KR100207351B1 - 항 인체 플라스민-알파2-플라스민 억제물질 복합체 항체, 하이브리도마 및 면역학적 측정방법 - Google Patents

항 인체 플라스민-알파2-플라스민 억제물질 복합체 항체, 하이브리도마 및 면역학적 측정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체(PIC) 및 인체 플라스미노겐과 특이적으로 반응하는 제 1 모노클로날 항체, PIC 및 인체 2-플라스민 억제물질과도 반응하는 제 2 모노클로날 항체, 및 PIC와 반응하지만 인체 플라스미노겐 및 인체 2-플라스민 억제물질과는 반응하지 않는 제 3 모노클로날 항체, 제 1 내지 제 3 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 및 제 1 내지 제 3 모노클로날 항체를 이용하는 면역학적 정량방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 혈장시료의 희석 조작을 행하지 않더라도 혈장중의 유리 플라스미노겐 및 유리 2-플라스민 억제물질의 간섭을 받지 않고, 환자 혈장중의 PIC량을 특이적으로 간편하고도 신속하게, 응집법에 의해 측정할 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
항 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체 항체, 하이브리도마 및 면역학적 측정방법
[기술분야]
본 발명은 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체(Plasmin- 2-Plasmin Inhibitor Complex: 이하에서는 PIC라 약칭한다)에 대해서 반응성을 갖는 각종 모노클로날 항체군, 상기 모노클로날 항체를 분비하는 각종 하이브리도마 군 및 상기 모노클로날 항체군을 상요한 인체 플라스민--플라스민 억제물질 복합체의 면역학적 정량방법에 관한 것이다.
[배경기술]
산재성 혈관내 응고 증후군(DIC: Disseminated intra-vascular coagulation) 환자의 혈장중 및 유로키나제 또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자(t-PA)를 사용한 혈전용해요법 실시중의 환자의 혈장중에서는 플라스미노겐이 활성화되어 플라스민이 생성된다. 생성된 플라스민은 혈류중에서 순간적으로 2플라스민 억제물질( 2PI: 아오끼 등, J. Biol. Chem., 251, 5956-5956, 1976)과 1:1의 복합체, 즉 상기 PIC를 형성한다. 따라서, PIC를 측정함으로써, 플라스민의 생성, 즉 선용계(fibrinolysis system) 활성화의 사실과 현상을 파악할 수 있다. 최근, 혈장중의 PIC는 DIC의 진단 및 혈전용해 치료법의 모니터 등의 분자 마커(marker)로서 중요시되고 있다. 그 때문에, 혈액 또는 혈장중의 PIC의 양을 정확하고 간단히 측정할 필요가 있다.
통상적으로 알려진 PIC의 측정법으로는, 이하에 기술하는 5가지 방법을 열거할 수 있다. 제 1 방법은 2차원 교차 면역 전기영동법을 사용하는 방법이다. 제 2 방법은 PIC의 네오항원을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용한 라텍스 응집법이다. 제 3 방법은 플라스미노겐에 대한 폴리클로날 항체와 2-플라스민 억제물질에 대한 폴리클로날 항체 둘다를 사용하고, 그중 하나를 고정화 항체로 하고, 다른 하나를 효소 표지 항체로 한 효소 면역 측정법이다. 제 4 방법은 2-플라스민 억제물질에 존재하는 플라스민의 섬유소용해 작용을 저지하는 부위를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체와 플라스민 폴리클로날 항체의 양쪽을 다 사용하는데, 그중 한쪽을 고정화 항체로 하고, 다른 한쪽은 효소 표시 항체로 하여 혈장 샘플을 1200배로 희석하여 측정하는 효소면역측정법이다. 제 5 방법은 PIC의 네오 항원을 인식하는 모노클로날 항체 2종 또는 3종을 사용하는 라텍스 응집법이다.
그러나, 제 1 방법은 감도가 낮아 정량성이 부족하다는 결점이 있다. 제 2 방법은 PIC를 특이적으로 측정할 수 없다고 하는 결점이 있다. 제 3 방법은, 감도는 좋으나 항혈청의 안정한 확보가 곤란하며, 면역반응이 2공정이므로 조작이 복잡하고, 측정하는데 장시간이 소요되는 결점이 있다. 제 4 방법은 2-플라스민 억제물질에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 점 및 면역반응을 1공정으로 조작하는 점에서 상기 제 3 방법이 개량되었지만, 효소 면역 반응이 갖는 결점, 즉, 조작이 복잡하고 측정에 장시간이 소요되는 문제점을 해소하지는 못하였다. 또, 제 4 방법에는 1공정의 면역반응을 도입하기 위해서, 샘플을 1200배로 희석하는 공정이 필요하게되는 결점도 있다. 제 5 방법은 폴리클로날 항체를 사용하는 제 2 방법과 비교하여, 특이성과 측정 감도에 있어서 별 차이가 없고, PIC를 특이적으로 측정할 수 없다고 하는 문제점을 해결하지 못하였다.
본 발명자는 PIC를 간단히, 정확히, 그리고 재현성 좋게 측정하는 방법을 개발하기 위해 예의 연구를 한 결과, PIC 및 플라스미노겐 둘다에 반응성을 나타내는 제 1 모노클로날 항체(PIC-1), PIC 및 2-플라스민 억제물질 둘다에 반응성을 나타내는 제 2 모노클로날 항체(PIC-2), PIC에 특이적 반응을 나타내지만 PIC의 구성 단백질인 플라스미노겐 및 2-플라스민 억제물질에는 반응성을 나타내지 않는 제 3 모노클로날 항체(PIC-3)의 3종의 모노클로날 항체를 발견하고, 이들의 모노클로날 항체 2종 이상의 조합 사용하면, 혈장 샘플의 희석공정을 필요로 하지 않고, 신속하고도 정확히 샘플중에 유리의 상태로 존재하는 플라스미노겐 및 2-플라스민 억제물질의 방해를 받지 않고, 혈장중의 PIC를 특이적으로 측정할 수 있음을 알게 되었다. 따라서, 본 발명의 목적은 상기 신규한 모노클로날 항체, 그 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포, 및 그의 모노클로날 항체를 사용하는 면역학적 정량 방법을 제공하는데 있다.
발명의 개시
따라서, 본 발명은
(1) 인체 플라스민- 2
(2) 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체 및 인체 2-플라스민 억제물질과 특이적으로 반응하는 제 2 모노클로날 항체, 및
(3) 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체와 특이적으로 반응하고, 인체 플라스미노겐 및 인체 2-플라스민 억제물질과는 반응하지 않는 제 3 모노클로날 항체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 (1) 내지 (3)항의 각 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 또는 이들로부터 유래하는 세포주에 관한 것이다.
본 발명의 또한 불용성 담체에 고정화된, 상기 (1) 내지 (3)항의 모노클로날 항체 2종 이상과 시험 샘플을 접촉시키고, 시험 샘플에서의 응집 반응을 관찰하는 것을 특징으로 하는, 인체 플라스민 2-플라스민 억제 물질 복합체의 측정방법에 관한 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 본 발명의 모노클로날 항체 라텍스 복합체를 사용하여, 건강한 정상인 혈장(12명) 및 DIC 환자 혈장(15명)중의 PIC 양을 측정한 결과를 보여주는 설명도이다.
[발명의 상세한 설명]
이하에서는 본 발명을 모노클로날 항체, 하이브리도마 및 면역학적 측정방법의 순서대로 설명한다.
면역원으로서 사용하는 인체 PIC는, 예를들면, 플로우(Plow) 등의 방법(J. Lab. Clin. Med. 93, 199-209, 1979)에 따라서 제조할 수 있다. 즉, 사람(정상인)의 혈장으로부터 플라스미노겐을 제거하고, 플라스미노겐을 함유하지 않는 그의 혈장에, 플라스민을 서서히 가함으로써 PIC를 생성시키며, 생성된 PIC를 적당한 친화성 겔에 흡착시킨다. 그 흡착 PIC를 적당한 완충액으로 용출시키고, 또 이온 교환 크로마토그래피나 분자체 크로마토드래피 등에 의한 정제 조작으로 처리하여 정제된 인체 PIC를 얻는다. 그렇게 하여 수득된 인체 PIC는 SDS-PAGE(SDS-Polyacrylamidegel electrophoresis)에서 단일 밴드를 나타낸다.
이어서, 정제한 인체 PIC 면역원 용액을 이용하여 포유동물(예를들면, 마우스, 래트, 토끼, 양 또는 말)을 생체내 면역법으로 면역시킨다.
구체적으로는, 예를들면 정제한 인체 PIC 면역원 용액을 등량의 프로인트(Freund's) 완전 보조제 또는 불완전 보조제와 유화되도록 혼합한다. 이 혼압액을 예를들면 마우스에게 피하 투여한다(제1회 면역). 그런 후에, 2 내지 4주간의 간격으로 동일한 조작을 실시하여 여러차례 면역시킨다. 최종 면역한지 수일 경과 후에 비장을 무균적으로 꺼내에 스테인레스 메쉬(stainless mesh) 등으로 눌러 으깨어 비장세포를 제조하여, 세포융합 공정에 사용한다.
세포융합에 사용하는 또다른 모세포(parental cell)인 마이엘로마세포(골수종세포)로서는, 각종의 공지된 세포주, 예를 들면 p3(p3/x63-Ag8) [Nature, 256, 495-497(1975)], p3-U1[Current Topics in Microbiology and Immunology, 81; 1-7(1978)], NS-1[Eur. H. Immunol., 6; 511-519(1976)], MPC-11[Cell, 8; 405-415(1976)], SP2/O[Nature, 276; 269-270(1978)], FO[J. Immunol. Meth., 35; 1-21(1980)], X63.6.55.3[J. Immunol., 123; 1548-1550(1979)], S 194[J. Exp. Med., 148; 313-323(1978)], 또는 래트에 있어서의 R210[Nature, 277; 131-133(1979)] 등을 사용할 수가 있다.
면역 비장세포와 골수종세포의 세포융합은 통상의 방법으로 수행할 수가 있으며, 예를들면, 공지된 융합촉진제(폴리에틸렌글리콜 또는 센다이 바이러스(Sendal virus) 등)을 사용하며, 경우에 따라서는 보조제(디메틸설폭사이드 등)를 사용할 수도 있다. 면역 비장세포와 골수종세포와의 사용 비율도 통상적인 방법과 유사하게 사용할 수 있으며, 예를들면, 골수종세포에 대해 비장 세포를 약 1 내지 10배 정도의 양으로 사용한다. 융합용 배지로서는, 예를들면, 40%(w/v) 폴리에틸렌글리콜을 함유하는 덜베코 개질 이글 배지(DMEM)를 사용할 수 있다. 융합은, 상기의 배지내에서 면역 비장세포와 골수종세포를 잘 혼합함으로써 이루어진다. 계속해서, 선별용 배지(예를들면, HAT 배지)를 사용하여 하이브리도마 이외의 세포를 제거하고, 하이브리도마 배양물의 상등액에서 항체 생성 유무를, 예를들면 ELISA 법으로 측정하고, 목적하는 하이브리도마를 분리한다.
이렇게 하여 수득된, 본 발명의 모노클로날 항체 PIC-1, PIC-2 또는 PIC-3를 분비하는 하이브리도마 PIC-1, PIC-2 또는 PIC-3는, 통상의 배지에게 계대 배양할 수가 있으며, 또한 액체 질소 등에서 용이하게 장기간 보존할 수가 있다.
또한, 상기의 하이브리도마를 배양하는 배지로서는, 하이브리도마의 배양에 적합한 임의의 배지를 사용할 수가 있으며, 바람직하게는 DMEM에 소 태아 혈청, L-글루타민, L-피루브산 및 항생물질(페니실린 G와 스트렙토마이신)을 함유하는 배지가 사용된다.
상기의 하이브리도마의 배양은, 시험관내 시험의 경우에는 예를들면 배지중 5% CO2농도 및 37℃에서 약 3일간, 또한 생체내 시험의 경우, 예를들면 마우스의 복강내에서 배양할 경우에는 약 14일간 실시하는 것이 바람직하다.
상기의 하이브리도마 PIC-1, PIC-2 또는 PIC-3을 통상의 방법으로 배양한 배양액으로부터, 또는 상기 3종류중 어느 하나의 하이브리도마를 투여한 적당한 포유동물(예를들면 마우스 또는 래트)의 복수(復水)로부터, 목적하는 모노클로날을 분리하고, 정제할 수가 있다.
이와 같이 하여 제조된 배양액 또는 마우스의 복수로부터 모노클로날 항체를 분리하고, 정제할 경우에는 단백질의 단리, 정제에 일반적으로 이용되는 방법을 사용할 수가 있다. 그와 같은 방법으로서는, 황산 암모니아 염석, 이온교환 크로마토그래피, 분자체 겔을 사용하는 분자체 컬럼 크로마토그래피, 단백질 A 결합 다당류를 사용하는 친화성 컬럼 크로마토그래피, 투석, 동결건조의 방법 등을 들 수 있다.
이렇게 하여 수득된 본 발명의 항 PIC 모노클로날 항체는 그 반응성에 따라 다음과 같이 3종류로 분류할 수가 있다:
(1) PIC 및 플라스미노겐과는 반응하지만, 2-플라스민 억제물질과는 반응하지 않는 제 1 모노클로날 항체(PIC-1).
(2) PIC 및 2-플라스민 억제물질과는 반응하지만, 플라스미노겐과는 반응하지 않는 제 2 모노클로날 항체(PIC-2).
(3) PIC와는 반응하지만, 플라스미노겐 및 2-플라스민 억제 물질과는 반응하지 않는 제 3 모노클로날 항체(PIC-3).
상기의 제 1 모노클로날 항체(PIC-1)는, 바람직하게는 인체 플라스미노겐의 크링글(Kringle) 2 및 크링글 3을 함유하는 영역을 인식한다.
본 발명에 의한 상기 제1 내지 제3항의 PIC 모노클로날 항체를 불용성 담체에 고정화시키고, 이들중 적어도 2종류를 시험 샘플과 접촉시키면, 시험 샘플중의 유리 플라스미노겐 및 2-플라스민 억제물질과는 응집반응을 일으키지 않고, PIC와의 사이에서만 응집 반응을 일으킬 수가 있으므로, PIC의 면역학적 정량방법에 이용할 수가 있으며, 면역학적 정량용 시약으로서도 유용하다.
본 발명의 면역학적 정량방법에 사용되는 시험 샘플로서는, PIC를 함유할 가능성이 있는 시료에만 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를들면, 생체시료, 특히 혈액, 혈청, 혈장 또는 뇨, 바람직하게는 혈장이 있다. 본 발명의 면역학적 정량 방법에 있어서는, 시험 샘플을 희석하지 않고 그대로 사용하더라도, 시험 샘플중에 유리상태로 존재하는 플라스미노겐 및 2 2 2
불용성 담체로서는, 항원항체의 응집반응을 이용하는 면역학적 측정 방법에 있어서 일반적으로 이용되는 임의의 불용성 담체를 사용할 수가 있으며, 예를 들면, 라텍스 입자(특히, 폴리스티렌 라텍스 입자)를 들 수가 있다.
본 발명에 따르는 모노클로날 항체를 불용성 담체에 고정화시키려면, 공지된 방법, 예를들면, 화학결합법(가교제로서 카보디이미드, 글루타르알데히드 등을 사용한다) 또는 물리흡착법을 사용할 수 있다. 이렇게하여, 모노클로날 항체와 불용성 담체와의 복합체를 형성하며, 이것을 발명의 면역학적 정량방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 면역학적 정량방법에 있어서는, 상기의 불용성 담체에 고정화한 적어도 2종류의 모노클로날 항체를 사용하지만, 어느 한 종류의 모노클로날 항체를 불용성 담체에 고정화하여 제조한 복합체를 2종류 또는 3종류 사용하거나, 또는 2종류 또는 3종류의 모노클로날 항체를 어느 한 종류의 불용성 담체에 고정화하여 제조한 복합체를 사용할 수 있다. 더욱이, 어느 한 종류의 모노클로날 항체를 불용성 담체에 고정화하여 제조한 복합체 1종류와, 2종류의 모노클로날 항체를 어느 한종류의 불용성 담체에 고정화하여 제조한 복합체 1종류를 조합하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 모노클로날 항체 2종류를 조합하여 임의로 사용할 수도 있지만, 상기 제 1 모노클로날 항체(PIC-1)와 제 2 모노클로날항체(PIC-2)를 조합 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 측정 방법에 있어서는, 상기의 모노클로날 항체 고정화 불용성 담체 복합체의 기지의 일정량과 미지량의 PIC를 함유하는 시험 샘플액 일정량을 적당한 반응용기(예를들면, 슬라이드판상 또는 반응 셀) 속에서 접촉시킨다. 예를들면 혈장시료의 경우에는, 혈장시료(비희석액) 1용량부에 대해 상기의 복합체 현탁수(1% 이상의 농도)를 1용량부 또는 1용량부 이상 가하여 접촉시킨다. 또한 응집상을 보다 선명하게 하기 위하여, 시료와 복합체 현탁수에 완충액(예를들면, 트리스 염산 완충액)을 더 가하여 접촉시킬 수가 있다. 이 응집 반응은, 혈장 시료중에 존재하는 유리 플라스미노겐 및 2-플라스민 억제물질의 방해를 받지 않는다. 예를들면 슬라이드 판의 경우에는 육안으로, 반응셀의 경우에는 특정 파장을 이용하여 분광학적으로 응집 반응을 측정하며, 시험 샘플중의 PIC 농도를 정량할 수 있다.
[실시예]
이하에서는 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
[ PIC의 정제]
(a) 인체 플라스민- 2
다음에, 수득된 PIC를 울트로겔 ACA44에 의한 분자체 크로마토그래피로 정제하였다. 이 정제된 PIC를 면역원 및 항 PIC 모노클로날 항체의 스크리닝에 사용하였다.
(b) 면역화 비장세포의 제조:
PIC 면역원 용액(A280nm=0.1)을 등량의 프로인트 완전보제조와 유화되도록 혼합하고, 그 혼합액 200㎕를 BALB/c계 마우스에 복강내 투여함으로써 면역반응을 행하였다(제 1 회 면역). 30일 경과 후, 상기와 동일한 혼합액 200㎕를 상기 마우스에게 복강내 투여하였다(제 2 회 면역). 제 2 회 면역한지 21일 경과 후, PIC 희석액 200㎕를, 상기 마우스에게 정맥내 투여하였다(최종 면역). 최종 면역한지 3일 경과 후, 마우스로부터 비장을 무균적으로 꺼내어, 다음의 세포융합 공정에 사용하였다.
(c) 세포융합
15% 소 태아 혈청을 함유하는 DME 배지 5㎖를 넣은 샤레(schale)에, 무균적으로 추출한 상기의 비장을 넣었다. 다음에, 15% 소 태아 혈청을 함유하는 DME 배지 약 15㎖로 상기 비장을 환류하며 비장세포를 유출시킨 후, 이 비장세포 현탁액을 나일론 메쉬에 통과시켰다. 이 비장세포를 50㎖ 원심 튜브에 모아, 500×g로 10분간 원심분리했다. 이렇게 하여 얻은 펠렛에 용혈반응(homolyzing) 용액(155mM-NH4Cl, 10mM-KHCO31mM-Na2EDTA: pH 7.0) 4㎖를 가하여 현탁시켰다. 0℃에서 5분간 방치하여 현탁액중의 적혈구를 파괴시켰다. 15% 소 태아 혈청 10㎖를 함유하는 DME 배지를 가하고나서 원심분리하였다. 이렇게 하여 얻은 팰렛을 DME 배지로 원심법에 의해 세척하고, 살아 있는 비장 세포수를 측정하였다.
한편, 미리 배양한 마우스 마이엘로마세포(골수종세포) SP2/O-Ag14(이화학연구소 진 뱅크(gene bank) 세포은행) 약 2×107개에 상기 비장세포 1×108개를 가하고, DME 배지중에서 잘 혼합하여 원심분리하였다(500×g, 10분간). 그의 상등액을 흡인하고, 펠렛을 잘 풀어서, 40% 폴리에틸렌글리콜 4000 용액(38℃로 보온) 0.5㎖를 적가하고, 원심 튜브를 손으로 1분간 완만하게 회전시킴으로써 폴리에틸렌글리콜 용액과 세포 펠렛을 혼합하였다. 이어서, 38℃로 보온한 DME 배지를 30초마다 1㎖씩 가하고 튜브를 천천히 회전시켰다. 이 조작을 10회 반복한 후, 15% 소 태아 혈청 20㎖를 함유하는 DME 배지를 가하여, 원심분리(500×g, 10분간)하였다. 상등액을 제거한후, 15% 소 태아 혈청을 함유하는 HAT 배지(DME 배지로 아미노프테린 4×10-7M, 티미딘 1.6×10-5M, 하이포크산틴 1×10-4M이 되도록 첨가한 것)에서 세포 펠렛을 원심법에 의해 2회 세척한 후, 상기 HAT 배지 40㎖에 현탁시켰다. 이 세포 현탁액을 96 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 200㎕씩 분주하고, 5% 탄산가스를 함유하는 탄산가스 배양기에서 37℃로 배양을 개시하였다. 배양중, 2 내지 3일 간격으로 각 웰의 배지를 약 100㎕ 제거하고, 새롭게 상기의 HAT 배지 100㎕를 가함으로써 HAT 배지중에서 증식하는 하이브리도마를 선택하였다. 8일째부터 15% 소 태아 혈청을 함유하는 HAT배지(DME 배지에 티미딘 1.6×10-5M, 하이포크산틴 1×10-4M이 되도록 첨가한 것)로 교환하고, 하이브리도마를 관찰함과 동시에, 10일째에 후술하는 ELISA 법으로, PIC 항체 생산 하이브리도마를 스크리닝하였다.
(D) 하이브리도마의 수립
하이브리도마 배양액의 상등액에 있어서의 생산 항체의 유무는 ELISA 법으로 측정하였다. 96 웰 ELISA 용 플레이트(ImmulonII, 니혼 다이나 텍크 가부시끼가이샤)의 각 웰에 상기의 PIC 면역된 용액(A280nm=0.05, 생리식염수로 희석함) 50㎕씩을 분주하고, 25℃에서 2시간 방치하였다. 이어서, 0.05% 트윈(Tween) 20-생리식염수로 3회 세척한 후, 각 웰에 배양액 상등액 50㎕를 가하고, 25℃에서 1시간 반응시켰다.
다음에, 트윈 20-생리식염수로 200배로 희석한 퍼옥시다제 결합 항 마우스 항체(다코사, 덴마크) 50㎕를 각 웰에 가하였다. 반응종료 후, 0.05% 트윈 20-생리식염수로 각 웰을 3회 세척하고, 0.05mM 아미노 안티피린, 10mM 페놀 및 0.005% 과산화수소를 함유하는 용액 250㎕를 각 웰에 가하고, 25℃에서 30분간 반응시킨 다음, 각 웰의 490nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 192 웰중, 3웰에 항체 생산이 인식되었다. 그 3웰중의 하이브리도마를 24웰 플레이트로 옮기고, 15% 소 태아 혈청을 함유하는 HAT 배지내에서 4 내지 5일간 배양하였다. 그 후 다시한번 ELISA 법으로 항 PIC 항체의 생산 유무를 확인하고 나서 한계 희석법으로 클로닝하였다. 한계 희석법은 HT 배지에 하이브리도마가 5개/㎖가 되도록 희석한 세포 부유액을, 정상적인 BALB/C계 마우스의 복강세포가 웰당 2×104개 분주되어 있는 96웰 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 분주하였다. 10일 후, ELISA법에 의해 항 PIC 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마의 클론을 스크리닝하였다.
그 결과, 각 하이브리도마에 대해, 20 내지 40개의 항체 생산 클론을 수득하였다. 이들의 클론중에서, 증식력이 강하고, 항체 분비능력이 높으며, 안정한 클론을 선택하여 상기와 동일한 방법으로 재클론화 하여, 3종류의 항 PIC 항체 생산 하이브리도마 PIC-1, PIC-2 및 PIC-3를 수립하였다. 이들 3종류의 하이브리도마로부터 분비되는 3종류의 모노클로날 항체 PIC-1, PIC-2 및 PIC-3과 인체 플라스미노겐(아텐즈, 리서치사, 미국) 또는 인체 2-플라스민 억제물질(아텐즈, 리서치사, 미국)과의 반응성을, 96웰 ELISA 용 플레이트로 인체 플라스미노겐 또는 인체 2 2 2 2
상기의 각 하이브리도마는 통상산업성공업기술원미생물 공업기술연구소(通商産業省工業技術院微生物工業技術硏究所; 주소: 일본국 305 이바라기껜 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 1990년 12월 4일부터 국내기탁되어, 1991년 12월 16일부터 국제기탁으로 이관되어 있다. 국제기탁번호(국제기탁번호에 이은 [ ]속은 국내기탁번호임)는, 하이브리도마 PIC-1이 미공연조기(微工硏條寄) 제 3681 호(FERM BP-3681)[미공연균기(微工硏菌寄) 제 11888 호(FERM P-11888)], 하이브리도마 PIC-2가 미공연조기 제 3682 호(FERM BP-3682)[미공연균기 제 11889 호(FERM P-11889)] 및 하이브리도마 PIC-3가 미공연조기 제 3683 호(FERM BP-3683)[미공연균기 제 11890 호(FERM P-11890)]이다.
[실시예 2]
[모노클로날 항체의 제조]
(a) 시험관내 시험법
마우스 하이브리도마 PIC-1, PIC-2 및 PIC-3을 각각 15% 소 태아 혈청을 함유하는 DME배지에서, 37℃로 5% 이산화탄소 대기하에 72 내지 96시간 배양하였다. 배양물을 원심분리(10000×g, 10분간)한 후, 상등액에 고형의 황산 암모늄을 50% 최종 농도가 되도록 서서히 가하였다. 혼합물을 빙냉하에서 30분간 교반훈 후, 60분간 방치하고나서 원심분리(10000×g, 10분간) 처리하고, 수득된 침전물을 소량의 10mM 인산 완충액(pH 8.0)에 용해하고, 1000배 량의 10mM 인산 완충액으로 이미 평형화 한 DEAE-셀룰로즈의 컬럼에 충진시켰다. 모노클로날 항체의 용출은 10mM 인산 완충액(pH 8.0)과 0.2M-NaCl을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 8.0)의 사이에서 농도 구배법으로 실시하였다. 용출된 모노클로날 항체를 한외(限外)여과법으로 농축하고, 0.1M 인산 완충액(pH 8.0)에 대해 투석하였다. 소 혈청 IgG를 제거하기 위하여, 투석물을 양의 한 소혈청 IgG-세파로즈 4B 컬럼에 통과시켰다. 이어서, 통과액을 0.1M 인산 완충액(pH 8.0)으로 평형화 한 단백질 A-세파로즈 4B 컬럼에 충전시켰다. 컬럼을 pH 3.5의 완충액으로 용출하여 정제한 항 PIC 특히 모노클로날 항체 PIC-1, 마찬가지로 모노클로날 항체 PIC-2, 및 모노클로날 항체 PIC-3의 용액을 수득하였다.
(b) 생체내 시험법
프리스탄(2.6, 10, 14-테트라메틸펜타데칸) 0.5㎖를 10 내지 12주령의 BALB/c계 마우스에게 복강내 투여하고, 그로부터 14 내지 20일째 마우스의 복강내에 생체내에서 증식된 하이브리도마 PIC-1, PIC-2, 또는 PIC-3를 마우스 한 마리당 2×106개가 되도록 접종하였다. 각 하이브리도마에 대해 한 마리의 마우스에서 약 10 내지 15㎖의 복수가 수득되었다. 그 항체 농도는 2 내지 10mg/㎖였다. 복수중의 모노클로날 항체의 정제는, 상기의 시험관내 시험법에서의 정제 방법과 동일한 방법(단, 양의 항소혈청 IGg-세파로즈 4B 컬럼을 통과하는 조작은 제외한다)으로 실시하였다.
[실시예 3]
[모노클로날 항체의 면역글로블린 분류 및 특이성의 동정]
항 PIC 특이 모노클로날 항체 PIC-1, PIC-2 및 PIC-3의 면역 글로블린 분류 및 특이성의 동정은 각각 오크테로니(Occhterlony) 면역확산법, 효소 면역 분석법 및 면역 블롯트법에 의해 실시하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
표 1에서, 「+」는 ELISA법에서 반응을 나타내고, 「-」는 ELISA 법에서 반응을 나타내지 않는 것을 의미한다. 또한, 「있음」은 면역블롯트법에서 반응을 나타냄을, 「없음」은 면역 블롯트법에서 반응을 나타내지 않음을 의미한다.
[실시예 4]
[항체와 불용성 담체(락텍스)와의 결합]
모노클로날 항체 PIC-1(2.0mg/㎖)를 함유하는 수용액 2㎖와, 라텍스 용액(2%, Dow Chemical 사; 입경 0.482㎛) 2㎖를 혼합하고, 약 1시간 교반하였다. 원심분리(20,000×g, 10분간)한 후, 침전물을 0.1% BSA 용액에 현탁시키고, 약 1시간 교반하였다. 다시 원심분리(20,000×g, 10분간) 한 후, 침전물을 물에 현탁시키고, 약 2시간 교반하였다. 이렇게 하여, 모노클로날 항체 PIC-1/라텍스 복합체 함유액을 수득하였다. 마찬가지로 모노클로날 항체 PIC-2 또는 모노클로날 항체 PIC-3을 사용하여 단독의 각 모노클로날 항체와 라텍스와의 복합체의 함유액을 제조하였다.
항체 혼합물과 라텍스와의 복합체는 다음과 같이 제조하였다: 모노클로날 항체 PIC-1, 모노클로날 항체 PIC-2 및 모노클로날 항체 PIC-3를 각각 0.66mg/㎖씩 함유하는 수용액 2㎖와, 라텍스 용액(2%, Dow Chemical 사; 입경 0.482㎛) 2㎖를 혼합하고, 약 1시간 교반하였다. 이하 상기와 동일하게 처리하여 모노클로날 항체 PIC-1/모노클로날 항체 PIC-2/ 모노클로날 항체 PIC-3/ 라텍스 복합체를 제조하였다.
모노클로날 항체 PIC-1 및 모노클로날 항체 PIC-2를 각각 1mg/㎖씩 함유하는 수용액과 라텍스 용액을 등량 혼합시키는 것을 제외하고는 상기와 동일하게 수행하여, 모노클로날 PIC-1/모노클로날-PIC 2/라텍스 복합체를 제조하였다.
[실시예 5]
[슬라이드 응집 반응에 의한 정량]
실시예 4에서 제조한 항체 라텍스 복합체 함유액 40㎕와 PIC를 다양한 농도로 함유하는 수용액 40㎕를 슬라이드 유리판상에서 혼합하고, 요동시켜 3분 후에 응집상을 육안으로 판정하였다. 결과를 표 2 에 나타내었다.
표 2에서, 「+」는 응집이 있음을, 「-」는 응집이 없음을 각각 의미한다. 또한, 표 2의 항체/라텍스 복합체의 난에서, 복합체의 종류를 그 복합체에 결합하는 모노클로날 항체에 의해 나타낸다. 따라서, 예를들면 PIC-1은 모노클로날 항체 PIC-1/라텍스 복합체를 의미하며, PIC-1 + PIC-2는 모노클로날 항체 PIC-1/라텍스 복합체와 모노클로날 항체 PIC-2/라텍스 복합체와의 등량 혼합액을 의미한다. 또한, PIC-1/PIC-2는 모노클로날 항체 PIC-1/모노클로날 항체 PIC-2/라텍스 복합체를 의미한다.
표 2에서, 「+」는 응집이 있음을, 「-」는 응집이 없음을 각각 의미한다.
[실시예 6]
[정제 PIC의 첨가회수 시험]
5종의 시험 샘플(건강인 A 및 B, DIC 환자, C, D 및 E로부터 채취한 혈장)중의 PIC 농도를, 실시예 5의 모노클로날 항체 PIC-1/모노클로날 항체 PIC-2/ 라텍스 복합체 용액을 이용하여 측정하였다. 이어서, 각각의 시험 샘플에 정제 PIC 2㎍/㎖. 4㎍/㎖ 및 8㎍/㎖를 첨가하고, 첨가 회수 시험을 실시하였다. 측정값은 시험 샘플을 여러배 희석하여 응집이 없어지는 희석 배수로부터 판정량적으로 측정하였다. 결과는 표 3에 나타나는 바와 같이, 양호하게 회수가 이루어졌다.
[실시예 7]
[건강인과 DIC 환자 군의 PIC 값]
실시예 6에서 사용한 모노클로날 항체 PIC-1/모노클로날 항체 PIC-2/라텍스 복합체 용액을 이용하여, 건강인 혈장 샘플 12개, DIC 환자 혈장 샘플 15개의 PIC 량을 측정하였다. 결과는 제1도에 나타내었다. 건강인 군의 PIC 량은 1㎍/㎖ 미만이었다. 그에 반해 DIC 환자 군은 2㎍/㎖ 이상이었다.
[산업상의 이용가능성]
이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 혈장시료의 희석 조작을 행하지 않더라도 혈장중의 유리 플라스미노겐 및 유리 2-플라스민 억제 물질의 간섭을 받지 않고, 환자 혈장중의 PIC 량을 특이적으로, 간편하면서도 신속하게, 응집법에 의해 측정할 수 있다. 이것은 본 발명에 의해 비로소 가능하게 된 것이다. 따라서 본 발명은 DIC 등의 진단 및 병리 연구에 유용한 수단을 제공하는 것이다.

Claims (9)

  1. 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체 및 인체 플라스미노겐과 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, 인체 플라스미노겐의 크링글(Kringle) 2 및 크링글 3을 함유하는 영역을 인식하는 모노클로날 항체.
  3. 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체 및 인체 플라스미노겐과 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 또는 그로부터 유래하는 세포주.
  4. 제3항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 인체 플라스미노겐의 크링글 2 및 크링글 3을 함유하는 영역을 인식하는 하이브리도마 또는 그로부터 유래하는 세포주.
  5. 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체 및 인체 2-플라스민 억제물질과 특이적으로 반응하며 하이브리도마 FERM BP-3682로부터 수득된 모노클로날 항체.
  6. 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체 및 인체 2-플라스민 억제물질과 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 FERM BP-3682 또는 그로부터 유래하는 세포주.
  7. 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체와 특이적으로 반응하고, 인체 플라스미노겐 및 인체 2-플라스민 억제물질과는 반응하지 않는 모노클로날 항체.
  8. 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체와 특이적으로 반응하고, 인체 플라스미노겐 및 인체 2-플라스민 억제물질과는 반응하지 않는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 또는 그로부터 유래하는 세포주.
  9. 불용성 담체에 고정화된, (1) 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체 및 인체 플라스미노겐과 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체, (2) 인체 플라스민- 2-플라스민 억제물질 복합체 및 인체 2-플라스민 억제물질과 특이적으로 반응하며 하이브리도마 FERM BP-3682로부터 수득된 모노클로날 항체, 및 (3) 인체 플라스민-2-플라스민 억제물질 복합체와 특이적으로 반응하고, 인체 플라스미노겐 및 인체 2 2-플라스민 억제 물질 복합체의 측정방법.
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