JPH05284994A - 抗ヒトｐｉｖｋａ−ｉｉ抗体、ハイブリドーマおよび免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 各々ヒトＰＩＶＫＡ−IIと反応するが、ヒト
プロトロンビンおよびヒトトロンビンとは反応しないモ
ノクローナル抗体、ヒトトロンビンおよびヒトプロトロ
ンビンにも反応するモノクローナル抗体、並びにヒトプ
ロトロンビンに反応しヒトトロンビンに反応しないモノ
クローナル抗体、それらを分泌するハイブリドーマ、並
びに前記モノクローナル抗体を用いる免疫学的定量方
法。 【効果】 前記モノクローナル抗体の２種以上の組み合
わせにより、血漿試料中のＰＩＶＫＡ−IIを、希釈工程
を必要とせず、迅速かつ正確に、しかも試料中のプロト
ロンビンの妨害を受けずに特異的に測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＰＩＶＫＡ−II
（Protein induced by vitamin K absense- II) に対し
て反応性を有する各種のモノクローナル抗体群、それら
のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ群およ
びそれらのモノクローナル抗体群を用いたヒトＰＩＶＫ
Ａ−IIの免疫学的定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】プロトロンビンは血液凝固II因子とも呼
ばれる糖タンパク質であり、そのアミノ末端近傍に１０
個のγ−カルボキシグルタミン酸残基（以下Ｇｌａとい
う）を有する。肝細胞癌などによる肝実質細胞障害、ビ
タミンＫの欠乏、ビタミンＫ拮抗剤の投与などがある
と、このプロトロンビンの１０個のＧｌａの一部あるい
は大部分は、カルボキシル化が不完全なグルタミン酸残
基（以下Ｇｌｕという）のままで血中に遊離してくる。
この糖タンパク質を異常プロトロンビンすなわちＰＩＶ
ＫＡ−IIと呼んでいる。近年、肝細胞癌患者において高
率にＰＩＶＫＡ−IIが発現され、健常人に比較して血漿
中に高濃度に出現することが報告されており、肝細胞癌
の新しい腫瘍マーカーあるいは診断のモニターのための
マーカーとして重要視されている。そのため、血液ある
いは血漿中のＰＩＶＫＡ−IIの量を正確かつ簡便に測定
する必要がある。

【０００３】従来から知られているＰＩＶＫＡ−IIの代
表的な測定方法としては、以下の４種類の方法を挙げる
ことができる。第１の方法は、二次元交叉免疫電気泳動
法を用いる方法である。第２の方法は、ＰＩＶＫＡ−II
に特異的なポリクローナル抗体を用いた競合的放射免疫
測定法である。第３の方法は、硫酸バリウムで混在する
プロトロンビンを吸着、除去し、ＰＩＶＫＡ−IIをラテ
ックスを用いた間接凝集法で測定する。第４の方法は、
ＰＩＶＫＡ−IIを特異的に認識するモノクローナル抗体
とプロトロンビンに対するポリクローナル抗体の両者を
用い、その一方を固定化抗体とし、酵素標識抗体として
測定する酵素免疫測定法である。

【０００４】しかしながら、第１の方法は感度が低く定
量性に欠けるという欠点があった。第２の方法は、放射
性同位元素を用いるという施設上の問題、およびＰＩＶ
ＫＡ−IIに特異的なポリクローナル抗体の精製が煩雑で
あり、ロット差があるという種々の問題点がある。第３
の方法では、間接凝集法に用いる抗体がプロトロンビン
に対するポリクローナル抗体であるため、ＰＩＶＫＡ−
IIを特異的に測定できない欠点がある。第４の方法で
は、モノクローナル抗体を使用するので、特異性に優れ
抗体を安定に供給できる点で第１および第２の方法の欠
点が改良されているものの、酵素免疫反応が有する欠
点、すなわち操作が煩雑で測定に長時間を要するという
問題点を解消するものではなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、ＰＩＶＫ
Ａ−IIを簡便、正確かつ再現性よく測定する方法を開発
するべく鋭意研究をした結果、ヒトＰＩＶＫＡ−IIに特
異的に反応性を示すが、ヒトプロトロンビンには反応し
ない第１のモノクローナル抗体群（ＧＬＡ−１、ＧＬＡ
−２）、ヒトトロンビンおよびヒトプロトロンビンの両
者に反応性を示す第２のモノクローナル抗体群（Ｔ−
１、Ｔ−２）、ヒトプロトロンビンに反応を示すが、ヒ
トトロンビンには反応しない第３のモノクローナル抗体
群（ＰＴ−１、ＰＴ−２）の３種類のモノクローナル抗
体群を見いだし、これらのモノクローナル抗体群の第１
のモノクローナル抗体群と第２あるいは第３のモノクロ
ーナル抗体群の２種類、第１と第２と第３のモノクロー
ナル抗体群の３種類の組み合わせを用いると、血漿中の
ＰＩＶＫＡ−IIを迅速かつ正確に、Ｂ／Ｆ分離を必要と
せず、しかも検体中にＰＩＶＫＡ−IIに比べて大量に存
在するプロトロンビンの妨害を受けずに、特異的に測定
することができることを見いだした。従って、本発明の
目的は、前記の新規モノクローナル抗体、そのモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、およびその
モノクローナル抗体を用いる免疫学的定量方法を提供す
ることにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、
（１）ヒトＰＩＶＫＡ−IIと特異的に反応し、ヒトプロ
トロンビンおよびヒトトロンビンとは反応しないモノク
ローナル抗体、（２）ヒトＰＩＶＫＡ−II、ヒトトロン
ビンおよびヒトプロトロンビンに反応するモノクローナ
ル抗体、および、（３）ヒトＰＩＶＫＡ−IIおよびヒト
プロトロンビンに特異的に反応し、ヒトトロンビンには
反応しないモノクローナル抗体に関する。また、本発明
は、ヒトプロトロンビンを脱炭酸して調製した人工的ヒ
トＰＩＶＫＡ−IIで免疫した哺乳動物の脾臓と哺乳動物
のミエローマ細胞との融合によって形成され、前記の各
モノクローナル抗体（１）、（２）または（３）を分泌
する各ハイブリドーマまたはそれに由来する細胞株にも
関する。更に、本発明は不溶性担体に固定化された、前
記モノクローナル抗体（２）または前記モノクローナル
抗体（３）の少なくとも１種および前記モノクローナル
抗体（１）と、被検試料とを接触させ、被検試料におけ
る凝集反応を観察することを特徴とする、ヒトＰＩＶＫ
Ａ−IIの測定方法にも関する。

【０００７】以下、本発明をモノクローナル抗体、ハイ
ブリドーマおよび免疫学的測定方法の順に説明する。免
疫源として用いる人工的ＰＩＶＫＡ−IIは、例えばＰ．
Ａ．Ｐｒｉｃｅの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５
４，４３１，１９７９）に従って調製することができ
る。次に、精製した人工ＰＩＶＫＡ−II免疫原溶液を用
いて哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ
またはウマ）をイン・ビボ免疫法により免疫する。

【０００８】具体的には、例えば、精製した人工ＰＩＶ
ＫＡ−II免疫原溶液を等量のフロインド氏完全アジュバ
ントまたは不完全アジュバントと乳化するまで混合す
る。この混合液を、例えばマウスの皮下に投与する（第
１回免疫）。以後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行
い、数回免疫する。最終免疫から数日後に脾臓を無菌的
に取り出し、ステンレスメッシュなどで押しつぶして脾
臓細胞を調製し、細胞融合工程に用いる。

【０００９】細胞融合に用いるもう一方の親細胞である
ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）としては、各種の公知の
細胞株、例えば、ｐ３（ｐ３／×６３−Ａｇ８）［Ｎａ
ｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）］、ｐ
３−Ｕ１［ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
８１；１−７（１９７８）］、ＮＳ−１［Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６；５１１−５１９（１９７
６）］、ＭＰＣ−11［Ｃｅｌｌ，８；４０５−４１５
（１９７６）］、ＳＰ２／０［Ｎａｔｕｒｅ，２７６；
２６９−２７０（１９７８）］、ＦＯ［Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈ．，３５；１−２１（１９８０）］、×
６３．６．５５．３［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３；
１５４８−１５５０（１９７９）］、Ｓ１９４［Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８；３１３−３２３（１９７
８）］、またはラットにおけるＲ２１０［Ｎａｔｕｒ
ｅ，２７７；１３１−１３３（１９７９）］などを使用
することができる。

【００１０】免疫脾臓細胞とミエローマ細胞との細胞融
合は通常の方法で行うことができ、例えば、公知の融合
促進剤（ポリエチレングリコールまたはセンダイウイル
スなど）を用い、場合により補助剤（ジメチルスルホキ
シドなど）を用いることもできる。免疫脾臓細胞とミエ
ローマ細胞との使用比率も常法と同様でよく、例えば、
ミエローマ細胞に対して脾臓細胞を約１〜１０倍程度の
量で用いる。融合用培地としては、例えば、４０％（ｗ
／ｖ）ポリエチレングリコールを含むダルベッコ改変イ
ーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いることができる。融合
は、前記の培地内で免疫脾臓細胞とミエローマ細胞とを
よく混合することによって行う。続いて、選別用培地
（例えば、ＨＡＴ培地）を用いてハイブリドーマ以外の
細胞を除去し、ハイブリドーマ培養上清の抗体産生の有
無を、例えばＥＬＩＳＡ法によって測定し、目的とする
ハイブリドーマを分離する。

【００１１】こうして得られた、本発明のモノクローナ
ル抗体（後述）を各々分泌するハイブリドーマは、通常
の培地で継代培養することができ、また液体窒素等の中
で容易に長期間保存することができる。

【００１２】また、前記のハイブリドーマを培養する培
地としては、ハイブリドーマの培養に適した任意の培地
を用いることができ、好適にはＤＭＥＭにウシ胎児血
清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸および抗生物質
（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用
いられる。

【００１３】前記のハイブリドーマの培養は、イン・ビ
トロの場合には例えば培地中で５％ＣＯ₂ 濃度および３
７℃で約３日間、またイン・ビボ例えばマウスの腹腔中
で培養する場合には約１４日間実施するのが好ましい。

【００１４】前記のハイブリドーマを常法によって培養
した培養液から、あるいは前記６種のいずれかのハイブ
リドーマを投与した適当な哺乳動物（例えばマウスまた
はラット）の腹水から、目的とするモノクローナル抗体
を分離し、精製することが可能である。

【００１５】このようにして製造された培養液またはマ
ウスの腹水からモノクローナル抗体を分離、精製する場
合にはタンパク質の単離、精製に一般的に用いられる方
法を用いることが可能である。そのような方法としては
硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩ゲル
を用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテイン
Ａ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィ
ー、透析、凍結乾燥の方法等がある。

【００１６】こうして得られた本発明のモノクローナル
抗体は、その反応性によって以下の３種に分類すること
ができる。 （１）ヒトＰＩＶＫＡ−IIと特異的に反応し、ヒトプロ
トロンビンとは反応しない第１のモノクローナル抗体群
（例えば、モノクローナル抗体ＧＬＡ−１およびＧＬＡ
−２）。 （２）ヒトトロンビンおよびヒトプロトロンビンと特異
的に反応する第２のモノクローナル抗体群（例えば、モ
ノクローナル抗体Ｔ−１およびＴ−２）。 （３）ヒトプロトロンビンと特異的に反応し、ヒトトロ
ンビンとは反応しない第３のモノクローナル抗体群（例
えば、モノクローナル抗体ＰＴ−１およびＰＴ−２）。

【００１７】本発明による前記の第１〜第３のモノクロ
ーナル抗体群を不溶性担体に固定化させ、前記第１のモ
ノクローナル抗体および前記第２および／または前記第
３のモノクローナル抗体を被検試料と接触させると、被
検試料中のプロトロンビンとは凝集反応を起こさず、Ｐ
ＩＶＫＡ−IIとの間でのみ凝集反応を起こさせることが
できるので、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的定量方法に用い
ることができ、そして免疫学的定量用試薬としても有用
である。

【００１８】本発明の免疫学的定量方法に用いる被検試
料は、ＰＩＶＫＡ−IIを含有する可能性のある試料であ
れば特に制限されるものではないが、例えば、生体試
料、特には血液、血漿または尿、好ましくは血漿であ
る。本発明の免疫学的定量方法においては、被検試料を
希釈せずに、そのまま使用しても、被検試料中に遊離の
状態で存在するヒトプロトロンビンの妨害を避けること
ができる。

【００１９】不溶性担体としては、抗原抗体の凝集反応
を利用する免疫学的測定方法において一般的に用いられ
る任意の不溶性担体を用いることができ、例えば、ラテ
ックス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を
挙げることができる。

【００２０】本発明によるモノクローナル抗体を不溶性
担体に固定化させるには、公知の方法、例えば、化学結
合法（架橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒ
ド等を用いる）または物理吸着法を用いることができ
る。こうして、モノクローナル抗体と不溶性担体との複
合体を形成し、これを本発明の免疫学的定量方法に用い
ることができる。

【００２１】本発明の免疫学的定量方法においては、前
記の不溶性担体に固定化した少なくとも２種のモノクロ
ーナル抗体を使用する（前記第１のモノクローナル抗体
は必須である）が、或る１種のモノクローナル抗体を不
溶性担体に固定化して調製した複合体を２種または３種
用いるか、あるいは、２種または３種のモノクローナル
抗体を或る１種の不溶性担体に固定化して調製した複合
体を用いることができる。更に、或る１種のモノクロー
ナル抗体を不溶性担体に固定化して調製した複合体１種
と、２種のモノクローナル抗体を或る１種の不溶性担体
に固定化して調製した複合体１種との組み合わせを用い
ることもできる。本発明のモノクローナル抗体２種の組
み合わせとしては、前記の第１のモノクローナル抗体
（ＧＬＡ−１、ＧＬＡ−２）と第２のモノクローナル抗
体（Ｔ−１、Ｔ−２）との組み合わせが好ましい。

【００２２】本発明の測定方法においては、前記のモノ
クローナル抗体固定化不溶性担体複合体の既知一定量と
未知量のＰＩＶＫＡ−IIを含有する水性被検試料の一定
量とを適当な反応容器（例えば、スライド板上あるいは
反応セル）中で接触させる。例えば血漿試料の場合に
は、血漿試料（非希釈液）１容量部に対して前記の複合
体懸濁水（１％以上の濃度）を１〜３容量部加えて接触
させる。また、凝集像をより鮮明にするために、試料と
複合体懸濁水に更に緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝
液）を加えて接触させてもよい。こうして形成される凝
集の程度からＰＩＶＫＡ−II濃度の定量を行うことがで
きる。この凝集反応は、血漿試料中に存在する遊離のプ
ロトロンビンの妨害を受けない。例えば、スライド板上
の場合には目視的に、反応セルの場合は特定の波長を用
いて分光学的に凝集反応を測定し、被検試料中のＰＩＶ
ＫＡ−II濃度を定量することができる。

【００２３】

【実施例】次に、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明は以下の実施例によって限定されるもの
ではない。 実施例１：人工的ＰＩＶＫＡ−IIの調製 （ａ）人工的ＰＩＶＫＡ−IIの調製は、精製プロトロン
ビンよりＰ．Ａ．Ｐｒｉｃｅの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５４，４３１，１９７９）に従って行った。
即ち、３ｍｇのヒトプロトロンビンを０．０５Ｍ塩酸お
よび０．１ＭＮＨ₄ ＨＣＯ₃ に溶解し、凍結乾燥した。
減圧下で乾燥プロトロンビンを１１０℃で加熱し、その
後セファデックスＧ−１００によるゲルクロマトグラフ
ィーにより（４℃）精製した。

【００２４】（ｂ）免疫化脾臓細胞の調製 人工ＰＩＶＫＡ−II免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．
１）を等量のフロインド氏完全アジュバントと乳化する
まで混合し、その混合液２００μｌをＢＡＬＢ／ｃ系マ
ウスの腹腔内に投与することにより免疫を行った（第１
回免疫）。３０日経過後、前記と同様の混合液２００μ
ｌを前記のマウスの腹腔内に投与した（第２回免疫）。
第２回免疫から２１日経過後、人工ＰＩＶＫＡ−II免疫
原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩水で
希釈して調製した人工ＰＩＶＫＡ−II希釈液２００μｌ
を、前記のマウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最
終免疫から３日経過後、脾臓を無菌的にマウスから取り
出し、次の細胞融合工程に使用した。

【００２５】（ｃ）細胞融合 １５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシ
ャーレに、無菌的に抽出した前記の脾臓を入れた。次
に、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで
前記脾臓を還流して脾臓細胞を流出させた後、この脾臓
細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾臓細胞
を５０ｍｌ遠心チューブに集め、５００×ｇで１０分間
遠心した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液
（１５５ｍＭ−ＮＨ₄ Ｃｌ、１０ｍＭ−ＫＨＣＯ₃ 、１
ｍＭ−Ｎａ₂ ＥＤＴＡ：ｐＨ７．０）４ｍｌを加え、懸
濁させた。０℃で５分間放置して懸濁液中の赤血球を破
壊させた。１５％ウシ胎児血清１０ｍｌを含むＤＭＥ培
地を加えてから遠心分離した。こうして得たペレットを
ＤＭＥ培地で遠心法により洗浄し、生きている脾臓細胞
数を測定した。

【００２６】一方、予め培養しておいたマウスミエロー
マ細胞（骨髄腫細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４（理化学研
究所ジーンバンク細胞銀行）約２×１０⁷ 個に前記脾臓
細胞１×１０⁸ 個を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し、
遠心分離を行った（５００×ｇ、１０分間）。その上清
を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、４０％ポリエチ
レングリコール４０００溶液（３８℃に保温）０．５ｍ
ｌを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏やかに回転す
ることによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレ
ットとを混合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤ
ＭＥ培地を３０秒毎に１ｍｌずつ加えて、チューブを穏
やかに回転させた。この操作を１０回繰り返した後、１
５％ウシ胎児血清２０ｍｌを含むＤＭＥ培地を加えて、
遠心分離（５００×ｇ、１０分間）を行った。上清を除
去した後、１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭ
Ｅ培地にアミノプテリン４×１０^-7Ｍ、チミジン１．６
×１０^-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍになるように
添加したもの）で細胞ペレットを遠心法によって２回洗
浄した後、前記ＨＡＴ培地４０ｍｌに懸濁した。この細
胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレートの各ウエルに２
００μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養
器で３７℃にて培養を開始した。培養中、２〜３日間隔
で各ウエルの培地を約１００μｌ除き、新たに前記のＨ
ＡＴ培地１００μｌを加えることによりＨＡＴ培地中で
増殖するハイブリドーマを選択した。８日目から１５％
ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン
１．６×１０^-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍになる
ように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマを観察
するとともに、１０日目に、後記のＥＬＩＳＡ法によ
り、抗人工ＰＩＶＫＡ−II抗体産生ハイブリドーマをス
クリーニングした。

【００２７】（ｄ）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養液の上清における産生抗体の有無は
ＥＬＩＳＡ法により測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用
プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ1.1.、日本ダイナテック株式
会社）の各ウエルに前記の人工ＰＩＶＫＡ−II免疫原溶
液（Ａ２８０ｎｍ＝０．０５、生理食塩水で希釈した）
５０μｌずつを分注し、２５℃で２時間放置した。次
に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で３回洗浄
した後、各ウエルに培養液上清５０μｌを加え、２５℃
で１時間反応させた。

【００２８】次に、Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で２０
０倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ダ
コ社、デンマーク）５０μｌを各ウエルに加えた。反応
終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で各ウ
エルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、１
０ｍＭフェノールおよび０．００５％過酸化水素水を含
む溶液２５０μｌを各ウエルに加え、２５℃で３０分間
反応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定
した。その結果、１９２ウエル中、６ウエルに抗体産生
が認められた。その６ウエル中のハイブリドーマを２４
ウエルプレートに移し、１５％ウシ胎児血清を含むＨＡ
Ｔ培地で４〜５日間培養した。その後、再度ＥＬＩＳＡ
法によって抗人工ＰＩＶＫＡ−II抗体の産生の有無を確
認してから限界希釈法によりクローニングした。限界希
釈法は、ＨＴ培地でハイブリドーマが５個／ｍｌとなる
ように希釈した細胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／ｃ系
マウスの腹腔細胞がウエルあたり２×１０⁴ 個分注して
ある９６ウエルプレートの各ウエルに１００μｌずつ分
注した。１０日後、ＥＬＩＳＡ法によって人工ＰＩＶＫ
Ａ−II特異的抗体を産生するハイブリドーマのクローン
をスクリーニングした。

【００２９】その結果、各ハイブリドーマにつき、２０
〜４０個の抗体産生クローンが得られた。これらのクロ
ーンの中から、増殖力が強く、抗体分泌能が高く、しか
も安定なクローンを選び、前記と同様の方法で再クロー
ン化を行い、６種の抗人工ＰＩＶＫＡ−II抗体産生ハイ
ブリドーマＧＬＡ−１、ＧＬＡ−２、Ｔ−１、Ｔ−２、
およびＰＴ−１、ＰＴ−２を樹立した。これら６種のハ
イブリドーマから分泌される６種のモノクローナル抗体
ＧＬＡ−１、ＧＬＡ−２、Ｔ−１、Ｔ−２、およびＰＴ
−１、ＰＴ−２とヒトプロトロンビンあるいはヒトトロ
ンビン（アテンズ・リサーチ社、アメリカ）との反応性
を、９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートにヒトトロンビン
あるいはヒトプロトロンビンを被覆し、前記のＥＬＩＳ
Ａ法と同様の方法により調べた。モノクローナル抗体Ｇ
ＬＡ−１、ＧＬＡ−２はヒトトロンビンとヒトプロトロ
ンビンの両者とは反応しなかった。モノクローナル抗体
Ｔ−１、Ｔー２はヒトトロンビンとヒトプロトロンビン
の両者と反応した。一方モノクローナル抗体ＰＴ−１、
ＰＴ−２はヒトプロトロンビンに反応したが、ヒトトロ
ンビンには反応しなかった。

【００３０】実施例２：モノクローナル抗体の製造 （ａ）イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマＧＬＡ−１、ＧＬＡ−２、Ｔ−
１、Ｔ−２、およびＰＴ−１、ＰＴ−２を、それぞれ１
５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で、３７℃で５％二
酸化炭素雰囲気中において７２〜９６時間培養した。培
養物を遠心分離（１００００×ｇ、１０分間）後、上清
に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるよう
に徐々に加えた。混合物を氷冷下で３０分間攪拌した
後、６０分間放置してから遠心分離（１００００×ｇ，
１０分間）処理し、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０
ｍＭリン酸緩衝液ですでに平衡化したＤＥＡＥ−セルロ
−スのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ−Ｎａ
Ｃｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の間で
濃度勾配法により行った。溶出されたモノクローナル抗
体を限外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）に対して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くため
に、透析物をヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂ
カラムに通した。次に、通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロー
ス４Ｂカラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液
で溶出して、精製した抗ヒトＰＩＶＫＡ−II特異モノク
ローナル抗体ＧＬＡ−１、同様にモノクローナル抗体Ｇ
ＬＡ−２、モノクローナル抗体Ｔ−１、モノクローナル
抗体Ｔ−２、モノクローナル抗体ＰＴ−１、およびモノ
クローナル抗体ＰＴ−２の溶液を得た。

【００３１】（ｂ）イン・ビボ法 プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）０．５ｍｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃ系
マウスの腹腔内に投与し、それから１４〜２０日目のマ
ウスの腹腔内にインビトロで増殖されたハイブリドーマ
ＧＬＡ−１、ＧＬＡ−２、Ｔ−１、Ｔ−２、ＰＴ−１、
またはＰＴ−２をマウス一匹あたり２×１０⁶ 個となる
ように接種した。

【００３２】各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから
約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、
２〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル
抗体の精製は、前記のイン・ビトロ精製と同様の方法
（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカ
ラムを通す操作を除く）で行った。

【００３３】実施例３：モノクローナル抗体の免疫グロ
ブリンクラスおよび特異性の同定 モノクローナル抗体ＧＬＡ−１、ＧＬＡ−２、Ｔ−１、
Ｔ−２、ＰＴ−１、またはＰＴ−２の免疫グロブリンク
ラスおよび特異性の同定はそれぞれオクテロニー免疫拡
散法およびエンザイムイムノアッセイ法により行った。
結果は表１および表２に示す通りである。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【表２】

【００３６】表１および表２において＋はＥＬＩＳＡ法
で反応を示すことを、そして−はＥＬＩＳＡ法で反応を
示さないことを意味する。また、図１に示すとおり、プ
レトロンビンの１〜５８２番目のアミノ酸配列におい
て、プレトロンビン１は１５８〜５８２番目、フラグメ
ント１は１〜１５７番目、フラグメント２は１５８〜２
７５番目、グラ領域は１〜４１番目、ペプチドＩは１〜
２４番目（但し、ｇｌａをｇｌｕに置換した合成ペプチ
ド）およびペプチドIIは２５〜４１番目（但し、ｇｌａ
をｇｌｕに置換した合成ペプチド）である。

【００３７】実施例４：抗体と不溶性担体（ラテック
ス）との結合 モノクローナル抗体ＧＬＡ−１（２．０ｍｇ／ｍｌ）を
含有する水溶液２ｍｌと、ラテックス溶液（２％、Ｄｏ
ｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社：粒径０．４８２μｍ）２ｍｌ
とを混合し、約１時間攪拌した。遠心（２００００×
ｇ、１０分間）した後、沈澱を０．１％ＢＳＡ溶液に懸
濁し、約１時間攪拌した。再び遠心（２００００×ｇ、
１０分間）した後、沈澱を水に懸濁し、約２時間攪拌し
た。こうして、モノクローナル抗体ＧＬＡ−１／ラテッ
クス複合体含有液を得た。同様にしてモノクローナル抗
体ＧＬＡ−２、モノクローナル抗体Ｔ−１、モノクロー
ナル抗体Ｔ−２、モノクローナル抗体ＰＴ−１およびモ
ノクローナル抗体ＰＴ−２を用いて、単独の各モノクロ
ーナル抗体とラテックスとの複合体の含有液を調製し
た。

【００３８】抗体混合物とラテックスとの複合体は以下
のように調製した。モノクローナル抗体ＧＬＡ−１、モ
ノクローナル抗体Ｔ−１およびモノクローナル抗体ＰＴ
−１をそれぞれ０．６６ｍｇ／ｍｌずつ含有する水溶液
２ｍｌと、ラテックス溶液（２％、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ社：粒径０．４８２μｍ）２ｍｌとを混合し、約
１時間攪拌した。以下、前記と同様に処理して、モノク
ローナル抗体ＧＬＡ−１／モノクローナル抗体Ｔ−１／
モノクローナル抗体ＰＴ−１／ラテックス複合体を調製
した。他の組み合わせも同様の方法で調製した。

【００３９】モノクローナル抗体ＧＬＡ−１およびモノ
クローナル抗体Ｔ−１をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌずつ含有
する水溶液とラテックス溶液とを等量混合すること以外
は前記と同様にして、モノクローナル抗体ＧＬＡ−１／
モノクローナル抗体Ｔ−１／ラテックス複合体を調製し
た。

【００４０】実施例５：スライド凝集反応による定量 実施例４で調製した抗体ラテックス複合体含有液３０μ
ｌと種々な濃度のＰＩＶＫＡ−IIを含有する水溶液３０
μｌとをスライドガラス上で混合し、揺動して３分後に
凝集像を目視的に判定した。結果を以下の表３〜表６に
示す。

【００４１】表３〜表６において、＋は凝集ありを、そ
して−は凝集なしを各々意味する。また、各表の抗体／
ラテックス複合体の欄において、複合体の種類をその複
合体に結合するモノクローナル抗体によって示す。従っ
て、例えばＧＬＡ−１はモノクローナル抗体ＧＬＡ−１
／ラテックス複合体を意味し、ＧＬＡ−１＋Ｔ−１はモ
ノクローナル抗体ＧＬＡ−１／ラテックス複合体とモノ
クローナル抗体Ｔ−１／ラテックス複合体との等量混合
液を意味する。更に、ＧＬＡ−１／Ｔ−１はモノクロー
ナル抗体ＧＬＡ−１含有液、モノクローナル抗体Ｔ−１
含有液およびラテックス溶液を等量混合したものであ
る。

【００４２】

【表３】

【００４３】

【表４】

【００４４】

【表５】

【００４５】

【表６】

【００４６】実施例６：精製ＰＩＶＫＡ−IIの添加回収
試験 ５種の検体、即ち健常人Ａから採取した血漿（検体
１）、健常人Ｂから採取した血漿（検体２）、肝細胞癌
患者Ｃから採取した血漿（検体３）、肝細胞癌患者Ｄか
ら採取した血漿（検体４）および肝細胞癌患者Ｅから採
取した血漿（検体５）中のＰＩＶＫＡ−II濃度を、実施
例５のモノクローナル抗体ＧＬＡ−１／モノクローナル
抗体Ｔ−１／ラテックス複合体溶液を用いて測定した。
次いで、それぞれの検体に精製ＰＩＶＫＡ−IIを表７に
記載の量で添加し添加回収試験を行った。測定値は検体
を倍々希釈して凝集の消失する希釈倍率から半定量的に
測定した。結果は表７に示すように、良好な回収が得ら
れた。

【００４７】

【表７】

【００４８】実施例７：健常人と肝細胞癌患者群のＰＩ
ＶＫＡ−II値 実施例６で使用したモノクローナル抗体ＧＬＡ−１／モ
ノクローナル抗体Ｔ−１／ラテックス複合体溶液を用い
て、健常人血漿２０検体、肝細胞癌患者血漿５５検体の
ＰＩＶＫＡ−II量を測定した。結果を第２図に示す。健
常人群のＰＩＶＫＡ−II量は全例０．１μｇ／ｍｌ未満
であった。それに対して肝細胞癌患者群は全例１μｇ／
ｍｌ以上であった。

【００４９】

【発明の効果】本発明によれば、血漿試料の希釈操作を
行わなくても、血漿中のプロトロンビンの干渉を受ける
ことなく、患者血漿中のＰＩＶＫＡ−II量を特異的に、
簡便かつ迅速に、凝集法により測定することができる。
これは、本発明によって初めて可能になったものであ
る。従って、本発明は肝細胞癌等の診断および病理研究
に有用な手段を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による各モノクローナル抗体の反応特異
性を同定した際に用いた各種のペプチド断片の構造を示
す説明図である。

【図２】本発明のモノクローナル抗体ラテックス複合体
を用いて、健常人血漿（２０検体）および肝細胞癌患者
血漿（５５検体）中のＰＩＶＫＡ−II量を測定した結果
を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/06

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＰＩＶＫＡ−IIと特異的に反応し、
   ヒトプロトロンビンおよびヒトトロンビンとは反応しな
   いモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒトプロトロンビンを脱炭酸して調製し
   た人工的ヒトＰＩＶＫＡ−IIで免疫した哺乳動物の脾臓
   と哺乳動物のミエローマ細胞との融合によって形成さ
   れ、請求項１記載のモノクローナル抗体を分泌するハイ
   ブリドーマまたはそれに由来する細胞株。
3. 【請求項３】 ヒトＰＩＶＫＡ−II、ヒトトロンビンお
   よびヒトプロトロンビンに反応するモノクローナル抗
   体。
4. 【請求項４】 ヒトプロトロンビンを脱炭酸して調製し
   た人工的ヒトＰＩＶＫＡ−IIで免疫した哺乳動物の脾臓
   と哺乳動物のミエローマ細胞との融合によって形成さ
   れ、請求項３記載のモノクローナル抗体を分泌するハイ
   ブリドーマまたはそれに由来する細胞株。
5. 【請求項５】 ヒトＰＩＶＫＡ−IIおよびヒトプロトロ
   ンビンに特異的に反応し、ヒトトロンビンには反応しな
   いモノクローナル抗体。
6. 【請求項６】 ヒトプロトロンビンを脱炭酸して調製し
   た人工的ヒトＰＩＶＫＡ−IIで免疫した哺乳動物の脾臓
   と哺乳動物のミエローマ細胞との融合によって形成さ
   れ、請求項５記載のモノクローナル抗体を分泌するハイ
   ブリドーマまたはそれに由来する細胞株。
7. 【請求項７】 不溶性担体に固定化された、請求項３記
   載のモノクローナル抗体または請求項５記載のモノクロ
   ーナル抗体の少なくとも１種および請求項１記載のモノ
   クローナル抗体と、被検試料とを接触させ、被検試料に
   おける凝集反応を観察することを特徴とする、ヒトＰＩ
   ＶＫＡ−IIの測定方法。