺乳
動物の腹水から、例えば、タンパク質の単離・精製に一
般的に用いられている方法により、本発明のモノクロー
ナル抗体を分離・精製することが可能である。そのよう
な方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロ
ースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分
子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プ
ロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができ
る。

【００２４】本発明の抗体フラグメントは、本発明のモ
ノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、も
とのモノクローナル抗体と同じ反応特異性を有する抗体
フラグメントである。すなわち、本発明による第１のモ
ノクローナル抗体の抗体フラグメントは、インタクトβ
２グリコプロテインＩとは反応せず、プロテアーゼによ
り一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩとのみ反
応する。また、本発明によるモノクローナル抗体１Ａの
抗体フラグメントは、インタクトβ２グリコプロテイン
Ｉとは反応せず、プロテアーゼにより一部に開裂を受け
たβ２グリコプロテインＩとのみ反応し、プロテアーゼ
により一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの第
Ｖドメインに反応する。また、本発明によるモノクロー
ナル抗体１Ｂの抗体フラグメントは、インタクトβ２グ
リコプロテインＩとは反応せず、プロテアーゼにより一
部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩとのみ反応
し、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコ
プロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領
域に反応する。更に、本発明による第２のモノクローナ
ル抗体の抗体フラグメントは、インタクトβ２グリコプ
ロテインＩ、及びプロテアーゼにより一部に開裂を受け
たβ２グリコプロテインＩと反応する。

【００２５】本発明の抗体フラグメントには、例えば、
Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）₂、又はＦｖ等が含まれ
る。これらのフラグメントは、例えば、本発明のモノク
ローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって
消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従っ
て得ることができる。

【００２６】このようにして得られた本発明による抗ニ
ックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体及びそ
の抗体フラグメントの内、本発明による第１のモノクロ
ーナル抗体又はその抗体フラグメントは、ニックβ２グ
リコプロテインＩとのみ特異的に結合する能力を有する
ので、例えば、（１）本発明による第１のモノクローナ
ル抗体又はその抗体フラグメント２種類以上を用いるこ
とにより、あるいは、（２）本発明による第１のモノク
ローナル抗体又はその抗体フラグメント１種類以上と、
本発明による第２のモノクローナル抗体若しくはその抗
体フラグメント１種類以上と組み合わせて用いることに
より、本発明による抗ニックβ２グリコプロテインＩモ
ノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、ニック
β２グリコプロテインＩの各種の免疫学的分析方法の試
薬として有用である。なお、本明細書において、前記
「分析方法」には、分析対象物質の存在の有無を確認す
る検出方法と、分析対象物質の量を測定する定量方法の
両方が含まれる。

【００２７】例えば、本発明による第１のモノクローナ
ル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶
性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と被検試
料とを接触させ、続いて、第１抗体とは別種の本発明に
よる第１のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグ
メントに標識を付した第２抗体、又は本発明による第２
のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに
標識を付した第２抗体と接触させると、前記の固定化第
１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と結合し
た前記第２抗体又は前記の固定化第１抗体−ニックβ２
グリコプロテインＩ複合体と結合しなかった前記第２抗
体の前記標識からの信号を検出することができるので、
本発明による抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクロ
ーナル抗体又はその抗体フラグメントは、ニックβ２グ
リコプロテインＩの免疫学的分析方法（サンドイッチ
法）の試薬として有用である。

【００２８】また、本発明による第１のモノクローナル
抗体又はその抗体フラグメント少なくとも１種類と、別
種の本発明による第１のモノクローナル抗体若しくはそ
の抗体フラグメント又は本発明による第２のモノクロー
ナル抗体若しくはその抗体フラグメント１種類とを不溶
性担体に固定化し、これらの固定化したモノクローナル
抗体又はその抗体フラグメントと被検試料とを接触させ
ると、被検試料中のインタクトβ２グリコプロテインＩ
とは凝集反応を起こさず、ニックβ２グリコプロテイン
Ｉとの間でのみ凝集反応を起こさせることができるの
で、本発明による抗ニックβ２グリコプロテインＩモノ
クローナル抗体又はその抗体フラグメントは、ニックβ
２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法（凝集法）の
試薬として有用である。

【００２９】従って、本発明による抗ニックβ２グリコ
プロテインＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメ
ントを用いて、本発明の免疫学的分析方法を実施するこ
とができる。本発明の免疫学的分析方法に用いる被検試
料は、ニックβ２グリコプロテインＩを含む可能性のあ
る試料であれば特に限定されるものでないが、例えば、
生体試料、特には血液、血漿、血清、又は尿、好ましく
は血漿又は血清である。本発明の免疫学的分析方法にお
いては、被検試料を前処理せずに（例えば、クロマトグ
ラフィーの手法で、あらかじめインタクトβ２グリコプ
ロテインＩとニックβ２グリコプロテインＩとを分離操
作することなく）、そのまま使用しても、被検試料中に
存在するインタクトβ２グリコプロテインＩの妨害を避
けることができる。

【００３０】サンドイッチ法を利用する本発明の免疫学
的分析方法では、具体的には、本発明による第１のモノ
クローナル抗体（例えば、本発明によるモノクローナル
抗体１Ａ又は本発明によるモノクローナル抗体１Ｂ）又
はその抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化す
る（第１抗体）。次に、不溶性担体と被検試料との非特
異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤［例え
ば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不
溶性担体の表面を被覆する。続いて、未希釈の検体試料
を加えて一定時間（たとえば、５分〜３時間）及び一定
温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で
接触させ反応させる（１次反応）。続いて、前記第１次
抗体として用いたモノクローナル抗体とは別種の本発明
による第１のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラ
グメントに標識を付した第２抗体、又は本発明による第
２のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント
に標識を付した第２抗体を加えて一定時間（たとえば、
５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、
好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（２次反
応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む
生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する
標識抗体の量を定量する。その値から、被検試料中のニ
ックβ２グリコプロテインＩの量を算出することができ
る。また、１次反応と２次反応とを同時に行うことも可
能である。

【００３１】本発明のサンドイッチ法による免疫学的分
析方法に使用することのできる不溶性担体は特に限定さ
れるものでなく、例えば、ポリエチレン、ポリスチレ
ン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、
ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラ
ン、ポリサッカライド等の高分子、その他ニトロセルロ
ース、紙、アガロース及びこれらの組み合わせ等を例示
することができる。

【００３２】標識物質としては、酵素、蛍光物質、又は
発光物質を使用するのが有利である。酵素としては、例
えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、
例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、
発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、
ルシフェリン等を使用することができる。

【００３３】凝集反応を利用する本発明の免疫学的分析
方法において、不溶性担体としては、一般に抗原抗体反
応の凝集反応を利用する免疫学的分析方法において用い
られる任意の不溶性担体を用いることができ、例えば、
ラテックス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒
子）を挙げることができる。モノクローナル抗体を不溶
性担体に固定化させるには、公知の方法、例えば、化学
結合法（架橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデ
ヒド等を用いる）又は物理吸着法を用いることができ
る。こうして、モノクローナル抗体と不溶性担体との複
合体（抗体／担体複合体）を形成し、これを本発明の免
疫学的分析方法に用いることができる。

【００３４】本発明の免疫学的測定方法（凝集法）にお
いては、前記の不溶性担体に固定化した少なくとも２種
のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント、すな
わち、（１）本発明による第１のモノクローナル抗体又
はその抗体フラグメント少なくとも１種類と、（２）別
種の本発明による第１のモノクローナル抗体若しくはそ
の抗体フラグメント又は本発明による第２のモノクロー
ナル抗体若しくはその抗体フラグメント１種類とを使用
するが、使用するモノクローナル抗体の各々のエピトー
プが互いに離れている方が凝集反応が起きやすい点で、
本発明によるモノクローナル抗体１Ａ若しくはその抗体
フラグメント、本発明によるモノクローナル抗体１Ｂ若
しくはその抗体フラグメント、又は本発明による第２の
モノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントの少
なくとも２種を使用することが好ましい。

【００３５】本発明の免疫学的測定方法（凝集法）にお
いては、例えば、モノクローナル抗体を２種用いる場合
には、或る１種のモノクローナル抗体を不溶性担体に固
定化して調製した抗体／担体複合体を２種用いるか、あ
るいは、２種のモノクローナル抗体を或る１種の不溶性
担体に固定化して調製した抗体／担体複合体を用いるこ
とができる。また、モノクローナル抗体を３種用いる場
合には、或る１種のモノクローナル抗体を不溶性担体に
固定化して調製した抗体／担体複合体を３種用いるか、
あるいは、３種のモノクローナル抗体を或る１種の不溶
性担体に固定化して調製した抗体／担体複合体を用いる
ことができる。更に、或る１種のモノクローナル抗体を
不溶性担体に固定化して調製した抗体／担体複合体１種
と、２種のモノクローナル抗体を或る１種の不溶性担体
に固定化して調製した抗体／担体複合体１種との組み合
わせを用いることもできる。スライド板を用いる場合に
は目視的に、又は反応セルを用いる場合には特定の波長
を用いて分光学的に凝集反応を測定し、被検試料中のニ
ックβ２グリコプロテインＩ濃度を定量することができ
る。

【００３６】ニックβ２グリコプロテインＩは、生体内
凝固線溶異常の予知マーカーであるので、本発明の免疫
学的分析方法を用いて、被検試料中に含まれるニックβ
２グリコプロテインＩを検出することによって、あるい
は、ニックβ２グリコプロテインＩの量を測定し、その
測定値と健常人の平均値とを比較することによって、生
体内凝固線溶異常の有無及び／又は程度を検出すること
ができる。

【００３７】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【実施例１】《各種タンパク質の調製》 （ａ）インタクトβ２グリコプロテインＩの調製 β２グリコプロテインＩは、Ｅ．Ｐｏｌｚらの方法［Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，第１１巻，２６５頁，（１
９８０年）］に準じて行った。すなわち、ヒト正常血漿
３００ｍｌに終濃度１．３％となるように過塩素酸を添
加し、４℃で１５分間処理した後に、遠心分離（５，０
００×ｇ，１０分間）を実施した。遠心分離により得ら
れた上清に、１／３容量の１Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）を添加して中性に戻した後に、限外濾過によ
り濃縮した。この濃縮液を、予め１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したヘパリン固定化Ｈｉ
Ｔｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ，スウェーデン）に充填し、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）にてカラムを洗浄した後に、１０ｍ
Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１Ｍ−ＮａＣｌ
を含む１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）とを
用いたグラジェント溶出法により、インタクトβ２グリ
コプロテインＩを溶出した。このインタクトβ２グリコ
プロテインＩは、ＮａＣｌ濃度が０．２０Ｍである画分
付近に溶出された。ヒト正常血漿３００ｍｌより、精製
インタクトβ２グリコプロテインＩ４．５ｍｇが得られ
た。

【００３８】得られた精製インタクトβ２グリコプロテ
インＩを、以下に示すニックβ２グリコプロテインＩの
調製のための原料及び抗ニックβ２グリコプロテインＩ
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選別するため
のＥＬＩＳＡ用抗原として、更には、抗ニックβ２グリ
コプロテインＩモノクローナル抗体の認識部位の同定に
使用した。

【００３９】（ｂ）Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ
の調製 実施例１（ａ）で調製したインタクトβ２グリコプロテ
インＩ−３ｍｇを２０ｍＭ−ＮａＣｌ及び０．３ｍＭ−
ＣａＣｌ₂を含有する０．１Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）３ｍｌに溶解し、この溶解液にヒトプラスミ
ン８６μｇを添加した。このときのインタクトβ２グリ
コプロテインＩとプラスミンとのモル比（インタクトβ
２グリコプロテインＩ：プラスミン）は、５０：１であ
った。３７℃で２時間インキュベートした後に、予め１
０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した
ヘパリン固定化ＨｉＴｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａＢｉｏｔｅｃｈ，スウェーデン）に充填し、１０ｍＭ
−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にてカラムを洗浄し
た後に、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と
１Ｍ−ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）とを用いたグラジェント溶出法により、
Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩを溶出した。Ｐ−ニ
ックβ２グリコプロテインＩは、ＮａＣｌ濃度が０．１
５Ｍである画分付近に溶出され、Ｐ−ニックβ２グリコ
プロテインＩ２．０ｍｇを得た。

【００４０】得られたＰ−ニックβ２グリコプロテイン
Ｉを、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル
抗体作製のための免疫原として、また、抗ニックβ２グ
リコプロテインＩモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として、更には、
抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体の
認識部位の同定に使用した。

【００４１】（ｃ）リコンビナント第Ｖドメイン及びイ
ンタクト第Ｖドメインの調製 ヒトβ２グリコプロテインＩをコードする全遺伝子配列
を含むプラスミドｐＵＣ１１８−β２−ＧＰＩ上の第IV
ドメインと第Ｖドメインとの間のヒンジ領域に相当する
箇所に、部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅ
ｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法により制限酵素
ＨｉｎｄIIIの切断部位を導入した［松浦ら，Ｉｎｔ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第３巻，第１２１７頁〜第１２２１
頁，（１９９１年）］。得られたプラスミドを制限酵素
ＨｉｎｄIIIで切断することにより生じる、ヒトβ２グ
リコプロテインＩの第Ｖドメイン（第２４２番目のアミ
ノ酸残基〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域）
をコードする領域の５'側に、活性化血液凝固Ｘａ因子
による切断部位をコードするＤＮＡ断片をリンカーとし
て接続し、得られたＤＮＡ断片を酵母（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）の発現ベクターであるｐＰＩＣ９
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；米国）に挿入した。このよ
うにして構築した第Ｖドメイン発現ベクターを、ｐＮＰ
Ｄ５と名付けた。この第Ｖドメイン発現ベクターｐＮＰ
Ｄ５において、前記活性化血液凝固Ｘａ因子による切断
部位及び第Ｖドメインをコードする領域の５'側には、
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）由来の分泌シグナルが存在している［萩原ら，
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１２１巻，第１２８頁〜第１
３７頁，（１９９７年）］。

【００４２】第Ｖドメイン発現ベクターｐＮＰＤ５を制
限酵素ＢｇｌIIで切断し、直鎖状にしてからヒスチジン
要求株である宿主ＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社；米国）にトランスフォーメーションした。抗β２グ
リコプロテインＩ・ウサギポリクローナル抗体（Ｓｅｒ
ｂｉｏ社；フランス）を用いたニトロセルロース膜ハイ
ブリダイゼーション法によるスクリーニングの結果、高
効率に第Ｖドメインを発現する形質転換株ＧＳ１１５
（ｐＮＰＤ５）を得た。

【００４３】得られた形質転換株ＧＳ１１５（ｐＮＰＤ
５）を、増殖培地［４％グリセロールを含むＢＭ培地
［酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）１０ｇ／リットル，肉ペ
プトン（Ｓｉｇｍａ社）２０ｇ／リットル，酵母窒素ベ
ース（ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ；Ｄｉ
ｆｃｏ社）６．７ｇ／リットル，Ｄ−ビオチン（ナカラ
イテスク社）０．４ｍｇ／リットル，１Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌ／リットル］］２リ
ットル中で、６００ｎｍにおける吸光度が６０を示すま
で増殖させた後に、誘導培地（３％メタノールを含むＢ
Ｍ培地）０．６６リットルに交換し、更に１３時間培養
を続けることにより、Ｎ末端側に酵母由来の分泌シグナ
ル及び活性化血液凝固Ｘａ因子による切断部位とが連結
したβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメイン（以下、リ
コンビナント第Ｖドメインと称する）を培地中に発現さ
せた。

【００４４】遠心分離にて細胞画分を除去した後に、上
清を、５０ｍＭ−ＮａＣｌ及び１ｍＭ−ＥＤＴＡを含有
する５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で６倍に希
釈し、予め５０ｍＭ−ＮａＣｌ及び１ｍＭ−ＥＤＴＡを
含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）にて平
衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）に充填した。
充分にカラムを洗浄した後に、５０ｍＭ−ＮａＣｌ及び
１ｍＭ−ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．５）と０．８Ｍ−ＮａＣｌ及び１ｍＭ−ＥＤ
ＴＡを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）
とによるグラジェント溶出法により溶出した。目的の溶
出フラクションを限外濾過により濃縮した後に、蒸留水
に対して透析し、更には、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８
−ＡＲカラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより、リコンビナ
ント第Ｖドメインを精製した。

【００４５】このようにして調製したリコンビナント第
ＶドメインのＮ末端には、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の分泌シグナルと
活性化血液凝固Ｘａ因子による切断部位とが存在する。
これを除去するために、リコンビナント第Ｖドメインを
１．３ｍＭ−ＣａＣｌ₂、０．１Ｍ−ＮａＣｌ、及び
０．１％アジ化ナトリウムを含有する６０ｍＭ−ＨＥＰ
ＥＳ（ｐＨ８．０）に溶解した後に、活性化血液凝固Ｘ
ａ因子を３７℃で９時間作用させた。この際のリコンビ
ナント第Ｖドメインに対する活性化血液凝固Ｘａ因子の
質量比は１／５０であった。この分解物をＣｏｓｍｏｓ
ｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲカラムを用いた逆相ＨＰＬＣによ
り分離し、精製第Ｖドメインを得た。培養液１リットル
当たり、第Ｖドメイン１００ｍｇが得られた。この精製
第Ｖドメインを、以下に示すニック第Ｖドメインの調製
のための原料及び抗ニックβ２グリコプロテインＩモノ
クローナルの認識部位の同定に使用した。なお、ここで
調製した第Ｖドメインを、以下のニック第Ｖドメインと
区別するために「インタクト第Ｖドメイン」と称するこ
ともある。

【００４６】（ｄ）Ｐ−ニック第Ｖドメインの調製 実施例１（ｃ）で調製した第Ｖドメイン（インタクト第
Ｖドメイン）１ｍｇを２０ｍＭ−ＮａＣｌ及び０．３ｍ
Ｍ−ＣａＣｌ₂を含む０．１Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）３ｍｌに溶解し、これにヒト・プラスミン１
４４μｇを添加した。この際の第Ｖドメインとプラスミ
ンとのモル比（第Ｖドメイン：プラスミン）は５０：１
であった。３７℃で２時間インキュベートした後に、Ｃ
ｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲカラムを用いた逆相Ｈ
ＰＬＣによりニック第Ｖドメインを分離、精製した。こ
のようにして調製したＰ−ニック第Ｖドメインを、抗ニ
ックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体の認識
部位の同定に使用した。

【００４７】

【実施例２】《ハイブリドーマの調製》 （ａ）免疫化した脾臓細胞の調製 前記実施例１（２）で得られたＰ−ニックβ２グリコプ
ロテインＩ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝１．０）を等量
のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混和
し、その混合液０．１ｍｌをマウス腹腔内に投与するこ
とにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後
に、そのマウスに前記と同様の方法で腹腔内に投与した
（第２回免疫）。第２回免疫から、２１日経過後に、Ｐ
−ニックβ２グリコプロテインＩ溶液（Ａ２８０ｎｍ＝
１．０）を等量の生理的食塩水で希釈し、その希釈液
０．１ｍｌを、マウスの静脈内に投与した（最終免
疫）。最終免疫から３日経過後に、マウスから脾臓を無
菌的に摘出し、以下の工程に使用した。

【００４８】（ｂ）細胞融合 無菌的に摘出した前記の脾臓を、１５％ウシ胎児血清を
含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレーに入れた。次
に、脾臓を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５
ｍｌで還流して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁
液をナイロンメッシュに通した。この脾細胞を５０ｍｌ
遠心チューブに集めて５００×ｇで１０分間遠心した。
こうして得たペレットにヘモライジング溶液（１５５ｍ
Ｍ−ＮＨ ₄Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ₃，及び１ｍＭ−Ｎ
ａ₂ＥＤＴＡ；ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、懸濁させ
た。０℃で５分間放置すると、懸濁液中の赤血球が破壊
された。１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地１５ｍｌ
を加えてから遠心分離した。このようにして得た細胞ペ
レットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きてい
る脾細胞数を測定した。

【００４９】一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細
胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４（約２×１
０⁷個）に前記脾臓細胞（１×１０⁸個）を加え、ＤＭＥ
培地中でよく混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ，
１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほ
ぐし、３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリ
コール４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブ
を手で、１分間穏やかに回転することによってポリエチ
レングリコール溶液と細胞ペレットとを混合させた。次
に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を３０秒毎に１
ｍｌずつ加えてチューブを穏やかに回転させた。この操
作を１０回繰り返した後、１５％ウシ胎児血清を含むＤ
ＭＥ培地２０ｍｌを加えて、遠心分離（５００×ｇ，１
０分間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレットを
１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にア
ミノプテリン４×１０^-7Ｍ、チミジン１．６×１０
^-5Ｍ、及びヒポキサンチン１×１０^-4Ｍになるように添
加したもの）で、遠心法によって２回洗浄した後、前記
ＨＡＴ培地４０ｍｌに懸濁した。

【００５０】この細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレ
ートの各ウェルに２００μｌずつ分注し、５％炭酸ガス
を含む３７℃の炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養
中、２〜３日間隔で各ウェルの培地約１００μｌを除
き、新たに前記のＨＡＴ培地１００μｌを加えることに
よりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択し
た。８日頃から１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（Ｄ
ＭＥ培地にチミジン１．６×１０^-5Ｍ及びヒポキサンチ
ン１×１０^-4Ｍになるように添加したもの）に交換し、
ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、約１０日目
に、後述するＥＬＩＳＡ法により、抗ニックβ２グリコ
プロテインＩモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを
スクリーニングした。

【００５１】（Ｃ）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無をＥＬＩＳ
Ａ法により測定した。９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート
（Ｉｍｍｕｌｏｎ II；日本ダイナテック株式会社）の
各ウェルに、前述の精製Ｐ−ニックβ２グリコプロテイ
ンＩ溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．０５；生理食塩水で希釈
した）を５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放置し
た。次に、０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を
含む生理食塩水（以下、トウィーン２０−生理食塩水と
称する）で３回洗浄した後、各ウェルの培養上清５０μ
ｌを加え、２５℃で１時間反応させた。次に、トウィー
ン２０−生理食塩水で洗浄した後に、トウィーン２０−
生理食塩水で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗
マウス免疫グロブリン・ウサギＩｇＧ抗体（ダコ社；デ
ンマーク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終了後、
トウィーン２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、
酵素基質溶液（０．５ｍＭ−４−アミノアンチピリン、
１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を
含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液；ｐＨ７．４）２００
μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各
ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。

【００５２】その結果、３８２ウェル中３ウェルに抗体
産生が認められた。その３ウェル中の各ハイブリドーマ
を２４ウェルプレートに移し、１５％ウシ胎児血清を含
むＨＴ培地で４〜５日間培養した。その後、再度ＥＬＩ
ＳＡ法によって抗ニックβ２グリコプロテインＩモノク
ローナル抗体の産生の有無を確認してから、限界希釈法
によりクローニングした。１０日後に、ＥＬＩＳＡ法に
よって抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニ
ングした。その結果、各ハイブリドーマにつき、２０〜
４０個の抗体産生クローンが得られた。これらのクロー
ンの中から、増殖の良い、抗体分泌能の高い、しかも安
定なクローンを選び、前述と同様の方法により再クロー
ン化を行い、本発明の抗ニックβ２グリコプロテインＩ
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＮＧＰＩ
−２３、ハイブリドーマＮＧＰＩ−５９、及びハイブリ
ドーマＮＧＰＩ−６０を樹立した。これらのハイブリド
ーマ３種は、それぞれ工業技術院生命工学工業技術研究
所に平成１０年７月９日から寄託されている。ハイブリ
ドーマＮＧＰＩ−２３の受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１６
８９１であり、ハイブリドーマＮＧＰＩ−５９の受託番
号はＦＥＲＭ Ｐ−１６８９２であり、そして、ハイブ
リドーマＮＧＰＩ−６０の受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１
６８９３である。

【００５３】

【実施例３】《モノクローナル抗体の製造》 （ａ）イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマＮＧＰＩ−２３を、１５％ウシ胎
児血清を含むＤＭＥ培地で３７℃にて５％二酸化炭素雰
囲気中において７２〜９６時間培養した。培養物を遠心
分離（１０，０００×ｇ，１０分間）した後、上清に固
形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるように徐
々に加えた。混合物を氷冷下で３０分間攪拌した後、６
０分間放置し、遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分）
した後、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン
酸緩衝液に対して透析した。

【００５４】透析物を、１０ｍＭリン酸緩衝液で予め平
衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モ
ノクローナル抗体の溶出は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）と０．２Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ８．０）との間でグラジェント溶出法によ
り行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法
で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対し
て透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をヤ
ギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通し
た。次に通過液を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカ
ラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出し
て、精製した本発明の抗ニックβ２グリコプロテインＩ
モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３を得た。なお、本明
細書においては、各ハイブリドーマの名称を、そのハイ
ブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の名称と
しても使用する。ハイブリドーマＮＧＰＩ−５９及びハ
イブリドーマＮＧＰＩ−６０についても、ハイブリドー
マＮＧＰＩ−２３と同様の前記操作をそれぞれ実施し、
本発明のモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９及びモノク
ローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を得た。

【００５５】（ｂ）イン・ビボ法 プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）０．５ｍｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に投与し、投与後１４〜２０日目のマウ
ス腹腔内にインビトロで増殖させたハイブリドーマＮＧ
ＰＩ−２３、ハイブリドーマＮＧＰＩ−５９、及びハイ
ブリドーマＮＧＰＩ−６０をマウス一匹あたり２×１０
⁶細胞となるように接種した。各ハイブリドーマにつ
き、一匹のマウスから約１０〜１５ｍｌの腹水が得られ
た。その抗体濃度は、５〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹
水中のモノクローナル抗体の精製は、前記のイン・ビト
ロ法と同様の方法で行った（但し、ヤギ抗ウシ血清Ｉｇ
Ｇ−セファロース４Ｂのカラムを通す操作は、実施しな
かった）。

【００５６】

【実施例４】《モノクローナル抗体の免疫グロブリンク
ラスの同定》本発明の抗ニックβ２グリコプロテインＩ
モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３、モノクローナル抗
体ＮＧＰＩ−５９、及びモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−
６０の免疫グロブリンクラスの同定は、オクテロニー免
疫拡散法により行った。結果を表１に示す。

【表１】モノクローナル抗体 免疫グロブリンのクラス ＮＧＰＩ−２３ ＩｇＧ１，κ ＮＧＰＩ−５９ ＩｇＧ２ａ，κＮＧＰＩ−６０ ＩｇＧ１，κ

【００５７】

【実施例５】《モノクローナル抗体の特異性》 （ａ）ＥＬＩＳＡ法 前記実施例１で調製したインタクトβ２グリコプロテイ
ンＩ、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ、インタクト
第Ｖドメイン、及びＰ−ニック第Ｖドメインを、１５０
ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）で５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、９６ウ
ェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ II；日本
ダイナテック株式会社）の各ウェルに、抗原希釈液５０
μｌずつを分注し、２５℃で２時間放置することで固定
化した。次に、トウィーン２０−生理食塩水でウェルを
３回洗浄した後、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノ
クローナル抗体ＮＧＰＩ−２３、モノクローナル抗体Ｎ
ＧＰＩ−５９、及びモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０
を０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０及び１５０
ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）で５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、各ウェ
ルにモノクローナル抗体希釈液５０μｌずつを分注し、
２５℃で１時間反応させた。対照試験は、各抗ニックβ
２グリコプロテインＩモノクローナル抗体の代わりに、
ＳＰ２／０細胞をマウス腹腔に投与して採取した腹水を
使用して実施した。

【００５８】ウェルを洗浄した後、トウィーン２０−生
理食塩水で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マ
ウス免疫グロブリン・ウサギＩｇＧ（ダコ社；デンマー
ク）の希釈液を５０μｌずつ各ウェルに加えた。反応終
了後、トウィーン２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗
浄し、酵素基質溶液（０．５ｍＭ ４−アミノアンチピ
リン、１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水
素水を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液；ｐＨ７．４）
２００μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間発色反
応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定し
た。各モノクローナル抗体と各抗原との結合反応の結果
を表２に示す。表２において、抗原（Ａ）はインタクト
β２グリコプロテインＩを示し、抗原（Ｂ）はＰ−ニッ
クβ２グリコプロテインＩを示し、抗原（Ｃ）はインタ
クト第Ｖドメイン示し、抗原（Ｄ）はＰ−ニック第Ｖド
メインを示し、「＋」は結合反応性を有することを示
し、「−」は結合反応性がないことを示す。

【００５９】

【表２】 モノクローナル抗体 抗原 （Ａ） （Ｂ） （Ｃ） （Ｄ） ＮＧＰＩ−２３ ＋ ＋ − − ＮＧＰＩ−５９ − ＋ − ＋ ＮＧＰＩ−６０ − ＋ − − 腹水 − − − −

【００６０】表２の結果から明らかなように、抗ニック
β２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−
２３は、インタクトβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニ
ックβ２グリコプロテインＩに反応し、インタクト第Ｖ
ドメイン及びＰ−ニック第Ｖドメインに反応しなかっ
た。すなわち、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノク
ローナル抗体ＮＧＰＩ−２３は、インタクトβ２グリコ
プロテインＩ及びＰ−ニックβ２グリコプロテインＩに
おける第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に反応
することが判明した。しかも、後述するように、抗ニッ
クβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ
−２３は、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクロー
ナル抗体ＮＧＰＩ−５９又は抗ニックβ２グリコプロテ
インＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０と組み合わせ
ることによりサンドイッチ免疫測定法の構築が可能であ
ることから、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクロ
ーナル抗体ＮＧＰＩ−５９及び抗ニックβ２グリコプロ
テインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０とは異なる
部位に反応する。

【００６１】抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクロ
ーナル抗体ＮＧＰＩ−５９は、インタクトβ２グリコプ
ロテインＩ及びインタクト第Ｖドメインには反応せず、
Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニック第Ｖ
ドメインに反応した。すなわち、抗ニックβ２グリコプ
ロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９は、プロ
テアーゼ、特にはプラスミンにより開裂を受けたＰ−ニ
ックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに特異的に
反応することが判明した。

【００６２】抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクロ
ーナル抗体ＮＧＰＩ−６０は、インタクトβ２グリコプ
ロテインＩ、インタクト第Ｖドメイン、及びＰ−ニック
第Ｖドメインには反応せず、Ｐ−ニックβ２グリコプロ
テインＩにのみ反応した。すなわち、抗ニックβ２グリ
コプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０は、
プロテアーゼ、特にはプラスミンにより開裂を受けたＰ
−ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメイン以外の
領域、つまり、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩの第
Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に特異的に反応
することが判明した。

【００６３】また、各抗原を固相に固定化する際に、ヘ
パリン（濃度：３０μｇ／ｍｌ）、又は陰性荷電リン脂
質であるカルジオリピン（濃度：１００μＭ）を共存さ
せても、インタクトβ２グリコプロテインＩ及びインタ
クト第Ｖドメインに対する抗ニックβ２グリコプロテイ
ンＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９及びＮＧＰＩ−
６０の反応性は認められなかった。このことは、ヘパリ
ン又は陰性荷電リン脂質のカルジオリピンが、β２グリ
コプロテインＩに結合することで誘導されるエピトープ
とは全く異なるエピトープを抗ニックβ２グリコプロテ
インＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９及びＮＧＰＩ
−６０が認識することを示している。

【００６４】（ｂ）イムノブロット法 前記実施例１で調製したインタクトβ２グリコプロテイ
ンＩ、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ、インタクト
第Ｖドメイン、及びＰ−ニック第Ｖドメインを、非還元
下あるいは還元下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分画した後、ゲル中の
タンパク質をニトロセルロースメンブレンに電気的に転
写した。このメンブレンを、５％スキムミルク及び０．
１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．５）中に２５℃で３０分間浸した後、一次抗
体として各抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクロー
ナル抗体であるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３、モ
ノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９、又はモノクローナル
抗体ＮＧＰＩ−６０を２５℃で１時間反応させた。対照
試験は、各抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクロー
ナル抗体の代わりに、ＳＰ２／０細胞をマウス腹腔に投
与して採取した腹水を使用して実施した。

【００６５】０．０５％トウィーン−２０及び０．１５
Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）でメンブレンを３回洗浄した後、二次抗体と
してアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ・ヤ
ギＩｇＧ抗体（バイオラッド社）を２５℃で１時間反応
させた。前記と同様の方法でメンブレンを洗浄した後、
５ｍＭ−ＭｇＣｌ₂を含む０．１Ｍジエタノールアミン
緩衝液（ｐＨ９．５）に、ニトロブルーテトラゾリウム
（終濃度＝０．３３ｍｇ／ｍｌ）及び５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルホスフェート−ｐ−トルイジン
（終濃度＝０．１７ｍｇ／ｍｌ）を加えた溶液を発色液
として用いた。この発色液を２５℃で５〜１０分間反応
させた。反応停止は、メンブレンを蒸留水で数回洗浄す
ることにより行った。非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
画した後のイムノブロットの結果を表３に示し、還元下
のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した後のイムノブロットの結
果を表４に示す。また、表３及び表４において、抗原
（Ａ）はインタクトβ２グリコプロテインＩを示し、抗
原（Ｂ）はＰ−ニックβ２グリコプロテインＩを示し、
抗原（Ｃ）はインタクト第Ｖドメイン示し、抗原（Ｄ）
はＰ−ニック第Ｖドメインを示し、「＋」は結合反応性
を有することを示し、「−」は結合反応性がないことを
示す。

【００６６】

【表３】 モノクローナル抗体 抗原 （Ａ） （Ｂ） （Ｃ） （Ｄ） ＮＧＰＩ−２３ ＋ ＋ − − ＮＧＰＩ−５９ − ＋ − ＋ ＮＧＰＩ−６０ − ＋ − − 腹水 − − − −

【００６７】

【表４】 モノクローナル抗体 抗原 （Ａ） （Ｂ） （Ｃ） （Ｄ） ＮＧＰＩ−２３ ＋ ＋ − − ＮＧＰＩ−５９ ＋ ＋ ＋ ＋ ＮＧＰＩ−６０ − − − − 腹水 − − − −

【００６８】表３の結果（すなわち、非還元下のＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分画した後のイムノブロットの結果）は、
実施例５（ａ）で示した表２の結果（すなわち、ＥＬＩ
ＳＡの結果）と一致する。すなわち、抗ニックβ２グリ
コプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３は、
インタクトβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニックβ２
グリコプロテインＩに反応し、インタクト第Ｖドメイン
及びＰ−ニック第Ｖドメインに反応しなかった。すなわ
ち、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクローナル抗
体ＮＧＰＩ−２３は、インタクトβ２グリコプロテイン
Ｉ及びＰ−ニックβ２グリコプロテインＩにおける第Ｉ
ドメイン〜第IVドメインからなる領域に反応することが
判明した。

【００６９】抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクロ
ーナル抗体ＮＧＰＩ−５９は、インタクトβ２グリコプ
ロテインＩ及びインタクト第Ｖドメインには反応せず、
Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニック第Ｖ
ドメインに反応した。すなわち、抗ニックβ２グリコプ
ロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９は、プロ
テアーゼ、特にはプラスミンにより開裂を受けたＰ−ニ
ックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに特異的に
反応することが判明した。

【００７０】抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクロ
ーナル抗体ＮＧＰＩ−６０は、インタクトβ２グリコプ
ロテインＩ、インタクト第Ｖドメイン、及びＰ−ニック
第Ｖドメインには反応せず、Ｐ−ニックβ２グリコプロ
テインＩにのみ反応した。すなわち、抗ニックβ２グリ
コプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０は、
プロテアーゼ、特にはプラスミンにより開裂を受けたＰ
−ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメイン以外の
領域、つまり、Ｐ−ニックβ２グリコプロテインＩの第
Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に特異的に反応
することが判明した。

【００７１】表４の結果（すなわち、還元下のＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分画した後のイムノブロットの結果）から明
らかなように、抗ニックβ２グリコプロテインＩモノク
ローナル抗体ＮＧＰＩ−２３は、インタクトβ２グリコ
プロテインＩ及びＰ−ニックβ２グリコプロテインＩに
反応し、インタクト第Ｖドメイン及びＰ−ニック第Ｖド
メインに反応しなかった。すなわち、抗ニックβ２グリ
コプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３は、
インタクトβ２グリコプロテインＩ及びＰ−ニックβ２
グリコプロテインＩにおける第Ｉドメイン〜第IVドメイ
ンからなる領域に存在する立体構造非依存的なエピトー
プに反応することが判明した。

【００７２】抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクロ
ーナル抗体ＮＧＰＩ−５９は、Ｐ−ニックβ２グリコプ
ロテインＩ及びＰ−ニック第Ｖドメインに反応するだけ
でなく、更に、非還元の状態では反応しなかったインタ
クトβ２グリコプロテインＩ及びインタクト第Ｖドメイ
ン（表３参照）にも反応した。この結果より、抗ニック
β２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−
５９は、非還元状態のインタクトβ２グリコプロテイン
Ｉ及びインタクト第Ｖドメインにおいては分子内に隠れ
ているが、還元状態では露出するエピトープを認識して
いることが判明した。

【００７３】抗ニックβ２グリコプロテインＩモノクロ
ーナル抗体ＮＧＰＩ−６０は、還元状態のインタクトβ
２グリコプロテインＩ、還元状態のＰ−ニックβ２グリ
コプロテインＩ、還元状態のインタクト第Ｖドメイン、
及び還元状態のＰ−ニック第Ｖドメインのいずれにも反
応しなかった。すなわち、非還元状態で反応したＰ−ニ
ックβ２グリコプロテインＩ（表３参照）にも、還元状
態では反応しなかった。この結果より、抗ニックβ２グ
リコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０
は、非還元状態でのみ、Ｐ−ニックβ２グリコプロテイ
ンＩにおける第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域
に構成される立体構造依存的なエピトープを認識してい
ることが判明した。

【００７４】

【実施例６】《酵素免疫測定法によるニックβ２グリコ
プロテインＩの測定》ナカネ及びカワオイ［ジャーナル
・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミスト
リー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２２
巻，第１０８４頁〜第１０９１頁（１９７４年）］の方
法に準じて、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを抗ニック
β２グリコプロテインＩモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−
２３及びＮＧＰＩ−５９に結合させた。この酵素標識抗
体を用いてニックβ２グリコプロテインＩのサンドイッ
チ酵素免疫測定を以下のようにして行った。

【００７５】すなわち、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−
６０を２０μｇ／ｍｌの濃度で含有する５０ｍＭ炭酸水
素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）１００μｌを９６ウ
ェルＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕ
ｌｏｎ−II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに
入れて、２５℃で２時間放置した。そのプレートをトウ
ィーン２０−生理食塩水で３回洗浄した。このようにし
て抗体を感作したプレートのウェルに、正常血漿に前記
実施例１（ｂ）で調製したＰ−ニックβ２グリコプロテ
インＩを、１０００ｎｇ／ｍｌ、３１６ｎｇ／ｍｌ、１
００ｎｇ／ｍｌ、３２ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、及
び３．２ｎｇ／ｍｌの濃度となるようにそれぞれ添加し
て調製した試料１００μｌを加え、２５℃で１時間反応
させた。次に、トウィーン２０−生理食塩水で洗浄した
後に、先に調製したペルオキシダーゼ標識モノクローナ
ル抗体ＮＧＰＩ−２３、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ、及び２
％ウシアルブミンを含む２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．５）１００μｌを加え、２５℃で１時間
反応させた。

【００７６】続いて、トウィーン２０−生理食塩水でプ
レートを洗浄した後、酵素基質液［１ｍＭ−２，２'−
アジノ−ジ（３−エチルベンツチアゾリンスルホン酸）
ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０．００２５％過酸
化水素水を含む溶液；ｐＨ４．５］２００μｌずつを各
ウェルに加え、２５℃で４０分間反応させた後に、各ウ
ェルの４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリ
ーダー（ＭＰＲ Ａ４ｉ型；東ソー）で測定した。得ら
れた検量線を図１に示す。また、固相化抗体としてモノ
クローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を用い、ペルオキシダー
ゼ標識モノクローナル抗体としてモノクローナル抗体Ｎ
ＧＰＩ−５９を用いた場合、及び固相化抗体としてモノ
クローナル抗体ＮＧＰＩ−５９を用い、ペルオキシダー
ゼ標識モノクローナル抗体としてモノクローナル抗体Ｎ
ＧＰＩ−２３を用いた場合にも同様の検量線を得ること
ができた。

【００７７】

【実施例７】《生体内凝固線溶異常をきたした患者群並
びに健常人群におけるニックβ２グリコプロテインＩの
測定》実施例６で示した酵素免疫測定法（すなわち、固
相化抗体としてモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を用
い、ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体としてＮ
ＧＰＩ−２３を用いた酵素免疫測定法）により、生体内
凝固線溶異常をきたした患者群（２１例）、並びに健常
人群（１０例）におけるニックβ２グリコプロテインＩ
濃度を測定した。結果を図２に示す。健常人群のニック
β２グリコプロテインＩ濃度は、全例において４ｎｇ／
ｍｌ以下であった。それに対して、生体内凝固線溶異常
をきたした患者群のそれは、全例において３０ｎｇ／ｍ
ｌ以上であった。

【００７８】

【実施例８】《抗体と不溶性担体との複合体含有液の調
製》 （ａ）不溶性担体上に１種類のモノクローナル抗体を担
持する複合体含有液の調製 モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３（２．０ｍｇ／ｍ
ｌ）を含有する水溶液２ｍｌと、ラテックス溶液（２％
ポリスチレンラテックス，日本合成ゴム；粒径＝０．３
１０μｍ）２ｍｌとを混合し、２時間撹拌して抗体をラ
テックス粒子上に固定化した。遠心分離（２０，０００
×ｇ，２０分間）した後、沈殿を０．１％ウシアルブミ
ン溶液に懸濁し、１時間撹拌した。再び、遠心分離（２
０，０００×ｇ，２０分間）した後、沈殿を蒸留水に懸
濁し、２時間撹拌した。こうしてモノクローナル抗体Ｎ
ＧＰＩ−２３／ラテックス複合体含有液を得た。モノク
ローナル抗体ＮＧＰＩ−２３の代わりに、モノクローナ
ル抗体ＮＧＰＩ−５９又はモノクローナル抗体ＮＧＰＩ
−６０を用いること以外は前記操作をそれぞれ繰り返す
ことにより、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ラテ
ックス複合体含有液、及びモノクローナル抗体ＮＧＰＩ
−６０／ラテックス複合体含有液を調製した。

【００７９】（ｂ）不溶性担体上に２種類のモノクロー
ナル抗体を担持する複合体含有液の調製 モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３及びモノクローナル
抗体ＮＧＰＩ−５９をそれぞれ１．０ｍｇ／ｍｌずつ含
有する水溶液水溶液２ｍｌと、前記実施例８（ａ）で用
いたラテックス溶液２ｍｌとを混合し、２時間撹拌して
抗体をラテックス粒子上に固定化した。以下、前記実施
例８（ａ）と同様の操作を行ない、モノクローナル抗体
ＮＧＰＩ−２３／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／
ラテックス複合体含有液を調製した。モノクローナル抗
体の組み合わせを変更し、前記操作を繰り返すことによ
り、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／モノクローナ
ル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液、及び
モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／モノクローナル抗
体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液を調製し
た。

【００８０】（ｃ）不溶性担体上に３種類のモノクロー
ナル抗体を担持する複合体含有液の調製 モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３、モノクローナル抗
体ＮＧＰＩ−５９、及びモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−
６０をそれぞれ０．６６ｍｇ／ｍｌずつ含有する水溶液
水溶液２ｍｌと、前記実施例８（ａ）で用いたラテック
ス溶液２ｍｌとを混合し、２時間撹拌して抗体をラテッ
クス粒子上に固定化した。以下、前記実施例８（ａ）と
同様の操作を行ない、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２
３／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／モノクローナ
ル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液を調製
した。

【００８１】

【実施例９】《スライド凝集反応によるＰ−ニックβ２
グリコプロテインＩの測定》前記実施例８で調製した種
々の抗体ラテックス複合体含有液又はそれらの混合液３
０μｌと、正常血漿に実施例１（２）で調製したＰ−ニ
ックβ２グリコプロテインＩを種々濃度で添加して調製
した試料３０μｌとをスライドガラス上で混合し、揺動
して３分後に凝集像を目視的に判定した。

【００８２】結果を表５に示す。表５において、「＋」
は凝集ありを、そして「−」は凝集なしを意味する。ま
た、表５の「モノクローナル抗体／ラテックス複合体の
種類」欄に示す「ＮＧＰＩ−２３」は、モノクローナル
抗体ＮＧＰＩ−２３／ラテックス複合体含有液を意味
し；以下、同様に、「ＮＧＰＩ−５９」は、モノクロー
ナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液を；
「ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−
６０／ラテックス複合体含有液を；「ＮＧＰＩ−２３／
ＮＧＰＩ−５９」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２
３／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ラテックス複
合体含有液を；「ＮＧＰＩ−２３／ＮＧＰＩ−６０」
は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／モノクローナ
ル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液を；
「ＮＧＰＩ−５９／ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナ
ル抗体ＮＧＰＩ−５９／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−
６０／ラテックス複合体含有液を；「ＮＧＰＩ−２３／
ＮＧＰＩ−５９／ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル
抗体ＮＧＰＩ−２３／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５
９／モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複
合体含有液を、それぞれ意味する。

【００８３】また、同欄に示す「ＮＧＰＩ−２３＋ＮＧ
ＰＩ−５９」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／
ラテックス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧＰ
Ｉ−５９／ラテックス複合体含有液との等量混合液を意
味し；以下、同様に、「ＮＧＰＩ−２３＋ＮＧＰＩ−６
０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３／ラテック
ス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０
／ラテックス複合体含有液との等量混合液を；「ＮＧＰ
Ｉ−５９＋ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体Ｎ
ＧＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液と、モノクロー
ナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液との
等量混合液を；「ＮＧＰＩ−２３＋ＮＧＰＩ−５９＋Ｎ
ＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３
／ラテックス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧ
ＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液と、モノクローナ
ル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液との等
量混合液を意味する。

【００８４】更に、同欄に示す「ＮＧＰＩ−２３＋ＮＧ
ＰＩ−５９／ＮＧＰＩ−６０」は、モノクローナル抗体
ＮＧＰＩ−２３／ラテックス複合体含有液と、モノクロ
ーナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ＮＧＰＩ−６０／ラテック
ス複合体含有液との１：２混合液を意味し；以下、同様
に、「ＮＧＰＩ−５９＋ＮＧＰＩ−２３／ＮＧＰＩ−６
０」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９／ラテック
ス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３
／ＮＧＰＩ−６０／ラテックス複合体含有液との１：２
混合液を；「ＮＧＰＩ−６０＋ＮＧＰＩ−２３／ＮＧＰ
Ｉ−５９」は、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０／ラ
テックス複合体含有液と、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ
−２３／ＮＧＰＩ−５９／ラテックス複合体含有液との
１：２混合液を意味する。

【００８５】

【表５】

【００８６】

【発明の効果】本発明によれば、被検試料中のインタク
トβ２グリコプロテインＩの干渉を受けることなく、患
者由来の被検試料中のニックβ２グリコプロテインＩの
量を特異的に、簡便かつ迅速に、ＥＩＡ法及び凝集法に
より測定することができる。これは、本発明により初め
て可能になったものである。従って、本発明は生体内凝
固線溶異常を把握するための有効な手段を提供するもの
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるモノクローナル抗体を用いたサン
ドイッチ酵素免疫測定法により、Ｐ−ニックβ２グリコ
プロテインＩの測定を行った検量線を示すグラフであ
る。

【図２】本発明によるモノクローナル抗体を用いたサン
ドイッチ酵素免疫測定法により、健常人（１０例）と生
体内凝固線溶異常をきたした患者群（２１例）のニック
β２グリコプロテインＩ濃度を測定した結果を示すグラ
フである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 犬塚 貴美子 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内 (72)発明者 中原 邦彦 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内 (72)発明者 加藤 久雄 大阪府吹田市上山田８−13−1013 Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA25 BB22 BB34 CA25 CA26 CB21 DA44 FB01 FB03 FB07 FB11 FB15 4B024 AA11 BA53 CA02 CA10 DA12 EA04 FA18 GA03 HA01 HA15 4B064 AG01 AG27 AG31 CA06 CA10 CA19 CA20 CB06 CC24 DA13 4B065 AA80X AA80Y AA92X AA93Y AB01 AB05 AC14 BA02 BA08 CA24 CA25 CA46 4H045 AA11 AA30 BA53 DA76 DA86 EA50 FA72 FA74

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 β２グリコプロテインＩと反応しない
   が、プロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコ
   プロテインＩとは反応することを特徴とする、モノクロ
   ーナル抗体又はその抗体フラグメント。
2. 【請求項２】 プロテアーゼにより一部に開裂を受けた
   β２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに反応する、請
   求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグ
   メント。
3. 【請求項３】 プロテアーゼにより一部に開裂を受けた
   β２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメイン
   からなる領域に反応する、請求項１に記載のモノクロー
   ナル抗体又はその抗体フラグメント。
4. 【請求項４】 β２グリコプロテインＩ、及びプロテア
   ーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩ
   と反応することを特徴とする、モノクローナル抗体又は
   その抗体フラグメント。
5. 【請求項５】 プロテアーゼにより一部に開裂を受けた
   前記β２グリコプロテインＩが、β２グリコプロテイン
   Ｉの第Ｖドメインに開裂を受けたものである、請求項１
   〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はそ
   の抗体フラグメント。
6. 【請求項６】 プロテアーゼが、プラスミン又は顆粒球
   エラスターゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記
   載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか一項に記載のモ
   ノクローナル抗体を産生することを特徴とする、ハイブ
   リドーマ。
8. 【請求項８】 請求項１に記載のモノクローナル抗体又
   はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶性担体に
   固定化し、この固定化された第１抗体と被検試料とを接
   触させ、続いて、前記の第１抗体とは別種の請求項１に
   記載のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメン
   トに標識を付した第２抗体、又は請求項４に記載のモノ
   クローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を
   付した第２抗体と接触させ、前記の固定化第１抗体とプ
   ロテアーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテ
   インＩとの複合体と結合した前記第２抗体の前記標識か
   らの信号、又は前記の固定化第１抗体とプロテアーゼに
   より一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩとの複
   合体と結合しなかった前記第２抗体の前記標識からの信
   号を検出することを特徴とする、プロテアーゼにより一
   部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩの免疫学的分
   析方法。
9. 【請求項９】 不溶性担体に固定化された請求項１に記
   載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント少な
   くとも１種類と、不溶性担体に固定化された請求項１に
   記載の別種のモノクローナル抗体若しくはその抗体フラ
   グメント又は請求項４に記載のモノクローナル抗体若し
   くはその抗体フラグメント１種類と、被検試料とを接触
   させ、凝集反応を観察することを特徴とする、プロテア
   ーゼにより一部に開裂を受けたβ２グリコプロテインＩ
   の免疫学的分析方法。
10. 【請求項１０】 プロテアーゼにより一部に開裂を受け
    たβ２グリコプロテインＩを分析することを特徴とす
    る、生体内凝固線溶異常の検出法。