JP2837030B2 - 抗ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体特異抗体及び免疫学的測定方法 - Google Patents
抗ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体特異抗体及び免疫学的測定方法Info
- Publication number
- JP2837030B2 JP2837030B2 JP4184467A JP18446792A JP2837030B2 JP 2837030 B2 JP2837030 B2 JP 2837030B2 JP 4184467 A JP4184467 A JP 4184467A JP 18446792 A JP18446792 A JP 18446792A JP 2837030 B2 JP2837030 B2 JP 2837030B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmin
- ppi
- human
- monoclonal antibody
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトプラスミン−α2
−プラスミンインヒビター複合体（Ｐｌａｓｍｉｎ−α
2 −Ｐｌａｓｍｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｍｐｌ
ｅｘ：以下ＰＰＩの略称を用いることがある）と特異的
に反応するが、ヒトプラスミン及びヒトα2 −プラスミ
ンインヒビターとは反応しないモノクローナル抗体、及
びそのモノクローナル抗体を用いたＰＰＩの免疫学的測
定方法に関する。更に詳しくは、本発明は、血漿検体を
希釈することなく、血漿中に存在するＰＰＩを、共存す
るヒトプラスミノーゲン及びヒトα2 −プラスミンイン
ヒビターの妨害を受けることなく、正確にしかも再現性
良く、免疫学的に測定する方法に関する。
−プラスミンインヒビター複合体（Ｐｌａｓｍｉｎ−α
2 −Ｐｌａｓｍｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｍｐｌ
ｅｘ：以下ＰＰＩの略称を用いることがある）と特異的
に反応するが、ヒトプラスミン及びヒトα2 −プラスミ
ンインヒビターとは反応しないモノクローナル抗体、及
びそのモノクローナル抗体を用いたＰＰＩの免疫学的測
定方法に関する。更に詳しくは、本発明は、血漿検体を
希釈することなく、血漿中に存在するＰＰＩを、共存す
るヒトプラスミノーゲン及びヒトα2 −プラスミンイン
ヒビターの妨害を受けることなく、正確にしかも再現性
良く、免疫学的に測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ：Ｄｉ
ｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ
ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）患者の血漿中や、ウロキナー
ゼ又はティッシュプラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−
ＰＡ）を用いた血栓溶解療法実施中の患者血漿中では、
プラスミノーゲンが活性化されてプラスミンが生成され
る。生成されたプラスミンは、流血中では瞬時にα2 プ
ラスミンインヒビター（α2 ＰＩ：青木ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１，５９５６−５９６５，１９７
６）と１：１の複合体、即ち前記のＰＰＩを形成する。
従って、ＰＰＩを測定することにより、プラスミンの生
成、即ち、線溶系活性化の事象を把握することができ
る。最近、血漿中のＰＰＩはＤＩＣの診断及び血栓溶解
療法のモニター等の分子マーカーとして重要視されてい
る。そのため、血液あるいは血漿中のＰＰＩの量を正確
かつ簡単に測定する必要がある。
ｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ
ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）患者の血漿中や、ウロキナー
ゼ又はティッシュプラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−
ＰＡ）を用いた血栓溶解療法実施中の患者血漿中では、
プラスミノーゲンが活性化されてプラスミンが生成され
る。生成されたプラスミンは、流血中では瞬時にα2 プ
ラスミンインヒビター（α2 ＰＩ：青木ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１，５９５６−５９６５，１９７
６）と１：１の複合体、即ち前記のＰＰＩを形成する。
従って、ＰＰＩを測定することにより、プラスミンの生
成、即ち、線溶系活性化の事象を把握することができ
る。最近、血漿中のＰＰＩはＤＩＣの診断及び血栓溶解
療法のモニター等の分子マーカーとして重要視されてい
る。そのため、血液あるいは血漿中のＰＰＩの量を正確
かつ簡単に測定する必要がある。
【０００３】従来から知られているＰＰＩ測定法として
は以下の４つの方法を挙げることができる。第１の方法
は、二次元交又免疫電気泳動法を用いる方法である。第
２の方法は、ＰＰＩのネオアンチゲンを認識するポリク
ローナル抗体を用いたラテックス凝集法である。第３の
方法は、プラスミノーゲンに対するポリクローナル抗体
とα2 −プラスミンインヒビターに対するポリクローナ
ル抗体の両者を用い、その一方を固定化抗体とし、他方
を酵素標識抗体とした、酵素免疫測定法である。第４の
方法は、α2 −プラスミンインヒビターに存在するプラ
ミスンの繊維素溶解作用を阻止する部位を特異的に認識
するモノクローナル抗体とプラスミンポリクローナル抗
体の両者を用い、その一方を固定化抗体とし、他方を酵
素標識抗体とし、血漿検体を１２００倍に希釈して測定
する酵素免疫測定法である。
は以下の４つの方法を挙げることができる。第１の方法
は、二次元交又免疫電気泳動法を用いる方法である。第
２の方法は、ＰＰＩのネオアンチゲンを認識するポリク
ローナル抗体を用いたラテックス凝集法である。第３の
方法は、プラスミノーゲンに対するポリクローナル抗体
とα2 −プラスミンインヒビターに対するポリクローナ
ル抗体の両者を用い、その一方を固定化抗体とし、他方
を酵素標識抗体とした、酵素免疫測定法である。第４の
方法は、α2 −プラスミンインヒビターに存在するプラ
ミスンの繊維素溶解作用を阻止する部位を特異的に認識
するモノクローナル抗体とプラスミンポリクローナル抗
体の両者を用い、その一方を固定化抗体とし、他方を酵
素標識抗体とし、血漿検体を１２００倍に希釈して測定
する酵素免疫測定法である。
【０００４】しかしながら、第１の方法には、感度が低
く定量性に欠けるという欠点があった。第２の方法に
は、ＰＰＩを特異的に測定できないという欠点があっ
た。第３の方法は、感度は良好であるが、抗血清の安定
な確保が困難であり、免疫反応が２工程であるので操作
が煩雑で、測定に長時間を要するという欠点があった。
第４の方法は、α2 −プラスミンインヒビターに対する
モノクローナル抗体を使用する点及び免疫反応を１工程
で操作する点で前記の第３の方法が改良されているが、
酵素免疫反応が有する欠点、即ち、操作が煩雑で測定に
長時間を要するという問題点を解消するものではなかっ
た。更に、第４の方法には、１工程の免疫反応を導入す
るために、検体を１２００倍に希釈する工程が必要にな
るという欠点もあった。
く定量性に欠けるという欠点があった。第２の方法に
は、ＰＰＩを特異的に測定できないという欠点があっ
た。第３の方法は、感度は良好であるが、抗血清の安定
な確保が困難であり、免疫反応が２工程であるので操作
が煩雑で、測定に長時間を要するという欠点があった。
第４の方法は、α2 −プラスミンインヒビターに対する
モノクローナル抗体を使用する点及び免疫反応を１工程
で操作する点で前記の第３の方法が改良されているが、
酵素免疫反応が有する欠点、即ち、操作が煩雑で測定に
長時間を要するという問題点を解消するものではなかっ
た。更に、第４の方法には、１工程の免疫反応を導入す
るために、検体を１２００倍に希釈する工程が必要にな
るという欠点もあった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、ＰＰＩを
簡便に、正確にそして再現性よく測定する方法を開発す
るべく鋭意研究をした結果、ＰＰＩに反応性を示す第１
のモノクローナル抗体（特には、ＰＰＩ Ｎｏ．５
０）、ＰＰＩ及びプラスミノーゲンの両者に反応性を示
す第２のモノクローナル抗体（特には、ＰＰＩ Ｎｏ．
３）の、２種のモノクローナル抗体を見出した。従っ
て、本発明は、新たに見出したモノクローナル抗体を利
用して、ＰＰＩを簡便に、正確にそして再現性よく測定
する方法を提供するものである。
簡便に、正確にそして再現性よく測定する方法を開発す
るべく鋭意研究をした結果、ＰＰＩに反応性を示す第１
のモノクローナル抗体（特には、ＰＰＩ Ｎｏ．５
０）、ＰＰＩ及びプラスミノーゲンの両者に反応性を示
す第２のモノクローナル抗体（特には、ＰＰＩ Ｎｏ．
３）の、２種のモノクローナル抗体を見出した。従っ
て、本発明は、新たに見出したモノクローナル抗体を利
用して、ＰＰＩを簡便に、正確にそして再現性よく測定
する方法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、受託番
号がＦＥＲＭ Ｐ−１３００１であるハイブリドーマか
ら分泌され、ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒ
ビター複合体と特異的に反応するが、ヒトプラスミン及
びヒトα２−プラスミンインヒビターとは反応しないモ
ノクローナル抗体に関する。
号がＦＥＲＭ Ｐ−１３００１であるハイブリドーマか
ら分泌され、ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒ
ビター複合体と特異的に反応するが、ヒトプラスミン及
びヒトα２−プラスミンインヒビターとは反応しないモ
ノクローナル抗体に関する。
【０００７】更に、本発明は、前記のモノクローナル抗
体を第１のモノクローナル抗体として不溶性担体に固定
し、この固定化された第１のモノクローナル抗体と被検
試料とを接触させ、続いて前記の第１のモノクローナル
抗体と異なる部位でヒトプラスミン−α２−プラスミン
インヒビター複合体に特異的に反応する、標識を付した
第２の抗体と接触させ、前記標識からの信号を検出する
ことを特徴とする、ヒトプラスミン−α２−プラスミン
インヒビター複合体の免疫学的測定方法に関する。
体を第１のモノクローナル抗体として不溶性担体に固定
し、この固定化された第１のモノクローナル抗体と被検
試料とを接触させ、続いて前記の第１のモノクローナル
抗体と異なる部位でヒトプラスミン−α２−プラスミン
インヒビター複合体に特異的に反応する、標識を付した
第２の抗体と接触させ、前記標識からの信号を検出する
ことを特徴とする、ヒトプラスミン−α２−プラスミン
インヒビター複合体の免疫学的測定方法に関する。
【０００８】本発明のモノクローナル抗体を分泌するハ
イブリドーマを作成する際に免疫原として用いるヒトＰ
ＰＩは、例えば、Ｐｌｏｗらの方法（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｍｅｄ．９３，１９９−２０９，１９７９）に従
って調製することができる。精製したヒトＰＰＩ免疫原
溶液を用いて、常法により、哺乳動物（例えば、マウス
又はラット）をイン・ビボ免疫法により免疫し、免疫動
物から脾臓を無菌的に取り出し、脾臓細胞を調製し、細
胞融合工程に用いる。細胞融合に用いるもう一方の親細
胞であるミエローマ細胞としては、各種の公知の細胞株
を使用することができる。
イブリドーマを作成する際に免疫原として用いるヒトＰ
ＰＩは、例えば、Ｐｌｏｗらの方法（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｍｅｄ．９３，１９９−２０９，１９７９）に従
って調製することができる。精製したヒトＰＰＩ免疫原
溶液を用いて、常法により、哺乳動物（例えば、マウス
又はラット）をイン・ビボ免疫法により免疫し、免疫動
物から脾臓を無菌的に取り出し、脾臓細胞を調製し、細
胞融合工程に用いる。細胞融合に用いるもう一方の親細
胞であるミエローマ細胞としては、各種の公知の細胞株
を使用することができる。
【０００９】免疫脾臓細胞とミエローマ細胞との細胞融
合は通常の方法で行うことができる。例えば、公知の融
合促進剤及び場合により補助剤の存在下で、免疫脾臓細
胞とミエローマ細胞とを、例えば、ミエローマ細胞に対
して脾臓細胞を約１〜１０倍程度の量で用いる。融合用
培地中で免疫脾臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合
し、続いて、選別用培地を用いてハイブリドーマ以外の
細胞を除去し、ハイブリドーマ培養上清の抗体産生の有
無を、例えば免疫沈降法により確認して、目的とするハ
イブリドーマを分離することができる。
合は通常の方法で行うことができる。例えば、公知の融
合促進剤及び場合により補助剤の存在下で、免疫脾臓細
胞とミエローマ細胞とを、例えば、ミエローマ細胞に対
して脾臓細胞を約１〜１０倍程度の量で用いる。融合用
培地中で免疫脾臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合
し、続いて、選別用培地を用いてハイブリドーマ以外の
細胞を除去し、ハイブリドーマ培養上清の抗体産生の有
無を、例えば免疫沈降法により確認して、目的とするハ
イブリドーマを分離することができる。
【００１０】こうして得られたハイブリドーマは、通常
の培地で継代培養することができ、液体窒素等の中で容
易に長期間保存することができる。また、ハイブリドー
マの培養培地は特に限定されず、好適にはＤＭＥＭにウ
シ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生
物質を含む培地が用いられる。ハイブリドーマの培養
は、イン・ビトロの場合には例えば培地中で５％ＣＯ2
濃度及び３７℃で約３日間、またイン・ビボ例えばマウ
スの腹腔中で培養する場合には約１４日間実施するのが
好ましい。
の培地で継代培養することができ、液体窒素等の中で容
易に長期間保存することができる。また、ハイブリドー
マの培養培地は特に限定されず、好適にはＤＭＥＭにウ
シ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生
物質を含む培地が用いられる。ハイブリドーマの培養
は、イン・ビトロの場合には例えば培地中で５％ＣＯ2
濃度及び３７℃で約３日間、またイン・ビボ例えばマウ
スの腹腔中で培養する場合には約１４日間実施するのが
好ましい。
【００１１】前記のハイブリドーマを常法によって培養
した培養液から、あるいはハイブリドーマを投与した適
当な哺乳動物（例えばマウス又はラット）の腹水から、
目的とするモノクローナル抗体を分離し、精製すること
が可能である。このようにして製造された培養液又はマ
ウスの腹水からモノクローナル抗体を分離、精製する場
合には、タンパク質の単離、精製に一般的に用いられる
方法、例えば、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィ
ー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロ
マトグラフィー、透析、凍結乾燥などを用いることがで
きる。
した培養液から、あるいはハイブリドーマを投与した適
当な哺乳動物（例えばマウス又はラット）の腹水から、
目的とするモノクローナル抗体を分離し、精製すること
が可能である。このようにして製造された培養液又はマ
ウスの腹水からモノクローナル抗体を分離、精製する場
合には、タンパク質の単離、精製に一般的に用いられる
方法、例えば、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィ
ー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロ
マトグラフィー、透析、凍結乾燥などを用いることがで
きる。
【００１２】こうして得られるヒトプラスミン−α2 −
プラスミンインヒビター複合体と特異的に反応するが、
ヒトプラスミン及びヒトα2 −プラスミンインヒビター
とは反応しないモノクローナル抗体を用いて、被検試料
中のＰＰＩを免疫学的に検出することができる。特に、
前記の特性をもつモノクローナル抗体を第１のモノクロ
ーナル抗体として固定化した不溶性担体と、標識を付し
た別の抗体（この抗体はモノクローナル抗体又はポリク
ローナル抗体であることができ、好ましくは第１のモノ
クローナル抗体と異なる部位でＰＰＩに特異的に反応す
るモノクローナル抗体を用いる）とによるサンドイッチ
ＥＩＡ法を好適に行うことができる。
プラスミンインヒビター複合体と特異的に反応するが、
ヒトプラスミン及びヒトα2 −プラスミンインヒビター
とは反応しないモノクローナル抗体を用いて、被検試料
中のＰＰＩを免疫学的に検出することができる。特に、
前記の特性をもつモノクローナル抗体を第１のモノクロ
ーナル抗体として固定化した不溶性担体と、標識を付し
た別の抗体（この抗体はモノクローナル抗体又はポリク
ローナル抗体であることができ、好ましくは第１のモノ
クローナル抗体と異なる部位でＰＰＩに特異的に反応す
るモノクローナル抗体を用いる）とによるサンドイッチ
ＥＩＡ法を好適に行うことができる。
【００１３】具体的には、前記第１のモノクローナル抗
体を適当な不溶性担体に固定化する（固定化抗体）。次
に、不溶性担体と検体試料との非特異的結合を避けるた
めに、適当な物質〔例えば、牛アルブミン（ＢＳＡ）や
ウサギアルブミン（ＲＳＡ）等〕で不溶性担体の表面を
被覆する。続いて、未希釈の検体試料を加えて一定時間
（例えば５分〜３時間）及び一定温度（例えば４°〜４
０°、好ましくは室温近辺）で接触させ反応させる（１
次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を
含む生理食塩水）で洗い、標識された抗体を加えて一定
時間（例えば５分〜３時間）及び一定温度（例えば４°
〜４０°、好ましくは室温近辺）で接触させ反応させる
（２次反応）。適当な洗浄液（例えば界面活性剤を含む
生理食塩水）で洗ってから、不溶性担体上に存在する標
識抗体の量を定量する。その値から、検体試料中のＰＰ
Ｉの量を算出することができる。また、１次反応と２次
反応を同時に行なうことも可能である。
体を適当な不溶性担体に固定化する（固定化抗体）。次
に、不溶性担体と検体試料との非特異的結合を避けるた
めに、適当な物質〔例えば、牛アルブミン（ＢＳＡ）や
ウサギアルブミン（ＲＳＡ）等〕で不溶性担体の表面を
被覆する。続いて、未希釈の検体試料を加えて一定時間
（例えば５分〜３時間）及び一定温度（例えば４°〜４
０°、好ましくは室温近辺）で接触させ反応させる（１
次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を
含む生理食塩水）で洗い、標識された抗体を加えて一定
時間（例えば５分〜３時間）及び一定温度（例えば４°
〜４０°、好ましくは室温近辺）で接触させ反応させる
（２次反応）。適当な洗浄液（例えば界面活性剤を含む
生理食塩水）で洗ってから、不溶性担体上に存在する標
識抗体の量を定量する。その値から、検体試料中のＰＰ
Ｉの量を算出することができる。また、１次反応と２次
反応を同時に行なうことも可能である。
【００１４】本発明の測定方法に使用することのできる
不溶性担体は特に限定されるものではなく、例えば、ポ
リエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化
ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素
樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分
子、その他ニトロセルロース、紙、アガロース及びこれ
らの組合せなどを例示することができる。
不溶性担体は特に限定されるものではなく、例えば、ポ
リエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化
ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素
樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分
子、その他ニトロセルロース、紙、アガロース及びこれ
らの組合せなどを例示することができる。
【００１５】標識物質としては酵素、螢光物質又は発光
物質を使用するのが有利である。酵素としてはアルカリ
ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼなど、また、螢光物質としてはフルオレセンイ
ソチオシアネートなど、また、発光物質としてはアクリ
ジニウムエステル、ルシフェリンなどを使用することが
できる。
物質を使用するのが有利である。酵素としてはアルカリ
ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼなど、また、螢光物質としてはフルオレセンイ
ソチオシアネートなど、また、発光物質としてはアクリ
ジニウムエステル、ルシフェリンなどを使用することが
できる。
【００１６】本発明の免疫学的定量方法に用いる被検試
料は、ＰＰＩを含有する可能性のある試料であれば特に
制限されるものではないが、例えば、生体試料、特には
血液、血清、血漿または尿、好ましくは血漿である。本
発明の免疫学的定量方法においては、被検試料を希釈せ
ずに、そのまま使用しても、被検試料中に遊離の状態で
存在するプラスミノーゲンおよびα2 −プラスミンイン
ヒビターの妨害を避けることができる。
料は、ＰＰＩを含有する可能性のある試料であれば特に
制限されるものではないが、例えば、生体試料、特には
血液、血清、血漿または尿、好ましくは血漿である。本
発明の免疫学的定量方法においては、被検試料を希釈せ
ずに、そのまま使用しても、被検試料中に遊離の状態で
存在するプラスミノーゲンおよびα2 −プラスミンイン
ヒビターの妨害を避けることができる。
【００１７】
【実施例】次に、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明は以下の実施例によって限定されるもの
ではない。実施例１：ＰＰＩの精製 （ａ）ヒトプラスミン−α2 −プラスミンインヒビター
複合体（ＰＰＩ）の精製はＰｌｏｗらの方法（Ｊ．Ｌａ
ｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．９３，１９９−２０９，１９７
９）に従って行った。簡単に説明すると、ヒト（健常
人）血漿１００ｍｌをリジン−セファロースカラム（ベ
ッド容量、１００ｍｌ）に通過させ、プラスミノーゲン
を除去した。プラスミノーゲン不含のこの血漿に、プラ
スミン水溶液（６０μｇ／ｍｌ）１００ｍｌを徐々に加
えた後、３７℃で１０分間保温した。反応後の水溶液を
リジン−セファロースカラム（ベッド容量、２００ｍ
ｌ）に通し、ＰＰＩを吸着させた。ＰＰＩ吸着カラムを
０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した
後、５０ｍＭε−アミノカプロン酸を含むＰＢＳでＰＰ
Ｉを溶出させた。更に、得られたＰＰＩをウルトロゲル
ＡＣＡ４４による分子篩クロマトグラフィーによって精
製した。この精製ＰＰＩを免疫原及び抗ＰＰＩモノクロ
ーナル抗体のスクリーニングに使用した。
するが、本発明は以下の実施例によって限定されるもの
ではない。実施例１：ＰＰＩの精製 （ａ）ヒトプラスミン−α2 −プラスミンインヒビター
複合体（ＰＰＩ）の精製はＰｌｏｗらの方法（Ｊ．Ｌａ
ｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．９３，１９９−２０９，１９７
９）に従って行った。簡単に説明すると、ヒト（健常
人）血漿１００ｍｌをリジン−セファロースカラム（ベ
ッド容量、１００ｍｌ）に通過させ、プラスミノーゲン
を除去した。プラスミノーゲン不含のこの血漿に、プラ
スミン水溶液（６０μｇ／ｍｌ）１００ｍｌを徐々に加
えた後、３７℃で１０分間保温した。反応後の水溶液を
リジン−セファロースカラム（ベッド容量、２００ｍ
ｌ）に通し、ＰＰＩを吸着させた。ＰＰＩ吸着カラムを
０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した
後、５０ｍＭε−アミノカプロン酸を含むＰＢＳでＰＰ
Ｉを溶出させた。更に、得られたＰＰＩをウルトロゲル
ＡＣＡ４４による分子篩クロマトグラフィーによって精
製した。この精製ＰＰＩを免疫原及び抗ＰＰＩモノクロ
ーナル抗体のスクリーニングに使用した。
【００１８】（ｂ）免疫化脾臓細胞の調製：ＰＰＩ免疫
原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量のフロインド氏
完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その混合液２
００μｌをＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内に投与するこ
とにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後、
前記と同様の混合液２００μｌを前記マウスの腹腔内に
投与した（第２回免疫）。第２回免疫から２１日経過
後、ＰＰＩ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量
の生理食塩水で希釈して調製したＰＰＩ希釈液２００μ
ｌを、前記マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最
終免疫から３日経過後、脾臓を無菌的にマウスから取り
出し、次の細胞融合工程に使用した。
原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量のフロインド氏
完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その混合液２
００μｌをＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内に投与するこ
とにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後、
前記と同様の混合液２００μｌを前記マウスの腹腔内に
投与した（第２回免疫）。第２回免疫から２１日経過
後、ＰＰＩ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量
の生理食塩水で希釈して調製したＰＰＩ希釈液２００μ
ｌを、前記マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最
終免疫から３日経過後、脾臓を無菌的にマウスから取り
出し、次の細胞融合工程に使用した。
【００１９】（ｃ）細胞融合 １５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシ
ャーレに、無菌的に抽出した前記の脾臓を入れた。次
に、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで
前記脾臓を還流して脾臓細胞を流出させた後、この脾臓
細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾臓細胞
を５０ｍｌ遠心チューブに集め、５００×ｇで１０分間
遠心した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液
（１５５ｍＭ−ＮＨ4 Ｃｌ、１０ｍＭ−ＫＨＣＯ3 、１
ｍＭ−Ｎａ2 ＥＤＴＡ：ｐＨ７．０）４ｍｌを加え、懸
濁させた。０℃で５分間放置して懸濁液中の赤血球を破
壊させた。１５％ウシ胎児血清１０ｍｌを含むＤＭＥ培
地を加えてから遠心分離した。こうして得たペレットを
ＤＭＥ培地で遠心法により洗浄し、生きている脾臓細胞
数を測定した。
ャーレに、無菌的に抽出した前記の脾臓を入れた。次
に、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで
前記脾臓を還流して脾臓細胞を流出させた後、この脾臓
細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾臓細胞
を５０ｍｌ遠心チューブに集め、５００×ｇで１０分間
遠心した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液
（１５５ｍＭ−ＮＨ4 Ｃｌ、１０ｍＭ−ＫＨＣＯ3 、１
ｍＭ−Ｎａ2 ＥＤＴＡ：ｐＨ７．０）４ｍｌを加え、懸
濁させた。０℃で５分間放置して懸濁液中の赤血球を破
壊させた。１５％ウシ胎児血清１０ｍｌを含むＤＭＥ培
地を加えてから遠心分離した。こうして得たペレットを
ＤＭＥ培地で遠心法により洗浄し、生きている脾臓細胞
数を測定した。
【００２０】一方、予め培養しておいたマウスミエロー
マ細胞（骨髄腫細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４（理化学研
究所ジーンバンク細胞銀行）約２×１０7 個に前記脾臓
細胞１×１０8 個を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し、
遠心分離を行った（５００×ｇ、１０分間）。その上清
を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、４０％ポリエチ
レングリコール４０００溶液（３８℃に保温）０．５ｍ
ｌを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏やかに回転す
ることによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレ
ットとを混合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤ
ＭＥ培地を３０秒毎に１ｍｌずつ加えて、チューブを穏
やかに回転させた。この操作を１０回繰り返した後、１
５％ウシ胎児血清２０ｍｌを含むＤＭＥ培地を加えて、
遠心分離（５００×ｇ、１０分間）を行った。上清を除
去した後、１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭ
Ｅ培地にアミノプテリン４×１０-7Ｍ、チミジン１．６
×１０-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように
添加したもの）で細胞ペレットを遠心法によって２回洗
浄した後、前記ＨＡＴ培地４０ｍｌに懸濁した。この細
胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレートの各ウエルに２
００μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養
器で３７℃にて培養を開始した。培養中、２〜３日間隔
で各ウエルの培地を約１００μｌ除き、新たに前記のＨ
ＡＴ培地１００μｌを加えることによりＨＡＴ培地中で
増殖するハイブリドーマを選択した。８日目から１５％
ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン
１．６×１０-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになる
ように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマを観察
するとともに、１０日目に、後記の免疫沈降法により、
ＰＰＩ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
マ細胞（骨髄腫細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４（理化学研
究所ジーンバンク細胞銀行）約２×１０7 個に前記脾臓
細胞１×１０8 個を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し、
遠心分離を行った（５００×ｇ、１０分間）。その上清
を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、４０％ポリエチ
レングリコール４０００溶液（３８℃に保温）０．５ｍ
ｌを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏やかに回転す
ることによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレ
ットとを混合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤ
ＭＥ培地を３０秒毎に１ｍｌずつ加えて、チューブを穏
やかに回転させた。この操作を１０回繰り返した後、１
５％ウシ胎児血清２０ｍｌを含むＤＭＥ培地を加えて、
遠心分離（５００×ｇ、１０分間）を行った。上清を除
去した後、１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭ
Ｅ培地にアミノプテリン４×１０-7Ｍ、チミジン１．６
×１０-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように
添加したもの）で細胞ペレットを遠心法によって２回洗
浄した後、前記ＨＡＴ培地４０ｍｌに懸濁した。この細
胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレートの各ウエルに２
００μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養
器で３７℃にて培養を開始した。培養中、２〜３日間隔
で各ウエルの培地を約１００μｌ除き、新たに前記のＨ
ＡＴ培地１００μｌを加えることによりＨＡＴ培地中で
増殖するハイブリドーマを選択した。８日目から１５％
ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン
１．６×１０-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになる
ように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマを観察
するとともに、１０日目に、後記の免疫沈降法により、
ＰＰＩ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
【００２１】（ｄ）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養液の上清における産生抗体の有無及
び特異性は、免疫沈降法により調べた。即ち、各ウエル
の培養上清５０μｌ（２００μｇ／ｍｌ）を、実施例１
（ａ）で調製した精製ＰＰＩと混合し、室温で２時間反
応させた。次に抗マウスイムノグロブリン抗体固定化セ
ファロース４Ｂ（ゲル１ｍｌ当たり１〜２ｍｇの抗体が
固定化されている）１００μｌと０．５Ｍ−ＮａＣｌを
含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）（以下緩
衝液Ａと称する）８００μｌを添加して混合し、４℃で
１晩転倒混和した。遠心分離法でゲルを緩衝液Ａにより
５回洗浄した後、ゲルを２％ＳＤＳ−２０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７．６）に懸濁し、室温で２時間転倒混和し
た。遠心分離（７００×ｇ、５分間、２０℃）した後、
上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３．５〜９．０％ゲル）にか
け、銀染色を行ってＰＰＩとの反応特異性を調べた。同
様に、ヒトプラスミノーゲン及びヒトα２−プラスミン
インヒビターとの反応性についても試験を行った。マー
カーとして、精製ＰＰＩ、精製ヒトプラスミノーゲン、
精製ヒトα２−プラスミンインヒビター及び分子量マー
カーを用いた。
び特異性は、免疫沈降法により調べた。即ち、各ウエル
の培養上清５０μｌ（２００μｇ／ｍｌ）を、実施例１
（ａ）で調製した精製ＰＰＩと混合し、室温で２時間反
応させた。次に抗マウスイムノグロブリン抗体固定化セ
ファロース４Ｂ（ゲル１ｍｌ当たり１〜２ｍｇの抗体が
固定化されている）１００μｌと０．５Ｍ−ＮａＣｌを
含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）（以下緩
衝液Ａと称する）８００μｌを添加して混合し、４℃で
１晩転倒混和した。遠心分離法でゲルを緩衝液Ａにより
５回洗浄した後、ゲルを２％ＳＤＳ−２０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７．６）に懸濁し、室温で２時間転倒混和し
た。遠心分離（７００×ｇ、５分間、２０℃）した後、
上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３．５〜９．０％ゲル）にか
け、銀染色を行ってＰＰＩとの反応特異性を調べた。同
様に、ヒトプラスミノーゲン及びヒトα２−プラスミン
インヒビターとの反応性についても試験を行った。マー
カーとして、精製ＰＰＩ、精製ヒトプラスミノーゲン、
精製ヒトα２−プラスミンインヒビター及び分子量マー
カーを用いた。
【００２２】このように免疫沈降法によって抗ＰＰＩ特
異的抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリ
ーニングすると、溶液中に自然な（天然の）状態で含ま
れるタンパク質抗原との反応性を観察することができ
る。即ち、スクリーニング法として一般に用いられるＥ
ＬＩＳＡ法では、タンパク質抗原を直接固相に結合させ
て抗体の特異性を見るので、固定化処理による人為的な
構造変化を認識する抗体を、天然の抗体に特異的に反応
するモノクローナル抗体であるとする間違った判断が度
々生じるが、前記の免疫沈降法はこうした誤認を防ぐこ
とができる。
異的抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリ
ーニングすると、溶液中に自然な（天然の）状態で含ま
れるタンパク質抗原との反応性を観察することができ
る。即ち、スクリーニング法として一般に用いられるＥ
ＬＩＳＡ法では、タンパク質抗原を直接固相に結合させ
て抗体の特異性を見るので、固定化処理による人為的な
構造変化を認識する抗体を、天然の抗体に特異的に反応
するモノクローナル抗体であるとする間違った判断が度
々生じるが、前記の免疫沈降法はこうした誤認を防ぐこ
とができる。
【００２３】前記のスクリーニングにより、各ハイブリ
ドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生クローンが得ら
れた。これらのクローンの中から、増殖力が強く、抗体
分泌能が高く、しかも安定なクローンを選び、前記と同
様の方法で再クローン化を行い、２種の抗ＰＰＩ抗体産
生ハイブリドーマＰＰＩ Ｎｏ．５０−１−１−１及び
ＰＰＩ Ｎｏ．３−１−２−２を樹立した。これら２種
のハイブリドーマから分泌される２種のモノクローナル
抗体ＰＰＩ Ｎｏ．５０及びＰＰＩ Ｎｏ．３とヒトプ
ラスミノーゲン（アテンズ・リサーチ社、アメリカ）あ
るいはヒトα2−プラスミンインヒビター（アテンズ・
リサーチ社、アメリカ）との反応性を前記の免疫沈降法
と同様の方法により調べた。モノクローナル抗体ＰＰＩ
Ｎｏ．５０はヒトプラスミノーゲンにも、ヒトα2 −
プラスミンインヒビターにも反応しなかった。モノクロ
ーナル抗体ＰＰＩ Ｎｏ．３はヒトプラスミノーゲンと
は反応したが、ヒトα2 −プラスミンインヒビターとは
反応しなかった。
ドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生クローンが得ら
れた。これらのクローンの中から、増殖力が強く、抗体
分泌能が高く、しかも安定なクローンを選び、前記と同
様の方法で再クローン化を行い、２種の抗ＰＰＩ抗体産
生ハイブリドーマＰＰＩ Ｎｏ．５０−１−１−１及び
ＰＰＩ Ｎｏ．３−１−２−２を樹立した。これら２種
のハイブリドーマから分泌される２種のモノクローナル
抗体ＰＰＩ Ｎｏ．５０及びＰＰＩ Ｎｏ．３とヒトプ
ラスミノーゲン（アテンズ・リサーチ社、アメリカ）あ
るいはヒトα2−プラスミンインヒビター（アテンズ・
リサーチ社、アメリカ）との反応性を前記の免疫沈降法
と同様の方法により調べた。モノクローナル抗体ＰＰＩ
Ｎｏ．５０はヒトプラスミノーゲンにも、ヒトα2 −
プラスミンインヒビターにも反応しなかった。モノクロ
ーナル抗体ＰＰＩ Ｎｏ．３はヒトプラスミノーゲンと
は反応したが、ヒトα2 −プラスミンインヒビターとは
反応しなかった。
【００２４】前記の各ハイブリドーマは工業技術院微生
物工業技術研究所に１９９２年６月１２日から寄託され
ている。受託番号は、ハイブリドーマＰＰＩ Ｎｏ．５
０−１−１−１が微工研菌寄第１３００１号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３００１）であり、ハイブリドーマＰＰＩ Ｎ
ｏ．３−１−２−２が微工研菌寄第１３００２号（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１３００２）である。
物工業技術研究所に１９９２年６月１２日から寄託され
ている。受託番号は、ハイブリドーマＰＰＩ Ｎｏ．５
０−１−１−１が微工研菌寄第１３００１号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３００１）であり、ハイブリドーマＰＰＩ Ｎ
ｏ．３−１−２−２が微工研菌寄第１３００２号（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１３００２）である。
【００２５】実施例２：モノクローナル抗体の製造 （ａ）イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマＰＰＩ Ｎｏ．５０−１−１−１
及びＰＰＩ Ｎｏ．３−１−２−２を、それぞれ１５％
ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で、３７℃で５％二酸化
炭素雰囲気中において７２〜９６時間培養した。培養物
を遠心分離（１００００×ｇ、１０分間）後、上清に固
形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるように徐
々に加えた。混合物を氷冷下で３０分間攪拌した後、６
０分間放置してから遠心分離（１００００×ｇ、１０分
間）処理し、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリ
ン酸緩衝液ですでに平衡化したＤＥＡＥ−セルロースの
カラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ−ＮａＣｌを
含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の間で濃度勾
配法により行った。溶出されたモノクローナル抗体を限
外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）に対して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、
透析物をヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂカラ
ムに通した。次に、通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４
Ｂカラムに充填した。カラムをｐＨ２．５の緩衝液で溶
出して、精製した抗ＰＰＩ特異モノクローナル抗体ＰＰ
Ｉ Ｎｏ．５０、及び同様にモノクローナル抗体ＰＰＩ
Ｎｏ．３の溶液を得た。
及びＰＰＩ Ｎｏ．３−１−２−２を、それぞれ１５％
ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で、３７℃で５％二酸化
炭素雰囲気中において７２〜９６時間培養した。培養物
を遠心分離（１００００×ｇ、１０分間）後、上清に固
形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるように徐
々に加えた。混合物を氷冷下で３０分間攪拌した後、６
０分間放置してから遠心分離（１００００×ｇ、１０分
間）処理し、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリ
ン酸緩衝液ですでに平衡化したＤＥＡＥ−セルロースの
カラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ−ＮａＣｌを
含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の間で濃度勾
配法により行った。溶出されたモノクローナル抗体を限
外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）に対して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、
透析物をヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂカラ
ムに通した。次に、通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４
Ｂカラムに充填した。カラムをｐＨ２．５の緩衝液で溶
出して、精製した抗ＰＰＩ特異モノクローナル抗体ＰＰ
Ｉ Ｎｏ．５０、及び同様にモノクローナル抗体ＰＰＩ
Ｎｏ．３の溶液を得た。
【００２６】（ｂ）イン・ビボ法 プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）０．５ｍｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃ系
マウスの腹腔内に投与し、それから１４〜２０日目のマ
ウスの腹腔内にインビトロで増殖されたハイブリドーマ
ＰＰＩ Ｎｏ．５０−１−１−１又はＰＰＩ Ｎｏ．３
−１−２−２をマウス一匹あたり２×１０6 個となるよ
うに接種した。各ハイブリドーマにつき一匹のマウスか
ら約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度
は、２〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモノクロー
ナル抗体の精製は、前記のイン・ビトロ精製と同様の方
法（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂの
カラムを通す操作を除く）で行なった。
デカン）０．５ｍｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃ系
マウスの腹腔内に投与し、それから１４〜２０日目のマ
ウスの腹腔内にインビトロで増殖されたハイブリドーマ
ＰＰＩ Ｎｏ．５０−１−１−１又はＰＰＩ Ｎｏ．３
−１−２−２をマウス一匹あたり２×１０6 個となるよ
うに接種した。各ハイブリドーマにつき一匹のマウスか
ら約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度
は、２〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモノクロー
ナル抗体の精製は、前記のイン・ビトロ精製と同様の方
法（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂの
カラムを通す操作を除く）で行なった。
【００２７】実施例３：モノクローナル抗体の免疫グロ
ブリンクラス及び特異性の同定 （ａ） 抗ＰＰＩ特異モノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎ
ｏ．５０及びＰＰＩ Ｎｏ．３の免疫グロブリンクラス
及び特異性の同定をそれぞれオクテロニー免疫拡散法及
びエンザイムイムノアッセイ法により行った。結果は表
１に示す通りである。
ブリンクラス及び特異性の同定 （ａ） 抗ＰＰＩ特異モノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎ
ｏ．５０及びＰＰＩ Ｎｏ．３の免疫グロブリンクラス
及び特異性の同定をそれぞれオクテロニー免疫拡散法及
びエンザイムイムノアッセイ法により行った。結果は表
１に示す通りである。
【００２８】
【表１】
【００２９】（ｂ）免疫沈降法によってモノクローナル
抗体ＰＰＩ Ｎｏ．５０及びＰＰＩＮｏ．３の特性を調
べた。即ち、前記実施例２で得た精製モノクローナル抗
体ＰＰＩ Ｎｏ．５０及びＰＰＩ Ｎｏ．３をブロムシ
アン化セファロース４Ｂ（ファルマシヤ社）に常法に従
って固定化した。ゲル１ml当たり１〜２mgの抗体が固定
化された。モノクローナル抗体固定化セファロース４Ｂ
ゲル（ＭｏＡｂゲル）と、各種の抗原試料、即ち、精製
ヒトプラスミノーゲン（アテンズ・リサーチ社）、α2
−プラスミンインヒビター（アテンズ・リサーチ社）、
ＰＰＩ〔前記実施例１（ａ）〕、血漿、及びウロキナー
ゼ処理血漿を混合し、下記の操作で免疫沈降法を行っ
た。前記抗原試料１００μｌと、前記の緩衝液Ａ７９０
μｌと、アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）（１００
ＴＩＵ／ml）１０μｌと、モノクローナル抗体ＰＰＩ
Ｎｏ．５０又はＰＰＩ Ｎｏ．３のＦ（ａｂ’）2 −セ
ファロース４Ｂの１００μｌとを混合し、５℃で１晩転
倒混和した。遠心分離でゲルを緩衝液Ａにより５回洗浄
し、２％ＳＤＳ−２０mM−トリス塩酸（pH７．６；２５
℃）にゲルを懸濁し、室温で２時間転倒混和した。更
に、遠心分離（７００×ｇ，５分，２０℃）して得た上
清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３．５〜９．０％ｇｅｌ）で分
離し、銀染色を行った。モノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎ
ｏ．５０とＰＰＩ Ｎｏ．３の反応性（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、銀染色）を図１に示す。マーカーとしては、精製Ｐ
ＰＩ、精製ヒトプラスミノーゲン、精製ヒトα2 −プラ
スミンインヒビター及び分子量マーカーを用いた。
抗体ＰＰＩ Ｎｏ．５０及びＰＰＩＮｏ．３の特性を調
べた。即ち、前記実施例２で得た精製モノクローナル抗
体ＰＰＩ Ｎｏ．５０及びＰＰＩ Ｎｏ．３をブロムシ
アン化セファロース４Ｂ（ファルマシヤ社）に常法に従
って固定化した。ゲル１ml当たり１〜２mgの抗体が固定
化された。モノクローナル抗体固定化セファロース４Ｂ
ゲル（ＭｏＡｂゲル）と、各種の抗原試料、即ち、精製
ヒトプラスミノーゲン（アテンズ・リサーチ社）、α2
−プラスミンインヒビター（アテンズ・リサーチ社）、
ＰＰＩ〔前記実施例１（ａ）〕、血漿、及びウロキナー
ゼ処理血漿を混合し、下記の操作で免疫沈降法を行っ
た。前記抗原試料１００μｌと、前記の緩衝液Ａ７９０
μｌと、アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）（１００
ＴＩＵ／ml）１０μｌと、モノクローナル抗体ＰＰＩ
Ｎｏ．５０又はＰＰＩ Ｎｏ．３のＦ（ａｂ’）2 −セ
ファロース４Ｂの１００μｌとを混合し、５℃で１晩転
倒混和した。遠心分離でゲルを緩衝液Ａにより５回洗浄
し、２％ＳＤＳ−２０mM−トリス塩酸（pH７．６；２５
℃）にゲルを懸濁し、室温で２時間転倒混和した。更
に、遠心分離（７００×ｇ，５分，２０℃）して得た上
清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３．５〜９．０％ｇｅｌ）で分
離し、銀染色を行った。モノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎ
ｏ．５０とＰＰＩ Ｎｏ．３の反応性（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、銀染色）を図１に示す。マーカーとしては、精製Ｐ
ＰＩ、精製ヒトプラスミノーゲン、精製ヒトα2 −プラ
スミンインヒビター及び分子量マーカーを用いた。
【００３０】実施例４：酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によ
るＰＰＩの測定 （ａ）固相抗体の調製 モノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎｏ．５０のＩｇＧ分画タ
ンパク濃度５μｇ／mlになるように５０mMリン酸バッフ
ァー生理食塩水（pH７．５）にて調製する。この抗体液
５０μｌずつを、９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉ
ｍｍｕｌｏｎII，日本ダイナテック）の各ウエルに分注
し、４℃で２４時間放置した。 （ｂ）標識抗体の調製 モノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎｏ．３のＩｇＧ分画を、
常法に従ってホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）で標識化し、標識抗体を得た。 （ｃ）検量線の作成 前記（ａ）で得られたモノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎ
ｏ．５０固定化９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートを０．
０５％Ｔｗｅｅｎ−２０生理食塩水で３回洗浄した後、
前記実施例１（ａ）の精製ＰＰＩ４０μｇ／ml、２０μ
ｇ／ml、１０μｇ／ml、５μｇ／ml、２μｇ／ml、１μ
ｇ／ml及び０．５μｇ／ml濃度の溶液５０μｌを各ウエ
ルに加え、２５℃で１０分間反応させた。０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ−２０−生理食塩水で３回洗浄した後、前記
（ｂ）のホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
標識モノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎｏ．３の０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０−５０mMリン酸緩衝液−生理食塩水
（pH７．５）溶液を５０μｌ加え、２５℃で１０分間反
応させた。次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−生理
食塩水で３回洗浄した後、ＨＲＰ用基質液〔０．５mMア
ミノアンチピリン、１０mMフェノール及び０．００５％
過酸化水素水を含む５０mMリン酸緩衝液（pH７．５）〕
２００μｌを各ウエルに加え、２５℃で１０分間反応さ
せ、各ウエルの４９０nmにおける吸光度を測定した。得
られた検量線を図２に示した。
るＰＰＩの測定 （ａ）固相抗体の調製 モノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎｏ．５０のＩｇＧ分画タ
ンパク濃度５μｇ／mlになるように５０mMリン酸バッフ
ァー生理食塩水（pH７．５）にて調製する。この抗体液
５０μｌずつを、９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉ
ｍｍｕｌｏｎII，日本ダイナテック）の各ウエルに分注
し、４℃で２４時間放置した。 （ｂ）標識抗体の調製 モノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎｏ．３のＩｇＧ分画を、
常法に従ってホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）で標識化し、標識抗体を得た。 （ｃ）検量線の作成 前記（ａ）で得られたモノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎ
ｏ．５０固定化９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートを０．
０５％Ｔｗｅｅｎ−２０生理食塩水で３回洗浄した後、
前記実施例１（ａ）の精製ＰＰＩ４０μｇ／ml、２０μ
ｇ／ml、１０μｇ／ml、５μｇ／ml、２μｇ／ml、１μ
ｇ／ml及び０．５μｇ／ml濃度の溶液５０μｌを各ウエ
ルに加え、２５℃で１０分間反応させた。０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ−２０−生理食塩水で３回洗浄した後、前記
（ｂ）のホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
標識モノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎｏ．３の０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０−５０mMリン酸緩衝液−生理食塩水
（pH７．５）溶液を５０μｌ加え、２５℃で１０分間反
応させた。次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−生理
食塩水で３回洗浄した後、ＨＲＰ用基質液〔０．５mMア
ミノアンチピリン、１０mMフェノール及び０．００５％
過酸化水素水を含む５０mMリン酸緩衝液（pH７．５）〕
２００μｌを各ウエルに加え、２５℃で１０分間反応さ
せ、各ウエルの４９０nmにおける吸光度を測定した。得
られた検量線を図２に示した。
【００３１】実施例５：精製ＰＰＩの添加回収試験 ５種の検体（健常人Ａ及びＢ、並びにＤＩＣ患者Ｃ，Ｄ
及びＥから採取した血漿）中のＰＰＩの定量を行い、次
いでそれぞれの検体に精製ＰＰＩ２．０μｇ／ml、４．
０μｇ／ml及び８．０μｇ／mlを添加し、添加回収試験
を行った。結果は表２に示すように、回収率９４〜１０
４％と良好であった。
及びＥから採取した血漿）中のＰＰＩの定量を行い、次
いでそれぞれの検体に精製ＰＰＩ２．０μｇ／ml、４．
０μｇ／ml及び８．０μｇ／mlを添加し、添加回収試験
を行った。結果は表２に示すように、回収率９４〜１０
４％と良好であった。
【００３２】
【表２】
【００３３】実施例６：健常人とＤＩＣ患者群のＰＰＩ
値 実施例５の測定法に準じ、健常人血漿１２検体、ＤＩＣ
患者血漿１５検体のＰＰＩを測定した。結果を図３に示
す。健常人群のＰＰＩ値は全例１μｇ／ml未満であっ
た。それに対してＤＩＣ患者群は全例２μｇ／ml以上で
あった。
値 実施例５の測定法に準じ、健常人血漿１２検体、ＤＩＣ
患者血漿１５検体のＰＰＩを測定した。結果を図３に示
す。健常人群のＰＰＩ値は全例１μｇ／ml未満であっ
た。それに対してＤＩＣ患者群は全例２μｇ／ml以上で
あった。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、血漿試料の希釈操作を
行わなくても、血漿中の遊離プラスミノーゲン及び遊離
α2 −プラスミンインヒビターの干渉を受けることな
く、患者血漿中のＰＰＩを特異的に、正確かつ迅速に測
定することができる。これは、本発明によって初めて可
能になったものである。従って、本発明はＤＩＣ等の診
断及び病理研究に有用な手段を提供するものである。
行わなくても、血漿中の遊離プラスミノーゲン及び遊離
α2 −プラスミンインヒビターの干渉を受けることな
く、患者血漿中のＰＰＩを特異的に、正確かつ迅速に測
定することができる。これは、本発明によって初めて可
能になったものである。従って、本発明はＤＩＣ等の診
断及び病理研究に有用な手段を提供するものである。
【図１】モノクローナル抗体ＰＰＩ Ｎｏ．５０及びＰ
ＰＩ Ｎｏ．３の免疫沈降法による、プラスミノーゲ
ン、α2 −プラスミンインヒビター及びＰＰＩとの反応
性を示す説明図である。
ＰＩ Ｎｏ．３の免疫沈降法による、プラスミノーゲ
ン、α2 −プラスミンインヒビター及びＰＰＩとの反応
性を示す説明図である。
【図２】ＰＰＩの定量用検量線を示すグラフである。
【図３】健常人とＤＩＣ患者の複合体の測定値を示すグ
ラフである。
ラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１３００１で
あるハイブリドーマから分泌され、ヒトプラスミン−α
２−プラスミンインヒビター複合体と特異的に反応する
が、ヒトプラスミン及びヒトα２−プラスミンインヒビ
ターとは反応しないモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ヒトプラスミン−α２−プラスミンイン
ヒビター複合体と特異的に反応するが、ヒトプラスミン
及びヒトα２−プラスミンインヒビターとは反応しない
モノクローナル抗体を分泌する、受託番号がＦＥＲＭ
Ｐ−１３００１であるハイブリドーマ。 - 【請求項３】 請求項１記載のモノクローナル抗体を第
１のモノクローナル抗体として不溶性担体に固定し、こ
の固定化された第１のモノクローナル抗体と被検試料と
を接触させ、続いて前記の第１のモノクローナル抗体と
異なる部位でヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒ
ビター複合体に特異的に反応する、標識を付した第２の
抗体と接触させ、前記標識からの信号を検出することを
特徴とする、ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒ
ビター複合体の免疫学的測定方法。 - 【請求項４】 標識を付した第２の抗体としてモノクロ
ーナル抗体を使用する、請求項３記載の免疫学的測定方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4184467A JP2837030B2 (ja) | 1992-06-17 | 1992-06-17 | 抗ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体特異抗体及び免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4184467A JP2837030B2 (ja) | 1992-06-17 | 1992-06-17 | 抗ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体特異抗体及び免疫学的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0694A JPH0694A (ja) | 1994-01-11 |
| JP2837030B2 true JP2837030B2 (ja) | 1998-12-14 |
Family
ID=16153669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4184467A Expired - Lifetime JP2837030B2 (ja) | 1992-06-17 | 1992-06-17 | 抗ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体特異抗体及び免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2837030B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2507317B2 (ja) * | 1986-04-10 | 1996-06-12 | 帝人株式会社 | プラスミン―α２プラスミンインヒビタ―複合体の測定方法 |
-
1992
- 1992-06-17 JP JP4184467A patent/JP2837030B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0694A (ja) | 1994-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH06237786A (ja) | 人フィブリンｉｉのｎｈ２ 末端フラグメントに対するモノクロナール抗体 | |
| US5821068A (en) | Anti-human soluble fibrin antibody, hybridoma, and immunoassaying method | |
| IL93207A (en) | A monoclonal antibody that binds to the factor and binds ALLXA and the factor ALLXB is weighted 1.0% or less with the LLX factor | |
| JP3681206B2 (ja) | 抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用 | |
| JP3889084B2 (ja) | 新規なモノクローナル抗体並びにｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の免疫学的測定法 | |
| JP3307422B2 (ja) | ヒトｐｉｖｋａ−ｉｉの免疫学的測定方法 | |
| EP0516863B1 (en) | Antibody against human plasmin-alpha 2-plasmin inhibitor complex, hybridoma and immunoassay | |
| JPH0746104B2 (ja) | Ｆｄｐの測定法 | |
| JP3857468B2 (ja) | Ｄダイマー及びｄｄ／ｅ複合体の免疫学的分析方法及び分析用キット | |
| JP2837030B2 (ja) | 抗ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体特異抗体及び免疫学的測定方法 | |
| JPH05304953A (ja) | 抗トロンビン結合性物質モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ | |
| US5358850A (en) | Sandwich immunoassay of β-n-acetylglucosaminidase and monoclonal antibody used therein | |
| JPH0644876B2 (ja) | 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法 | |
| EP0315447A2 (en) | Method of immunological measurement of human protein S and reagent and kit therefor | |
| JP2609858B2 (ja) | コラゲナーゼインヒビターの酵素免疫学的定量法 | |
| JP3841364B2 (ja) | 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 | |
| JPS6379900A (ja) | モノクロ−ナル抗体と検出方法 | |
| JP2840852B2 (ja) | Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル坑体 | |
| JPH0534353A (ja) | ヒト９２ｋＤａゼラチナーゼの免疫学的定量法 | |
| JP2878317B2 (ja) | ラミニン測定試薬 | |
| JP2742886B2 (ja) | 好中球コラゲナーゼの免疫学的定量法 | |
| JP4318085B2 (ja) | 抗体およびハイブリドーマ、並びにこれらを用いた免疫学的測定法 | |
| JPS60253871A (ja) | 抗アポａ−１抗体 | |
| JPH1014592A (ja) | ラットｐａｉ−１に対するモノクローナル抗体 | |
| JPH02492A (ja) | 新規なモノクローナル抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081009 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091009 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091009 Year of fee payment: 11 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101009 Year of fee payment: 12 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101009 Year of fee payment: 12 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111009 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121009 Year of fee payment: 14 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121009 Year of fee payment: 14 |