JPH0548119B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

「産業上の利用分野」 本発明は、新規なモノクローナル抗体に関する
ものである。さらに詳細には、ヒトフイブリンの
プラスミン分解物中のＤダイマー、（DD）Ｅ複
合体およびヒトフイブリノーゲンのプラスミン分
解物中のＤモノマーと特異的に反応するけれども
フイブリノーゲン、フラグメントＸ、フラグメン
トＹおよびフラグメントＥと反応しない新奇な性
質をもつモノクローナル抗体に関するものであ
り、このモノクローナル抗体は血漿中あるいは血
清中のＤダイマー、（DD）Ｅ複合体の免疫定量
法のための試薬として有用である。 「従来の技術」 汎発性血管内凝固症候群（DIC）の臨床的診断
方法としてフイブリノーゲン・フイブリン分解産
物（FDP）の測定が広汎に使用されている。従
来FDPの測定は抗ヒトフイブリノーゲン抗体を
用いた感作ラテツクスによる凝集反応が一般的に
使用されている。この方法は抗体が抗フイブリン
抗体であるため、検体として血溶あるいは脱フイ
ブリンした検体を使用することが必須でまた、最
近、Ｄダイマー特異的なモノクローナル抗体感作
ラテツクスを用いた凝集反応による血漿、血清中
Ｄダイマー測定法が報告されている。 「発明が解決しようとする問題点」 本発明者らは、血漿中のフイブリノーゲン、フ
ラグメントＸおよびフラグメントＹの量に関係な
く、Ｄダイマー、（DD）Ｅ複合体量を測定する
方法を鋭意検討した結果、本発明を完成した。 「問題を解決するための手段および原理」 すなわち本発明はヒトフイブリノーゲンのプラ
スミン分解物中のＤモノマーおよびヒトフイブリ
ンのプラスミン分解物中のＤダイマーと特異的に
反応するがフイブリノーゲン、Ｘ，ＹおよびＥと
反応しない性質をもつモノクローナル抗体であ
る。更に本発明は生物学的試料において、ヒトＤ
ダイマーおよび（DD）Ｅ複合体の存在を検出す
る方法において、ヒトフイブリノーゲンのプラス
ミン分解物中のＤモノマーおよびヒトフイブリン
のプラスミン分解物中のＤダイマーと特異的に反
応するがフイブリノーゲン、Ｘ，ＹおよびＥと反
応しない性質をもつモノクローナル抗体を感作し
た支持体を前記試料と接触させ、前記Ｄダイマあ
るいは（DD）Ｅ複合体と前記モノクローナル抗
体感作支持体との凝集物の形成を、前記試料中に
おける前記Ｄダイマー、（DD）Ｅ複合体の存在
の指標として検出することを特徴とする検出方法
である。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明は、近年各方面で行なわれているハイブ
リドーマによるモノクローナル抗体産生法で得ら
れたモノクローナル抗体である。このモノクロー
ナル抗体はＤダイマー、（DD）Ｅ複合体および
Ｄモノマーと特異的に反応するけれどフイブリノ
ーゲン、フラグメントＸ、フラグメントＹおよび
フラグメントＥとは反応しない新奇な性質をも
つ。 また、前記モノクローナル抗体感作ラテツクス
は前記モノクローナル抗体と反応する複数の抗原
決定基をもつＤダイマー、（DD）Ｅ複合体と凝
集反応を生じさせる、けれども単一の抗原決定基
しかもたないＤモノマーとは凝集反応を生じさせ
ない。このような凝集反応における差異に基づい
て血漿中Ｄダイマー、（DDE）複合体量を測定す
る。 抗Ｄダイマー、Ｄモノマー、モノクローナル抗
体は新規なマウス・ハイブリドーマをそれぞれ培
地またはマウスの腹腔内で培養することによつて
製造できる。ここで用いるマウス・ハイブリドー
マは一般的にはＤダイマーで免疫したマウスの脾
臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、Ｋｏ¨hlerおよび
Milsteillの細胞融合の基本方法〔nature第256巻
495頁（1975年）参照〕により細胞融合して製造
することが可能である。詳細には、下記実施例に
述べる如くである。 また、上記のハイブリドーマを培養する培地と
しては、ハイブリドーマの培養に適した培地であ
ればよく、好適にはダルベツコ氏変法イーグル氏
最小必須培地（Dulbeccｏ′smodified Eeaglｅ′ｓ
minimum essential medium以下DMEと記
す。）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピ
ルビン酸および抗生物質（ペニシリンＧとストレ
プトマイシン）を含む培地が用いられる。 上記のハイブリドーマの培養は、培地中で行な
う場合には５％CO₂濃度、37℃で約３日間、また
マウスの腹腔内で培養する場合には約14日間で行
なわれる。 このようにして製造された培養液またはマウス
の腹水から、蛋白質の単離、精製に一般的に用い
られる方法により、前述のモノクローナル抗体を
分離、精製することが可能である。 そのような方法としては、硫安塩析、イオン交
換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマト
グラフイー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムク
ロマトグラフイー、プロテインＡ結合多糖類を用
いる親和性カラムクロマトグラフイー、透析、凍
結乾燥等がある。 「実施例」 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。 実施例 １ Ｄダイマーおよび（DD）Ｅの調製方法 Ｄダイマーの調製法は、主にStephanie A.
OlexaとAndrei Z.Budzynskiの方法、（1978）
Circulation，Suppl.58，119，Olexa et al.の方
法、（1979）Biochim.Biophys.Acta 576，39〜50
に準じて行なつた。フイブリノーゲン（カビ社、
スウエーデン）20mg（10mg／ml）に、ヒトトロン
ビンおよび塩化カルシウムをそれぞれ終濃度10単
位／ml，10mMとなるよう加え、37℃，２時間反
応させフイブリノーゲンをフイブリンに変換させ
た。18000×ｇ，30分遠心しフイブリンを非凝固
性物質から分離した。フイブリンは20mlの0.15M
トリス−塩酸緩衝液（PH7.8）−5mM塩化カルシ
ウム−0.02％ NaN₃液に浮遊させる。浮遊液に
ヒトプラスミン（１単位／ml、ミドリ十字社）を
１時間毎に0.5ml添加した。10時間後、アプロチ
ニン（Mobay Chemical Corp.）を200単位加え
て分解反応を停止させた。容量10mlのリジン・セ
フアロースカラムに通過させプラスミンを除去し
た。 次に、通過液を前もつて50mMトリス塩酸緩衝
液（PH7.5）−0.15M塩化ナトリウム−5mM塩化カ
ルシウム溶液で平衡化したセフアロースCL6B
（フアルマシヤ社、スウエーデン）のカラム（直
径2.6cm、長さ90cm）に充てんした。前記の溶液
で展開する分子ふるいクロマトグラフイーを行つ
た。分子量マーカーおよび抗Ｄ、抗Ｅ抗血清（ヘ
キスト社、ドイツ）を用いるオクテロニー法によ
り（DD）Ｅ複合体の分画を同定、分離した。こ
のようにして得られた（DD）Ｅ複合体を3M尿
素−50mMクエン酸（PH5.5）の溶液中で37℃，
４時間保温する。次に50mMトリス−塩酸緩衝液
（PH7.4）−28mMクエン酸ナトリウム−0.1M塩化
ナトリウム溶液で平衡化したセフアロースCL−
6Bのカラム（直径2.6cm、長さ90cm）に充てん
し、上記の溶液で展開した。分子量マーカーと抗
Ｄ、抗Ｅ抗血清を用いたオクテロニー法により、
Ｄダイマー（DD）分画とE₁（Ｅ）分画を同定、
分離した。A280nm＝2.0のＤダイマー10mlを得
た。このようにして調製したＤダイマーは免疫原
として、また抗Ｄダイマーモノクローナル抗体産
生性ハイブリドーマを選別するためのエンザイム
イムノアツセイ（ELISA）用抗原として使用す
る。 実施例 ２ (a) 免疫化した脾臓細胞の調製： 上記のＤダイマー免疫原溶液（A280nm＝2.0）
を等量のフロインド氏完全アジユバントと乳化す
るまで混合し、その混合液100μをマウス腹腔
内に投与することにより免疫を行なつた（第１回
免疫）。30日経過後、該マウスに上記の同様の方
法でマウス腹腔内に投与した（第２回免疫）。第
２回免疫から21日経過後、Ｄダイマー免疫原溶液
（A280nm＝2.0）を等量の生理食塩水で希釈し、
その希釈液200μを、該マウスの静脈内に投与
した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾
臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用し
た。 (b) 細胞融合： 無菌的に摘出した上記の脾臓を、10〜15％ウシ
胎児血清を含むDME培地５mlを入れたシヤーレ
に入れる。次に、脾臓を10〜15％ウシ胎児血清を
含むDME培地約15mlで還流して脾細胞を流出さ
せた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメツシユに
通す。この脾細胞を50ml遠心チユーブに集めて
500×ｇ、10分間遠心する。こうして得たペレツ
トに３〜５mlのヘモライジング溶液（155mM
NHaCl，10mM KHCO₃，1mM Na₂EDTA PH
7.0）を加え、懸濁させる。０℃で５〜10分間放
置すると懸濁液中の赤血球は破壊される。10〜20
mlの10〜15％ウシ胎児血清を含むDME培地を加
えてから遠心分離する。このようにして得た細胞
ペレツトをDME培地で遠心法によつて洗浄し、
生きている脾細胞数を測定する。 一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞
（ミエローマ細胞）SP2／０−Ag14約２×10⁷個
に１×10⁸個の上記脾細胞を加え、DME培地中で
よく混合し、遠心分離を行なつた（500×ｇ，10
分間）。その上清を吸引し、ペレツトをよく解き
ほぐし、38℃に保温しておいた40％ポリエチレン
グリコール4000溶液0.5mlを滴下し、遠心チユー
ブを手で、１分間穏やかに回転することによつて
ポリエチレングリコール溶液と細胞ペレツトを混
合させた。次に、38℃に保温しておいたDME培
地、30秒毎に１ml加えてチユーブを穏やかに回転
させる。この操作を10回繰り返した後、20〜30ml
の10〜15％ウシ胎児血清を含むDME培地を加え
て、遠心分離（500×ｇ，10分間）を行なつた、
上清を除去した後、細胞ペレツトを10〜15％ウシ
胎児血清を含むHAT培地（DME培地にアミノプ
テリン４×10^-7、チミジン1.6×10^-5Ｍ、ヒポキ
サンチン１×10^-4Ｍになるように添加したもの）
で、遠心法によつて２回洗浄後、40mlの上記
HAT培地に懸濁する。この細胞懸濁液を96ウエ
ル細胞培養プレートの各ウエルに200μずつ分
注し、37℃，５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器
で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウ
エルの培地を約100μ除き、新たに上記のHAT
培地を100μ加えることによりHAT培地中で増
殖するハイブリドーマを選択した。８日目頃から
10〜15％ウシ胎児血清を含むHT培地（DME培
地にチミジン1.6×10^-5Ｍ、ヒポキサンチン１×
10^-4Ｍになるように添加したもの）に交換し、ハ
イブリドーマの増殖を観察するとともに、約10日
目に、下述のELISA法により、抗Ｄモノマーか
つ、Ｄダイマー抗体産生ハイブリドーマをスクリ
ーニングした。 (c) ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無は
ELISA法により測定した。96ウエルELISA用プ
レート（Immulon 、日本ダイナテツク株式
会社）の各ウエルに、前述の精製Ｄダイマー溶液
（A280nm＝0.05、生理食塩水で希釈した。）を
50μずつ分注し、25℃で２時間放置した。次
に、0.05％ Tween 20−生理食塩水で３回洗浄
した後、各ウエルに培養上清を50μ加え、25℃
で１時間反応させた。 次にTween 20−生理食塩水で200倍希釈した
ペルオキシターゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デ
ンマーク）50μを各ウエルに加えた。反応終了
後、0.05％ Tween 20−生理食塩水で各ウエル
を３回洗浄し、0.5mMアミノアンチピリン、
10mMフエノールおよび0.005％過酸化水素水を
含む溶液250μを各ウエルに加え、25℃で30分
間反応させ各ウエルの490nmにおける吸光度を測
定した。その結果、192ウエル中12ウエルに抗体
産生が認められた。 上記のELISA法によつて認められた培養上清
中の抗Ｄダイマー抗体が、Ｄモノマー、フラグメ
ントＸ、フラグメントＹ、フラグメントＥおよび
フイブリノーゲンと反応するか否かを上記の抗原
を感作した96ウエルELISA用プレートを用いて
上記と同様の方法で測定した。その結果Ｄダイマ
ーと反応した12ウエルの培養上清中、１ウエルの
培養上清がＤモノマーと反応した。他の11ウエル
の培養上清はＤモノマー、フラグメントＸ、フラ
グメントＹおよびフイブリノーゲンのすべてに反
応した。 Ｄダイマー、Ｄモノマーに特異的に反応するウ
エル中のハイブリドーマを24ウエルプレートに移
し、10〜15％ウシ胎児血清を含むHT培地で４〜
５日間培養した。その後、再度ELISA法によつ
て抗Ｄダイマー、Ｄモノマー抗体の産生の有無を
確認してから限界希釈法によりクローニングし
た。限界希釈法はHT培地でハイブリドーマが５
個／mlとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め
正常BALB／Ｃ系マウスの腹腔細胞がウエルあ
たり２×10⁴個分注してある96ウエルプレートの
各ウエルに100μlずつ分注した。約10日後、
ELISA法によつて抗Ｄダイマー、Ｄモノマー抗
体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリ
ーニングした。その結果、20個の抗体産生クロー
ンが得られた。これらのクローンの中から、増殖
のよい、抗体分泌能の高い、しかも安定なクロー
ンを選び、前述と同様の方法で再クローン化を行
い、抗Ｄダイマー、Ｄモノマー特異的抗体産生ハ
イブリドーマDD／Ｄ−１を樹立した。 実験例３ （モノクローナル抗体の製造）（イン
ビトロ法） マウスハイブリドーマDD／Ｄ−１を15％ウシ
胎児血清を含むDME培地で37℃，５％二酸化炭
素雰囲気中72〜96時間培養した。培養物を遠心分
離後（10000×ｇ，10分）後、上清に固形の硫酸
アンモニウムを50％最終濃度となるように徐々に
加えた。混合物を氷冷下30分間攪拌した後60分間
放置し、遠心分離（10000×ｇ，10分）後、得ら
れた沈渣を少量の10mMリン酸緩衝液（PH8.0）
に溶解し、1000倍量の10mMリン酸緩衝液に対し
て透析した。これを、10mMリン酸緩衝液ですで
に平衡化したDEAE−セルロースのカラムに充填
した。モノクローナル抗体の溶出は10mMリン酸
緩衝液（PH8.0）と0.2M NaClを含む10mMリン
酸緩衝液（PH8.0）の間で濃度勾配法により行な
つた。溶出されたモノクローナル抗体を限外過
法で濃縮し、0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）に対し
て透析した。ウシ血清1gGを除くために、透析物
をやぎ抗ウシ血清1gG−セフアロース4Bのカラ
ムに通した。次に通過液を0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0）で平衡化したプロテインＡ−セフアロー
ス4Bのカラムに充填した。カラムをPH3.5の緩衝
液で溶出して、精製した抗Ｄダイマー、Ｄモノマ
ー特異抗体DD／Ｄ−１を得た。 （イン・ビボ法） プリスタン（２，６，10，14−テトラメチルペ
ンタデカン）0.5mlを10〜12週齢のBALB／Ｃ系
マウスの腹腔内に投与後14〜20日目のマウス腹腔
内にインビトロで増殖させたハイブリドーマ
DD／Ｄ−１をマウス一匹あたり２×10⁶細胞とな
るように接種した。 一匹のマウスから約10〜15mlの腹水が得られ
た。その抗体濃度は、５〜10mg／mlであつた。腹
水中のモノクローナル抗体の精製は、（但し、ヤ
ギ抗ウシ血清1gG−セルフアロース4Bのカラム
を通す操作を除く。）上記のインビトロ精製法と
同様の方法で行なつた。 実験例４ （モノクローナル抗体の免疫グロブリ
ンクラスおよび特異性の同定） 抗Ｄダイマ、Ｄモノマー特異モノクローナル抗
体DD／Ｄ−１の免疫グロブリン・クラスをオク
テロニー免疫拡散法により行つた。結果は表１に
しめす通りである。

【表】 実験例５ （モノクローナル抗体の認識部位の同
定） モノクローナル抗体、DD／Ｄ−１の認識部位
の同定はウエスターンブロツテイング法によつて
行なつた。実験操作は主に、バイオ−ラツド社、
アメリカZeta−Probe Blotting Mewbraues
Instruction Mannualにより行なつた。実験操作
の概要は次のようである。 フイブリノーゲンをCa²⁺あるいはEGTAの存
在下でプラスミン処理を行ない、30分、60分、24
時間反応後のフイブリノーゲンの分解物を、
DTT（ジチオスレイトール）存在および非存在下
でSDSポリアクリルアミド電気泳動を行なつた。
上記の方法でブロツテイング、エニザイムイムノ
アツセイを行ない、この結果とSDSポリアクリル
アミドゲルのクマジー・ブリリアント・ブルーＧ
−250による蛋白染色の結果から、モノクローナ
ル抗体DD／Ｄ−１の認識部位の同定を行なつ
た。フイブリノーゲンおよび精製Ｄダイマー、
（DD）Ｅに対しても上記と同様の方法で行なつ
た。結果は表２に示すとおりである。

【表】 −：結合反応性、無
以上実験例５の諸結果から本発明のモノクロー
ナル抗体DD／Ｄ−１はＤモノマーのDegta領域
を認識すること、また上記のモノクローナル抗体
の認識する上記の領域の立体構造はフイブリノー
ゲン、Ｘフラグメント、Ｙフラグメントおよび
early Ｄとは異なることが明白になつた。 「発明の効果」 以上から明らかな如く、本発明によればヒトフ
イブリンのプラスミン分解物中のＤダイマー、
（DD）Ｅ複合体およびヒトフイブリノーゲンの
プラスミン分解物中のＤモノマーと特異的に反応
するけれどもフイブリノーゲン、フラグメント
Ｘ、フラグメントＹおよびモノクローナル抗体と
ヒトＤダイマーおよび（DD）Ｅ複合体の存在を
検出する方法を提供することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒトフイブリノーゲンのプラスミン分解物中
   のＤモノマーおよびヒトフイブリンのプラスミン
   分解物中のＤダイマーと特異的に反応するがフイ
   ブリノーゲン、Ｘ，ＹおよびＥと反応しない性質
   をもつモノクローナル抗体。 ２ フイブリノーゲンＸおよびＹと立体構造的に
   異なるＤモノマーのDegta領域（D₃）を特異的に
   認識する特許請求の範囲第１項記載のモノクロー
   ナル抗体。 ３ 生物学的試料において、ヒトＤダイマーおよ
   び（DD）Ｅ複合体の存在を検出する方法におい
   て、ヒトフイブリノーゲンのプラスミン分解物中
   のＤモノマーおよびヒトフイブリンのプラスミン
   分解物中のＤダイマーと特異的に反応するがフイ
   ブリノーゲン、Ｘ，ＹおよびＥと反応しない性質
   をもつモノクローナル抗体を感作した支持体を前
   記試料と接触させ、前記Ｄダイマあるいは
   （DD）Ｅ複合体と前記モノクローナル抗体感作
   支持体との凝集物の形成を、前記試料中における
   前記Ｄダイマー、（DD）Ｅ複合体の存在の指標
   として検出することを特徴とする検出方法。 ４ 前記試料中におけるＤモノマーは前記モノク
   ローナル抗体と反応する抗原決定基を１つだけも
   つため、前記モノクローナル抗体感作支持体と凝
   集物を形成しえないので凝集物の形成は前記試料
   中における前記Ｄダイマー、（DD）Ｅ複合体の
   存在に基づくことを特徴とする特許請求の範囲第
   ３項記載の検出方法。 ５ 前記凝集物を、前記試料中における前記Ｄダ
   イマー、（DD）Ｅ複合体の定量的尺度として測
   定する、特許請求の範囲第３項又は第４項記載の
   検出方法。