JPH0327296A - ヒトラミニンのモノクローナル抗体、その製法および利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野１ 本発明は、肝臓疾患の診断等に、あるいは、その他医学
的生埋学的分野の用途に有用なヒトラミニンのモノクロ
ーナル抗体、ならびにその製法およびその利用に関する
。

さらに詳しく言えば、本発明は、ヒトラミニンの抗原決
定基に対し、特異的に結合するモノクローナル抗体なら
びにその製法およびそれを用いて行うヒトラミニンの定
量法に関する。

［背景技術］ 従来、ヒト血中のヒトラミニンを測定する方法としては
、ウサギポリクローナル抗体を使用して、放射性同位元
素、蛍光色素、酵素あるいは染料等により標識を付与し
た抗原と被検試料中の未知量の抗原との競争反応に基づ
き免疫学的測定を行う方法が知られている（特公平１２
２９０４号公報参照）。

本発明は、肝臓疾患の簡易診断に有用なヒトラこニンの
定食に関するものである。更に詳しくは、本発明は、固
相担体に結合させる抗体および酵素を付与する抗体とし
てヒトラミニンの異なる抗原決定基に対し、特異的に結
合する２種類のヒトラミニンに対するモノクローナル抗
体を用いて、ザンドイツチ法に基づいてヒ１・ラミニン
を定量する方法に関するものである。

すな４）ち、上記公報記載の実施例に見られるように、
この方法では、被検試料にラミニンボリク口ーナル抗体
を混和し１６時間以上反応させた後、標識ラミニンを加
え６−７時間反応させ、その後、沈澱剤を加え１６時間
以上反応させ遠心により結合ラミニンおよび遊離ラミニ
ンを分離し、抗原量を算出している。と１二ろで、この
ような方法では、まず、反応時間が長いこと、更には、
精度が著しく低いことなどの欠点が存在する。

［発明の目的１ 本発明の目的は．ヒトラミニンの抗原決定基に対し、特
異的に結合するモノクローナル抗体ｋらびにその製法を
提供し、このモノクローナル抗体を用いて微量の被検試
料から、精度良く、簡便かつ迅速にその試料中のヒトラ
ミニンを定量する方法を提供することにある。

［発明の開示１ 本発明により、前記のモノクローナル抗体を用いて、ザ
ンドイツチ法による酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）ｌこ
よりヒトラミニンを定量する方法が提供されるが、その
際、固相担体に結合させる抗体ならびに酵素標識を付与
する抗体として、ヒトラミニンの異なる抗原決定基に対
し特異的に結合するモノクローナル抗体をそれぞれ使用
することを特徴とするものである。

本発明により提供されるモノクローナル抗体ならびにそ
の製法に関しては、後に詳述するが、本発明に係るヒト
ラミニンの定量法について説明すると、本発明の定量方
法においては、酵素免疫学的測定法が用いられるが、モ
の際の固相担体としては、抗原や抗体を良く吸着するポ
リスヂレン製、ポリカーボネイト製、ボリブロピレン製
あるいはポリビニル製のボール、マイクロプレート、ス
ティックあるいは試験管などの種々の材料および使用形
態を任意に選択し、使用することができる。一方、酵素
標識を付与する抗体と（２ては、抗体含有物を硫安分画
した後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅ　ｌの如き陰イオン
交換ゲルおよびＩｇＧを特異的に吸着させるＰｒｏｔｅ
ｉｒＡにより精製したｌｇＧ画分、更には、ペプシン消
化後還元して得られる特異的結合部分Ｆａｂ’を用いる
ことができる。

本発明の方法は、被検試料中のヒトラミニンの定量を短
時間に行うことができること、精度よく測定し得ること
を特徴的利点とするものであり、この定量法は、慢性肝
炎、急性肝炎、肝硬変、アルコール性肝障害、原発性肝
癌および原発性胆汁性肝硬変などの肝臓疾患において起
こる肝の線維化を診断し得るので極めて有用なものであ
る。後に詳述するが、本発明の方法により測定した肝臓
疾患患者血清中ヒトラミニン量の測定値は、健常者血清
中のそれよりも有意に高いことが認められ、更に、本発
明の方法により、血中ヒｌ・ラミニン量を測定すること
によって、患者に負担のかかるバイオブシーを行うこと
なく肝臓疾患、特に線維化を診断することができる。す
なわち、本発明の定量法によるヒトラこニン量の測定は
、肝組織の線維化診断ｌ＝おいて、非常に有用なもので
ある。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明
は、これら実施例により限定されるものではない。

実施例　ｌ 抗ヒトラミニンモノクローナル抗体の作製（ａ）抗原（
ヒトラミニン）の調製 ．１．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．．　１９３，　７４９−７
５５（１９８１）に記載のＲｉｓｔｅｌｉらの方法に従
い、ヒト胎盤をベブシン消化し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｂａ
ｅｅｌカラム（　Ｐｈａｒｍａｅ　ｉａ製）の溶出画分
に、ラミニンＰ１８よびＰａ画分を得た。次にその溶出
画分をコラケナーゼ勉理し、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ
−４Ｂカラム（　Ｐｒａｒｍａｅ　ｉａ製）で精製し、
ヒトラミニンＰｌ画分を得た。精製ヒ１・ラミニンは、
Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．．　８０．　５７９−５９
９（１９７３）に記載の１ａＢＩｍ　ｌ　ｉらの方法に
０．５％アガロースを加えたドデシル硫酸ナトリウムー
ポリアクリルアミド（３６５％）電気泳動（　ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）でその純度を調べた。その結果、分子量約２
００　Ｋダルトン（　２００ＫＤ）の単・−バンドを示
した。

（ｂ）抗体産生細胞の調製 精製ヒトラミニン６　０　ｔｔ　ｇを完全７口インドア
ジュバンドと共に８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウス２匹に
初回腹腔内投与しＩ二。更に１６日目にＯ．１５Ｍ塩化
ナトリウム含有５０ｎＭ　｝リスー塩酸緩衝液（ｐＨ　
７．４）に溶解させた杭！６０ｐｇを追加免疫した。

最終免疫として５０日目に抗原６５μｇを静脈内投与し
、その３日後に牌臓を摘出し、牌細胞を調製した。

（Ｃ）細胞融合 以下の材料および方法を用いる。

ＲＰＭ１　１６４０培地：ＲＰ旧１６４０（Ｄｉｒｅｏ
　ｔａｂ．製）に重炭酸ナトリウム（１２ｍＭ）、ピル
ビン酸ナトリウム（ｌｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ
）、ベニシリンＧカリウ”　（５０　Ｕ／　ｍ４）　、
硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ／　ＩＩｌ＋２）お
よび硫酸アミ力シン（１００μｇ／　ｒｓＱ’）を加え
、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２μ聰東洋メ
ンブレンフィルターで除菌枦過する。

ＭＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ　　１６４０培地に除菌枦
過した仔牛胎児血清（Ｍ．　Ａ．　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｅ
ｔｓ製）をｌ５％（ｖ／　ｖ）の濃度に加える。

ＰＥＧ　４．０００溶液：　ＲＰＭ［　１６４０培地の
ポリエチレングリコール４．０００（ＰＥＧ　４．００
０，　ｌＪｅｒｃｋ　＆　Ｇｏ．，Ｉｎｃ。製）５０％
（Ｗ／　Ｗ）無血清溶液を調製する。

８−アザグアニン耐性ミエローマｍ胞ＮＳ−　１（Ｐ３
−ＮＳＩ　−　１　”）との融合は、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ
　Ｍｅｔ．ｈｏｄｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ　（ｅｄ．　Ｂ．　Ｂ．　Ｍｉｓｈｅ口ａｎ
ｄ　Ｓ．　Ｍ．　Ｓｈｉｉｇｉ）　、ｔ＃．　Ｈ．　Ｆ
ｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃａｍ−ｐａｎｙ（１９８０）
　、３５１−３７２に記載のＯｉらの方法を若干改変し
て行った。

前記（ｂ）で調製した有核牌臓細胞（生細胞率１００％
）とミエローマ細胞（生細胞率１００％）とを５：１の
割合で融合ずる。牌臓細胞とミエロ一マ細胞とを別に前
記のＲＰＭＩ　　１６４０培地で洗浄し、次に同じ培地
にけん濁し、融合させるため上記の割合で混合する。容
量５ＱｍＱの円錐形スチロール樹脂製試験管（岩城ガラ
ス製）を用い、４０＋ｍＱノＲＰＭ１　１６４０培地中
４００Ｘｇ、ＩＯ分間遠心１，、上清を完全に吸引除去
する。沈澱細胞に３７℃加温ＰＥＧ　４．０００溶液１
．３ｍＱを穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、更に
１分間撹拌し細胞を再けん濁、分散さーせる。次に３７
℃加温ＲＰＭＩ　　１６４０培地１−３ｍ（２を１分間
で滴下する。この操作をさらに１回繰り返した後、同培
地９＋ＩＩＱを２〜３分間撹拌しながら滴下し細胞を分
散させる。これを４００Ｘ９、１０分間遠心分離し、上
清を完全に吸引除去する。次にこの沈澱細胞に３７℃加
温ＮＳ−１培地１２．９＋ｍｆｌをすみやかに加え、細
胞の大きい塊りを１　０ｔＱのビベットを用いて注意深
くビベツテイングして分散させる。更に同培地２６ｙｒ
Ｑを加え、ポリスチレン製９６六マイクロウエル（岩城
ガラス！１）にウエル当り６．ＯＸ　１０’個／Ｏ．ｌ
＋ｍ４の細胞を加える。なお、この時使用する９６穴マ
イク口ウｘ　ルハ、前処理とＬ　Ｏ−２ｍＱ（Ｄ　ＮＳ
　−　１培地を加え、炭酸ガス培養器中（３７゜Ｃ）で
一晩保温し、使用時に培地を吸引除去しておいたものを
使用する。

細胞を加えた上記のマイクロウェルを７％炭酸ガス／９
３％空気中（３７゜Ｃ）湿度ｌｏｏ％下で培養する。

（ａ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 使用する培地は以下のとおりである。

ＨＡＴ培地：前記（ｃ）で述べたＭＳ−１培地にさらに
ヒボキサンチン（１００ｐＭ）　、アミノブテリン（０
．４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加える。

ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組戊のものである。

前記（Ｃ）の培養開始後翌日（ｉ日目）、細胞にバスツ
ールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍＱ）を加え
る。２、３、５、８、ｌｌ日目に培地の半分（０−１ａ
Ｏを新しいＨＡＴ培地で置き換え、ｉ４口目に培地の半
分を新しいＨＴ培地で置き換える。

以降３日毎に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換える
。通常２〜３週間で充分なノ１イブリドーマの生育が観
察される。ハイブリドーマ生育全ウエルについて次項（
ｅ）記載の固相一抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）によ
り陽性ウエルをチェックする。次にフィーダーとしてｌ
０７個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地ｉｒａｇ．をポ
リスチレン製２４穴ウエル（岩城ガラス製）に加えたも
のに、上記で検出された各陽性ハイブリドーマの全内容
物を移す。これを前記（ｅ）におけると同様に７％炭酸
ガス存在下、３７゜Ｃで約１週間培養する。その間、ｌ
〜２回各ウエルの上清０．５翼αを新しいＨＴ培地０　
．　５ｍ＋２と交換する。／％イブリドーマの充分生育
した時点でＥＬＩＳＡ法により陽性を再確認し、それぞ
れについて次項（ｆ）記載の限界希釈によるクローニン
グを行う。なお、クローニングに使用後の残液をボリス
チレン１１２　５　ｃ　ｒａ　”組織培養フラスコ（岩
城ガラス製）に移し、凍結保存用試料を調製する。

（ｅ）固相一抗体結合テスト（ＥＬＩＳＡ）による抗ヒ
１・ラミニン抗体産生ハイブリドーマの検Ａｎａｌ．　
Ｂｉｏｃｌｉｅｍ．，　　１０４．　　２０５−２１４
（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干改
変した方法を用いる。この方法は、ハイブリドーマ抗体
の検出に適している．９６穴ミクロタイトレーションプ
レート　（　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ．　　Ｉｎｃ．　　製）
を０．５ｐｇヒ　トラミニンでコートシ、次に、未コー
ト部分をｌ％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックす
る。これに前記（ｄ）で得られたハイブリドーマ生育ウ
エルの上溝の一部を加えて室温で約１時間インキユベー
ションする。２次抗体として、西洋わさびベルオキシダ
ーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグ口プリン（　Ｃａｐｐｅ
　１　１．ａｈ　．製）を加え、更に室温で約１時間イ
ンキユベーションする。次に、基質である過酸化水素と
０−フエニレンジアミンとを加え、生或しｔ；褐色の程
度をマイクロプレートリーダー（東洋ソーダ、ＭＰＲ−
Ａ４型）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定する。

（ｆ）クローニング 前記（ｄ）の操作後、各ウエル中には２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングヲ行い、モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地ｒｍＱ当り、フ
ィーダーとして１０７個のマウス胸腺細胞を含むクロー
ニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエ
ル、３６ウエルおよび２４ウエルにそれぞれ、ウエル当
り５個、１個および０．５個のハイブリドーマを加える
。５日目、１２日目に全ウエノレに約１　ｔａｎのＮＳ
−１培地を追加する。クローニング開始後、ｌ４〜ｌ５
日で充分なハイブリドーマの生育が認められ、コロニー
形戒陰性ウエルが５０％以上である群についてＥＬＩＳ
Ａを行う。テストした全ウエルが陽性でない場合、抗体
陽性ウエル中のコロニー数を確認し、ウエル中にｌコロ
ニーがＩｌｌ　ａされたウエルを４〜６個選び再クロー
ニングする。最終的にヒトラミニンに対するモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ１６株が得られた。

（ｇ）モノクローナル抗体の生体外増殖および体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、モ
ノクローナル抗体は、得られた各ハイブリドーマをＮＳ
−１培地などの適当な培養液で培養（生体外増殖）し、
その培養上清から得ることができる（モノクローナル抗
体たん白質濃度は１０〜ｌ００ｊＩｇ／　ｒａＱテあル
）．一方、大ｉ　ニ抗体を得るためには、牌細胞とミエ
ローマ細胞の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃマウ
ス）に腫瘍形戊促進剤プリスタン（２、６、１０，１４
−テトラメチルベンタデカン、Ａｌｄｒｉｅｈ　Ｃｈｅ
ｍ．製）をマウスー匹当り、０．５＋ｍｆｆ腹腔内投与
し、１〜３週間後、各ハイブリドーマｉｘｉｏ’個を同
じく腹腔内投与することにより生体内で、更に１〜２週
間後、モノクローナル抗体たん白質濃度４〜７１１ｇ／
ｌ（２の腹水を得ることができる。

（ｈ）モノクローナル抗体の重鎮、軽鎖およびアイソタ
イプ 前記（ｇ）で得られたそれぞれの腹水を、まず、ヒトラ
ミニンをコートしたミクロタイトレーションプレートに
前述したＥＬｔＳＡ法に従って結合させる。０．９％塩
化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．１
）（ＰＢＳ）による洗浄後、次にアイソタイプ特異性ウ
サギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＺｙＩＩＩＣｄＬａｂｏ．製
）を加える。ＰＢＳによる洗浄後、西洋わさびベルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ十Ｌ　）抗体を加
え、２．２′−アジノージ（３−エチルベンゾチアゾリ
ン硫酸−６）および過酸化水素を用いて陽性ウエルを検
出し、その結果を第ｌ表に示した。得られたヒトラミニ
ンに対するモノクローナル抗体のうち、１５個が免疫グ
ロブリン鎖γ１／κを、１個がγ２ａ／κを有してい　
Ｉこ　。

ＨＬ２Ｄｌ２ ■！、４Ｈ３ １｛Ｌ５ＡＩＯ ２２−ＩＥＩ ２２−２Ａｌ ２２−３８１０ ２２−５Ｃ９ ２２−６Ｂ４ ２２−７Ｃ５ ２２−８Ｅ９ ２２−９Ｇ７ ２２−１０ＨＩ ２２−２４Ｄ５ ２２−２５Ｂ７ ２２−２６ＥＩＯ ２２−２７Ｅ７ 第 ｌ表 ＩｇＧ　　ｌ／κ ＩｇＧ　　ｌ／κ ＩｇＧ　　１／κ ＩｇＧ　　２ａ／κ ＩｇＧ　　ｌ／κ ＩｇＧ　　１／κ ＩｇＧ　　ｌ／〆 ＩｇＧ　　ｌ／κ ＩｇＧ　　ｌ／κ ＩｇＧ　　ｌ／κ ＩｇＧ　　ｌ／　ｔ ＩｇＧ　　ｌ／κ ＩｇＧ　　ｌ／κ ＩｇＧ　　ｌ／κ ［ｇＧ　　ｌ／κ ＩｇＧ　　ｌ／κ （ｉ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｇ）で得られた各腹水を硫安分画（４０％飽和）
後，　０．０６Ｍ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ　８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｃｅ　１（　Ｐｈａｒｍａｅ　ｉａ　！！　）の非
吸着画分を分取し、このＩｇＧ画分を更に０．４２Ｍ塩
化ナトリウムを含む５ＱｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．
４）で平衡化したＳｅｐｈａ−ｃｙｌ　Ｓ−３００　Ｓ
ｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｏｉａｅｉａ製）カラムで
ゲル炉過し、培地中の仔牛胎児血清および１マウス由来
のたん白質を分離、除去した。

実施例　２ イムノブロツテイング 実施例１　（ａ）で精製したヒトラミニンをＳＤＳ　−
ＰＡＧＥに供した後、ベルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウ
ス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂ．製）を用い
て、細胞工学１＆２、１０６１−　１０６８　（　１９
８３）に記載の田部の方法に従ってウエスタンブロツテ
イングを行い、免疫染色を行った（第ｌ図）。

図中レーンｌ−１６は、それぞれクローンＨＬ２Ｄｌ２
、旧、４　Ｈ　３、ＨＬ５ＡｌＯ、２２−ＩＥＩ，２２
−２ＡＩ，２２−３ＢｌＯ，２２−５ＣＱ、２２−６８
４、２２−７Ｃ５、２２−８Ｅ９、２２−９Ｇ７、２２
−１０旧、２２−２４Ｄ５、２２−２５８７、２２−２
６ＥｌＯおよび２２２７Ｅ７からの抗体で免疫染色した
結果であるが、レーンｌのクローンＨＩ．２Ｄｌ２およ
びレーン３のクローンＨＬＳＡｌＯからの抗体では、バ
ンドが検出されなかった。クローン２２−２７Ｅ７（レ
ーン１６）からの抗体では、分子量２００　ＫＤより高
分子側に１本のバンドが検出され、その他のクローンの
抗体では、分子量２００　ＫＤの位置に１本のバンドが
検出された。

実施例　３ 裸識抗体の調製法 （ａ）　ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体の調製法１）　　ＳＨ基
標識１ｇＧの調製 Ｊ．　　［ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　４．　２０９＝３２
７．　　１９８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａらの方法に
従って、マウス抗ヒトラミニンＩｇＧ−ＰＯＤ複合体を
調製した。前記実施例１（ｉ）項で得られたマウス抗ヒ
トラミニンＩｇＧを０。【Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６−５
）に透析し、その溶液に含有するＩｇＧに対してｉｏｏ
＠モルのＳ−アセチルメルカブト無水コハク酸をジメチ
ルホルムアミドとして加え、３０℃、３０分間インキユ
ベーションした。次に、０．１ＭトＩＪス−塩酸緩衝液
（ｐＨ　７−０）　ｌ００μＬ　Ｏ．ｌＭＥＤＴＡ溶液
（ｐＨ　６．０）　１０ｕＱ．　　ｌ　Ｍヒドロキシル
アミン溶液（ｐＨ　７．０）　１００μ＋２を加え、３
０”Ｏ、５分間静配後、５　＋ｌｌＭ　ＥＤＴＡ含有０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　６．０）で平衡化したＳｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５でゲル枦過した。この操作によ
りＳＨ基標識マウス抗ヒトラミニンＩｇＧが得られる。

２）マレイミド標識ベルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の調製 ＰＯＤを１０＋ｗｇ／冑Ｑの濃度になるように０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）に溶解し、そのＰＯＤ量
に対して２５倍モル量のＮ−（ｔ−マレイミドカプ口イ
ルオキシ）コハク酸イミド（　ＥＭＣＳ）をジメチルホ
ルムアミド溶液として加え、３０℃、３０分間反応させ
た。この反応液を０。１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　６．０
）で平衡化したＳｅｐｈａｄａｘ　Ｇ−２５カラムでゲ
ル枦過し、マレイミド標識ＰＯＤ両分を分取した。

３）　　ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体の調製 上記１）で調製したＳＨ基標識［ｇ０　１モルに上記２
）で得られたマレイミド標識ＰＯＤ約５モルを加え、４
＠０、２０時間靜置する。この混合液を０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ　６．５）で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ
　　ＡｃＡ　３４カラムでゲル枦過し、マウス抗ヒトラ
ミニンＩｇＧ−ＰＯＤ複合体画分を分取した。更に、Ｂ
ＳＡおよびチメロサールをそれぞれ（Ｌｌ％および０．
００５％になるように添加し、４℃で保存した。

（ｂ）　Ｆａｂ’−ＰＯＤ複合体のｍ製１）　　Ｆａｂ
’のＩＩＩ製 実施例１（ｉ）項で得られたマウス抗ヒトラミニンＩｇ
Ｇを０．１Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍ酢酸緩衝液、
ｐＨ　４．５で透析し、そのＩｇＧ量に対しＬ％（ｖ／
ｗ）ペプシンを加え、３７℃、８時間消化した。更に、
その消化液に２Ｍトリス溶液を加えてｐＨを７．０に調
整することにより、消化反応を停止させ、０．１Ｍ　！
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した■ｌｔｒｏｇ
ｅｌ　ＡｃＡ　４４カラムでゲル枦過することによりＦ
（ａｂ’）．画分を分取した。次にｓ　Ｆ　（　ａ　ｂ
　’　）　１［分をエチレンジアミン四酢酸（　ＥＤＴ
Ａ）含有０−ＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で透析し
、それに終濃度ｌＯμ輩となるようにアミノエタンチオ
ール（ＭＥＡ）を加え、３７℃、１．５時間還元した，
モの後、５ｓ＋Ｍ　ＥＤＴＡ含有Ｏ。１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ　６．０）で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ　Ａｃ
＾４４カラムでゲル枦過し、Ｆａｂ’画分を分取した、 ２）　　Ｆａｂ’−ＰＯＤ複合体の調製上記１）で調製
したｔａｂ’に対して前記（ａ）−２）項記載の方法に
従って調製したマレイミド標識ＰＯＤを等モル加え、更
にＦａｂ’およびマレイミド標識ＰＯＤの終濃度が１０
０ｐＭ．！：なるようにＳｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ　６．０）で希釈した。この混合液
を４℃、２０時間静Ｒ後、Ｆａｂ’に対してｌＯ倍モル
量のＮ一エチルマレイミド未反応チオール基でプロツク
した。これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　６．５）で
平衡化したｔｌｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　４４カラムで
ゲル枦過し、Ｆａｂ’−ＰＯＤ複合体画分を分取後、Ｂ
ＳＡおよびチメロサールを各０．１％および０．００５
％になるように添加し、４℃で保存した。

実施例　４ モノクローナル抗体のグループ分け （ａ）抗原結合マイクロプレートの調製法実施例ｔ　（
ａ）項で得られたヒトラミニンを０．１％アジ化ナトリ
ウム含有リン酸緩衝液、ｐＨ　７．５に溶解し、それを
５００ｎｙ／ｒａＱの濃度に調整した後、この抗原溶液
を９６穴マイクロウエルプレー｝　（Ｎｕｎｃ製）にウ
エル島り１００μＱずつ加え２時間静直した。次に、抗
原溶液を除夫し、生理食塩水で２回洗浄した後、０．ｉ
％ＢＳＡ，　０．１％塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ　７．０）を３００ｕａウエルに加え、
４℃で保存した。

（ｂ）競合反応によるモノクローナル抗体のグループ分
け 実施例１　（ｉ）項で得られたｌ６種類のモノクローナ
ル抗体（ＩｇＧ）をｌ％ＢＳＡ，　０．１％塩化ナトリ
ウムおよび１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有３ＱｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ　７．０）　（以下緩衝液Ａと略記する）に
溶解し、各モノクローナル抗体溶液をそれぞれ２５、５
、１、Ｑ．２、０．０４μｇ／ｍ（ｌの濃度に希釈した
。次に、実施例３（ａ）項でＩｌ製したＩｇＧ−ＰＯＤ
を緩衝液Ａに溶解し、これを４００ｎｉｉ／＋ｍＱ．の
濃度に調整後、先の５種類の濃度に希釈したモノクロー
ナル抗体溶液と等量に混合した。次に、この混合溶液を
上記（ａ）項でＷＲ製した抗原結合マイクロウエルに１
　０　０　ｕ　Ｑ．ずつ分注し、１時間室温に静置した
。

反応終了後、混合液を除去した後、生理食塩水で２回洗
浄した。次に、０．０２％過酸化水素含有０．１Ｍクエ
ン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４。５）に溶解した１　１１
ｇ／　ｒｓＱ　ｏ　−　７エニレンジアミンをウエルあ
たり１００１２加え、室温でｌ５分間靜置した後、２Ｎ
硫酸１００１を添加して反応を停止した。その反応混液
のＡ４，，をマイクログレートリーダーを用いて測定し
た。

ＩｇＧ一ＰｏＤ複合体に用いられている七ノクσ一ナル
抗体と同じ抗原認識部位ε競合する七ノクローナル抗体
に関しては、その濃度が高くなるに従って、Ａ４，，値
が低下し、また、複合体に用いられているモノクローナ
ル抗体占異なる抗原認識部位を認識する抗体においては
Ａ４，，値が低下１，ないことに基づき、実施例ｌで得
られた１６種類のモノクローナル抗体を、第２表で示す
ように分類した。

実施例　５ サンドインチＥＩＡ法 （ａ）　％ノクローナル抗体結合マイクロプレートの調
製法 Ｊ．　Ｉｍ＋ｎｕｎｏａｓｓａｙ　４．　２０９−３２
７　（１９８３）に記載のＩｓｈｉｋａｗａらの方法に
従って実施例１（ｉ）項で得られたモノクロ〜ナル抗体
をＯ．１％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ　７．５）に溶解し、ｌｏｏｇ９／　ｓａ（１（
Ａ　！ａｌｌ　−　１　−５）　（’）　濃度ニＴＩ４
　整１，　タ。

そのモノクローナル抗体溶液を９６穴マイクロプレート
にウエル当り１００μＱずつ加え、４゜Ｃに２４時間靜
置した。次にモノクローナル抗体溶液ヲ除去し、生理食
塩水で２回洗浄後、ｏ．ｉ％ＢＳＡ，Ｏ．ｌ％塩化ナト
リウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬
し、４℃で保存した。

（ｂ）１ステップサンドインチＥＩＡ法緩衝液Ａで希釈
した精製ヒトラミニン溶液あるいはヒトラミニンを含む
検体を９６穴ビニルプレ−１−　（　Ｆａｌｃｏｎｌ＆
　）にウェル当り２ＯｕＱずつ加えた。次に実施例３（
ａ）および同（ｂ）項で調製したＩｇＧ−ＰＯＤおよび
Ｆａｂ’−ＰＯＤ複合体１　ｕ９／ｒｍＱとなるように
緩衝液Ａで希釈し、上記ビニルプレートにウエル当り１
００μａずつ加え混合した。この混合溶液を前記（ａ）
項で調製した抗体結合プレートに１００ｕ１２加え、室
温で１時間反応させ、生理食塩水で２回洗浄した。次に
、０．０２％過酸化水素水含育Ｑ．１ＭクＪ．ン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した０．５１［９／　
ｍＯ．　ｏ　−　７　ｘ　ニレンジアミンをウエル当り
１００μＱ加え、室温でｌ５分間静直後、２Ｎ硫酸１０
０μＱを添加し、反応を停止させた。この反応混液のＡ
４，，をマイクロプレートリーダーを用いて測定し、標
準直線より検体中のラミニンＩを求めた（第３表参照）
。

（Ｃ）サンドインチＥＸＡ最適七ノクローナル抗体の選
択 ヒトラミニンを定量することが可能な最適モノクローナ
ル抗体の組合せを探す目的で、実施例１（ｉ）項記載の
方法で精製したクローンＨＬ４Ｈ３、２２−３ＢｌＯ，
　２２−７Ｃ５、２２−２６ＥＩＯおよび２２−２７Ｅ
７からの各モノクローナル抗体から、実施例３（ａ）項
記載の方法でＩｇＧ−ＰＯＤ複合体を調製した。一方、
上記と同一クローンのモノクローナル抗体を固相とし、
１．３μｇ　／　ｒａ　Ｑの精製ヒトラミニンを抗原に
して、上記５（ｂ）項記載のサンドイッチＥＩＡ法によ
りラミニンを定量した。その結果を第４表に示す。

／ 第３表 数値：Ａ４Ｂ クローン２２−２７Ｅ７からのモノクローナル抗体を固
相およびベルオキシダーゼ標識複合体に用いた場合、Ａ
４，，値が低かった。しかし、クローン２２−２７Ｅ７
からの抗体を除く他の４種類のクローンからの抗体、す
なわち１６通りの組合せにおいてＡ，，２値は高く、そ
れぞれの組合せについてヒトラミニンの添加量を変化さ
せ、サンドイッチＥＲＡ法によりラミニンを定量した。

クローン２２−３８ＩＯからの抗体を固相に、クローン
■Ｌ　４　Ｈ　３からの抗体を複合体（　ＩｇＧ−ＰＯ
Ｄ）とした場合に得られた標準直線を第２図に示した。

第２図で明らかなようにヒトラミニン０．０１〜２２ｎ
ｇの範囲で直線性が認められ、その定量感度はウエル当
り約１０ｐｇ　（　０．５ａｍｏ１）であった。実施例
３（ｂ）項記載の方法で調製したＦａｂ’−ＰＯＤ複合
体を用いた場合においても同様の結果が得られた。なお
、上記クローン２２−３８ＩＯおよびクローンＨＬ４Ｈ
３からの抗体以外の１４通りの組合せについても直線性
が認められ、そのいずれの組合せについてもサンドイッ
チＥＩＡ法によるラミニンの定量が可能であることが判
明した。

次に、ヒト血清中ラミニンを定量し、かつ健常者と肝疾
患患者との是を示すモノクローナル抗体の組合せを探す
目的で、クローン２２−２７Ｅ７を除くクローンＨＬ４
Ｈ３、２２−２６ＥＩ０，　２２−７Ｃ５８よび２２−
３８ＩＯからのモノクローナル抗体を固相およびＩ　ｇ
Ｇ−ＰＯＤ複合体として、健常者および肝疾患患者血清
中ラミニンを実施例５（ｂ）項記載のサンドイッチＥＩ
Ａ法により定量した（第５表）．，第５表で明らかなよ
うにｌ６通りの組合せにより、固相抗体としてクローン
２２−３ＢＩＯからの抗体、ベルオキシダーゼ標識複合
体としてクローンＨ　Ｌ　４　Ｈ　３からの抗体（Ｉｇ
Ｇ−ＰＯＤ）を用いた場合に最も良い結果が得られるこ
とが判明した。なお、複合体にＦａｂ’−ＰＯＤを用い
た場合、また固相抗体に第２表に示したクローン２２−
３ＢｌＯと同じグループのクローン２２−５Ｃ９、２２
−６８４、２２−８Ｅ９あるいは２２−１０ＨＩからの
抗体を用いても同様の結果が得られた。

実施例　６ 抗原の同定 サンドインチＥＩＡ法によって認識されている抗原が実
施例１　（ａ）項で胎盤より精製したヒトラミニンと同
一のものかを調べるために、健常者（　Ｎｏｒ）血清２
−と肝硬変患者（ＬＣ）血清Ｑ．５ｍｇおよび精製ヒト
ラミニン２μ９を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　７．０
）で２復Ｑに調整し、予め上記緩衝液で平衡化した旧ｔ
ｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　３４カラム（　１．５Ｘ　４５ｃ
＋ｘ）でゲル枦過した。実施例５（ｂ）項記載のサンド
イッチＥＩＡ法を若干改変した方法で、これらの溶出画
分のＡ，，，を測定した。すなわち、各溶出画分６０ｕ
Ｑをとり、１．７μｇ／ｙａ（１．に希釈した［ｇＧ−
ＰＯＤ複合体６０μａｈ混合し、この混合液１００μα
を抗体結合マイクロプレートに分注した。また、固相抗
体としてクローン２２−３８ＩＯからのモノクローナル
抗体、ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体としてクローンＨｌ、４Ｈ
３からのモノクローナル抗体を用いた。ザンドイツチＥ
ＩＡ法で得られたＡ４９２値を第３図に示した。ＬＣ患
者血清（一◆−）では、精製ヒトラミニン（一←）ど同
じ位置（約２００　ＫＤ）に１つのピークが認められた
。一方、Ｎｏｒ血清（−−−−−−）では、分子量約２
００　ＫＤ以外に約７０　ＫＤにピークが認められた。

実施例　７ サンドインチＥＩＡ法による健常者および肝疾患患者血
清中ラミニンの定量 クローン２２−３ＢＩＯからのモノクローナル抗体を固
相抗体およびクローンＨＬ４Ｈ３からの抗体ヲＩｇＧ−
ＰＯＤ複合体として、健常者血清２９検体、原発性肝癌
（ＨＣＣ）患者血清２５検体、慢性肝炎（ＣＨ）患者血
清６検体、肝硬変（ＬＣ）患者血清８検体および原発性
胆汁性肝硬変（　ＰＢＣ）患者血清ｌ３検体中のラミニ
ンを実施例５（ｂ）項記載のサンドイッチＥＩＡ法によ
り定量したその結果は、第４図に示すとおりである。第
４図に示されているように健常者血清ラミニン濃度が平
均１０２士１６．９ｎｇ／ｒａＱに対し、ＨＣＣ患者血
清では、平均３０５土１３６ｎｇ／　ｒａＱ，　ＣＨ患
者血清では、平均２２４土９５．４ｎ９／ｒａＱ，ＬＣ
患者血清では、平均２３６士６８．４ｎｇ／＋＊（！お
よびＰＢＣ患者血清では、平均２４４士９７．７ｎｇ／
　ｍＱであった。いずれの肝疾患患者血清ラミニン値も
健常者のそれと比較して有意な差（Ｐ　＜０．００１）
が認められた。なお、健常者の平均→一（標準偏差Ｘ　
２　’）　（Ｍ　＋２５Ｄ）をカットオフ値とした時、
ＨＣＣ，　ＣＨ，　ＬＣおよびＰＩ３Ｇ各患者の陽性率
は、それぞれ１００％、ｌＯＯ％、８８％および６９％
であった。

【図面の簡単な説明】

第ｌ図はヒトラミニンをＳＯＳ−ＰＡＧＥに供した後、
種々のモノクローナル抗体を用いた時のウエスタンブロ
ツテイングパターンを示す図であり、第２図は、２２−
３ＢＩＯ固相抗体、ＨＬ４Ｈ３　［ｇＧ−ＰＯＤ複合体
の測定系でのヒトラミニンの標準直線を示す図であり、
第３図は、Ｎｏｒ，　ＬＣ患者血清および精製ヒトラミ
ニンをゲルが過し、その溶出画分を２２−３８１０固相
抗体、ＨＬ４Ｈ３　１ｇＧ−ＰＯＤ複合体の測定系でラ
ミニンを定量した時のＡ，，２値を示した図である。第
４図は、２２−３ＢＩＯ固相抗体、ＨＬ４Ｈ３　１ｇＧ
−ＰＯＤ測定系での健常者、ＨＣＣ，　ＣＭ，　ＬＣお
よびＰＢＣ各患者血清中ラミニン濃度を示す図である。 図中縦棒はＭｌｆ：ＳＤを、点線は、鮭常者のＭ　＋　
２ＳＤを、０内数値は、検体数を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒトラミニンの抗原決定基に対し、特異的に結合す
   るモノクローナル抗体。 ２）ヒトラミニンで免疫したマウスの抗体産生細胞とマ
   ウスミエローマ細胞との融合により得られたハイブリド
   ーマを培養し、培養液またはマウス腹水中からヒトラミ
   ニンの抗原決定基に対して特異的に結合するモノクロー
   ナル抗体を取得することを特徴とする上記のモノクロー
   ナル抗体の製法。 ３）ヒトラミニンの異なる抗原決定基に対し、特異的に
   結合する２種類のモノクローナル抗体を用い、それらを
   固相担体に結合させる抗体および酵素を付与する抗体と
   して使用し、サンドイッチ法により酵素免疫学的な測定
   を行うことを特徴とするヒトラミニンの定量法。