JPH01131462A - 慢性関節リウマチ疾患の診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明はコラゲナーゼインヒビターを定量することによ
り慢性関節リウマチ疾患を診断する方法に関するもので
ある。さらに詳しくは、本発明はウシコラゲナーゼイン
ヒビター（ティシュ・インヒビター・オプ・メタロプロ
テアーゼ：ＴＩＭＰ）に対するモノクローナル抗体を用
いるサンドインチ法に基づく酵素免疫学的測定法による
ヒトコラゲナーゼインヒビターの測定法を手段とし、慢
性関節リウマチ疾患患者の血清中、血漿中あるいは関節
液中のコラゲナーゼインヒビター量がそれぞれ健常人の
血清中、血漿中あるいは関節液中のコラゲナーゼインヒ
ビター量に比べて明らかに高い値を示すことに基づいて
慢性関節リウマチ疾患の診断を行う方法に関するもので
ある。なお、上記の酵素免疫学的測定法とは、固相抗体
に結合させる抗体および酵素標識を付与する抗体として
コラゲナーゼインヒビターの異なる抗原決定基に対し特
異的に結合する２種類のモノクローナル抗体を用いるこ
とを特徴とするコラゲナーゼインヒビターの測定法を意
味する。

〔背景技術〕

従来、慢性関節リウマチ疾患の診断法としては、リウマ
チ因子の検出法に基づいたＲｏｓｅ法、Ｒｏｓｅ法のＨ
ｅ１ｆｅｒによる変法、ＲＡＨＡ−テストおよびＲＡ−
テストなどが用いられている。しかしながら、それらの
方法は複雑な実験方法を用いる点、あるいは診断までに
長い日数を要する点などの欠点を有する。

ところで、コラゲナーゼインヒビターは、ヒトおよびそ
の他の動物の骨、皮膚、歯髄、羊水、血液、関節液中お
よび関節軟骨細胞、滑液細胞、各種組織由来線維芽細胞
、線維肉腫細胞培養液中に存在することが知られている
。コラゲナーゼインヒビター量を測定する手段としては
、従来、その生物活性を測定することによる方法が知ら
れている。しかし、Ｊ、　　Ｌａｂ、　　Ｃｌ１ｎ、　
　Ｍｅｄ。

７５、２５８〜２６３（１９７３）にＥｉｓｅｎらが、
また、Ａｒｔｈ−ｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｍａｔ
ｉｓｍ　２７．２８５〜２９０（１９８４）にＣａｗｓ
ｔｏｎらが記載しているように、血清中、血漿中あるい
は関節液中の゛コラゲナーゼインヒビター活性を測定す
るには、それらの液中に、その測定を妨害する蛋白質、
たとえば、α２−マクログロブリンが存在するため、従
来知られている測定方法によっては、その測定は不可能
である。半月、岩田らは、先に、ウシコラゲナーゼイン
ヒビターに対するモノクローナル抗体を用い、サンドイ
ンチ法に基づく酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）を行うこ
とにより微量の試料で精度良く、簡伊かつ迅速にコラゲ
ナーゼインヒビターを特異的に定量する方法を開発した
が（特願昭６２−４２７８１号）、本発明者らは、ヒト
血清中、血漿中あるいは関節液中に存在するコラゲナー
ゼインヒビター量が、慢性関節リウマチ疾患にかかるこ
とにより明らかに増加することを発見し、血清中、血漿
中あるいは関節液中に存在するコラゲナーゼインヒビタ
ーの量を上記の酵素免疫学的測定法により測定すること
によって、慢性関節リウマチ疾患の診断を行い得ること
を見出しｔ；。

〔発明の開示〕

本発明は、固相単体に結合させる抗体および酵素標識を
付与する抗体としてウシコラゲナーゼインヒビターの異
なる抗原決定基に対し特異的に結合するモノクローナル
抗体を用いて、酵素抗体免疫学的測定法を行うことによ
り、血清中、血漿中あるいは関節液中に存在するヒトコ
ラゲナーゼインヒビターを定量し、その定量値を健常人
の示す値と比較することにより、被測定者が慢性関節リ
ウマチ疾患にかかっているか否かを診断する方法を提供
するものである。

本発明方法においては上記の酵素免疫学的測定法が用い
られるが、固相単体として抗原や抗体を受動的に良く吸
着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロ
ピレン製、あるいはポリビニール製のポール、マイクロ
プレート、スティック、試験管などの種々の材料および
使用形態が任意に選択、使用できる。一方、酵素標識を
付与する抗体としては、抗体含有物を硫安分画後、ＤＥ
ＡＥ　−５ｅｐｈａｃｅｌの如き陰イオン交換ゲルによ
り精製したＩｇＧ画分、さらにはペプシン消化後、還元
して得られる特異的結合部分Ｆａｂ’を用いることもで
きる。

本発明方法は、固相単体に結合させる抗体および酵素標
識を付与する抗体として、コラゲナーゼインヒビターの
異なる抗原決定基に対し、特異的に結合する２種類のモ
ノクローナル抗体の組み合わせを用いた固相抗体酵素免
疫学的測定法に基づいたヒトコラゲナーゼインヒビター
の定量を行い、その結果を、健常人の値と比較すること
によって、被測定者が、慢性関節リウマチ疾患にかかつ
ているか否かを診断するものである。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例　１ 抗ウシコラゲナーゼインヒビターモノクローナル抗体の
作製 （ａ）抗原−ウシコラゲナーゼインヒビターの調製 Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９６．３９５〜４０４（１９
８４）に記載の本発明者らの方法に従いウシ未萌出知歯
の根部歯髄をイーグルＭＥＭ培地（日本製薬製）で培養
した培養外液からＣｏｎ　Ａ−セファロース、ウシトロ
ゲルＡｃＡ　４４およびＤＥ−５２セルロースの各カラ
ムを用いてコラゲナーゼインヒビターを精製した。

精製インヒビターはＪ、　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、　
　録、５７９〜５９９（１９７３）に記載のＬａａｍｍ
ｌｉらの方法に従いドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で調べたとこ
ろ分子量約３２，０００ダルトン（Ｄ）の単一バンドを
示した。

（ｂ）抗体産生細胞の調製 ６退会のＢａ１ｂ／ｃ雌マウス２匹をまず７０インド完
全アジユバント中で、前記（ａ）で記述した精製ウシコ
ラゲナーゼインヒビターで初回免疫する。マウスにそれ
ぞれ４８μ９のウシコラゲナーゼインヒビターをＱ、４
ｍ１２の溶液として腹腔内投与する。さらに３０日目に
生理食塩水に溶解した８４μ９のウシコラゲナーゼイン
ヒビターを追加免疫する。最終免疫として５８日目に腹
腔内投与（９５μｇ１５００μα生理食塩水）により補
助免疫し、３日後にマウス牌臓を取り出し、牌細胞を調
製する。

（ｃ）細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いる。

ＲＰＭＩ　１６４０培地：　ＲＰＭＩ　Ｎｏ、　１６４
０（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ）に重炭
酸ナトリウム（１２ｍ１Ｊ）、ピルビン酸ナトリウム（
１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧカ
リウム（５０Ｕ／　ｍｄ）　、ＷＭ　ｒｌｌｔストレプ
トマイシン（５０μｇ／ｍＱ”）、および硫酸アミカシ
ン（１００μｇ／　ｍ（２）を加え、ドライアイスでｐ
Ｈを７．２にし、０．２μｍ東洋メンブレンフィルター
で除菌濾過する。

ＮＳ−１培地：上記ＲＰ旧１６４０培地に除菌濾過した
仔牛脂児血清（Ｍ、　Ａ、　　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ
）を１５％（ｖ／　ｖ）の濃度に加える。

ＰＥＧ　４，０００溶液：　ＲＰＭＩ　１６４０培地の
ポリエチレングリコール４．０００　（ＰＥ０４．００
０、Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ、。

Ｉｎｃ、）　５０％（ｗ／ｖ）無血清溶液を調製する。

８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＮＳ−１（Ｐ３−
ＮＳＩ−１）との融合は５ｅｌｅｃｔｅｄ’　Ｍｅｔｈ
ｏｄ　　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
（ｅｄ、　Ｂ、　Ｂ、　Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄＳ、Ｍ
、　Ｓｈｉｉｇｉ）　、Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａ
ｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）、３５１〜３７２に
記載のＯｌらの方法を若干改変して行った。

（２）前記（ｂ）で調製した有核牌臓細胞（生細胞率１
００％）とミエローマ細胞（生細胞率１００％）とを５
＝１の割合で融合する。牌臓細胞とミエローマ細胞とを
別に前記のＲＰＭ［１６４０培地で洗浄する。次に同じ
培地にけん濁し、融合させるため上記の割合で混合する
。容量５０ｍＱの円錐形スチロール樹脂製試験管（Ｉｗ
ａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）を用い、４０ｍＱ（７）　ＲＰＭ
ｌ　１６４０培地中４００Ｘ９．１０分間遠心し、上溝
を完全に吸出する。沈澱細胞に３７℃加温ＰＥＧ　４，
０００溶液１．３ｍ（２を穏やかに撹拌しながら１分間
で滴下し、さらに１分間撹拌し細胞を再けん濁、分散さ
せる。次に３７°Ｃ加温ＲＰＭＩ　１６４０培地１３ｍ
Ｑを１分間で滴下する。この操作をさらに１＠繰返した
後、同培地９ｍＱを２〜３分間で常に撹拌しながら滴下
し細胞を分散させる。これを４００Ｘｐ、１０分間遠心
分離し、上清を完全に吸引除去する。次にこの沈澱細胞
に３７℃加温ＭＳ−１培地１２．９＋ｃＱをすみやかに
加え、細胞の大きい塊りをＬＯｍＱのピペットを用いて
注意深くピペッティングして分散する。さらに同培地２
６ｍ４を加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロ
ウエル（Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）にウェル当り６．Ｏ
Ｘ　１０’個１０．ｌＩ＋ＩＱの細胞を加える。なお、
この時使用する９６穴マイクロウエルは前処理として０
．２ｍＱのＮＳ−１培地を加え、炭酸ガス培養器中（３
７°Ｃ）で−晩保温し、使用時に培地を吸引除去してお
く。細胞を加えた上記のマイクロウェルを７％炭酸ガス
／９３％空気中で温度３７℃、湿度１００％下に培養に
付する。

（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 （１）使用する培地は以下のとおりである。

ＨＡＴ培地：前記（Ｃ）で述べたＭＳ−１培地にさらに
ヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０，
４μＭ）、およびチミジン（１６μＭ）を加える。

ＨＴ培地ニアミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。

（２）前記（ｃ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞に
パスツールピペットでＨＡＴ培地２　ｍ　（約０．１ｍ
Ｑ）を加える。２．３．５．８．１１日目に培地の半分
（０，１ｍｆｆ１）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１
４４日目培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換える。

以降３〜４日毎に培地の半分を新しいＩＴ培地で置き換
える。通常２〜３週間で充分なハイブリドーマの生育が
観察される。ハイブリドーマ生育全ウェルについて次項
（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）に
より陽性ウェルをチエツクする。次にフィーダーとして
１０’個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１１ｎＱをポ
リスチレン族・２４穴セルウエル（Ｉｖａｋｉ　Ｇｌａ
ｓｓ）に加えｔ；ものを用い、上記で検出された各陽性
ハイブリドーマの全内容物を移す。これを前記（ｃ）に
おけると同様に７％炭酸ガス存在下、３７°Ｃで約１週
間培養に付する。その間１〜２回各ウェルの上溝０．５
ｍ（２を新しいＨＴ培地０．５ｍ＋２と交換する。ハイ
ブリドーマの充分生育した時点でＥＬＩＳＡ法により陽
性を再確認し、それぞれについて次項（ｆ）記載の限界
希釈法によるクローニングを行う。なお、クローニング
に使用後の残液をポリスチレン族２５ｃｍ”組織培養フ
ラスコ（Ｉｖａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）に移し、凍結保存用
試料を調製する。

（ｅ）固相−抗体結合テスト（ＥＬＩＳＡ）にょる抗つ
シコラゲナーゼインヒビター抗体産土ハイブリドーマの
検索 Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４．２０５〜２１
４（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干
改変した方法を用いる。この方法は、ハイブリドーマ抗
体の検出に適している。９６穴ミクロタイトレージヨン
プレー　ト（Ｆ−１ｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
　　Ｉｎｃ、）を０．５〜１．０μ分のウシコラゲナー
ゼインヒビターでコートし、次に、未コート部分を１％
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックする。これに前
記（ａ）で得られたハイブリドーマ生育ウェルの上清の
一部を加えて室温で約１時間インキュベートする。２次
抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウ
スイムノグロブリン（ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂ、）を加え
、さらに室温で約１時間インキュベートする。次に過酸
化水素と基質である０−７二二レンジアミンを加え生成
した褐色の程度を肉眼で定性的に判定するか、あるいは
コロナ２波長マイクロプレート光度計（ＩＪＴＰ−２２
、コロナ電気社）を用いて５００ｎｍの吸光度を測定す
る。

（ｆ）クローニング 前記（ｄ）の操作後、各ウェル中には２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ抗体得する。Ｎ５−１培地ｍα当りフィー
ダーとして１０７個のマウス胸腺細胞を含むクローニン
グ培地を調製し、９６六マイクロウエルの３６ウエル、
３６ウエル８よび２４ウエルにウェル当り５個、１個お
よび０．５個のハイブリドーマをカロえる。５日目、１
２２日目全ウェルに６約０．１ｍ（２のＮ５−１培地を
追加する。クローニング開始後１４〜１５日で充分なハ
イブリドーマの生育が認められ、コロニー形成陰性ウェ
ルが５０％以上である群についてＥＬＩＳＡ法を行う。

テストした全ウェルが陽性でない場合、抗体陽性ウェル
中のコロニー数を確認し、ウェル中にｌコロニーが確認
されたウェルを４〜６個選び再クローニングする。最終
的にウシコラゲナーゼインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ１７株が得られ　Ｉこ　。

（ｇ）モノクローナル抗体の生体外増殖および生体内増
殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、モ
ノクローナル抗体は、得られた各ハイブリドーマをＭＳ
−１培地などの適当な培養液で培養（生体外増殖）し、
その培養上清から得ることができる（モノクローナル抗
体たん白質濃度は１０−１００μｇ／ｒｎｎである）。

一方、大量に抗体を得るためには牌細胞とミエローマ細
胞の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃ、マウス）に
腫瘍形成促進剤ブリスタン（２，６，ｌＯ，１４−テト
ラメチルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａ１社）をマウス−匹当たり０．５ｍＱ腹腔内投与し、
１〜３週間後に、各ハイプリドーマｌＸｌ０’個を同じ
く腹腔的投与することにより生体内で、さらに、１〜２
週間後、モノクローナル抗体たん白質濃度４〜７ｍｇ／
ｒｎＱの腹水を得ることができる。

（ｈ）モノクローナル抗体の重鎮、軽鎖及びアイソタイ
プ 前記（ｇ）で得られた各々の腹水を先ずウシコラゲナー
ゼインヒビターをコートしたミクロタイトレージョンプ
レートに前述したＥｉＳＡ法に従って結合させる。ＰＢ
Ｓによる洗浄後火に、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウ
スＩｇ抗体（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
加える。ＰＢＳによる洗浄後、西洋わさびペルオキシダ
ーゼ漂識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋　Ｌ　）抗体を加え
、基質として２．２′−アジノージ（３−エチルベンゾ
チアゾリン硫酸−〇）および過酸化水素を用いて検出し
た。その結果をまとめて後掲の第１表に示した。得られ
たウシコラゲナーゼインヒビターに対するモノクローナ
ル抗体の内１５個が免疫グロブリン鎖γ１／にを、１個
がγ２ａ／にを、そして、１個がγ２ｂ／にを有してい
た。

（ｉ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｇ）で得られた各腹水を硫安分画（４０％飽和）
後、塩化ナトリウム０．０６Ｍを含む４０ｍＭリン酸緩
衝液、ｐＨ８、０で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃ
ｅｌ（ｐｈａｒｉａｃｉａ社）の非吸着画分を分取し、
このＩｇＧ画分を更に０．４２Ｍ塩化ナトリウムを含む
５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，４で平衡化した５ｅｐ
ｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−３００Ｓｕｐｅｒｆ　ｉｎｅ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ社）カラムでゲル濾過し、培地中のＦ
ＣＳおよびマウス由来のたん白質を分離、除去した。

実施例　２ ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターとモノクローナル抗
体との交叉性 （ａ）酵素標識モノクローナル抗体（Ｆａｂ’−ＰＯＤ
複合体）の調製法 （１）　Ｆａｂ’画分の調製 実施例１（ｉ）で得られたＩｇＧ画分をＯ，１Ｍ塩化ナ
トリウム含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２）に溶解
し、その溶液を以下述べるようにしてペプシンで消化し
た。すなわち、前記画分中のＩｇＧに対して２％（Ｗ／
Ｗ）のペプシンを加え、３７℃、２４時間消化した。更
にその消化物に２Ｍトリス溶液を加えてｐｕを７．０に
調整することにより消化反応を停止させ、Ｏ，１Ｍ　！
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したウシトロゲル
ＡｃＡ　４４カラム（ＬＫＢｌｌ　）を用いたゲル濾過
によりＦ（ａｂ’）、画分を分取しｔこ　。

次に、このＦ（ａｂ’）２画分をエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０
）中で透析し、終濃度１０ｍＭとなるようにアミノエタ
ンチオール（ＭＥＡ）を加え３７℃で１．５時間還元し
た後、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０，１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ６，０）で平衡化したウシトロゲルＡｃＡ　４４カ
ラムを用いてゲル濾過し、Ｆａｂ’画分を分取した。

（２）マレイミド標識ＰＯＤ画分の調製上記（１）の操
作とは別に、以下述べるようにして西洋ねさび由′来ペ
ルオキシダーゼ（ＰＯＤ）にマレイミドを標識した。す
なわち、ＰＯＤをｌ　Ｏｍ９／ｍ（ｌの量で０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、そのＰＯＤに対し
て、２５倍モル量のＮ−（ε−マレイミドカプロイルオ
キシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ）をジメチルホルムア
ミド溶液として加え、３０℃、３０分間反応させた。こ
れを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化した
セファデックスＧ−５０カラムでゲル濾過し、マレイミ
ド標識ＰＯＤ画分を分取した。

（３）　Ｆａｂ’−ＰＯＤ複合体画分の調製上記（１）
の如くして調製した画分中のＦａｂ’に対して上記（２
）で得られた画分中のマレイミド標識ＰＯＤとして等モ
ルになるようにして、両画分を混合し、更にＦａｂ’お
よびマレイミド標識ＰＯＤの終濃度が１００μＭとなる
ように５　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０−１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ６，０）で希釈した。この混合液を４°Ｃｌ２Ｏ時
間反応後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマレイ
ミドで未反応のチオール基をブロックした。これを０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化したウシトロ
ゲルＡｃＡ　４４カラムでゲル濾過し、Ｆａｂ’＝ＰＯ
Ｄ複合体画分を分取後、０．１％牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）及び０．００５％チメロサールを添加し、４°Ｃ
で保存した。

（ｂ）ウェスタンブロッティング 実施例１　（ａ）項で精製したウシ歯髄コラゲナーゼイ
ンヒビターを５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、市販のＰＯ
Ｄ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンおよび上記実施例２
（ａ）で得られたＦａｂ’−ＰＯＤ複合体を用いて細胞
工学１＆２．１０６１−１０６８（１９８３）に記載の
円部の方法に従ってウェスタンブロッティングを行い、
酵素抗体染色のパターンを得た。

これを第１図に示す。第１図において、Ａ及びＢはウェ
スタンブロッティング後のニトロセルロース膜をそれぞ
れ実施例２（ａ）で得られたＦａｂ’（クローン７−３
Ｆｌ）−ＰＯＤ複合体及びＦａｂ’（クローン７−２１
８１２）−ＰＯＤ複合体で免疫染色した結果を示すもの
である。

また、１〜１６は下記の各モノクローナル抗体（いずれ
もＩｇＧタイプ）の溶液にウェスタンブロッティング後
のニトロセルロース膜を浸した後、あらためて各ニトロ
セルロース膜をＰＯＤ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン
（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ製）で免
疫染色した結果を示すものである。

１：クローン７−３Ｆ１．２：クローン７−４Ｆ２．３
：クローン７−５Ａｌ、４：クローン７−６ＣＩ、５：
クロ一ン７−７Ｆ１１．６：クローン７−８Ｂ２．７：
クローン７−９Ｂ４．８：クローン７−１０ＥＩＩ、９
：クローン７−１１Ａ５、ｌＯ：クローン７−１２Ｂ６
．１１：クローン７−１５Ｅ８、Ｉ２：クローン７−１
８Ｆ３．１３：クローン７−１９Ｆ６．１４：クローン
７−２０Ｃ２，１５：クローン７−２１Ｂ１２．１６：
クローン７−２３Ｇ９゜第１図に示されるところから明
らかなように、上記のモノクローナル抗体は、いずれも
ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターと交叉することがわ
かった。

実施例　３ サンドインチ酵素免疫測定法 （ａ）モノクローナル抗体結合ボールの調製法Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　４．２０９〜３２７（１９８３
）に記載の石川らの方法に従って実施例１（ｉ）で得ら
れたモノクローナル抗体を０．１％アジ化ナトリウム含
有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、それ
を１００μｇ／ＩＩＱ（Ａ２．。−０，１５）の濃度に
調整した後、そのモノクローナル抗体溶液にポリスチレ
ンボール（径６−５ｍ＋ｘ、　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐ
ｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１ｌ製）を浸漬し、４°Ｃに２４時
間静置した。次にモノクローナル抗体溶液を除去した後
、０．１％ＢＳＡ。

０．１％塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウム
含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　（以下緩衝
液Ａと略記する）で５回洗浄した後、緩衝液Ａに浸し、
４℃で保存した。

（ｂ）サンドインチ測定法 精製したコラゲナーゼインヒビター溶液、あるいはコラ
ゲナーゼインヒビターを含む試料溶液を１％ＢＳＡを含
む緩衝液Ａで希釈し、各試験管に３０．０μａを加えた
。次に前記（ａ）項で調製した抗体結合ボールを加え、
３７℃で１時間振とう加温後（第１反応）　、０．１Ｍ
塩化ナトリウム含有１０ｍ１Ｊリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）　３　ｍ（ｌで各試験管を３回洗浄した。次に実施
例２（ａ）項で調製したＦａｂ’−ＰＯＤ複合体を２０
ｎｇ／試験管となるように０．１％ＢＳＡ及び０．１Ｍ
塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）で希釈し３０℃で１時間振とう加温した（第２反応）
。反応終了後、第１反応終了時と同様に洗浄した。次に
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）に溶解したＰＯＤ基
質、すなわち０．０１３４％テトラメチルベンチジン（
ＴＭＢＺ）を０．３ｍＱ加え、更に０．０１％過酸化水
素Ｑ、１ｍ（２を加えて３０°Ｃで１時間振とう加旦（
第３反応）後、１．３３Ｎ硫酸０　、６ｍ＋２を添加す
ることにより反応を停止させた。その反応混液のＡ４５
゜値を分光光度計で測定し、標準直線より試料中のコラ
ゲナーゼインヒビター量を求めた。

（Ｃ）サンドイッチ測定用モノクローナル抗体の選択 コラゲナーゼインヒビターを定量することが可能なモノ
クローナル抗体の組み合わせを探す目的で実施例１（ｉ
）項の方法で精製したクローン７−３Ｆｌ、７−６ＣＬ
　７−１９Ｆ６、および７−２１Ｂ１２の各モノクロー
ナル抗体からＦａｂ’−ＰＯＤ複合体を調製した。一方
、クローン７−３Ｆｌ、　７−４Ｆ２．７−５ＡＩ、７
−６Ｃ１，７−７Ｆｌｌ、？　−８Ｂ２．７−９Ｂ４．
７−　ｌ０ＥＩＩ、　７−１１Ａ５．７−１２Ｂ６．７
−１５Ｅ８，７−１８Ｆ３．７−１９Ｆ６．７−２０Ｃ
２，７−２１Ｂ１２、および７−２３Ｇ９の各モノクロ
ーナル抗体を固相として、試験管当たりｌｏｇの精製し
たウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターを用いて実施例３
（ｂ）項の方法によりサンドインチ定量を行った。得ら
れた八〇。値を後掲の第２表に示す。なお、第２表中の
ＡｊＳＯ値は試料１　ｎｇ添加の値からコラゲナーゼイ
ンヒビターを添加しない時の値を差し引いた数値である
。上記４種類のいずれのＦａｂ’−ＰＯＤ複合体を用い
た場合においても、固相として７−４Ｆ２．７−１ＩＡ
５．７−１２８６．７−１８Ｆ３．７−２０Ｃ２、およ
び７−２３０９の６種類の抗体を用いた時のＡ４５Ｏが
２以上の値を示した。次にこれら２４通りの組み合わせ
について、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの添加量
を変えてサンドインチ定量を行った。

Ｆａｂ’（クローン７−６Ｃ１）　−ＰＯＤを複合体と
して、クローン７−２３Ｃ９抗体を固相とした場合に得
られた結果を第２図に示す。第２図に示すように、添加
したウシ歯髄コラゲナーゼインヒビター量とＡ４５ａの
間に直線関係が成立し、定量感度は試験管当たり約１　
ｐｇ（３２ａ　ｍｏＱ）であった。上記以外の組み合わ
せについても上記の直線関係がみられ、いずれの組み合
わせについてもサンドインチ定量が可能であることがわ
かった。

実施例　４ ヒト血清中のコラゲナーゼインヒビターの同定（ａ）ア
フイニティ力ラムの調製 Ｎａｔｕｒｅ　２１４．１３０２〜１３０４（１９６７
）に記載のＡｘｏｎらおよびＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　６１６３６〜６４３
（１９６８）に記載のＣｕａｔｒｅｃａｓａｓらの方法
に従って臭化シアンを介して担体のセファロース４Ｂに
リガンドとして実施例１（ｉ）項で得られた精製モノク
ローナル抗体を固定化した。次に抗体結合セファロース
４Ｂゲル０．３ｍαをガラス管に充填し、Ｏ，１Ｍ塩化
ナトリウムおよび５ｍＭ塩化カルシウム含有３０ｍＭ　
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化し使用した
。

（ｂ）ヒト血清コラゲナーゼインヒビターの７フイニテ
イ力ラムクロマトグラフイー ヒト血清１ｍ１２を０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍ
Ｍ塩化カルシウム含有３０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ８，０）に対して透析した後、上記（＆）項記載の
方法に従って調製したクローン７−２１Ｂ１２抗体結合
セファロース４Ｂカラムに供し、上記緩衝液で洗浄しく
非吸着画分）、次にカラムを２Ｍ塩化ナトリウム含有３
０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　オＪ：び
０．５Ｍ塩化ナトリウム含有０．２Ｍグリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，５）で順次洗浄しく洗浄
画分）、最後にカラムに吸着した蛋白質を０．２Ｍグリ
シン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，０）で溶出した（溶出画分
）。得られた溶出画分を０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび
５ｍＭ塩化カルシウム含有３０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）中で透析した後、もう−度クローン７
−２１Ｂ１２抗体結合セファロース４Ｂカラムを用いた
再アフイニテイクロマトグラフィーに供し、上記と同様
の操作により溶出画分にコラゲナーゼインヒビターを得
た。そこで、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対す
るモノクローナル抗体がヒト血清　　くコラゲナーゼイ
ンヒビターと交叉するのか否かを検討するため、上記の
溶出画分を５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ウェスタンブ
ロッティングを行った。　　（第３図はウェスタンブロ
ッティング後のニトロセルロース膜をｌ：クローン７−
３Ｆ１．２：クローン７−６Ｃ１，３：　７−１９Ｆ６
．４：クローン７−２１Ｂ１２および５：クローン７−
２３Ｇ９の各モノクローナル抗体から調製したＦａｂ　
’−ＰＯＤ複合体で免疫染色を行った結果を示すもので
ある。第３図に示されるように、ヒト血清中にもウシ歯
髄コラゲナーゼインヒビターに対するモノクローナル抗
体と反応するコラゲナーゼインヒビターが存在すること
がわかった。しかも、それらの分子量はいずれも実施例
１　（ａ）項で得られたウシ歯髄コラゲナーゼインヒビ
ターのそれと同じ３２．０００Ｄであることがわかった
。

実施例　５ サンドインチ測定法によるヒト血清中のコラゲナーゼイ
ンヒビターの定量 ：ａ）標準直線の作成 ヒトコラゲナーゼインヒビターをサンドインチ定量する
のに最も適したモノクローナル抗体つ組み合わせについ
て検討した。実施例３（ｃ）項に示したように、ウシ歯
髄コラゲナーゼインヒビターを感度良く定量できる４種
類のＦａｂ’−ＰＯＤ複合体、すなわち、Ｆａｂ’（７
−３Ｆｌ）−ＰＯＤＳＦａｂ’（７−６Ｃ１）−ＰＯＤ
、　Ｆａｂ’（７−１９Ｆ６）−ＰＯＤおよびＦａｂ’
（７−２１Ｂ１２）−ＰＯＤと６種類の固相用抗体、す
なわち、クローン７−４Ｆ２．７−１１Ａ５．７−１２
Ｂ６．７−１８Ｆ３．７−２０Ｃ２および７−２３０９
のモノクローナル抗体を用いた２４通りの組み合わせの
うち、実施例４（ｂ）項に記載したとおりにカラムクロ
マトグラフィー処理したヒト血清コラゲナーゼインヒビ
ターを定量できる組み合わせを調べた。その結果、ヒト
血清コラゲナーゼインヒビターを抗原とした場合、用い
たほとんどの組み合わせでＡ４６゜のシグナルは全く検
出されなかったが、固相用抗体としてクローン７−２３
Ｃ９抗体、複合体としてＦａｂ’　（クローン７−６Ｃ
１）　−ＰＯＤを用いた場合、サンドインチ定量可能で
あることがわかった。次に、上記の組み合わせを用いて
、実施例３（ｃ）項に示した方法により、ヒト血清コラ
ゲナーゼインヒビターの添加量を変えてサンドイッチ定
量を行うことによって標準直線を作成し、得られた結果
を第４図に示す。第４図にみられるように、添加したヒ
ト血清コラゲナーゼインヒビター量とＡ４８Ｇの間に直
線関係が成立し、ヒトコラゲナーゼインヒビターの定量
が可能であることがわかった。しかし、その定量感度は
試験背当たり約１０ｐｇ（３２０ａ　ｍｏＱ）であり、
ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの場合の定量感度（
試験背当な”りｌｐｇ）に比べて１０倍低いことがわか
った。

（ｂ）サンドインチ測定法による健常人血清中および慢
性関節リウマチ患者血清中のコラゲナーゼインヒビター
の定量 上記（ａ）項に示したモノクローナル抗体の組み合わせ
を用いて、健常人血清５０検体および慢性関節リウマチ
患者血清１４検体の中に存在するコラゲナーゼインヒビ
ターをサンドインチ定量し、その結果を後掲の第３表に
宗した。なお、このサンドインチ定量においては、標準
直線の作成には抗原として実施例４（ｂ）項で精製した
ヒト血清コラゲナーゼインヒビターを用いた。

また、この定量は、検体血清を１％ＢＳＡを含む緩衝液
Ａで１，６００倍に希釈して行った。第３表に示した数
値は、同一の実験系を２回行った結果の平均値である。

第３表１こみられるように、健常人血清１　ｍ（ｌ中に
存在するコラゲナーゼインヒビター量は平均１．２３±
０　、２０Ｉｔｇであるのに対し、慢性関節リウマチ患
者血清Ｉｒｎａ中に存在するコラゲナーゼインヒビター
量は平均２．０８士０．５８μ９と高い値（ｐ　＜０．
００１）を示した。従って、血清中のコラゲナーゼイン
ヒビターをサンドインチ定量することにより、被測定者
が慢性関節リウマチ疾患にかかっているか否かを知るこ
とができる。

（Ｃ）サンドインチ測定法による健常人関節液中および
慢性関節リウマチ患者関節液中のコラゲナーゼインヒビ
ターの定量 上記（ｂ）項に示したのと同じ方法を用いて、健常人関
節液７検体および慢性関節リウマチ患者関節液５検体の
中に存在するコラゲナーゼインヒビターをサンドインチ
定量し、その結果を後掲の第４表に示した。第４表にみ
られるように、健常人関節液１　ｒａ（ｌ中に存在する
コラゲナーゼインヒビター量は平均２．３５±０．３６
μりであるのに対し、慢性関節リウマチ患者血清中に存
在するコラゲナーゼインヒビター量は平均９．４９±１
．７７μこと高い値（ｐ　＜　０．００１）を示した。

従って、関節液中に存在するコラゲナーゼインヒビター
をサンドインチ定量することにより、被測定者が、慢性
関節リウマチ疾患にかかっているか否かを知ることがで
きる。

実施例　６ ヒト血清中のコラゲナーゼインヒビターの精製 実施例４の（ｂ）で最終的に得られた溶出画分中には前
述したとおり、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対
するモノクローナル抗体と反応するコラゲナーゼインヒ
ビターが存在する（第３図参照）。しかし、コラゲナー
ゼインヒビター以外にも、上記モノクローナル抗体とは
反応しない蛋白質が多種存在することが認められた。そ
こで、この溶出画分をＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
５）で平衡化したＡｃＡ　４４カラムを用いてゲル濾過
を行い、コラゲナーゼインヒビターと他の蛋白質とを分
離することによりヒト血清コラゲナーゼインヒビターを
精製した。第５図は得られた血清コラゲナーゼインヒビ
ター（１）、対照としてのウシ歯髄コラゲナーゼインヒ
ビター（２）および分子量マーカー（３）の各５ＤＳ−
ＰＡＧＥパターンを示している。第５図にみられるよう
に、ヒト血清コラゲナーゼインヒビターの分子量はウシ
歯髄コラゲナーゼインヒビターのそれと同様、３２，０
ＯＯＤであることがわかった。

実施例　７ サンドインチ測定法における精製ヒト血清コラゲナーゼ
インヒビターの標準直線の作成実施例６において得られ
た精製ヒト血清コラゲナーゼインヒビターの添加量を変
えて、実施例５の（ａ）項記載のモノクローナル抗体の
組み合わせを用いてサンドインチ定量を行うことによっ
て標準直線を作成した。得られた結果は第６図に示すと
おりである。第６図にみられるように、添加したヒト血
清コラゲナーゼインヒビター量とＡ４５Ｏの間に直線関
係が成立し、この時の定量感度は試験管光たり１．５ｐ
９（４８ａ　ｍｏ１２）であった。この定量感度は、実
施例５の（ａ）項で作成した標準直線の場合に比べて６
．７倍高く、また、実施例３の（Ｃ）項記載のウシ歯髄
コラゲナーゼインヒビターの場合に比べて１．５倍低い
ことがわかった。

実施例　８ サンドイッチ測定法によるヒト体液中のコラゲナーゼイ
ンヒビターの定量に基づく慢性関節リウマチ疾患の診断 （ａ）サンドインチ測定法による健常人血清中および慢
性関節リウマチ疾患患者血清中のコラゲナーゼインヒビ
ターの定量 実施例７に示した標準直線に基づいて健常人血清５０検
体および慢性関節リウマチ患者血清１４検体の中に存在
するコラゲナーゼインヒビターをサンドインチ定量した
。その結果は後掲の第５表に示されている。なお、この
サンドインチ定量においては、標準直線の作成には抗原
として実施例６項で精製したヒト血清コラゲナーゼイン
ヒビターを用いた。また、この定量は、検体血清を１％
ＢＳＡを含む緩衝液Ａで１，６００倍に希釈して行った
。第５表に示した数値は、同一の実験系を２回行った結
果の平均値である。第５表にみられるように、健常人血
清ｌ　ｍＱ中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は
平均１８４±３１ｎｇであるのに対し、慢性関節リウマ
チ患者血清ｌ　ｍＱ中に存在するコラゲナーゼインヒビ
ター量は平均３１２±８７ｎｇと高い値（ｐ　＜　０−
００１）を示した。従って、血清中のコラゲナーゼイン
ヒビターをサンドインチ定量することにより、被測定者
が慢性関節リウマチ疾患にかかっているか否かを知るこ
とができる。

（ｂ）サンドインチ測定法による健常人血漿中および慢
性関節リウマチ疾患患者血漿中のコラゲナーゼインヒビ
ターの定量 Ｂｒ、　Ｊ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、　３３．２３９〜２
４７（１９７６）に記載のＬｕｄ　ｌａｍとＣａ５ｈの
方法に従って、健常人血液および慢性関節リウマチ疾患
患者血液からそれぞれの血漿を採取した。なお、ここで
採取した血漿は、血液にＥＤＴＡ、グロスタグランジン
Ｅ１、およびテオフィリンを加え冷却した後、４℃で１
９００Ｘ　９６０分間遠心分離して得られた上澄であり
、血液中の血小板は、分解されずに沈澱画分にとどまっ
ている。

上記の如くして得られた健常人血漿２６検体および慢性
関節リウマチ疾患患者血漿２４検体の中に存在する各コ
ラゲナーゼインヒビターヲ上記（ａ）項に示した方法と
同じ方法を用いてサンドイッチ定量した。その結果は後
掲の第６表に示すとおりである。第６表にみられるよう
に、健常人血漿ｌ　ｍＱ中に存在するコラゲナーゼイン
ヒビター量は平均６４±ＩＯｎｇであるのに対し、慢性
関節リウマチ疾患患者血漿中に存在するコラゲナーゼイ
ンヒビター量は平均８４±２３ｎｇと高い値（ｐ　＜　
０．００１）を示した。

（ｃ）サンドインチ測定法による健常人関節液中および
慢性関節リウマチ疾患患者関節液中のコラゲナーゼイン
ヒビターの定量 上記（ａ）項に示した方法と同じ方法を用いて、健常人
関節液７検体および慢性関節リウマチ疾患患者関節液５
検体の中に存在するコラゲナーゼインヒビターをサンド
イッチ定量した。その結果は、後掲の第７表に示すとお
りである。第７表にみられるように、健常人関節液１ｍ
（２中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は平均３
５７±５１ｎ９であるのに対し、慢性関節リウマチ疾患
患者血清中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は平
均１４２４±２６ｎｇと高い値（ｐ　＜　０．００１）
を示した。

従って、関節液中に存在するコラゲナーゼインヒビター
をサンドイッチ定量することにより、被測定者が、慢性
関節リウマチ疾患にかかつているか否か知ることができ
る。

実施例　９ モノクローナル抗体とコラゲナーゼインヒビターとの特
異的反応の確認 実施例４（ｂ）項に示したように、サンドイッチ測定法
に用いる２種類のモノクローナル抗体（クローン７−６
ＣＩとクローン７−２３Ｇ９）はヒトコラゲナーゼイン
ヒビターと反応するが、血清、血漿あるいは関節液など
のように、種々の蛋白質が高濃度で溶解している系中で
もこのモノクローナル抗体がコラゲナーゼインヒビター
と特異的に反応していることを確認するための試験を行
った。健常人血清あるいはりウマチ疾患患者血清をそれ
ぞれ０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭ塩化カルシウ
ム含有３０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で
５倍に希釈した後、実施例４（ａ）項記載の方法に従っ
て調製したクローン７−２３Ｇ９（サンドインチ測定法
の固相用抗体）結合セファロース４Ｂカラムに供し、実
施例４の（ｂ）項記載の方法に従って溶出画分を得た。

この溶出画分を５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ウェスタ
ンブロッティングを行い、サンドイッチ測定法の標識抗
体であるＦａｂ’（クローン？−６Ｃ１）−ｐｏｏ複合
体で免疫染色を行った。その結果は第７図に示すとおり
である。この第７図に見られるように、■＝精製ヒト血
清コラゲナーゼインヒビター、２：健常人血清、３：リ
ウマチ疾患患者血清のいずれを用いた場合にも、単一バ
ンドを示すことから、本発明の診断法におけるサンドイ
ンチ測定法により、極めて特異的にコラゲナーゼインヒ
ビターが定量されていることが示された。

以上述べたことから明らかなように、本発明方法を用い
ることにより、慢性関節リウマチ疾患の診断を、簡便に
、短時間内にさらに感度良く行うことができる。

第　　１　　表 クローン番号　　　サブクラス／鎖 ７−３ＦＩ　　　　　　ＩｇＧ１／に ７−４Ｆ２　　　　　　＋ｇＧ１／に ７−５Ａ１　　　　　　［ｇＧｌ／に ７＝　６Ｃ１１ｇＧ１／に ７−７Ｆ１１　　　　　１ｇＧ１／に ７　８Ｂ２　　　　　１ｇＧ２ａ／　ｘ７−９Ｂ４　　
　　　１ｇＧ１／に ７−１０ＥＩＩ　　　　　ＩｇＧ１／に７−１１Ａ５　
　　　　１ｇＧ１／に ７−１２Ｂ６　　　　　１ｇＧ１／に ７−１４Ｅ９　　　　　１ｇＧ１／に ７−１５Ｅ８　　　　　１ｇＧ１／に ７−１８Ｆ３　　　　　　ｒｇＧ２ｔ＋／に７−１９Ｆ
６　　　　　１ｇＧ１／に ７−２０Ｃ２１ｇＧ１／に ７−２１Ｂ１２　　　　　［ｇＧｌ／に７−２３Ｇ９　
　　　　１ｇＧ１／に 第３表 第４表 第５表 第６表 第７表

【図面の簡単な説明】

第１図はウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターを５ＤＳ−
ＰＡＧＥに供した後、種々のモノクローナル抗体を用い
た時のウェスタンブロッティングパターンを示す図であ
り、第２図は固相７−２３０９抗体−複合体Ｆａｂ’（
７−６Ｃ１）−ＰＯＤ測定系でのウシ歯髄コラゲナーゼ
インヒビターの標準直線を示す図であり、第３図はヒト
血清コラゲナーゼインヒビターを５ＤＳ−ＰＡＧＥに供
した後、ウェスタンブロッティングを行った時の免疫染
色のパターンを示す図であり、第４図は固相７−２３Ｇ
９抗体−複合体Ｆａｂ’（７−６ＣＩ）−ＰＯＤ測定系
でのヒト血清コラゲナーゼインヒビターの標準直線を示
す図であり、第５図はヒト血清から精製したコラゲナー
ゼインヒビターの５ＯＳ−ＰＡＧＥパターンを示す図で
あり、第６図は精製したヒト血清コラゲナーゼインヒビ
ターを用いて、サンドインチ測定した時の標準直線を示
す図であり、第７図はヒト血清をＩｇＧＣ７−２３６９
）抗体結合アフイニテイ力ラムに供して得られた溶出画
分を５Ｏ３−ＰＡＧＥに供した後、Ｆａｂ’（７−６Ｃ
Ｉ）−ＰＯＤ複合体を用いた時のウェスタンブロッティ
ングパターンを示す図である。 特許出願人　富士薬品工業株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コラゲナーゼインヒビターの異なる抗原決定基に対し、
   特異的に結合する２種類のモノクローナル抗体の組み合
   わせを用いたサンドイッチ法により、酵素免疫学的に血
   清中、血漿中あるいは関節液中に存在するコラゲナーゼ
   インヒビターを定量し、その定量値を健常人の値と比較
   することを特徴とする慢性関節リウマチ疾患の診断法。