JPS61183299A - 人正常細胞由来の組織型プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−に対する新規なモノクロナル抗体およびそれによる精製法ならびに検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野）′ 本発明は、ヒト正常組織由来細胞の細胞培養液より採取
した組織型プラスミノーゲンアクチベータ−（以下、ｔ
−ＰＡと略称する）に対して特異性を有する新規なモノ
クロナル抗体およびその使用に関する。

（従来の技術） リンパ球細胞と咄乳動物（たとえば、マウスやラット）
に由来する骨髄腫細胞との間の融合は、試験管内におい
て増殖し、複製可能な雑種細胞を産み出すこと（Ｋｏｈ
ｌｅｒ　ａｎｄ旧１ｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　２５
６＋４９５−４９７頁、　１９７５年）を可能にした。

このような９（ｔ、種細胞は、予め決った特異性のある
均一な抗体（モノクロナル抗体）を分泌するという特質
を有することから、種々のホルモン、蛋白質等に対する
モノクロナル抗体を産生ずる雑種細胞を作製し、それら
により産生されたモノクロナル抗体を種々の研究に利用
する試みがなされてきた。

（Ｂ、　Ｄａｌｅ　５ｅｒｖｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ、２７．
　Ｎｏ、１１．１７９７〜１８０６．１９８］）　、　
しかし、ヒト正常細胞由来のｔ−ＰＡに対するモノクロ
ナル抗体については、いかなる知見もなかった。

ブラスミノ−ゲンアクチヘーターとしては今日、尿また
は培養腎細胞から分離精製されたウロキナーゼ、および
ストシブ１〜コツキより採取されるストレプトキナーゼ
が血栓溶解剤として実用に供されている。

しかし、これらはフィブリンに対する親和性の点で劣る
ので、治療に際し必要な効果を得るには大量に投与する
場合が多く、内出血等の副作用が発現することが知られ
ている。すなわち、これらによって循環血液中で生成さ
れるプラスミンは、血中のプラスミンインヒビタ−と結
合して速やかに失活するため、治療効果をあげるために
は、これらを大量に投与して、血中のプラスミンインヒ
ビタ−の量を上回るプラスミンを生成する必要がある。

しかし、大量のプラスミンが生成されるとフィブリノー
ゲンを分解して、出血傾向という副作用を引き起すこと
になる。これに対しフィブリンに親和性が高く、フィブ
リン上でプラスミンを生成することができれば、循環血
液中のプラスミンインヒビタ−の影響を受けることなく
、少量でフィブリンを分解することができ、循環血液中
のフィブリノーゲンを分解する作用も弱くなる。かかる
実情からフィブリン親和性が高く、少量でかつ血栓）容
解活性が高く、副作用の少ない血栓溶解剤が望まれてい
る。

一方、近年フィブリン親和性の高いブラスミノ−ゲンア
クチヘーターが大黒色腫細胞培養液より分離精製されて
いる（特開昭５７−２８００９号公報参照）。しかしな
がら、これは腫瘍細胞を原料とするものであるから、抗
原性、発癌性に問題があり、実用に供し得ないものであ
る。

これに対して、最近、ヒト正常組織由来の細胞培養液よ
り、下記の性質を有するｔ−ＰＡが見出され、分離精製
された（特開昭５９−５１２２０号）。

ａ）分子量：　　６３，０００　±１０，０００ｂ）等
電点；７．０〜８．５ Ｃ）フィブリンに対する親和性：あり ｄ）コンカナバリンＡに対する親和性：ありｅ）至適ｐ
　Ｈ：　７〜９．５ ｆ）抗ウロキナーゼ特異抗体と反応しないｔ−ＰＡの大
きな利点は、フィブリンに対する親和性が極めて高く、
また、ヒト正常細胞培＃液より分離したものであるから
、」二連した各種プラスミノ−ゲンアクチヘーターの種
々欠点を有しない副作用の少ない血栓溶解剤となり得る
ことである。

また、大黒色腫細胞由来のプラスミノーゲンアクチヘー
ターでは、人血清アルブミン添加による安定化効果がな
い　（Ｔｈｒｏｍｂ　Ｉｌａｅｍｏｓｔａｓ、　４８ｔ
’３号、２９４〜２９６頁、　１９８２年）のに対して
、ｔ−ＰＡでは安定化効果があり、長期保存、凍結乾燥
による失活がないなど、大黒色腫細胞由来のプラスミノ
−ゲンアクチヘータ−とは種々の異なる性質を有するも
のである。

（発明が解決しようとする問題点） ｔ−ＰＡの取得法としては、適当な生育培体中で人の正
常ｒＵ　ＩＮ由来細胞、たとえば、人胎児の腎、腸、肺
、心臓、輸尿管、皮膚、包皮および全胎児由来の細胞、
人の胎盤由来の細胞あるいは人の腎、腸、肺、甲状腺、
心臓、輸尿管、皮膚由来の細胞等を用いたＭｉ織培養液
、特に好ましくは、人胎児の腎、肺および包皮由来の細
胞を用いた組織培養液を、蛋白質化学において通常使用
される方法、たとえば、担体による吸着法、イオン交換
法、分別沈ｌ殿法、ケル濾過法、電気泳動法、各種アフ
イニテイクロマトグラフイ−を組み合わせることにより
精製する方法等を挙げることができる。しかし、培養液
中のｔ−ＰＡは微量であり、また、ｊｍ常使用される各
種クロマト法では、ｔ−ＰＡとの特異的結合も弱く、高
純度のｔ−ＰＡを取得することば回動であり、加えて回
収率も満足のいくものではなかった。故に、高純度の１
．−ＰＡを高回収率で取得する特異的精製法の開発が望
まれている。

一方、血栓症等の治療に際して、ｔ−ＰＡの作用機構の
研究、血中レヘルの確認等の手段として、ｔ−ｐへの高
感度検出法の開発が望まれている。

現在、ｔ−ＰＡの測定法としては、メラノーマ由来のプ
ラスミノ−ゲンアクチヘーターを抗原としで調製したモ
ノクロナル抗体を用いる方法が報告され（特開昭５９−
５１２１号参照）、また、ｔ＝ＰＡのポリクロナル抗体
を用いるサンドウィッチ酵素免疫測定法（ＥＬ［ＳＡ）
によるキットが市販されている（　Ｂｉｏｐｏｏ１社製
、　　Ｂｉｏｐｏｏｌ　　　ｔ　−Ｐ　ＡＥＬＩＳＡ　
　ｋｉｔ）。しかしながら、これらの方法は、ｔ−ＰＡ
に対する特異性が劣るため、感度、精度の面で満足なも
のでなく、改良が望まれている。

（問題点を解決するだめの手段） 本発明者らは、これらの問題点を克服するためａ意研究
を重ねた結果、細胞融合によりｔ−ＰＡに対して特異性
を有するモノクロナル抗体を取得することに成功し、こ
のモノクロナル抗体を用いれば、１段階で高純度高収率
にｔ−ＰＡを精製できることを見出し、本発明を成すに
至った。また、該モノクロナル抗体は免疫定量等に用い
ることができ、かつ保存した雑種細胞を培養すれば、い
つでも均一な該モノクロナル抗体を大量に取得できるな
ど工業的に非常に有用である。

すなわち、本発明は、ヒト正常組織由来細胞の細胞培養
液より採取したｔ−ＰＡに対して特異性を有するモノク
ロナル抗体およびその使用に関す】０ るものである。

本発明により得られるモノクロナル抗体は、ｔ−ＰＡの
フィブリン親和性部位に特異的に結合する性質を有する
ものであるが、本発明と同様の方法により、異なる抗原
決定部位に対する反応性を有するモノクロナル抗体が得
られる。

すなわち、（１）線維素溶解活性発現部位に４′１．異
的に結合するモノクロナル抗体（抗体が結合するとブラ
スミノーケンアクチヘーターの綿維素ン容解ン占性が消
失するが、フィブリン親和性は保持している）、（２）
フィブリン親和性部位に特異的に結合するモノクロナル
抗体（抗体が結合するとプラスミノ−ケンアクチヘータ
−のフィブリン親和性が消失するが、綿糾素溶解活性を
保持ビている）、（３）上記［１１ｆ２＋］ソ外の抗原
決定部位に結合するモノクロナル抗体（抗体が結合して
も綿維素溶解活性およびフィブリン親和性になんら影響
を示さない）が得られる。

上記のような異なる抗原決定基に対し、特異的に結合す
るモノクロナル抗体を組合せて使用することにより、よ
り感度の高いｔ−ＰＡの測定方法が提供される。

以下、細胞融合方法について具体的に説明を加える。

（ａ＋　　抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は、常法に準じて行えばよい。すな
わち、抗原であるｔ−ＰＡで動物を免疫し、その動物の
抗体産生細胞を取得する方法によればよい。

動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモツＩ・
、ヒツジ、ウマ、ウシなどが例示され、抗体産生細胞と
しては肺細胞、リンパ節細胞、末梢血管細胞などが使用
される。

ｆｂｌ　　骨髄腫細胞の調整 細胞融合方法において使用される骨髄腫細胞には特に限
定はなく、多くのマウス、ラット、ウサギ、ヒトなどの
動物の細胞株が適用できる。使用する細胞株は、好まし
くは薬剤抵抗性のものであって、未融合の骨髄腫細胞が
選択培地で生存できず、雑種細胞のみが増夕１６するよ
うにずべきである。

最も９１ｍに用いられるものは、８−アザグアニン抵抗
性の細胞株で、これはヒボキサンチン・グアニン・ホス
ホリポシル・トランスフェラーゼを欠損し、ヒボキザン
チンーアミノプリテンーチミジン（ＨＡＴ）培地中では
生育できない性質を有する。また、使用する細胞株は、
いわゆる「非分泌型」のものであることが好ましい。た
とえば、マウス骨髄腫株５Ｐ−１またはマウス骨髄腫株
ＭＯＰＣ−２１由来のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１　　（
ＰｚＵｌ）、Ｐ　３／　Ｘ６３　　Ａ　ｇ・６・５・３
、Ｐ３／ＮＳＩ　　Ｔ−Ａｇ、ｋｌ、Ｓｐ２１０−Ａｇ
１４、ラット骨髄腫細胞２１０・ＲＣＹ３・Ａｇｌ　・
２・３などが好適に用いることができる。

（Ｃ１細胞融合 通常、イーグル最小基本培地（ＭＥＭ）　、ロズウエル
・パーク・メモリアル・インステイチュート（Ｒ））　
Ｍ　Ｔ　）　１６４０培地などの培地中で１〜５×１０
７個の骨髄腫細胞と抗体産生細胞１〜５Ｘ］Ｏ”個を混
合（混合比は通常１：４〜１：１０）、細胞融答が行わ
れる。融合促進剤としては、平均分子量が１　、０００
〜６，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が好
ましいが、他にウィルスなども使用できる。ＰＥＧの使
用濃度はｊＭ常３０〜５０％である。

ｆｄｌ　　雑種細胞の選択的増殖 細胞融合を終えた細胞は、１０〜２０％ウシ胎児血清含
有ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地などで適当に希釈し、マ
イクロプレートに１０５〜１０６程度に植えつける。

各ウェルに選択培地（たとえば、■■ＡＴ培地）を加え
、以後適当に選択培地の交換を行ない、培養する。骨髄
腫細胞として８−アザグアニン抵抗性株を用いれば、未
融合の骨髄腫細胞は、ＨＡＴ培地中では１０日目ぐらい
までに全部死滅し、また、抗体産生細胞は正常細胞であ
るから、インビトロ（ｉ　ｎ　　ｖ　ｉ　ｔ　ｒ　ｏ）
では長時間生育できない。

したがって、培養１０〜１４日ぐらいから生育してくる
ものはすべて雑種細胞である。

ｔｅｌ　　抗体産生雑種細胞の検索 雑種細胞のスクリーニングは常法によればよく、特に限
定はない。たとえば、雑種細胞の増殖したウェルの−１
−清の−・部を採取し、ｔ−Ｐ　Ａと反応させたのち、
酵素、ラジオアイソト−プケイ光物質、発光物質で標識
した第２抗体との反応に３Ｌつで標識量を測定し、抗ヒ
Ｉ−組織型プラスミノーゲンアクチヘータ−の存在を検
定することができる。

（「）りｌコーニング 各ウェル中には２種以上の雑種細胞が生育している可能
性があるので、限界希釈法などによりクローニングを行
ない、モノクロナル抗体産生雑種細胞を取得する。

ＩＫ）　　抗体取得 最も純粋なモノクロナル抗体は、所望の雑種細胞を１０
％程度のウシ胎児血清を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培
地などの適当な培養液で培養し、その培養り清液から得
ることができる。

一方、さらに大量の抗体を取得するためには、骨髄腫細
胞の由来動物と同系の動物にプリスタン（２，６，１０
，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹
腔内投すし、その後、雑種細胞を投与するごとにより、
インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）で雑種細胞を大量に増殖
さセればよい。この場合、１０〜１８日位で腹水腫瘍を
形成し、血清および）復水中に高濃度の抗体が生ずる。

（ｈｌ　　モノクロナル抗体の精製 腹水からの抗ヒｌ−１１ｔ　ＩＮ型プラスミノーゲンア
クチヘ−ターモノクロナル抗体の精製は、通常の血清か
らの抗体の回収方法に準じた方法、たとえば、Ｉｊｕ　
ｄ　ｓ　ｏ　ｎら　（Ｐｒａｃｔｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ＋　Ｂｌａｃｋ＋ｖｅｌｌ　Ｓｃｉ。

Ｐｕｂ、、　１９７６年）を適用することができる。

抗原物質として精製したｔ−ＰＡＯ力価測定は、次の方
法で行なった（以下の実験についても同様）。

９５％凝固フィブリノーゲン（プラスミノーゲン含量約
５０カセイン単位／　ｇ　？Ｊｌ固蛋白）を原料として
作製した寒天力ｌフィブリン平板を用い、ウロキナーゼ
を標準品とするブレート法で測定した。Ｌ−ＰＡ熔液を
、０．５％ウシ血清アルブミン、０．１塩化す１−リウ
ムおよび０．１％窒化ナトリウムを含む０．０５Ｍへロ
ナール酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，８）で希釈し、フィブリン
平板上でｌ０ＩＵ／ｍｌのウロキナーゼと同じ溶解窓を
示す本発明に用いるプラスミノーゲンアクチヘータ＝ン
容ン１女の７農度を１００／ｍｌとした。

本発明によれば、人正常細胞由来のｔ−ＰＡに対して特
異性があることを特徴とするモノクロナル抗体が雑種細
胞系によって提供される。

かくして得られた抗ヒト組織型プラスミノーゲンアクチ
ヘークーモノクロナル抗体は、不溶性担体と化学的に結
合する免疫吸着クロマトグラフィーに付すごとにより、
ｔ−ＰＡｔ＃製に利用することができる。すなわち、カ
ラムに充填された該不溶性担体とｔ−ＰＡを含む人正常
細胞由来培養液またはこれらの粗精製溶液を接触ゼしめ
ることにより、ｔ　−１）　Ａは該不溶性担体に固定さ
れてカラムに保持される。次に、ｐＨ５〜９の洗浄液で
該不溶性担体を洗浄して未吸着不純物質を除去し、続い
て溶離液にて該不溶性担体から吸着したｔ−ＰＡを溶離
ゼしめる。ここで用いられる不溶性担体、不溶性担体と
抗ヒト組織型プラスミノ−ゲンアクチヘーターモノクロ
ナル抗体との結合方法、溶離液等は、通常のアフィニテ
ィークロマトグラフィーに用いられるものならどのよう
なものでも通用することができる。

（発明の効果） 本発明の抗体を用いれば、人正常細胞由来培養液またば
これらの和積製ｔ　−Ｐ　Ａ溶液中に含まれる不純物を
１段階で容易に分離除去することができ、極めて高い純
度のｔ−ＰＡを高回収率で取得することができる。

さらに、該不溶性担体はｔ−ＰＡを脱着せしめたのち、
洗浄液で洗浄するだけで何回でも使用することができる
ので、ｔ　−Ｐ　Ａ精製工程に簡便さを与えることがで
きるなど多くの利点を有し、工業的に極めて有用である
。また、本発明心こおける抗ヒト組織型プラスミノーゲ
ンアクチヘーターモノクロナル抗体の異なる利用方法と
しては、臨床等におけるｔ−ＰＡの免疫定量が挙げられ
る。ｔ〜ＰＡの血中での作用機構の研究など、凝固線溶
系の解析に該モノクロナル抗体を導入することにより１
．感度の高い微量定量が可能になる。

（実施例） 実施例１ 抗原の精製 人胎児腎糾織培養液４ｐに硫安を３００ｇ／ｎの割合で
加え、４℃下−晩装置する。生じた沈澱を濾過で集め、
１Ｍ塩化ナトリウムを含む１Ｍロダンアンモニウム溶液
で溶解する。得られた溶解液は液量４００ｍ１．　ｔ　
−Ｐ　Ａの活性は２ＩＴＪ／ｍｌ、比活性は１．ＯＵ　
／　Ａ　２８０であった。これをフェニールセファロー
スカラム（Ｉ　Ｘ　１０ｃｍ）に吸着させた後、エチレ
ングリコールを５０％程度まで濃度勾配法で増加させ、
ｔ−ＰＡを溶出する。溶出液は液量１５０ｍ１、ｔ−Ｐ
Ａの活性は５２１Ｊ／ｍｌ、比活性ば２５０　Ｕ　／　
Ａ　２　Ｒｏであった。

この溶出液は０．１％ツイン８０を含む生理食塩水で透
析し、抗つロキナーゼＩｇ−Ｇセファロースカラムを１
Ｍ過させた後、アルギニンセファロースカラム（１，５
Ｘ］Ｏｃｍ　）に連続的に吸着させる。０．１％ツイン
８０を含む０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で充分洗浄後、
０．１％ツイン８０を含む０．５Ｍアルギニン？容液で
ｔ−ＰＡをン容出する。この？容ン夜は、液量５２ｍ１
、ｔ−ＰＡの活性は９ＦＩＵ／ｍｌ、比活性は３２００
ｔＪ　／　Ａ　ｚｅｏであった。

これを凍結乾燥で凍縮後、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０
．１Ｍアルギニン、０．１Ｍ　　ＥＤＴΔおよび０．１
％ツイン８０を含む０．０１　Ｍリン酸緩衝’／＆　（
ｐ　Ｈ７，０）で平衡化したセファデックスＧ−１５０
のカラム（１，５Ｘ１００ｃｍ　）でケル濾過して活性
のある部分を集める。得られた？容液は？夜間１５ｍ１
、Ｉ−Ｐ　Ａの活性は２７０Ｕ／ｍｌ、比活性は１２５
００　Ｕ　／　Ａ　２１１０であった。

マウスの免疫 上述の如く精製したｔ−ＰＡ１００μｇをフロイント・
コンプリー１・・アジュバントに乳濁化させ、マウスＢ
　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ♂群の皮下に２週間の間隔をあけ
て３回投与し、免疫を行なった。これらのマウスの中で
、ｔ、−ＰＡに対する血清抗体価が最も高いマウスにｔ
−ｐＡ１００μｇを静脈内注射し、免疫を完了した。

細胞融合 最終免疫の３日後にマウスを殺し、肺臓を取り出し、細
断した後、ナイロンメツシュで圧迫、濾過し、イーグル
ス・ミニマム・エツセンシャル・メディウム（ＭＥＭ）
に浮遊させ、牌臓細胞浮遊液を得た。この肺細胞とマウ
ス骨髄腫細胞５Ｐ−１をそれぞれ血清を含有しないＭＥ
Ｍで３回洗浄し、肺細胞と５Ｐ−１とを１０＝１で混合
して遠心後（８００回転、５分）沈澱を軽くはくし、４
４％ポリエチレングリコール２０００／　Ｍ　Ｅ　Ｍ溶
液１ｍｌを徐々に加え、３７°Ｃ湛水中で１分間遠心管
をゆっくり回転させて細胞融合を行なった。１分後ＭＢ
Ｍ１ｍｌを加えてゆっくり回転させ、さらに毎分２ｍｌ
の割合でＭＥＭを添加し、計１０ｍ１とした後、１００
０回転、５分間遠心して上清を除去した。この細胞沈澱
物を１０％ウシ胎児血清含有ロズウエル・パーク・メモ
ルアル・インステイチュート（ＲＰＭＩ）１６４０培地
に５Ｐ−１がｌＸｌ０６個／ｍｌになるように懸濁し、
９６ウエルマイクロプレート　（ヌンク社製）に０．１
ｍｌずつ植えつけた。

１日後、ＨＡＴ（ヒボキサンチンｌＸｌ０−’Ｍ、アミ
ノプリテン４　Ｘｌ０−７Ｍ、チミジン１．６　Ｘ　１
０−５Ｍ）を含んだＲＰ　Ｍ　Ｔ　１６４（１−１０％
ＦＣ３培地（ＨＡＴ培地）を各ウェルに０．１ｍ１．ず
つ添加し、その後、３〜４日毎に１／２量をＨＡ　Ｔ培
地で交換して、ＨＡ　Ｔ　３択を進めた。雑種細胞は７
日月ぐららいくつかのウェルで生育が認められ、１０〜
１４日後にはほぼ全ウェルで雑種細胞が増殖した。

抗体産生細胞の検索 雑種細胞が増殖した穴の培養液を分取し、Ｅｎｚｙｍｅ
Ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ
　　（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ）によりｔ−ＰＡに対する抗
体産生雑種細胞を調べた。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡは　Ｊｅａｎ−Ｌｕｃ　Ｇｕｅｓｄｏｎ
（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ。

ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　２７．１１３Ｌ　１９７９）のビ
チオン−アビジン系を用いた。９６穴マイクロプレート
にｔ−ＰＡを０．０５μｇ　／１００　μｌ／ｌ／性分
、２５°Ｃで１８時間静置して、ｔ−ＰＡを固相に吸着
させた。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２００μｌで３回
洗浄した後、０．５％生血清アルブミンを含むＰＢＳ２
００μｌを加え、０℃で一晩静置し、各穴の未吸着部分
をブｌコックした。

次いで、検体である培養液を１００μ７！／穴を入れ、
３７℃で２時間反応させた。０．０５％ｌ□　’Ｊ　Ｌ
　７Ｘ１００を含むＰ　１３　Ｓで３回洗浄後、ヒチオ
ン化−ヤキ抗マウスＴｇＧ（ＥＹラボラトリ−社製）］
００ｘノア！／穴を加え、３７℃で１時間反応さ−ロだ
。

ン先ン’ｌＩｉ＆、ワリーヒパーオキシダービーアヒ゛
シン（ＥＹラポラｌリ−社製）１００７！ｇ／穴を加え
、１時間後Ｐ　Ｂ　Ｓ　−１−リドンで洗浄し、０．０
０１％過酸化水素、　０．１５ｍｇ／ｍｌ　　Ａｚｉｎ
ｏ−ｈｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔ旧ａｚｏｌｉ
ｎｅ　−６、６−５ｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）（平井
化学薬品社製）の０．１Ｍクエン酸−水酸化ナトリウム
緩１！ｉ液（ｐＨ４，０）を加え、波長４１４ｎｍでの
吸光度を測定した。検体中、ｔ−ＰＡに対する抗体が存
在した穴にのみ発色が見られる。

ｔ　−Ｐ　Ａに対する単一抗体産生細胞のクローニング ＥＬＩＳＡで陽性を示したマイクロプレー１・の穴の雑
種細胞を取り出し、細胞の数を測定した。

１０％ウシ胎児而清添加ＲＰＭ１１６４０培地で希釈し
、マイクロプレー１〜に０．５個／穴の割に接種した。

マイクロプレートは前日、マウスの腹腔細胞をｆｅｅｄ
ｅｒ　ｃｅｌｌ　として２×１０５個／ｍ＋接種、培養
したものを用いた。培地を交換しながら、約２週間注意
深く培養を続け、雑種細胞のコ１コニー形成を待った。

雑種細胞が増殖し、コロニーの出現した穴の抗体産生量
をＥＬＩＳＡで測定し、陽性を示した雑種細胞を再度ク
ローニングした。

抗体産生能の高いクローン細胞Ｘ−２１およびＸ−２３
が得られた。

ｉｎ　　ｖｉｖｏによるｔ−ＰＡに対する単一抗体の作
製 ７週令以りのＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ，系マウスにプリ
スタン（アルトリンチ礼製）　０．５ｍｌを腹腔内投与
し、１週間以上経過した後、ｉｎνｉｖｏで培養、増殖
させた雑種細胞（Ｘ−２３）１〜９×１０′１個／マウ
スを腹腔内接種した。雑種細胞（Ｘ−２３）を接種した
１週間後から、マウスの体重は急激に増加し、１０〜１
５日にピークに達した。体重がピークの前後にマウスを
エーテル麻酔下に層殺し、腹水を採取した。これを３，
０００ｒｐｍ　　１０分間遠心分離し、５〜１５ｍ１．
／匹のモノクロナル抗体含有腹水を得た。

実施例２ モノクロナル抗体の精製 実施例１で得られた腹水１０ｍ１から、ＩＩ　ｕ　ｄ　
ｓ　ｏ　ｎら（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉ、　Ｐｕｂ、＋１９
７６年）の方法に準してモノクロナル抗体を精製した。

まず、腹水１０ｍ１に飽和硫酸アンモニウム溶液５ｍｌ
　（１／３％飽和）を加え、４℃下−晩装置する。

生じた沈澱を遠心分離し、Ｏ，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
　Ｈ８）　ｌｏｍｌで溶解し、１００量倍の同緩衝液に
一晩透析した。透析後１０　、０００回転、５分間遠心
分離して上澄み液を分取した。このザンブルを充分量の
０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化しておいた
ＤＥＡＥ　）コパール６５０Ｍカラム（東洋曹達社製）
　２０ｍ１にかけ、Ａｚｓ。が０．０２以下になるまで
０．０１Ｍ＋−リス緩衝液（ｐＨ８）で洗浄した後、当
該溶液から０．２Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃβを含む０．０１Ｍ
　）リス緩衝液（ｐＨ８）まで直線的に濃度を変え、該
モノクロナル抗体を分画溶出した。モノクロナル抗体分
画はＥＩＡによる抗体活性およびＳ　ＯＳ　−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法により決定し、続いて、リン
酸緩衝食塩水で平衡化したセファデックスＧ−２００カ
ラム（ファルマシア社製）を用いて分画溶出し、Ｘ−２
３モノクロナル抗体７３ｍｇを得た。

実施例３ モノクロナル抗体の物理化学的性質 以下の物性は、実施例２で精製したモノクロナル抗体（
Ｘ−２３）を用いて測定した。

ａ）分子量：　　１．５３，０００±５，０００５〜１
０％の濃度勾配ゲルによる５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルスラブ電気泳動をＬａｅｍｍｌｉの緩衝液系を用い
て行ない、モノクロナル抗体の分子量を推定した。分子
量マーカーは旧。Ｒａｄ社ノ５ＤＳ−ＰＡＧＥ標準分子
量マーカー（ｌｌｉｇｈ）　（ミオシン２００　Ｋ　、
　　β−ガラクトシダーゼ１１６．２５　Ｋ。

ボスフオリラーゼ８９２．５　Ｋ、ウシ面清アルブミン
６６．２　Ｋ、オボアルブミン４５Ｋ）を用いた。

ｂ）ＩｇＧザブクラス：ＩｇＧ］ １　／１５Ｍリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，２）にアガ「
Ｊ−スを１％加え、煮沸溶解後スライドグラスに５ｍｌ
のせて固化した。直径３ｍｍの穴を３ｍｍ間隔で開け、
各穴に腹水化に成功した雑種細胞の培養液またはヤギで
作製したマウス抗体に対する抗血清（抗マウスＴｇ）の
各種類を１５μｌ入れた。スライドグラスを湿潤箱に入
れ、室温で１８時間静置し、培養液と抗マうスＴｇを入
れた２穴間に抗原抗体反応による沈降線の形成を観察し
た。

Ｃ）等電点：ｐＴ＝６．６〜６．９ Ｔ、、　Ｋ　Ｂ−カラ１、等重点電気泳動装置を用い、
１■程度の部分精製したモノクロナル抗体を添加し、ｐ
Ｈ３，５〜９．５のアンボラインキャリア：アンホライ
１−（１，１＜Ｂ社製）存在下で４℃、定電圧７００Ｖ
、４０〜６０時間通電し、定常状態となったところで、
１ｍｌずつ分画した。水冷下でｐ　Ｈ測定後、２８０ｎ
ｍの吸光度とｔ−ＰＡに対する特異的抗体の検出をモノ
クロナル抗体のスクリーニング法を利用して測定した。

結果を第１図に示す。

ｄ）抗原との結合部位：フィブリン親和性部位実施例１
および２と同様にして製造したＸ−２１モノクロナル抗
体およびＸ−２３モノクロナル抗体を用い、ｔ−ＰＡと
抗原抗体反応させた後、フィブリンプレート法で残存す
る線維素溶解活性を測定した。結果を表１に示す。

表１ Ｘ−２１Ｘ−２３ 残存活性（％）　　　　１００　　　　　２５」二記の
抗原抗体反応液をり、Ｉｌ、Ｈｅｅｎｅらの方法に準じ
て作製したフィブリンセファロースカラム（Ｔｈｒｏｍ
ｂ、　Ｒｅｓ、−ｇ　１３７〜１５４（１９７３）　）
に付し、０．３Ｍアルギニン・塩酸を加えた生理食塩液
に溶出させ、溶出液の線維素溶解活性をフィブリンプレ
ート法にて測定した。結果を表２に示す。

表２ 線維素溶解活性（％） ？容出ン＆　　　ｔ”Ｐへ単独　　　ｔ、　−ｐ八−Ｘ
　−２１，ｔ−ＰＡ−Ｘ−２３通過画分　　２０　　　
　　　２３　　　’　　　　　８６溶出画分　　８０　
　　　　　７７　　　　　　　１４ｅ）　アミノ酸配列
（Ｎ末端） 配列解析ばＥｄｍａｎ分解（Ｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、
、１ＥｕｒｏｐｅａｎＪ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　Ｌ　Ｆ
Ｈ’ｌ、　］９９６７年に基いて行なった。

検体を気相プロティンシーケンサ−（ＡｐｐｌｉｅｄＢ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、　Ｍｏｄｅｌ　４７０　Ａ）
のカー１−リッジに導入し、予め作成したプログラムを
用いて自動的にｃｏｕｐｌｉｎｇ、、ｃｌｅａｖａｇｅ
およびｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ反応を行なった。得られた
ＰＴＴ（（フェニルチオヒダントイン）−アミノ酸をア
セトニトリル／　ｔｌ　２０　／ＴＦＡ　　日・リフル
オロ酢酸）　−３３／６７１０．０２　（Ｖ／Ｖ／Ｖ）
に溶解し、逆相高圧液体クロマトグラフ（カラム＝４．
６φＸ　３０ｃｍ、センシュー科学製５ＥＱ−４）に注
入し、その保持時間を標ｉ１ｉ　ｐ　ＴＨ−アミノ酸の
保持時間と比較することによって各Ｐ　Ｔ　Ｉ（−アミ
ノ酸を同定した。

得られたアミノ酸配列は下記のとおりである。

１７鎖：Ａｓｐ−１］　］ｅ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ
−Ｇｉｎ３ｅｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔ
ｙｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−１、、ｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌｕ
−Ａｒｇ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｔ　Ｉ　ｅ　−Ｔｈｒ−
Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ　＝
Ｈ鎖：　　（Ｐｃａ）　−Ｉ　Ｉ　ｅ−Ｇｌｎ−ＬＣａ
−Ｖａ　ｌ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ−Ｔ＋ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｈｒ−Ｖａ　ｌ−１，ｙｓ−１１ｅ−３ｅｒ−（
式中、括弧ジオ推定残基、Ｘば未同定残基、Ｐｃａはピ
ロリドンカルボン酸を表わす。） ｆ）各種プラスミノーゲンアクチヘーターとの交叉反応
性 ヒト尿由来つロキナーゼおよびＣｏ１ｅ　Ｅ、Ｒ等の方
法に準じて調製した（　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２
５２　３７２９−３７３７　１９７７）ブタ心臓抽出プ
ラスミノーゲンアンクチベーターとの反応性をＥＬＩＳ
Ａ（ビチオン−アビジン系）により調べた。Ｘ−２１モ
ノクロナル抗体はｔ−ＰＡのみと結合し、その他のウロ
キナーゼ、ブタ心臓抽出プラスミノーゲンアクチベータ
−とは反応しなかった。

実施例４ 免疫吸着クロマトグラフィーによるｔ−ＰＡの精製 人胎児腎細胞培養液５！！に硫酸アンモニラｌ、３１１
０　ｇ　／　７！を加え、４℃で一晩放置する。生した
沈澱を遠心分離し、０．１％ツイン８０．１Ｍ塩化すト
リウムを含む０．０２Ｍ＋−リス塩酸緩衝液で熔解透析
する。得られた熔解液は、液堅４８０ｍ１　、活性３５
ＬＪ／ｍｌであった。この粗精製液を限外２！ｆ過で約
５０倍に濃縮した後、０．Ｏ１％ツ・イン８０．１Ｍ塩
化すＩ・リウＪ、を含む０．０２Ｍ　＋・リス塩酸緩衝
液で洗浄したＸ−２３モノクロナル抗体結合セファロー
ス４Ｂ（抗体３ｍｇ／印１担体）カラムに、濃縮液５ｍ
ｌをｉｆｆ！した。未吸着分を洗浄除去後、カラムに吸
着保持されたｔ−ＰＡを、５０％エチレングリニ１−）
し、０．０１％ツイン８０を含む０．１Ｍグリシン・塩
酸（ｐ　Ｉｆ２．５）で溶出した。溶出した分画の吸光
度Ａ２ＲＯとｔ−ＰＡ活性の関係を第２図に示した。

粗精製液と溶出分画の性質は表３のとおりであった。

表３ サンプル　　　活性（Ｕ／ｍｌ）　　回収率（％）オ■
精製液　　　　７８００　　　　　　１００溶出分画　
　　　７７００　　　　　　９８実施例５ モノクロナル抗体を用いたＥＬＴＳＡによるｔ−ＰＡの
定量 実施例１および２にしたがって製造したモノクロナル抗
体Ｘ−２１およびＸ−２３を用いて、ＥＬＦＳＡ用試薬
を調製した。

（］）］西洋ワサビパーオキシダーセ）−ＴＲＰ）標識
モノクロナル抗体−Ｆａｂ’　の作製Ｓ、Ｙｏｓｈｉｔ
ａｋｅ　らの方法（，１，Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、Ｑ２．
１４１３〜１４２４．１９８２）に準じて、モノクロナ
ル抗体Ｘ−２３１ｇＧ　３０ｍｇをペプシン消化し、セ
ファデックスＧ−１００を用いゲル濾過して、Ｆ　（ａ
ｂ’）ｚ分画を分取した。得られたＦ（ａｂ’）ｚの緩
衝液溶液にβ−メルカプ１−エチルアミンを加え、３７
℃で２時間還元処理した後、セファデックスＧ−２５を
用いて分画し、Ｆａｂ“］５ｍｇを採取した。マレイミ
ド化ＴＩ　ＲＰ　ｌ０ｍｇとＦ”ａｂ’　を混合し、４
°Ｃで２０時間反応させた後、０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化したセファクリルＳ−
２００を用いて精製し、２８０ｎｍおよび４０３ｎｍの
吸光度を測定し、吸収極大部分の分画を分取した。

＋２１　　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ測定系 ９６穴平底マイクロプレートの各ウェルに０．０５Ｍ炭
酸ナトリウム（ｐＨ９，６）に溶解したモノクロナル抗
体Ｘ−２１を２００μβずつ添加した。２５°Ｃで３時
間湿潤箱でインキュベートし、溶液を捨てた後、０．０
５％ツイン２０を含むＰＢＳ溶液を各ウェルに注ぎ、数
分間振盪洗浄し、溶液を捨てた。ｔ−ＰＡを０．１％Ｂ
ＳＡを含むＰＢＳ／ツイン溶液で希釈し、２００μβず
つ各ウェルに注加し、２５゛Ｃで１６時間反応さゼ”だ
。先と同様にＰＢＳ／ツイン溶液で洗浄した後、ＨＲＰ
標識モノクロナル抗体Ｘ−２３−Ｆａｂ″　のＰＢＳ／
ツイン希釈を容ン夜を２００μｌ添加し、２５℃で３時
間反応させた後、溶液を捨てた。洗浄後、酵素基質とし
て、０．０１％過酸化水素、Ｏ−フェニレンジアミン（
０，４ｍｇ／ｍｌ）を含むりエン酸リン酸ナトリウム緩
衝液（ｐ　＋−１５，０）　２００μｌを添加し、２５
゛Ｃで３０分間反応させた。４．５Ｍ硫酸５０μβを加
え、反応を停止にさせた後、４９２ｎｍの吸光度を測定
した。

（３）測定系の感度 各種濃度のｔ−Ｐ　Ａ　（０，０４〜０．００１２５０
／ｍ＋）を用い、１０回測定した平均値で検量線を作成
した。

結果を第３図に示す。

この結果から、本測定系を用いれば、ｔ−ＰＡＯ，００
２Ｕ／ｍｌまでは定量可能である。

実施例６ ヒト血液中のｔ−ＰＡの定量 実施例５で調製したＥＬ　Ｔ　ＳＡにより、人血液中の
ｔ−ＰＡの定量を行なった。検体はＢｅｒｇｓｄａｒｆ
らの方法（Ｔｒｏｍｂ、　ｌｌａｅｍｏｓｔ、　５Ｑ＋
　７４０〜７４４．１９８３）に準じて調製した。クエ
ン酸加採血した血液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、　１
５分）して得た血、漿２５メツβに、１Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐ　Ｈ３，９）２５μｌを加え、室温で１時
間放置する。０．１Ｍリン酸酸水素ナナトリウム−０，
４Ｎ水酸化１〜リウム水？６　ｔ＆を５０μρ加え中和
した後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ／ツイン溶液４０
０μβを加え２０倍希釈液とし、検体とした。健常人２
２名より採血し、ｔ−ＰＡの定量を行なった。結果を第
４図に示す。

この結果から、健常人血液中のｔ−ＰＡは、平均０．２
２２±０．０１１（Ｓ　Ｄ）　ＴＪ／ｍｌ　（８，８８
ｍｇ／ｍｌ）であった。　　　□

【図面の簡単な説明】

第１図はＸ−２３モノクロナル抗体の等電点電気泳動結
果と抗体活性の相関を示した図表、第２図はＸ−２３モ
ノクロナル抗体を用いた免疫吸着クロマトパターンであ
り、各溶出分画（横軸）の吸光度（Ａ２＋１０）とｔ−
ＰＡ活性の相関を示した図表、第３図はＸ−２３モノク
ロナル抗体を用いたＥＬＴＳＡによる検量線の図表、第
４図は健常人血液中のｔ−ＰＡの量を測定した結果を示
す図表である。 溶出分画 ｔ　−ＰＡ　１８度　　　（Ｕ／ｒＪ）第４図 手続補正書 １右利６０年３月１４日 一許庁長官　志賀　学　殿 １　事件の表示 ％願昭６０−２１８６２号 発明の名称 人正常細胞由来の組織型プラスミノーゲンアクチベータ
ーに対する新規なモノクロナル抗体およびそれによる′
ｎＩ製法ならびに検出床 補正をする者 事件との関係・特許出願人 興和株式会社

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）人の正常組織由来細胞の細胞培養液より採取した
   組織型プラスミノーゲンアクチベーターに対する下記の
   性質を有するモノクロナル抗体。 ａ）分子量：１５３，０００±５，０００ ｂ）ＩｇＧサブクラス：ＩｇＧ１ ｃ）等電点：６．６〜６．９ ｄ）抗原との結合部位：フィブリン親和性部位 ｅ）Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域Ｎ末端アミノ酸配列 Ｌ鎖：【アミノ酸配列があります】 Ｈ鎖：【アミノ酸配列があります】 （式中、括弧は推定残基、Ｘは未同定残基、Ｐｃａはピ
   ロリドンカルボン酸を表わす。）
2. （２）免疫吸着クロマトグラフィーによる人正常細胞由
   来の組織型プラスミノーゲンアクチベーターの精製に当
   り、人の正常組織由来細胞の細胞培養液より採取した組
   織型プラスミノーゲンアクチベーターに対する下記の性
   質を有するモノクロナル抗体を使用することを特徴とす
   る精製法。 ａ）分子量：１５３，０００±５，０００ ｂ）ＩｇＧサブクラス：ＩｇＧ１ ｃ）等電点：６．６〜６．９ ｄ）抗原との結合部位：フィブリン親和性部位 ｅ）Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域Ｎ末端アミノ酸配列 Ｌ鎖：【アミノ酸配列があります】 Ｈ鎖：【アミノ酸配列があります】 （式中、括弧は推定残基、Ｘは未同定残基、Ｐｃａはピ
   ロリドンカルボン酸を表わす。）
3. （３）人正常細胞由来の組織型プラスミノーゲンアクチ
   ベーターの検出に当り、人の正常組織由来細胞の細胞培
   養液より採取した組織型プラスミノーゲンアクチベータ
   ーに対する下記の性質を有するモノクロナル抗体を使用
   することを特徴とする検出法。 ａ）分子量：１５３，０００±５，０００ ｂ）ＩｇＧサブクラス：ＩｇＧ１ ｃ）等電点：６．６〜６．９ ｄ）抗原との結合部位：フィブリン親和性部位 ｅ）Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域Ｎ末端アミノ酸配列 Ｌ鎖：【アミノ酸配列があります】 Ｈ鎖：【アミノ酸配列があります】 （式中、括弧は推定残基、Ｘは未同定残基、Ｐｃａはピ
   ロリドンカルボン酸を表わす。）