JPH0644876B2 - 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法 - Google Patents
抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法Info
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- JPH0644876B2 JPH0644876B2 JP60279129A JP27912985A JPH0644876B2 JP H0644876 B2 JPH0644876 B2 JP H0644876B2 JP 60279129 A JP60279129 A JP 60279129A JP 27912985 A JP27912985 A JP 27912985A JP H0644876 B2 JPH0644876 B2 JP H0644876B2
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、抗トロンビン・アンチトロンビンIII複
合体モノクローナル抗体、トロンビン・アンチトロン
ビンIII複合体モノクローナル抗体の製造方法、抗ト
ロンビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル
抗体を用いるトロンビン・アンチトロンビンIII複合体
の免疫定量法、抗トロンビン・アンチトロンビンIII
複合体モノクローナル抗体を用いるトロンビン・アンチ
トロンビンIII複合体の精製方法、に関するものであ
る。
合体モノクローナル抗体、トロンビン・アンチトロン
ビンIII複合体モノクローナル抗体の製造方法、抗ト
ロンビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル
抗体を用いるトロンビン・アンチトロンビンIII複合体
の免疫定量法、抗トロンビン・アンチトロンビンIII
複合体モノクローナル抗体を用いるトロンビン・アンチ
トロンビンIII複合体の精製方法、に関するものであ
る。
臨床分野において、血中のトロンビンを測定すること
は、播種性血管内凝固や血栓症等の凝固亢進状態を知る
うえで重要である。しかしながら、トロンビンそのもの
を測定することはできないので、代わりにトロンビンが
血中のアンチトロンビンIII（以下ＡＴIIIともいう）と
速やかに結合して生ずるトロンビン・アンチトロンビン
III複合体（以下ＴＡＴともいう）を測定して、その量
からトロンビンの量を推定して血液の凝固活性化の指標
としている。
は、播種性血管内凝固や血栓症等の凝固亢進状態を知る
うえで重要である。しかしながら、トロンビンそのもの
を測定することはできないので、代わりにトロンビンが
血中のアンチトロンビンIII（以下ＡＴIIIともいう）と
速やかに結合して生ずるトロンビン・アンチトロンビン
III複合体（以下ＴＡＴともいう）を測定して、その量
からトロンビンの量を推定して血液の凝固活性化の指標
としている。
「従来の技術」 従来、トロンビン・アンチトロンビンIII複合体（ＴＡ
Ｔ）を測定するには、一般に二次元免疫電気泳動法が用
いられてきた。この方法においては、試料をゲル内電気
泳動によってＴＡＴとＡＴIIIとに分け、次に抗ＡＴIII
抗体を含むゲル平板に対して直角に電気泳動させ、各成
分と抗体によってできる沈降線に囲まれる面積からこれ
らを定量していた。
Ｔ）を測定するには、一般に二次元免疫電気泳動法が用
いられてきた。この方法においては、試料をゲル内電気
泳動によってＴＡＴとＡＴIIIとに分け、次に抗ＡＴIII
抗体を含むゲル平板に対して直角に電気泳動させ、各成
分と抗体によってできる沈降線に囲まれる面積からこれ
らを定量していた。
しかしながら、この方法は測定操作が煩雑であるばかり
ではなく、測定に長時間を要する欠点があり、しかもそ
の検出感度が低いため実用上問題があった。
ではなく、測定に長時間を要する欠点があり、しかもそ
の検出感度が低いため実用上問題があった。
［発明が解決しようとする問題点］ 本発明者等は、血漿あるいは血清中に存在するＴＡＴの
同定定量に用いられていた従来の免疫電気泳動法におけ
る、測定に長時間を要し検出感度が低い、という欠点を
解消すべく種々研究を行い、ＡＴIIIとトロンビンが複
合体を形成することによって生ずる新しい抗原決定基を
認識するモノクローナル抗体を産生、分泌するハイブリ
ドーマを得た。そして、このハイブリドーマの培養物を
分離・精製して、ＴＡＴと特異的に反応し、遊離トロン
ビンおよび遊離ＡＴIIIとは反応しない抗ＴＡＴモノク
ローナル抗体を製造し、本願発明を完成させるに至っ
た。
同定定量に用いられていた従来の免疫電気泳動法におけ
る、測定に長時間を要し検出感度が低い、という欠点を
解消すべく種々研究を行い、ＡＴIIIとトロンビンが複
合体を形成することによって生ずる新しい抗原決定基を
認識するモノクローナル抗体を産生、分泌するハイブリ
ドーマを得た。そして、このハイブリドーマの培養物を
分離・精製して、ＴＡＴと特異的に反応し、遊離トロン
ビンおよび遊離ＡＴIIIとは反応しない抗ＴＡＴモノク
ローナル抗体を製造し、本願発明を完成させるに至っ
た。
［問題点を解決するための手段］ すなわち、本願発明は下記の（１）〜（６）に記載する
構成を有するものである。
構成を有するものである。
（１）トロンビン・アンチトロンビンIII複合体とと特
異的に反応し、遊離トロンビンおよび遊離アンチトロビ
ンIIIとは反応しないことを特徴とする抗トロンビン・
アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体。
異的に反応し、遊離トロンビンおよび遊離アンチトロビ
ンIIIとは反応しないことを特徴とする抗トロンビン・
アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体。
（２）トロンビン・アンチトロンビンIII複合体で免疫
したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞との融合によ
って形成され、トロンビン・アンチトロンビンIII複合
体と特異的に反応し、遊離トロンビンおよび遊離アンチ
トロンビンIIIとは反応しないモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマの培養物を分離・精製することを
特徴とする抗トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
モノクローナル抗体の製造方法。
したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞との融合によ
って形成され、トロンビン・アンチトロンビンIII複合
体と特異的に反応し、遊離トロンビンおよび遊離アンチ
トロンビンIIIとは反応しないモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマの培養物を分離・精製することを
特徴とする抗トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
モノクローナル抗体の製造方法。
（３）トロンビン・アンチトロンビンIII複合体と特異
的に反応し、遊離トロンビンおよび遊離アンチトロンビ
ンIIIとは反応しない抗トロンビン・アンチトロンビンI
II複合体モノクローナル抗体の１種または２種以上を使
用することを特徴とするトロンビン・アンチトロンビン
III複合体の免疫定量法。
的に反応し、遊離トロンビンおよび遊離アンチトロンビ
ンIIIとは反応しない抗トロンビン・アンチトロンビンI
II複合体モノクローナル抗体の１種または２種以上を使
用することを特徴とするトロンビン・アンチトロンビン
III複合体の免疫定量法。
（４）免疫定量法が酵素免疫定量法である特許請求の範
囲第３項記載のトロンビン・アンチトロンビンIII複合
体の免疫定量法。
囲第３項記載のトロンビン・アンチトロンビンIII複合
体の免疫定量法。
（５）免疫定量法がラテックス凝集免疫定量法である特
許請求の範囲第３項記載のトロンビン・アンチトロンビ
ンIII複合体の免疫定量法。
許請求の範囲第３項記載のトロンビン・アンチトロンビ
ンIII複合体の免疫定量法。
（６）トロンビン・アンチトロンビンIII複合体と特異
的に反応し、遊離トロンビンおよび遊離アンチトロビン
IIIとは反応しない抗トロンビン・アンチトロンビンIII
複合体モノクローナル抗体を担体に結合させたものを免
疫吸着剤として用いることを特徴とするトロンビン・ア
ンチトロンビンIII複合体の精製法。
的に反応し、遊離トロンビンおよび遊離アンチトロビン
IIIとは反応しない抗トロンビン・アンチトロンビンIII
複合体モノクローナル抗体を担体に結合させたものを免
疫吸着剤として用いることを特徴とするトロンビン・ア
ンチトロンビンIII複合体の精製法。
以下、本発明を詳細に説明する。
抗ＴＡＴモノクローナル抗体は新規なマウス・ハイブリ
ドーマを、それぞれ培地またはマウスの膜腔内で培養す
ることによって製造できる。
ドーマを、それぞれ培地またはマウスの膜腔内で培養す
ることによって製造できる。
ここで用いるマウス・ハイブリドーマは一般的にはＴＡ
Ｔで免疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞と
を、Ｋｈｌｅｒおよび Milstein の細胞融合の基本方
法〔Nature 第２５６巻 ４９５頁（１９７５年）参
照〕により細胞融合して製造することが可能である。詳
細には、下記実施例に述べる如くである。
Ｔで免疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞と
を、Ｋｈｌｅｒおよび Milstein の細胞融合の基本方
法〔Nature 第２５６巻 ４９５頁（１９７５年）参
照〕により細胞融合して製造することが可能である。詳
細には、下記実施例に述べる如くである。
また、上記のハイブリドーマを培養する培地としては、
ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適
にはダルペッコ氏変法イーグル氏最小必須培地(Dulbecc
o′s modified Eeagle′sminimun essential medium以
下、ＤＭＥと記す）にウシ胎児血清、Ｌ-グルタミン、
Ｌ-ピルビン酸および抗生物質（ペニシリンＧとストレ
プトマイシン）を含む培地が用いられる。
ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適
にはダルペッコ氏変法イーグル氏最小必須培地(Dulbecc
o′s modified Eeagle′sminimun essential medium以
下、ＤＭＥと記す）にウシ胎児血清、Ｌ-グルタミン、
Ｌ-ピルビン酸および抗生物質（ペニシリンＧとストレ
プトマイシン）を含む培地が用いられる。
上記ハイブリドーマの培養は、培地中で行う場合には５
％ＣＯ２濃度、３７℃で約３日間、またマウスの腹腔内
で培養する場合には約１４日間で行われる。
％ＣＯ２濃度、３７℃で約３日間、またマウスの腹腔内
で培養する場合には約１４日間で行われる。
このようにして製造された培養液またはマウスの腹水か
ら、蛋白質の単離、精製に一般的に用いられる方法によ
り前述の抗ＴＡＴモノクローナル抗体を分離、精製する
ことが可能である。
ら、蛋白質の単離、精製に一般的に用いられる方法によ
り前述の抗ＴＡＴモノクローナル抗体を分離、精製する
ことが可能である。
そのような方法としては、硫安塩析、イオン交換セルロ
ースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分
子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プ
ロエテンＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー、透析、凍結乾燥等がある。
ースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分
子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プ
ロエテンＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー、透析、凍結乾燥等がある。
このようにして得られた抗ＴＡＴモノクローナル抗体
は、遊離のＡＴIII及びトロンビンとは結合しないで、
ＴＡＴとだけ結合する能力を有し、ＴＡＴの免疫定量用
の試薬として、及びＴＡＴの精製に用いる免疫吸着剤と
して有用である。この発明の抗ＴＡＴモノクローナル抗
体（例えば後述の実施例で得られたＡＴ−１、ＡＴ−
２、ＡＴ−３、ＡＴ−４、およびＡＴ−５）は、酵素免
疫定量法（ＥＩＡ）あるいは放射能免疫定量法（ＲＩ
Ａ）における試薬として使用できる。酵素免疫定量法と
しては、マイクロタイターあるいはプラスチックチュー
ブを用いるワン・ステップ・サンドイッチ酵素免疫定量
法が例として挙げられる。この酵素免疫定量法の具体例
は、下記実施例７に示す通りであるが、一般的には、Ｔ
ＡＴの互いに異なった抗原決定基を認識する２種類の抗
ＴＡＴモノクローナル抗体を用いて行い、まずマイクロ
タイター・プレートの穴（ウェル）あるいはプラスチッ
クチューブを前もって１種類の抗体（例えばＡＴ−１）
で感作させておき、次に、この穴あるいはプラスチック
チューブにＴＡＴを含む被検体および酵素標識した別種
の抗体（例えば、ＡＴ−２）の溶液を入れ、約３０分間
静置後洗浄し、酵素基質溶液を加えて３０分間程度酵素
反応を行う。反応終了後、比色法等により、被検体中の
ＴＡＴの量を定量することにより行うことが可能であ
る。
は、遊離のＡＴIII及びトロンビンとは結合しないで、
ＴＡＴとだけ結合する能力を有し、ＴＡＴの免疫定量用
の試薬として、及びＴＡＴの精製に用いる免疫吸着剤と
して有用である。この発明の抗ＴＡＴモノクローナル抗
体（例えば後述の実施例で得られたＡＴ−１、ＡＴ−
２、ＡＴ−３、ＡＴ−４、およびＡＴ−５）は、酵素免
疫定量法（ＥＩＡ）あるいは放射能免疫定量法（ＲＩ
Ａ）における試薬として使用できる。酵素免疫定量法と
しては、マイクロタイターあるいはプラスチックチュー
ブを用いるワン・ステップ・サンドイッチ酵素免疫定量
法が例として挙げられる。この酵素免疫定量法の具体例
は、下記実施例７に示す通りであるが、一般的には、Ｔ
ＡＴの互いに異なった抗原決定基を認識する２種類の抗
ＴＡＴモノクローナル抗体を用いて行い、まずマイクロ
タイター・プレートの穴（ウェル）あるいはプラスチッ
クチューブを前もって１種類の抗体（例えばＡＴ−１）
で感作させておき、次に、この穴あるいはプラスチック
チューブにＴＡＴを含む被検体および酵素標識した別種
の抗体（例えば、ＡＴ−２）の溶液を入れ、約３０分間
静置後洗浄し、酵素基質溶液を加えて３０分間程度酵素
反応を行う。反応終了後、比色法等により、被検体中の
ＴＡＴの量を定量することにより行うことが可能であ
る。
また、本発明のモノクローナル抗体は、後述するように
ラテックス凝集免疫法にも使用できる。本発明のモノク
ローナル抗体を感作したラテックスと被検体を接触さ
せ、それに伴う凝集の有無を測定することで、被検体中
のＴＡＴを定量することができる。
ラテックス凝集免疫法にも使用できる。本発明のモノク
ローナル抗体を感作したラテックスと被検体を接触さ
せ、それに伴う凝集の有無を測定することで、被検体中
のＴＡＴを定量することができる。
また、この発明の抗ＴＡＴモノクローナル抗体をＴＡＴ
の精製に使用できる。まず、抗ＴＡＴモノーナル抗体
（ＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ−３、ＡＴ−４、またはＡ
Ｔ−５）をシアン化臭素・活性化セファロース４Ｂと常
法により反応させ、該ＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ−３、
ＡＴ−４、またはＡＴ−５結合セファロース４Ｂを調製
し、これを用いて、カラム法またはバッチ法でＴＡＴを
常法によって精製すればよい。
の精製に使用できる。まず、抗ＴＡＴモノーナル抗体
（ＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ−３、ＡＴ−４、またはＡ
Ｔ−５）をシアン化臭素・活性化セファロース４Ｂと常
法により反応させ、該ＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ−３、
ＡＴ−４、またはＡＴ−５結合セファロース４Ｂを調製
し、これを用いて、カラム法またはバッチ法でＴＡＴを
常法によって精製すればよい。
「実施例」 次にこの発明の実施例により更に詳細に説明する。
実施例１ ＴＡＴの調製： ＴＡＴの調製は次のような操作で行った。精製したトロ
ンビン５ｍｇ（０．５ｍｇ／ｍｌのトロンビン溶液、１
０ｍｌ）と精製したＡＴIII１５ｍｇ（５ｍｇ／ｍｌの
ＡＴIII溶液、３ｍｌ）を混合し（モル比１：２）、３
７℃で１時間反応後、１Ｍのジイソプロピルフルオロリ
ン酸溶液を１３ｍｌ反応液に添加することによって反応
を停止させる。この混合液を前もって０．１Ｍ ＮａＣ
ｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液 ｐＨ７．４で平衡
化したヘパリン−セファロースカラム（カラム容量１０
０ｍｌ）に充填する。このカラムを上記の緩衝液約４０
０ｍｌで洗浄後、０．１ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）と０．５Ｍ ＮａＣｌを
含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）による直
線濃度勾配によって溶離する。溶出液は、５ｍｌずつ集
めた。ＳＤＳディスク電気泳動法によって、複合体の含
まれている分画を測定したＴＡＴが含まれている分画番
号６１−１２０を集め、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液で透析する。次に前もって５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で平衡化
してあるＤＥＡＥ−セファセルカラム（カラム容量５０
ｍｌ，ファルマシャ社製，スウェーデン）に充填する。
このカラムを上記の緩衝液約２００ｍｌで洗浄した後、
０．０５Ｍ ＮａＣｌを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）と０．５Ｍ ＮａＣｌを含むトリス塩酸緩衝液
による直線濃度勾配によって溶離する。溶出後は、２ｍ
ｌずつ集めた。上記の方法で測定したＴＡＴの含まれて
いる分画を集め、限外濾過法によって濃縮し、Ａ２８０
ｎｍ＝１．０のＴＡＴ，５ｍｌを得た。このようにして
得たＴＡＴ溶液は、免疫原として、また抗ＴＡＴ抗体産
生性ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原
として使用する。
ンビン５ｍｇ（０．５ｍｇ／ｍｌのトロンビン溶液、１
０ｍｌ）と精製したＡＴIII１５ｍｇ（５ｍｇ／ｍｌの
ＡＴIII溶液、３ｍｌ）を混合し（モル比１：２）、３
７℃で１時間反応後、１Ｍのジイソプロピルフルオロリ
ン酸溶液を１３ｍｌ反応液に添加することによって反応
を停止させる。この混合液を前もって０．１Ｍ ＮａＣ
ｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液 ｐＨ７．４で平衡
化したヘパリン−セファロースカラム（カラム容量１０
０ｍｌ）に充填する。このカラムを上記の緩衝液約４０
０ｍｌで洗浄後、０．１ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）と０．５Ｍ ＮａＣｌを
含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）による直
線濃度勾配によって溶離する。溶出液は、５ｍｌずつ集
めた。ＳＤＳディスク電気泳動法によって、複合体の含
まれている分画を測定したＴＡＴが含まれている分画番
号６１−１２０を集め、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液で透析する。次に前もって５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で平衡化
してあるＤＥＡＥ−セファセルカラム（カラム容量５０
ｍｌ，ファルマシャ社製，スウェーデン）に充填する。
このカラムを上記の緩衝液約２００ｍｌで洗浄した後、
０．０５Ｍ ＮａＣｌを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）と０．５Ｍ ＮａＣｌを含むトリス塩酸緩衝液
による直線濃度勾配によって溶離する。溶出後は、２ｍ
ｌずつ集めた。上記の方法で測定したＴＡＴの含まれて
いる分画を集め、限外濾過法によって濃縮し、Ａ２８０
ｎｍ＝１．０のＴＡＴ，５ｍｌを得た。このようにして
得たＴＡＴ溶液は、免疫原として、また抗ＴＡＴ抗体産
生性ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原
として使用する。
実施例２ （ａ）免疫化した脾臓細胞の調製： 上記のＴＡＴ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等
量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混合
し、その混合液２００μをマウス腹腔内に投与するこ
とにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後、
該マウスに上記の同様の方法でマウス腹腔内に投与した
（第２回免疫）。第２回免疫から２１日経過後、ＴＡＴ
免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩
水で希釈し、その希釈液２００μを、該マウスを静脈
内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、
脾臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混合
し、その混合液２００μをマウス腹腔内に投与するこ
とにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後、
該マウスに上記の同様の方法でマウス腹腔内に投与した
（第２回免疫）。第２回免疫から２１日経過後、ＴＡＴ
免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩
水で希釈し、その希釈液２００μを、該マウスを静脈
内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、
脾臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
（ｂ）細胞融合： 無菌的に摘出した上記の脾臓を、１０〜１５％ウシ胎児
血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレに入れ
る。次に脾臓を１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
培地約１５ｍｌで還流して脾細胞を流出させた後、この
脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通す。この脾細胞を
５０ｍｌ遠心チューブに集めて５００×ｇ、１０分間遠
心する。こうして得たペレットに３〜５ｍｌのヘモライ
ジング溶液（１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨ
ＣＯ３，１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０）を加
え、懸濁させる。０℃で，５〜１０分間放置すると懸濁
液中の赤血球は破壊される。１０〜２０ｍｌの１０〜１
５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地を加えてから遠心分
離する。このようにして得た細胞ペレットをＤＭＥ培地
で遠心法によって洗浄し、生きている脾細胞数を測定す
る。
血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレに入れ
る。次に脾臓を１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
培地約１５ｍｌで還流して脾細胞を流出させた後、この
脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通す。この脾細胞を
５０ｍｌ遠心チューブに集めて５００×ｇ、１０分間遠
心する。こうして得たペレットに３〜５ｍｌのヘモライ
ジング溶液（１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨ
ＣＯ３，１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０）を加
え、懸濁させる。０℃で，５〜１０分間放置すると懸濁
液中の赤血球は破壊される。１０〜２０ｍｌの１０〜１
５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地を加えてから遠心分
離する。このようにして得た細胞ペレットをＤＭＥ培地
で遠心法によって洗浄し、生きている脾細胞数を測定す
る。
一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエロー
マ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４ 約２×１０７個に１×
１０８個の上記脾細胞を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合
し、遠心分離を行った（５００×ｇ，１０分間）。その
上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３８℃に保
温しておいた４０％ポリエチレングリコール４０００溶
液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを、手で１分間穏
やかに回転することによってポリエチレングリコール溶
液と細胞ペレットを混合させた。次に、３８℃に保温し
ておいたＤＭＥ培地を、３０秒ごとに１ｍｌ加えてチュ
ーブを穏やかに回転させる。この操作を１０回くり返し
た後、２０〜３０ｍｌの１０〜１５％ウシ胎児血清を含
むＤＭＥ培地を加えて、遠心分離（５００×ｇ，１０分
間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレットを１０
〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地に
アミノプテリン４×１０-7Ｍ，チミジン１．６×１０-5
Ｍ，ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加した
もの）で、遠心法によって２回洗浄後、４０ｍｌの上記
ＨＡＴ培地に懸濁する。この細胞懸濁液を９６ウエル細
胞培養プレートの各ウエルに２００μずつ分注し、３
７℃、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始
した。培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を約１０
０μ除き、新たに上記のＨＡＴ培地を１００μ加え
ることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを
選択した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血清を含
むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０-5Ｍ，
ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したも
の）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するととも
に、約１０日目に、下述のＥＬＳＩＡ法により、抗ＴＡ
Ｔ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
マ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４ 約２×１０７個に１×
１０８個の上記脾細胞を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合
し、遠心分離を行った（５００×ｇ，１０分間）。その
上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３８℃に保
温しておいた４０％ポリエチレングリコール４０００溶
液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを、手で１分間穏
やかに回転することによってポリエチレングリコール溶
液と細胞ペレットを混合させた。次に、３８℃に保温し
ておいたＤＭＥ培地を、３０秒ごとに１ｍｌ加えてチュ
ーブを穏やかに回転させる。この操作を１０回くり返し
た後、２０〜３０ｍｌの１０〜１５％ウシ胎児血清を含
むＤＭＥ培地を加えて、遠心分離（５００×ｇ，１０分
間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレットを１０
〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地に
アミノプテリン４×１０-7Ｍ，チミジン１．６×１０-5
Ｍ，ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加した
もの）で、遠心法によって２回洗浄後、４０ｍｌの上記
ＨＡＴ培地に懸濁する。この細胞懸濁液を９６ウエル細
胞培養プレートの各ウエルに２００μずつ分注し、３
７℃、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始
した。培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を約１０
０μ除き、新たに上記のＨＡＴ培地を１００μ加え
ることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを
選択した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血清を含
むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０-5Ｍ，
ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したも
の）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するととも
に、約１０日目に、下述のＥＬＳＩＡ法により、抗ＴＡ
Ｔ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
（ｃ）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＳＩ
Ａ法により測定した。９６ウエルＥＬＳＩＡ用プレート
（ＩｍｍｕｌｏｎII，日本ダイナテック株式会社）の各
ウエルに、前述の精製ＴＡＴ溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．
０５，生理食塩水で稀釈したもの）を５００μずつ分
注し、２５℃で２時間放置した。次に、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０（ＩＣＩ社の登録商標）−生理食塩水で３回
洗浄した後、各ウエルに培養上清を５０μ加え、２５
℃で１時間反応させた。
Ａ法により測定した。９６ウエルＥＬＳＩＡ用プレート
（ＩｍｍｕｌｏｎII，日本ダイナテック株式会社）の各
ウエルに、前述の精製ＴＡＴ溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．
０５，生理食塩水で稀釈したもの）を５００μずつ分
注し、２５℃で２時間放置した。次に、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０（ＩＣＩ社の登録商標）−生理食塩水で３回
洗浄した後、各ウエルに培養上清を５０μ加え、２５
℃で１時間反応させた。
次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で２００
培稀釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ
社，デンマーク）５０μを各ウエルに加えた。反応終
了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で各ウエ
ルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、１０
ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を含む
溶液２５０μを各ウエルに加え、２５℃で３０分間反
応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。その結果、１９２ウエル中、２３ウエルに抗体産生
が認められた。
培稀釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ
社，デンマーク）５０μを各ウエルに加えた。反応終
了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で各ウエ
ルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、１０
ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を含む
溶液２５０μを各ウエルに加え、２５℃で３０分間反
応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。その結果、１９２ウエル中、２３ウエルに抗体産生
が認められた。
上記のＥＬＩＳＡ法によって認められた培養上清中の抗
ＴＡＴ抗体が、ＡＴIIIおよびトロンビンと反応するか
否かを、ＡＴIIIあるいはトロンビンの感作した９６ウ
エルＥＬＩＳＡ用プレートを用いて上記と同様の方法で
測定した。その結果、ＴＡＴと反応した２３ウエルの培
養上清中、１８ウエルの培養上清がＡＴIIIとも反応し
た。一方、トロンビンとは全く反応しなかった。
ＴＡＴ抗体が、ＡＴIIIおよびトロンビンと反応するか
否かを、ＡＴIIIあるいはトロンビンの感作した９６ウ
エルＥＬＩＳＡ用プレートを用いて上記と同様の方法で
測定した。その結果、ＴＡＴと反応した２３ウエルの培
養上清中、１８ウエルの培養上清がＡＴIIIとも反応し
た。一方、トロンビンとは全く反応しなかった。
ＡＴIIIおよびトロンビンとは反応しないで、ＴＡＴの
みに特異的に反応する５ウエル中のハイブリドーマは２
４ウエルプレートに移し、１０〜１５％ウシ胎児血清を
含むＨＴ培養で４〜５日間培養した。その後、再度ＥＬ
ＩＳＡ法によって“抗ＴＡＴ特異的抗体”（以下単に抗
ＴＡＴ抗体という）の産生の有無を確認してから限界希
釈法によりクローニングした。限界希釈法は、ＨＴ培地
でハイブリドーマが５個／ｍｌとなるように稀釈した細
胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞
がウエルあたり２×１０４個分注してある９６ウエルプ
レートの各ウエルに１００μずつ分注した。約１０日
後、ＥＬＩＳＡ法によって、抗ＴＡＴ抗体を産生するハ
イブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結
果、各ハイブリドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生
クローンが得られた。これらのクローンの中から、増殖
のよい、抗体分泌能の高い、しかも安定なクローンを選
び、前述と同様の方法で再クローン化を行ない、“抗Ｔ
ＡＴ特異的抗体”産生ハイブリドーマＡＴ−１、ＡＴ−
２、ＡＴ−３、ＡＴ−４、およびＡＴ−５を樹立した。
みに特異的に反応する５ウエル中のハイブリドーマは２
４ウエルプレートに移し、１０〜１５％ウシ胎児血清を
含むＨＴ培養で４〜５日間培養した。その後、再度ＥＬ
ＩＳＡ法によって“抗ＴＡＴ特異的抗体”（以下単に抗
ＴＡＴ抗体という）の産生の有無を確認してから限界希
釈法によりクローニングした。限界希釈法は、ＨＴ培地
でハイブリドーマが５個／ｍｌとなるように稀釈した細
胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞
がウエルあたり２×１０４個分注してある９６ウエルプ
レートの各ウエルに１００μずつ分注した。約１０日
後、ＥＬＩＳＡ法によって、抗ＴＡＴ抗体を産生するハ
イブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結
果、各ハイブリドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生
クローンが得られた。これらのクローンの中から、増殖
のよい、抗体分泌能の高い、しかも安定なクローンを選
び、前述と同様の方法で再クローン化を行ない、“抗Ｔ
ＡＴ特異的抗体”産生ハイブリドーマＡＴ−１、ＡＴ−
２、ＡＴ−３、ＡＴ−４、およびＡＴ−５を樹立した。
実施例３（モノクローナル抗体の製造） （イン・ビトロ法） マウスハイブドーマＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ−３、Ａ
Ｔ−４、およびＡＴ−５を各々１５％ウシ胎児血清を含
むＤＭＥ培地中で３７℃，５％二酸化炭素雰囲気中７２
〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１００００×
ｇ，１０分）後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５０
％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下
３０分間撹拌した後６０分間放置し、遠心分離（１００
００×ｇ，１０分）後、得られた沈渣を少量の１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の
１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。これを、１０
ｍＭリン酸緩衝液ですでに平衡化したＤＥＡＥ−セルロ
ースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の間で
濃度勾配法により行なった。溶出されたモノクローナル
抗体を限外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に対して透析した。ウシ血清１ｇＧを除くた
めに、透析物をヤギ抗ウシ血清１ｇＧ−セファロース４
Ｂのカラムに通した。次に通過液を０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロ
ース４Ｂのカラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩
衝液で溶出して精製した抗ＴＡＴ抗体ＡＴ−１（同様に
してＡＴ−２、ＡＴ−３、ＡＴ−４、ＡＴ−５）の溶液
を得た。
Ｔ−４、およびＡＴ−５を各々１５％ウシ胎児血清を含
むＤＭＥ培地中で３７℃，５％二酸化炭素雰囲気中７２
〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１００００×
ｇ，１０分）後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５０
％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下
３０分間撹拌した後６０分間放置し、遠心分離（１００
００×ｇ，１０分）後、得られた沈渣を少量の１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の
１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。これを、１０
ｍＭリン酸緩衝液ですでに平衡化したＤＥＡＥ−セルロ
ースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の間で
濃度勾配法により行なった。溶出されたモノクローナル
抗体を限外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に対して透析した。ウシ血清１ｇＧを除くた
めに、透析物をヤギ抗ウシ血清１ｇＧ−セファロース４
Ｂのカラムに通した。次に通過液を０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロ
ース４Ｂのカラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩
衝液で溶出して精製した抗ＴＡＴ抗体ＡＴ−１（同様に
してＡＴ−２、ＡＴ−３、ＡＴ−４、ＡＴ−５）の溶液
を得た。
（イン・ビボ法） プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）０．５ｍｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に投与後１４〜２０日目のマウス腹腔内
にインビトロで増殖させたハイブリドーマＡＴ−１、Ａ
Ｔ−２、ＡＴ−３、ＡＴ−４またはＡＴ−５をマウス１
匹あたり２×１０６細胞となるように接種した。
デカン）０．５ｍｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に投与後１４〜２０日目のマウス腹腔内
にインビトロで増殖させたハイブリドーマＡＴ−１、Ａ
Ｔ−２、ＡＴ−３、ＡＴ−４またはＡＴ−５をマウス１
匹あたり２×１０６細胞となるように接種した。
各ハイブリドーマにつき１匹のマウスから約１０〜１５
ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜１０ｍｇ
／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製
（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカ
ラムを通す操作は除く。）は、上記のインビトロ精製法
と同様の方法で行なった。
ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜１０ｍｇ
／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製
（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカ
ラムを通す操作は除く。）は、上記のインビトロ精製法
と同様の方法で行なった。
実施例４（モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス
および特異性の同定） 抗ＴＡＴモノクローナル抗体ＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ
−３、ＡＴ−４およびＡＴ−５の免疫グロブリン・クラ
ス、及び特異性の同定は、各々オクテロニー免疫拡散
法、及びエンザイムノアッセイ法により行なった。
および特異性の同定） 抗ＴＡＴモノクローナル抗体ＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ
−３、ＡＴ−４およびＡＴ−５の免疫グロブリン・クラ
ス、及び特異性の同定は、各々オクテロニー免疫拡散
法、及びエンザイムノアッセイ法により行なった。
結果は次の第１表及び第１〜５図に示す通りである。
実施例５（アフィニティクロマトグラフィー） 精製された抗ＴＡＴモノクローナル抗体ＡＴ−１（また
はＡＴ−２、ＡＴ−３、ＡＴ−４、ＡＴ−５）４ｍｇを
ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ１ｍｌに結合させたも
のを免疫吸着剤として使用した。
はＡＴ−２、ＡＴ−３、ＡＴ−４、ＡＴ−５）４ｍｇを
ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ１ｍｌに結合させたも
のを免疫吸着剤として使用した。
「実施例１」の方法で精製したＴＡＴ、あるいはＴＡＴ
混合溶液をＡＴ−１（またはＡＴ−２、ＡＴ−３、ＡＴ
−４、ＡＴ−５）結合セファロース４Ｂ（１．０ｍｌ）
カラムに充填し、次に０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ８．０）で洗浄する。ＡＴIII
とトロンビンは、この洗浄後中に１００％回収された。
一方、カラムに吸着されたＴＡＴを次の溶出溶媒で溶出
を試みた。
混合溶液をＡＴ−１（またはＡＴ−２、ＡＴ−３、ＡＴ
−４、ＡＴ−５）結合セファロース４Ｂ（１．０ｍｌ）
カラムに充填し、次に０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ８．０）で洗浄する。ＡＴIII
とトロンビンは、この洗浄後中に１００％回収された。
一方、カラムに吸着されたＴＡＴを次の溶出溶媒で溶出
を試みた。
ａ）４．５Ｍ ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．５） ｂ）リン酸−クエン酸，ｐＨ２．８ ｃ）グリシン／Ｈｃｌ，ｐＨ２．５ ｄ）３Ｍチオシアン酸カリウム溶液 ＴＡＴを有する画分を、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析後、
各画分のＴＡＴの含量を定量した。結果を第２表に示
す。
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析後、
各画分のＴＡＴの含量を定量した。結果を第２表に示
す。
実施例６（ラテックススライド凝集免疫定量法） 抗ＴＡＴモノクローナル抗体によるラテックス（日本合
成ゴム社製、０．４９７μｍ）の感作は次のような操作
で行った。
成ゴム社製、０．４９７μｍ）の感作は次のような操作
で行った。
５種類のモノクローナル抗体ＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ
−３、ＡＴ−４、ＡＴ−５、各々の濃度が０．１ｍｇ／
ｍｌの溶液１０ｍｌに、ラテックス濃度が１％（ｗ／
ｖ）になるようにラテックスを加え、２５℃で１時間激
しく撹拌する。次に、牛アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を０．２ｍｌ添加し、２５℃で３０分間激しく撹拌
後、遠心分離（２００００×ｇ，３０分間）を行なう。
沈渣を５０ｍｌの水に懸濁し、抗ＴＡＴモノクローナル
抗体感作ラテックスとして以下のラテックススライド凝
集免疫定量に用いた。
−３、ＡＴ−４、ＡＴ−５、各々の濃度が０．１ｍｇ／
ｍｌの溶液１０ｍｌに、ラテックス濃度が１％（ｗ／
ｖ）になるようにラテックスを加え、２５℃で１時間激
しく撹拌する。次に、牛アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を０．２ｍｌ添加し、２５℃で３０分間激しく撹拌
後、遠心分離（２００００×ｇ，３０分間）を行なう。
沈渣を５０ｍｌの水に懸濁し、抗ＴＡＴモノクローナル
抗体感作ラテックスとして以下のラテックススライド凝
集免疫定量に用いた。
スライド凝集板の各ウエルに感作ラテックス（０．２
％）２５μを添加し、次に、生理食塩水による２倍希
釈列の被検体２５μを加える。このスライド凝集板を
１００回転で１分間回転させ各ウエルの凝集の有無を測
定する。被検体中のＴＡＴの量は、同時に測定した２倍
希釈列の検量用複合体によるラテックス凝集反応の有無
から求める。
％）２５μを添加し、次に、生理食塩水による２倍希
釈列の被検体２５μを加える。このスライド凝集板を
１００回転で１分間回転させ各ウエルの凝集の有無を測
定する。被検体中のＴＡＴの量は、同時に測定した２倍
希釈列の検量用複合体によるラテックス凝集反応の有無
から求める。
実施例７（ワン・ステップ・サンドイッチ酵素免疫定量
法） 西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを抗ＴＡＴモノクローナ
ル抗体ＡＴ−１に結合させる方法は、ナカネおよびカワ
オイ（ジャーナル・オブ・ヒストメミストリー・アンド
・サイトケミストリー第２２巻 第１０８４〜１０９１
頁（１９７４年））の方法に準じて行った。この酵素ラ
ベル抗体を用いてＴＡＴのワン・ステップ・サンドイッ
チ酵素免疫定量を次のようにして行った。
法） 西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを抗ＴＡＴモノクローナ
ル抗体ＡＴ−１に結合させる方法は、ナカネおよびカワ
オイ（ジャーナル・オブ・ヒストメミストリー・アンド
・サイトケミストリー第２２巻 第１０８４〜１０９１
頁（１９７４年））の方法に準じて行った。この酵素ラ
ベル抗体を用いてＴＡＴのワン・ステップ・サンドイッ
チ酵素免疫定量を次のようにして行った。
抗ＴＡＴIIIモノクローナル抗体ＡＴ−２を２０ｍＭ炭
酸緩衝液中に１０μｇ／ｍｌの濃度にした溶液を、９６
ウエル平底型ポリスチレン製マイクロタイター・プレー
トに、１００μ入れて２５℃で３０分間静置した。そ
のプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食
塩水で３回洗浄した。このようにして得た抗体を感作し
たプレートのウエルに、５０μの被検体、及び上記で
調製したペルオキシダーゼ標識抗体、０．１５ＭＮａＣ
ｌ、及び２％ウシアルブミンを含む２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）１００μを加えた。２５℃で３０分
間静置後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含
む生理食塩水で３回洗浄した。次いで、酵素基質液（１
０ｍＭフェノール、２０ｍＭ ４−アミノアンチピリ
ン、及び０．００５％ 過酸化水素を含む液）２００μ
ずつをプレートのそれぞれのウエルに添加した。２５
℃で３０分反応後、各ウエルの液の４９０ｎｍにおける
吸光度をＭＰ−５９０型マイクロエライザ・ミニリーダ
ー（ダイナテック社製）で測定した被検体中のＴＡＴの
量は、同時に測定した検量用複合体の４９０ｎｍにおけ
る吸光度から描いた検量線から求めた。
酸緩衝液中に１０μｇ／ｍｌの濃度にした溶液を、９６
ウエル平底型ポリスチレン製マイクロタイター・プレー
トに、１００μ入れて２５℃で３０分間静置した。そ
のプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食
塩水で３回洗浄した。このようにして得た抗体を感作し
たプレートのウエルに、５０μの被検体、及び上記で
調製したペルオキシダーゼ標識抗体、０．１５ＭＮａＣ
ｌ、及び２％ウシアルブミンを含む２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）１００μを加えた。２５℃で３０分
間静置後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含
む生理食塩水で３回洗浄した。次いで、酵素基質液（１
０ｍＭフェノール、２０ｍＭ ４−アミノアンチピリ
ン、及び０．００５％ 過酸化水素を含む液）２００μ
ずつをプレートのそれぞれのウエルに添加した。２５
℃で３０分反応後、各ウエルの液の４９０ｎｍにおける
吸光度をＭＰ−５９０型マイクロエライザ・ミニリーダ
ー（ダイナテック社製）で測定した被検体中のＴＡＴの
量は、同時に測定した検量用複合体の４９０ｎｍにおけ
る吸光度から描いた検量線から求めた。
「発明の効果」 この発明の抗ＴＡＴモノクローナル抗体を使用すれば、
上述のごとく、ＴＡＴを感度よく定量することができ
る。また、この抗ＴＡＴモノクローナル抗体は、ＴＡＴ
吸着剤として有用である。
上述のごとく、ＴＡＴを感度よく定量することができ
る。また、この抗ＴＡＴモノクローナル抗体は、ＴＡＴ
吸着剤として有用である。
第１〜第５図は、それぞれ抗ＴＡＴモノクローナル抗体
（ＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ−３、ＡＴ−４、ＡＴ−
５）のトロンビン、ＡＴIII、およびＴＡＴとの結合力
を、９６ウエルマイクロタイター・プレートを用いてエ
ンザイムイムノアッセイ法で測定した結果を表すグラフ
図である。 Ｔ……トロンビン Ａ……アンチトロビンIII Ｂ……トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
（ＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ−３、ＡＴ−４、ＡＴ−
５）のトロンビン、ＡＴIII、およびＴＡＴとの結合力
を、９６ウエルマイクロタイター・プレートを用いてエ
ンザイムイムノアッセイ法で測定した結果を表すグラフ
図である。 Ｔ……トロンビン Ａ……アンチトロビンIII Ｂ……トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 3/20 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 馬場 光広 千葉市さつきが丘２―10―２―205 (56)参考文献 特開 昭52−108018（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，256，495−497（1975) Ｂｌｏｏｄ，65（５），1201−1207 （1985) (54)【発明の名称】 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれ を用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・ アンチトロンビン３複合体の精製方法
Claims (6)
- 【請求項１】トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
と特異的に反応し、遊離トロンビンおよび遊離アンチト
ロンビンIIIとは反応しないことを特徴とする抗トロン
ビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗
体。 - 【請求項２】トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
で免疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞との融
合によって形成され、トロンビン・アンチトロンビンII
I複合体と特異的に反応し、遊離トロンビンおよび遊離
アンチトロンビンIIIとは反応しないモノクローナル抗
体を分泌するハイブリドーマの培養物を分離・精製する
ことを特徴とする抗トロンビン・アンチトロンビンIII
複合体モノクローナル抗体の製造方法。 - 【請求項３】トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
と特異的に反応し、遊離トロンビンおよび遊離アンチト
ロンビンIIIとは反応しない抗トロンビン・アンチトロ
ンビンIII複合体モノクローナル抗体の１種または２種
以上を使用することを特徴とするトロンビン・アンチト
ロンビンIII複合体の免疫定量法。 - 【請求項４】免疫定量法が酵素免疫定量法である特許請
求の範囲第３項記載のトロンビン・アンチトロンビンII
I複合体の免疫定量法。 - 【請求項５】免疫定量法がラテックス凝集免疫定量法で
ある特許請求の範囲第３項記載のトロンビン・アンチト
ロンビンIII複合体の免疫定量法。 - 【請求項６】トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
と特異的に反応し、遊離トロンビンおよび遊離アンチト
ロビンIIIとは反応しない抗トロンビン・アンチトロン
ビンIII複合体モノクローナル抗体を担体に結合させた
ものを免疫吸着剤として用いることを特徴とするトロン
ビン・アンチトロンビンIII複合体の精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60279129A JPH0644876B2 (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60279129A JPH0644876B2 (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62138187A JPS62138187A (ja) | 1987-06-20 |
| JPH0644876B2 true JPH0644876B2 (ja) | 1994-06-15 |
Family
ID=17606834
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60279129A Expired - Lifetime JPH0644876B2 (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法 |
Country Status (1)
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| JP (1) | JPH0644876B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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-
1985
- 1985-12-13 JP JP60279129A patent/JPH0644876B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）Ｂｌｏｏｄ，６５（５），１２０１−１２０７（１９８５） |
Also Published As
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|---|---|
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