JPH03183953A - ヒト膵臓α―アミラーゼの測定方法 - Google Patents
ヒト膵臓α―アミラーゼの測定方法Info
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、ヒト膵臓α−アミラーゼに特異的なモノクロ
ーナル抗体を利用した試料中のヒト膵臓α−アミラーゼ
の測定方法に関するものである。
ーナル抗体を利用した試料中のヒト膵臓α−アミラーゼ
の測定方法に関するものである。
(従来の技術)
α−アミラーゼ(E、C,3,2,1,1,)は、1.
4−d−グルコシド結合で結合したオリゴおよび多糖類
を、その1.4−d−グルコシド結合を切断することに
よりマルトースおよびマルト−オリゴ糖類へと加水分解
する酵素である。
4−d−グルコシド結合で結合したオリゴおよび多糖類
を、その1.4−d−グルコシド結合を切断することに
よりマルトースおよびマルト−オリゴ糖類へと加水分解
する酵素である。
本酵素は工業的発酵技術においてのみならず臨床検査に
おいても著しく重要である。特に、ヒト肝臓q−アミラ
ーゼは膵臓から血液中にそのままの形で遊離され、膵臓
疾患で血中ヒト膵臓α−アミラーゼ値が増加することが
知られている。したがって、ヒト膵臓α−アミラーゼを
測定することにより膵臓疾患の病理診断が可能になる。
おいても著しく重要である。特に、ヒト肝臓q−アミラ
ーゼは膵臓から血液中にそのままの形で遊離され、膵臓
疾患で血中ヒト膵臓α−アミラーゼ値が増加することが
知られている。したがって、ヒト膵臓α−アミラーゼを
測定することにより膵臓疾患の病理診断が可能になる。
しかしながら、ヒト血清中にはp−(膵臓由来)および
s−(唾液腺由来)の2種のα−アミラーゼアイソザイ
ムが存在することが知られており、膵臓疾患の病理診断
を行うためにはヒトp−αアミラーゼをヒト6−α−ア
ミラーゼと分別して定量することが盛挙である。その測
定方法とじては、α−アミラーゼ活性測定法(特開昭6
0−155134号公報、特開昭63−2600号公報
、鈴木直生他 バイオサイエンスとインダストリ゛−V
o 1.47 No、7 (1989)) 、サンド
イツチEIA法(特開昭63−158463号公報)が
知られている。
s−(唾液腺由来)の2種のα−アミラーゼアイソザイ
ムが存在することが知られており、膵臓疾患の病理診断
を行うためにはヒトp−αアミラーゼをヒト6−α−ア
ミラーゼと分別して定量することが盛挙である。その測
定方法とじては、α−アミラーゼ活性測定法(特開昭6
0−155134号公報、特開昭63−2600号公報
、鈴木直生他 バイオサイエンスとインダストリ゛−V
o 1.47 No、7 (1989)) 、サンド
イツチEIA法(特開昭63−158463号公報)が
知られている。
前者は、ヒトS−α−アミラーゼの酵素活性を特異的に
阻害しかつヒトp−α−アミラーゼの酵素活性をほとん
ど阻害しない抗ヒトS−α−アミラーゼ・モノクローナ
ル抗体をヒトS−およびp−α−アミラーゼをともに含
む試料溶液に加えることにより、ヒトS−α−アミラー
ゼの酵素活性を試料溶液から除去し、その後試料溶液の
α−アミラーゼ活性を測定することにより試料溶液中の
ヒトp−α−アミラーゼを定量するもの□である。
阻害しかつヒトp−α−アミラーゼの酵素活性をほとん
ど阻害しない抗ヒトS−α−アミラーゼ・モノクローナ
ル抗体をヒトS−およびp−α−アミラーゼをともに含
む試料溶液に加えることにより、ヒトS−α−アミラー
ゼの酵素活性を試料溶液から除去し、その後試料溶液の
α−アミラーゼ活性を測定することにより試料溶液中の
ヒトp−α−アミラーゼを定量するもの□である。
しかし、この方法では用いた抗体がヒトp−αアミラー
ゼの酵素活性をも弱く阻害するために正確にヒトp−α
−アミラーゼを定量することができない。
ゼの酵素活性をも弱く阻害するために正確にヒトp−α
−アミラーゼを定量することができない。
後者は、ヒトp−α−アミラーゼに特異的でかつヒトS
−α−アミラーゼと交差しないモノクローナル抗体を固
相に固定して用い、標識抗体としてヒトp−α−アミラ
ーゼとも同等に反応するウサギ抗ヒトS−α−アミラー
ゼ・ポリクローナル抗体のFab−フラグメントまたは
ヒトp−αアミラーゼとヒトS−α−アミラーゼをほぼ
同等に認識する抗ヒトp−α−アミラーゼ・モノクロー
ナル抗体を用いたサンドイッチアッセイによりヒトp−
α−アミラーゼを定量するものである。
−α−アミラーゼと交差しないモノクローナル抗体を固
相に固定して用い、標識抗体としてヒトp−α−アミラ
ーゼとも同等に反応するウサギ抗ヒトS−α−アミラー
ゼ・ポリクローナル抗体のFab−フラグメントまたは
ヒトp−αアミラーゼとヒトS−α−アミラーゼをほぼ
同等に認識する抗ヒトp−α−アミラーゼ・モノクロー
ナル抗体を用いたサンドイッチアッセイによりヒトp−
α−アミラーゼを定量するものである。
しかし、この方法では標識抗体としてヒトp−α−アミ
ラーゼとヒトS−α−アミラーゼをほぼ同等に認識する
抗体を用いているので、ワンステ・ツブサンドイッチア
ッセイによる簡便な測定法が用いられないため、より操
作が多くかつより多くの時間を要するツーステップサン
ドイッチアッセイによる測定法を用いている。
ラーゼとヒトS−α−アミラーゼをほぼ同等に認識する
抗体を用いているので、ワンステ・ツブサンドイッチア
ッセイによる簡便な測定法が用いられないため、より操
作が多くかつより多くの時間を要するツーステップサン
ドイッチアッセイによる測定法を用いている。
以上のように、上記のいずれの測定法においても簡便か
つ短時間かつ正確にヒトp−α−アミラーゼをヒトS−
α−アミラーゼと分別して定量することができない。
つ短時間かつ正確にヒトp−α−アミラーゼをヒトS−
α−アミラーゼと分別して定量することができない。
(発明が解決しようとする課題)
本発明の目的は、ヒトp−α−アミラーゼに特異的なモ
ノクローナル抗体を用いることによって従来の方法より
もより簡便な操作で短時間に、高精度かつ高感度かつ広
い濃度範囲でヒトp−αアミラーゼを免疫学的にif!
IJ定する方法を提供することにある。
ノクローナル抗体を用いることによって従来の方法より
もより簡便な操作で短時間に、高精度かつ高感度かつ広
い濃度範囲でヒトp−αアミラーゼを免疫学的にif!
IJ定する方法を提供することにある。
(課題を解決するための手段)
本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明
に到達した。即ち本発明は、ヒト膵臓α−アミラーゼを
特異的に認識し、ヒト唾液腺α−アミラーゼと交差反応
しないモノクローナル抗体で、A:固定化されている第
1抗体、および、B:第1抗体とは異なる抗原部位を認
識しかつ標識剤で標識されている第2抗体を用いること
を特徴とするヒト膵臓α−アミラーゼの測定方法である
。
に到達した。即ち本発明は、ヒト膵臓α−アミラーゼを
特異的に認識し、ヒト唾液腺α−アミラーゼと交差反応
しないモノクローナル抗体で、A:固定化されている第
1抗体、および、B:第1抗体とは異なる抗原部位を認
識しかつ標識剤で標識されている第2抗体を用いること
を特徴とするヒト膵臓α−アミラーゼの測定方法である
。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明方法において、用いられるモノクローナル抗体は
、それ自体公知である方法(G、Kohler&C,M
i 1stein、Nature。
、それ自体公知である方法(G、Kohler&C,M
i 1stein、Nature。
256 495、(1975))に準じて製造すること
ができる。
ができる。
本発明では以上の方法により、複数の、ヒトS−α−ア
ミラーゼと交差反応しない抗ヒl−p−αアミラーゼ・
モノクローナル抗体で、異なる抗原部位を認識するもの
を得た。これらのモノクローナル抗体を使って、ヒトp
−α−アミラーゼを定量的に測定てきるサンドイツチ法
による免疫学的測定方法が可能となった。
ミラーゼと交差反応しない抗ヒl−p−αアミラーゼ・
モノクローナル抗体で、異なる抗原部位を認識するもの
を得た。これらのモノクローナル抗体を使って、ヒトp
−α−アミラーゼを定量的に測定てきるサンドイツチ法
による免疫学的測定方法が可能となった。
本発明方法に用いられる抗体もしくは該抗体のF(ab
−)2フラグメントを固相に固定化する方法は、公知の
方法を採用でき、固相としては例えば、ポリスチレン、
ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、セ
ファロース粒子、ラテックス、アガロース、セルロース
、ポリメタアクリレートなどが使用される。
−)2フラグメントを固相に固定化する方法は、公知の
方法を採用でき、固相としては例えば、ポリスチレン、
ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、セ
ファロース粒子、ラテックス、アガロース、セルロース
、ポリメタアクリレートなどが使用される。
用いられる試料はなんら限定されず、例えば血清、血漿
、尿などの生体試料でも精製したp−α−アミラーゼを
含む試料でもよい。
、尿などの生体試料でも精製したp−α−アミラーゼを
含む試料でもよい。
また抗体の標識化の方法とその検出方法もなんら限定さ
れるものでなく、公知の方法により標識化および検出す
ることができる。標識として酵素を用いる場合、標識物
質としては例えば、ペルオキシダーゼ、β−D−ガラク
トシダーゼ、アルカリホスファラーゼ、ウレアーゼ、カ
タラーゼ、β−グルクロニダーゼなどの酵素が使われる
。放射性物質としては、3H,12’IT または13
1■等が、蛍光物質を使用する方法としては、例えば、
フルオレスカミン、フルオレラセンチオシアネート、テ
トラローダミンイソチオシアネート等が常法によりモノ
クローナル抗体に結合される。しかしながら、標識物質
は上記物質に何ら限定されるべきものではない。
れるものでなく、公知の方法により標識化および検出す
ることができる。標識として酵素を用いる場合、標識物
質としては例えば、ペルオキシダーゼ、β−D−ガラク
トシダーゼ、アルカリホスファラーゼ、ウレアーゼ、カ
タラーゼ、β−グルクロニダーゼなどの酵素が使われる
。放射性物質としては、3H,12’IT または13
1■等が、蛍光物質を使用する方法としては、例えば、
フルオレスカミン、フルオレラセンチオシアネート、テ
トラローダミンイソチオシアネート等が常法によりモノ
クローナル抗体に結合される。しかしながら、標識物質
は上記物質に何ら限定されるべきものではない。
サンドイッチ測定法において、試料、第1抗体および第
2抗体の添加順序にはなんら限定はなく、また1ステツ
プサンドイツチ法、2ステツプサンドイツチ法のいずれ
も行うことができる。
2抗体の添加順序にはなんら限定はなく、また1ステツ
プサンドイツチ法、2ステツプサンドイツチ法のいずれ
も行うことができる。
遊離の標識された抗体の除去には、例えば通常のイムノ
アッセイで使用されるB/F分離法等の洗浄等を行えば
よい。
アッセイで使用されるB/F分離法等の洗浄等を行えば
よい。
測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、基質、溶
解剤、緩衝剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。
解剤、緩衝剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。
(発明の効果)
以上の説明から明らかなように本発明によれば、(1)
試料中のヒトp−α−アミラーゼ濃度は血中レベルのヒ
トp−α−アミラーゼ濃度を含む広い濃度範囲(約8〜
2000 n g/ m 1 )で測定することができ
、(2)ヒトS−α−アミラーゼはO〜2000 n
g / m Iの濃度範囲でs−aアミラーゼと交差反
応を示さず、(3)従来法に比べて簡便かつ短時間かつ
正確にヒトp−α−アミラーゼをヒトS−α−アミラー
ゼと分別して定量することが可能である。このことは、
短時間に多数の検体(試料)を測定するという臨床的な
要望も充分満足させるものである。
試料中のヒトp−α−アミラーゼ濃度は血中レベルのヒ
トp−α−アミラーゼ濃度を含む広い濃度範囲(約8〜
2000 n g/ m 1 )で測定することができ
、(2)ヒトS−α−アミラーゼはO〜2000 n
g / m Iの濃度範囲でs−aアミラーゼと交差反
応を示さず、(3)従来法に比べて簡便かつ短時間かつ
正確にヒトp−α−アミラーゼをヒトS−α−アミラー
ゼと分別して定量することが可能である。このことは、
短時間に多数の検体(試料)を測定するという臨床的な
要望も充分満足させるものである。
(実施例)
以下に本発明の詳細な実施例を説明する。しかしながら
、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではな
い。
、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではな
い。
実施例1
(モノクローナル抗体の調製)
(A)抗原感作動物細胞の調製
Ba1b/cマウス(♀)をヒトp−α−アミラーゼで
免疫した。免疫は、マウスの腹腔にフロイントの完全ア
ジュバントとヒトp−α−アミラーゼ80μg/匹とを
乳化させた試料100μlを投与した。8週間後に追加
免疫としてヒトpα−アミラーゼ50μg/匹をフロイ
ントの不完全アジュバントと乳化させたちの100μl
をマウス腹腔に投与した。1週間後最終免疫としてヒト
p−α−アミラーゼ50μg/匹をリン酸緩衝化生理食
塩水(0,85%NaC1含有0,01%リン酸緩衝液
、pH7,2:以下PBS)に溶解したちの100μl
を腹腔内に投与した。
免疫した。免疫は、マウスの腹腔にフロイントの完全ア
ジュバントとヒトp−α−アミラーゼ80μg/匹とを
乳化させた試料100μlを投与した。8週間後に追加
免疫としてヒトpα−アミラーゼ50μg/匹をフロイ
ントの不完全アジュバントと乳化させたちの100μl
をマウス腹腔に投与した。1週間後最終免疫としてヒト
p−α−アミラーゼ50μg/匹をリン酸緩衝化生理食
塩水(0,85%NaC1含有0,01%リン酸緩衝液
、pH7,2:以下PBS)に溶解したちの100μl
を腹腔内に投与した。
3日後この処置マウスの肺臓を無菌的に取出した。10
%子牛脂児血清(以下10%FC3と省略する)を含む
D M E M 10 m lを注射器で吸い取り27
ゲージの注射針をつけた。肺臓を氷冷しておいたデイツ
シュに入れ、注射針で数か新入をあけた。注射針を差し
込み還流し肺臓細胞をデイツシュに流出させた。流出液
をナイロンメツシュで濾過し遠心チューブに入れ、11
000rpで10分間遠心分離して上澄をすてた。細胞
ペレット中の赤血球を0.15M塩化アンモニウム溶液
(1mMエチレンジアミン4酢酸−2すI・リウム塩(
以下EDTAと省略する)を含む0.OIM炭酸緩衝l
夜、pH7,2)で溶血させ遠心分離し、さらに細胞ペ
レットをDMEMで2回同様に遠心洗浄して牌細胞とし
た。
%子牛脂児血清(以下10%FC3と省略する)を含む
D M E M 10 m lを注射器で吸い取り27
ゲージの注射針をつけた。肺臓を氷冷しておいたデイツ
シュに入れ、注射針で数か新入をあけた。注射針を差し
込み還流し肺臓細胞をデイツシュに流出させた。流出液
をナイロンメツシュで濾過し遠心チューブに入れ、11
000rpで10分間遠心分離して上澄をすてた。細胞
ペレット中の赤血球を0.15M塩化アンモニウム溶液
(1mMエチレンジアミン4酢酸−2すI・リウム塩(
以下EDTAと省略する)を含む0.OIM炭酸緩衝l
夜、pH7,2)で溶血させ遠心分離し、さらに細胞ペ
レットをDMEMで2回同様に遠心洗浄して牌細胞とし
た。
(B)骨髄腫細胞の調製
明髄腫細胞としてはBa1b/cマウス由来の8−アザ
グアニン耐性株として、SP210−Ag14(以下S
P 210と省略する)を使用した。
グアニン耐性株として、SP210−Ag14(以下S
P 210と省略する)を使用した。
細胞融合を行う1週間前まで20μg / m lの8
−アザグアニン、10%FCSを含むDMEMで培養し
、その後細胞融合日まで10%FC8を含むDMEMを
使用した。細胞融合直前に、5P210は無菌的にDM
EMで1100Orpで10分間遠心洗浄を2回繰り返
し調製した。
−アザグアニン、10%FCSを含むDMEMで培養し
、その後細胞融合日まで10%FC8を含むDMEMを
使用した。細胞融合直前に、5P210は無菌的にDM
EMで1100Orpで10分間遠心洗浄を2回繰り返
し調製した。
0
(C)細胞融合
上記(A)項で調製した肺臓細胞と上記(B)項で調製
した骨髄腫細胞を5=1の割合で混合遠心(1,00O
r p m 、 10分)し細胞ペレットを集めた。
した骨髄腫細胞を5=1の割合で混合遠心(1,00O
r p m 、 10分)し細胞ペレットを集めた。
遠心チューブを軽くたたいて細胞ペレットを壁面にうず
く広げた。その中に37℃に暖めておいた5096PE
G (MERK社製ポリエチレングリコール、4000
)を含むDMEM溶液0.5mlを遠心チューブを回
しながら少しずつ滴下した。1分間ゆっくりと遠心チュ
ーブを回転させ混合した後、30秒に1mlの割合で遠
心チューブを回転しながら37℃に加温しておいたDM
EMを10回加え、次にFe2を2mlゆっくりと入れ
、11000rp、10分間遠心した。
く広げた。その中に37℃に暖めておいた5096PE
G (MERK社製ポリエチレングリコール、4000
)を含むDMEM溶液0.5mlを遠心チューブを回
しながら少しずつ滴下した。1分間ゆっくりと遠心チュ
ーブを回転させ混合した後、30秒に1mlの割合で遠
心チューブを回転しながら37℃に加温しておいたDM
EMを10回加え、次にFe2を2mlゆっくりと入れ
、11000rp、10分間遠心した。
細胞ペレットを10%FC3とI X 10−’Mヒボ
キサンチン、4×10−7Mアミノプテリン、1.6
X 10−’Mチミジンを含むDMEM (以下HAT
培地と省略する)で2回遠心洗浄(1000rpin、
10分間)した。この培養液を96ウエルプレート(F
a 1con#3042)1 に5×105細胞個/ウェルになるように200μlず
つ分注した。3日日ごとにHAT培地を100μm/ウ
ェル交換した。3週間後からは、lXl0−’Mヒポキ
サンチン、1.6X10−’Mチミジンと10%FC8
を含むDMEM (以下HT培地と省略する)を培地交
換に用いた。
キサンチン、4×10−7Mアミノプテリン、1.6
X 10−’Mチミジンを含むDMEM (以下HAT
培地と省略する)で2回遠心洗浄(1000rpin、
10分間)した。この培養液を96ウエルプレート(F
a 1con#3042)1 に5×105細胞個/ウェルになるように200μlず
つ分注した。3日日ごとにHAT培地を100μm/ウ
ェル交換した。3週間後からは、lXl0−’Mヒポキ
サンチン、1.6X10−’Mチミジンと10%FC8
を含むDMEM (以下HT培地と省略する)を培地交
換に用いた。
(D)ハイブリドーマの選択
96ウエルプレートに細胞コロニーが認められる10日
目前後から固相酵素免疫測定法を行い、培養上清に抗ヒ
トp−α−アミラーゼ抗体が存在するかどうか調べた。
目前後から固相酵素免疫測定法を行い、培養上清に抗ヒ
トp−α−アミラーゼ抗体が存在するかどうか調べた。
96ウエルイムノプレート平底(インターメ・ンド社製
)に、ヒトp−α−アミラーゼ5μg/m1を50μm
/ウェル分注し、37℃で1.5時間静置した。ウェル
に残っている溶液を除去し、PBSに0.04%ツイー
ン(t w e e r) )20を含んだ溶液(以下
PBS−T)で3回洗浄した後、0.2%ウシ血清アル
ブミン(以下BSA)を溶解したPBS−T溶液300
μmを各ウェルに加えて、37℃で1.5時間プロ・ソ
キング2 処理した。次に各ウェルに上記培養上清を50μlずつ
分注し37℃で1.5時間静置した。これらのウェルを
PBS−T溶液で3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標
識ラビット抗マウスIgG抗体(ジャクソン社製)40
00倍希釈を50μm/ウェルずつ分注し、37℃で1
.5時間静置した。PBS−T溶液で3回洗浄したのち
、基質溶液(0,3mg/ml 2.2−アジノジー
(3エチルベンズチアゾリン硫酸)−ジアンモニウム塩
及び0.01%過酸化水素(H2O2)を含有する0、
1Mクエン酸緩衝液(pH5,1))を各ウェルに50
μl添加した。30分間室温で放置し、200mMシュ
ウ酸溶液を50.μlを加えて酵素反応を停止させた。
)に、ヒトp−α−アミラーゼ5μg/m1を50μm
/ウェル分注し、37℃で1.5時間静置した。ウェル
に残っている溶液を除去し、PBSに0.04%ツイー
ン(t w e e r) )20を含んだ溶液(以下
PBS−T)で3回洗浄した後、0.2%ウシ血清アル
ブミン(以下BSA)を溶解したPBS−T溶液300
μmを各ウェルに加えて、37℃で1.5時間プロ・ソ
キング2 処理した。次に各ウェルに上記培養上清を50μlずつ
分注し37℃で1.5時間静置した。これらのウェルを
PBS−T溶液で3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標
識ラビット抗マウスIgG抗体(ジャクソン社製)40
00倍希釈を50μm/ウェルずつ分注し、37℃で1
.5時間静置した。PBS−T溶液で3回洗浄したのち
、基質溶液(0,3mg/ml 2.2−アジノジー
(3エチルベンズチアゾリン硫酸)−ジアンモニウム塩
及び0.01%過酸化水素(H2O2)を含有する0、
1Mクエン酸緩衝液(pH5,1))を各ウェルに50
μl添加した。30分間室温で放置し、200mMシュ
ウ酸溶液を50.μlを加えて酵素反応を停止させた。
415nmでの吸光度を測定し、酵素活性が認められた
ウェルに抗ヒトp−α−アミラーゼ抗体を繰生するハイ
ブリドーマが存在することがわかる。以上のようにして
、抗体価の強い抗体産生ハイブリドーマを取得した。
ウェルに抗ヒトp−α−アミラーゼ抗体を繰生するハイ
ブリドーマが存在することがわかる。以上のようにして
、抗体価の強い抗体産生ハイブリドーマを取得した。
(E)コンデショニングメデウムの調製26ゲージの注
射針をつけた注射器に10m13 の冷蔵しておいた0134Mサッカロース溶液を吸い取
った。B a 1 b / cマウス(♂)をを椎脱臼
させ、無菌的に腹腔内に上記溶液を注入した。
射針をつけた注射器に10m13 の冷蔵しておいた0134Mサッカロース溶液を吸い取
った。B a 1 b / cマウス(♂)をを椎脱臼
させ、無菌的に腹腔内に上記溶液を注入した。
注入後5分以内に左側腹部に18ゲージの注射針をつけ
氷冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。氷冷
しておいた遠心チューブに上記回収波を流し込み、11
000rpで5分間遠心分離した。遠心後上清を廃棄し
、細胞ペレットに10%FC8−DMEMを加え攪拌し
プッシュに入れた。37℃95%炭酸ガス濃度、95%
湿度で一晩培養した。培養上清を集め、0.22μmの
メンブレンフィルターで濾過し、これをコンデショニン
グメデウムとした。
氷冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。氷冷
しておいた遠心チューブに上記回収波を流し込み、11
000rpで5分間遠心分離した。遠心後上清を廃棄し
、細胞ペレットに10%FC8−DMEMを加え攪拌し
プッシュに入れた。37℃95%炭酸ガス濃度、95%
湿度で一晩培養した。培養上清を集め、0.22μmの
メンブレンフィルターで濾過し、これをコンデショニン
グメデウムとした。
(F)クローニング
抗体産生を認めるバイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。上記(E)項で作製したコ
ンデショニングメデウムを1ml含むHAT培地20m
1を用意した。クローニングしたいハイブリドーマ細胞
を各ウェルに1個になるように上記培養液中に調整し、
200μl/ 4 ウェルずつ96ウエルイムノプレート(Falcon#
3042)に分注した。培養10日目前後から細胞コロ
ニーが認められるウェルについて、上記(D)項に記載
した固相酵素免疫測定法に準じて抗ヒトp−α−アミラ
ーゼ抗体産生ハイブリドーマを選択し、さらに再度クロ
ーニングを繰り返しり1−ハイブリドーマを樹立した。
用いて単一クローンにした。上記(E)項で作製したコ
ンデショニングメデウムを1ml含むHAT培地20m
1を用意した。クローニングしたいハイブリドーマ細胞
を各ウェルに1個になるように上記培養液中に調整し、
200μl/ 4 ウェルずつ96ウエルイムノプレート(Falcon#
3042)に分注した。培養10日目前後から細胞コロ
ニーが認められるウェルについて、上記(D)項に記載
した固相酵素免疫測定法に準じて抗ヒトp−α−アミラ
ーゼ抗体産生ハイブリドーマを選択し、さらに再度クロ
ーニングを繰り返しり1−ハイブリドーマを樹立した。
最終的に17クローンのハイブリドーマを確立した。こ
れらのモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株のうち
、ヒトS−α−アミラーゼと交差せず、叉なる抗原部位
を認識する抗体を産生じていた2種のモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ株をサンドイッチアッセイに用い
た。(G)抗ヒトp−α−アミラーゼ抗体の精製 Ba1b/cマウス(♂)6〜10週令の腹腔にブリス
タン(2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン
)を0.5ml/匹投与した。2週間後、上記(F)項
で得られた抗ヒトp−αアミラーゼ抗体産生ハイブリド
ーマ株のうちヒトS−α−アミラーゼと交差しない抗体
を産生ずる 5 2種のハイプリドーマ株を、マウス腹腔内に各クローン
について2X106細胞個/匹移植した。
れらのモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株のうち
、ヒトS−α−アミラーゼと交差せず、叉なる抗原部位
を認識する抗体を産生じていた2種のモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ株をサンドイッチアッセイに用い
た。(G)抗ヒトp−α−アミラーゼ抗体の精製 Ba1b/cマウス(♂)6〜10週令の腹腔にブリス
タン(2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン
)を0.5ml/匹投与した。2週間後、上記(F)項
で得られた抗ヒトp−αアミラーゼ抗体産生ハイブリド
ーマ株のうちヒトS−α−アミラーゼと交差しない抗体
を産生ずる 5 2種のハイプリドーマ株を、マウス腹腔内に各クローン
について2X106細胞個/匹移植した。
10日目前後に生成した腹水を18ゲージの注射針を腹
腔に差し込み、1720量の0.2M−EDTAをいれ
た遠心チューブに滴下させた。遠心チューブを4000
rpmで10分間遠心し、上清を集めた。採取した上清
を50%硫酸アンモニウム沈殿分画法にしたがって粗精
製し、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過をおこ
ない精製した。メルカプトエタノール還元下での12%
5DS−ポリアクリルアミド電気泳動で1本の重鎮と1
本の軽鎖の2本のバンドになったことで抗体の純度を確
認した。
腔に差し込み、1720量の0.2M−EDTAをいれ
た遠心チューブに滴下させた。遠心チューブを4000
rpmで10分間遠心し、上清を集めた。採取した上清
を50%硫酸アンモニウム沈殿分画法にしたがって粗精
製し、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過をおこ
ない精製した。メルカプトエタノール還元下での12%
5DS−ポリアクリルアミド電気泳動で1本の重鎮と1
本の軽鎖の2本のバンドになったことで抗体の純度を確
認した。
(酵素標識法によるヒトp−α−アミラーゼの測定)
(A)抗ヒトp−α−アミラーゼ抗体の固定化:未処理
マイクロタイタープレート(96ウエル・ヌンクプレー
ト、インターメッド社製)の各ウェルにO,1M炭酸ナ
トリウム緩衝液(pH9,5)に溶解した5μg /
m 1のマウス由来の 6 ヒトS−α−アミラーゼと交差しない抗ヒトpα−アミ
ラーゼモノクローナル抗体(名称Aとする)の溶液10
0μlを加えて、4℃−夜インキユベートした。次に、
各ウェルの溶液を除去し、P B S−Tテ3回洗浄し
た後、0.1%BSAを溶解したPBS−T溶液400
μmを各ウェルに加えて、4℃でブロッキング処理しそ
のまま保存した。
マイクロタイタープレート(96ウエル・ヌンクプレー
ト、インターメッド社製)の各ウェルにO,1M炭酸ナ
トリウム緩衝液(pH9,5)に溶解した5μg /
m 1のマウス由来の 6 ヒトS−α−アミラーゼと交差しない抗ヒトpα−アミ
ラーゼモノクローナル抗体(名称Aとする)の溶液10
0μlを加えて、4℃−夜インキユベートした。次に、
各ウェルの溶液を除去し、P B S−Tテ3回洗浄し
た後、0.1%BSAを溶解したPBS−T溶液400
μmを各ウェルに加えて、4℃でブロッキング処理しそ
のまま保存した。
CB)西洋ワサビペルオキシダーゼ(以下HRP)標識
抗体の調製: 0.3M重炭酸ナトリウム緩衝液(pI(8,1)に溶
解したHRP溶液(5mg/ml)に1%1−フルオロ
−2,4−ジニトロベンゼンのエタノール溶液0.1m
lを加え、室温にて1時間反応させた。その溶液に0.
06M過ヨウ素酸ナトリウム1.0mlを添加し30分
反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムをO,,1
6Mのエチレングリコール1.0rrilを加えて除去
した後、0.01M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,5
)で透析した。次に、マイクロタイタープレートに 7 固定化したものとは別のマウス由来のヒトS−α−アミ
ラーゼと交差しない抗ヒトp−α−アミラーゼ抗体(名
称Bとする。モノクローナル抗体Aとは異なる抗原部位
を認識するもの。)5mgを加えて5〜6時間反応させ
た。水素化ホウ素ナトリウム5mgを添加して4℃中で
一夜放置した。
抗体の調製: 0.3M重炭酸ナトリウム緩衝液(pI(8,1)に溶
解したHRP溶液(5mg/ml)に1%1−フルオロ
−2,4−ジニトロベンゼンのエタノール溶液0.1m
lを加え、室温にて1時間反応させた。その溶液に0.
06M過ヨウ素酸ナトリウム1.0mlを添加し30分
反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムをO,,1
6Mのエチレングリコール1.0rrilを加えて除去
した後、0.01M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,5
)で透析した。次に、マイクロタイタープレートに 7 固定化したものとは別のマウス由来のヒトS−α−アミ
ラーゼと交差しない抗ヒトp−α−アミラーゼ抗体(名
称Bとする。モノクローナル抗体Aとは異なる抗原部位
を認識するもの。)5mgを加えて5〜6時間反応させ
た。水素化ホウ素ナトリウム5mgを添加して4℃中で
一夜放置した。
この後、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除去するた
め、0.85%塩化ナトリウムを含む10mMリン酸ナ
トリウム緩衝液(pH7,1)に対して4℃で一夜攪拌
しながら透析した。上記反応物をT S K−ゲルG−
3000SW (東ソー株式会社製、商品名)を用いて
高速液体クロマトグラフィーにて精製し、HRP標識抗
体とした。
め、0.85%塩化ナトリウムを含む10mMリン酸ナ
トリウム緩衝液(pH7,1)に対して4℃で一夜攪拌
しながら透析した。上記反応物をT S K−ゲルG−
3000SW (東ソー株式会社製、商品名)を用いて
高速液体クロマトグラフィーにて精製し、HRP標識抗
体とした。
(C)試料中のヒトp−α−アミラーゼの定量二本実施
例中の(A)で記述した方法で作製したマイクロタイタ
ープレートを室温にもどし、PBST溶演で洗浄した後
、0〜2000 n g / m 1のヒトp−α−ア
ミラーゼの希釈系列液を各ウェルにそれぞれ10μl加
えた。次に本実施例中の(B)で記述した方法で得たH
RP標識抗体をP 8 BS−T溶液で希釈し、各ウェルに100μmずつ添加
した。そのまま37℃で1時間インキュベートした後、
溶液を除去しPBS−T溶液で3回洗浄した。それに、
0.3mg/mlの2,2−アジノジ−(3−エチルベ
ンズチアゾリン硫酸)−ジアンモニウム塩及び0.01
%過酸化水素(H2O2)を含有する0、1Mクエン酸
緩衝液(pH4,1)から成る基質溶液を各ウェルに1
00μm添加し、室温で5分間酵素反応させた後、20
0mMシュウ酸溶液を100μm加えて酵素反応を停止
させた。上記マイクロタイタープレートを各ウェルにつ
いて、波長415nm、対照波長492nmの吸光強度
を自動マイクロタイタープレートリーダー(東ソー株式
会社製、MPR−A4、商品名)で測定した結果、試料
中のヒトp−α−アミラーゼ濃度が8〜2000ng/
mlの範囲内でヒトp−α−アミラーゼ濃度と測定値の
間に直線性が認められ、試料中のヒトp−α−アミラー
ゼは8〜2000ng/mlの濃度範囲で定量できるこ
とが確認された。結果を第19 図に示す。一方、試料としてヒトp−α−アミラーゼ又
はヒトS−α−アミラーゼを用いて同様に測定を行った
結果、0〜2’OOOn g/m lの濃度範囲でS−
α−アミラーゼと交叉反応を示さないことが確認された
結果を第2図に示す。
例中の(A)で記述した方法で作製したマイクロタイタ
ープレートを室温にもどし、PBST溶演で洗浄した後
、0〜2000 n g / m 1のヒトp−α−ア
ミラーゼの希釈系列液を各ウェルにそれぞれ10μl加
えた。次に本実施例中の(B)で記述した方法で得たH
RP標識抗体をP 8 BS−T溶液で希釈し、各ウェルに100μmずつ添加
した。そのまま37℃で1時間インキュベートした後、
溶液を除去しPBS−T溶液で3回洗浄した。それに、
0.3mg/mlの2,2−アジノジ−(3−エチルベ
ンズチアゾリン硫酸)−ジアンモニウム塩及び0.01
%過酸化水素(H2O2)を含有する0、1Mクエン酸
緩衝液(pH4,1)から成る基質溶液を各ウェルに1
00μm添加し、室温で5分間酵素反応させた後、20
0mMシュウ酸溶液を100μm加えて酵素反応を停止
させた。上記マイクロタイタープレートを各ウェルにつ
いて、波長415nm、対照波長492nmの吸光強度
を自動マイクロタイタープレートリーダー(東ソー株式
会社製、MPR−A4、商品名)で測定した結果、試料
中のヒトp−α−アミラーゼ濃度が8〜2000ng/
mlの範囲内でヒトp−α−アミラーゼ濃度と測定値の
間に直線性が認められ、試料中のヒトp−α−アミラー
ゼは8〜2000ng/mlの濃度範囲で定量できるこ
とが確認された。結果を第19 図に示す。一方、試料としてヒトp−α−アミラーゼ又
はヒトS−α−アミラーゼを用いて同様に測定を行った
結果、0〜2’OOOn g/m lの濃度範囲でS−
α−アミラーゼと交叉反応を示さないことが確認された
結果を第2図に示す。
第1図は、実施例1における抗体価を反映した呈色反応
の415nmでの吸光度を縦軸に、抗原(ヒトp−α−
アミラーゼ)の濃度(ng/ml)を横軸にその関係を
示した図である。 第2図は、実施例1における抗体価を反映した呈色反応
の415nmでの吸光度を縦軸に、抗原(ヒトp−α−
アミラーゼまたはヒトS−α−アミラーゼ)の濃度(n
g/m l )を横軸にその関係を・示した図である
。
の415nmでの吸光度を縦軸に、抗原(ヒトp−α−
アミラーゼ)の濃度(ng/ml)を横軸にその関係を
示した図である。 第2図は、実施例1における抗体価を反映した呈色反応
の415nmでの吸光度を縦軸に、抗原(ヒトp−α−
アミラーゼまたはヒトS−α−アミラーゼ)の濃度(n
g/m l )を横軸にその関係を・示した図である
。
Claims (1)
- (1)ヒト膵臓α−アミラーゼを特異的に認識し、ヒト
唾液腺α−アミラーゼと交差反応しないモノクローナル
抗体で、 A:固定化されている第1抗体 および B:第1抗体とは異なる抗原部位を認識し、かつ標識剤
で標識されている第2抗体 を用いることを特徴とするヒト膵臓α−アミラーゼの測
定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP32153289A JPH03183953A (ja) | 1989-12-13 | 1989-12-13 | ヒト膵臓α―アミラーゼの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP32153289A JPH03183953A (ja) | 1989-12-13 | 1989-12-13 | ヒト膵臓α―アミラーゼの測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03183953A true JPH03183953A (ja) | 1991-08-09 |
Family
ID=18133619
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP32153289A Pending JPH03183953A (ja) | 1989-12-13 | 1989-12-13 | ヒト膵臓α―アミラーゼの測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03183953A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05317083A (ja) * | 1992-02-12 | 1993-12-03 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | 人アルドース還元酵素に結合する抗体およびその使用法 |
-
1989
- 1989-12-13 JP JP32153289A patent/JPH03183953A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05317083A (ja) * | 1992-02-12 | 1993-12-03 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | 人アルドース還元酵素に結合する抗体およびその使用法 |
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