JPH11151085A - 抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及びそれを用いる免疫学的測定方法 - Google Patents
抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及びそれを用いる免疫学的測定方法Info
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- JPH11151085A JPH11151085A JP9336303A JP33630397A JPH11151085A JP H11151085 A JPH11151085 A JP H11151085A JP 9336303 A JP9336303 A JP 9336303A JP 33630397 A JP33630397 A JP 33630397A JP H11151085 A JPH11151085 A JP H11151085A
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 顆粒球に存在するセリンプロテアーゼの
一種であるメダラシンを測定できるモノクローナル抗体
及び該抗体を利用したヒトメダラシンの免疫学的測定方
法を提供する。 【解決手段】 ヒトメダラシンを特異的に認識する抗ヒ
トメダラシンモノクローナル抗体、ヒトメダラシンで免
疫した動物から採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞との
細胞融合により作製したハイブリドーマを培養し、培養
物より抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を採取する
ことを特徴とする抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体
の製造方法及び該抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体
を利用するヒトメダラシンの免疫学的測定方法。
一種であるメダラシンを測定できるモノクローナル抗体
及び該抗体を利用したヒトメダラシンの免疫学的測定方
法を提供する。 【解決手段】 ヒトメダラシンを特異的に認識する抗ヒ
トメダラシンモノクローナル抗体、ヒトメダラシンで免
疫した動物から採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞との
細胞融合により作製したハイブリドーマを培養し、培養
物より抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を採取する
ことを特徴とする抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体
の製造方法及び該抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体
を利用するヒトメダラシンの免疫学的測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術】本発明は、抗ヒトメダラシンモノ
クローナル抗体、その製造方法及び該抗体を利用してヒ
トメダラシンを測定する免疫学的測定方法に関する。
クローナル抗体、その製造方法及び該抗体を利用してヒ
トメダラシンを測定する免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】セリンプロテアーゼの一種であるメダラ
シンは顆粒球等に存在し、炎症、特に慢性炎症の発現を
含めて広く生体防御機構において重要な役割を演じてい
ると考えられる。顆粒球メダラシンは多くの慢性炎症性
疾患の憎悪期で増大し、寛解期で正常化するが、多発性
硬化症の患者では憎悪する数日前に著増し、寛解に先行
して正常化することが認められている。多発性硬化症
は、中枢神経系の白質に限局性の脱髄巣とグリオーシス
の出現を特徴とし、寛解と悪化を繰り返しながら進行
し、多くは、１０〜１５年の経過で死亡すると云う慢性
炎症性の難病であり、原因については、未だ、はっきり
とは解明されていないが、ウィルスや細菌が免疫系を刺
激して抗体が自らの神経組織を攻撃する自己免疫疾患の
一種ではないかと考えられている。また、その診断法は
なかなか難しく、核磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）等によっ
て行なわれているのが現状であるが、ＭＲＩ等の方法は
非常に大がかりな装置を用い、測定操作も熟練を要し、
経費もかかるので、簡便な検査で病気の診断、病勢の把
握、予後の推定等が行なえる方法の開発が検討されてい
る。このような方法として、血液中の顆粒球メダラシン
活性の測定方法が研究され、アポーオルニチン−トラン
スアミナーゼに対する不活性化能による方法が開発され
ている。しかし、顆粒球メダラシン活性の酵素化学的方
法による測定は非常に煩雑であるので、簡便な免疫学的
測定方法の開発が試みられ、ポリクローナル抗体を用い
る免疫測定方法が行なわれている。
シンは顆粒球等に存在し、炎症、特に慢性炎症の発現を
含めて広く生体防御機構において重要な役割を演じてい
ると考えられる。顆粒球メダラシンは多くの慢性炎症性
疾患の憎悪期で増大し、寛解期で正常化するが、多発性
硬化症の患者では憎悪する数日前に著増し、寛解に先行
して正常化することが認められている。多発性硬化症
は、中枢神経系の白質に限局性の脱髄巣とグリオーシス
の出現を特徴とし、寛解と悪化を繰り返しながら進行
し、多くは、１０〜１５年の経過で死亡すると云う慢性
炎症性の難病であり、原因については、未だ、はっきり
とは解明されていないが、ウィルスや細菌が免疫系を刺
激して抗体が自らの神経組織を攻撃する自己免疫疾患の
一種ではないかと考えられている。また、その診断法は
なかなか難しく、核磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）等によっ
て行なわれているのが現状であるが、ＭＲＩ等の方法は
非常に大がかりな装置を用い、測定操作も熟練を要し、
経費もかかるので、簡便な検査で病気の診断、病勢の把
握、予後の推定等が行なえる方法の開発が検討されてい
る。このような方法として、血液中の顆粒球メダラシン
活性の測定方法が研究され、アポーオルニチン−トラン
スアミナーゼに対する不活性化能による方法が開発され
ている。しかし、顆粒球メダラシン活性の酵素化学的方
法による測定は非常に煩雑であるので、簡便な免疫学的
測定方法の開発が試みられ、ポリクローナル抗体を用い
る免疫測定方法が行なわれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ポリク
ローナル抗体を用いるヒトメダラシンの免疫測定方法
は、抗体の反応性が必ずしも充分ではなく、測定時間が
長く、測定操作も若干煩雑であり、迅速、簡便にヒトメ
ダラシンを測定できるモノクローナル抗体を用いる免疫
測定方法の開発が望まれていたが、本発明は上記事情に
鑑みなされたもので、ヒトメダラシンを特異的に認識す
るモノクローナル抗体を製造し、これを用いてヒトメダ
ラシンを特異的にかつ迅速、簡便に測定する方法を提供
することを課題とする。
ローナル抗体を用いるヒトメダラシンの免疫測定方法
は、抗体の反応性が必ずしも充分ではなく、測定時間が
長く、測定操作も若干煩雑であり、迅速、簡便にヒトメ
ダラシンを測定できるモノクローナル抗体を用いる免疫
測定方法の開発が望まれていたが、本発明は上記事情に
鑑みなされたもので、ヒトメダラシンを特異的に認識す
るモノクローナル抗体を製造し、これを用いてヒトメダ
ラシンを特異的にかつ迅速、簡便に測定する方法を提供
することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意研究を行なった結果、ヒト顆粒球
より分離精製したヒトメダラシンで免疫してから採取し
た抗体産生細胞と骨髄腫細胞の細胞融合により作製した
ハイブリドーマを培養するケラー−ミルシュタインの方
法により抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を製造
し、更に、該抗体を利用することによりヒトメダラシン
を特異的にかつ迅速、簡便に測定できることを見い出
し、本発明に到達したものである。
を達成するために鋭意研究を行なった結果、ヒト顆粒球
より分離精製したヒトメダラシンで免疫してから採取し
た抗体産生細胞と骨髄腫細胞の細胞融合により作製した
ハイブリドーマを培養するケラー−ミルシュタインの方
法により抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を製造
し、更に、該抗体を利用することによりヒトメダラシン
を特異的にかつ迅速、簡便に測定できることを見い出
し、本発明に到達したものである。
【０００５】従って、本発明の第一は、ヒトメダラシン
を特異的に認識する抗ヒトメダラシンモノクローナル抗
体に関するものである。
を特異的に認識する抗ヒトメダラシンモノクローナル抗
体に関するものである。
【０００６】また、本発明の第二は、ヒトメダラシンで
免疫した動物から採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
の細胞融合により作製したハイブリドーマを培養し、そ
の培養物よりヒトメダラシンを特異的に認識する抗ヒト
メダラシンモノクローナル抗体を採取することを特徴と
する抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の製造方法に
関するものである。
免疫した動物から採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
の細胞融合により作製したハイブリドーマを培養し、そ
の培養物よりヒトメダラシンを特異的に認識する抗ヒト
メダラシンモノクローナル抗体を採取することを特徴と
する抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の製造方法に
関するものである。
【０００７】更に、本発明の第三は、不溶性担体に固定
化した抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体と標識抗ヒ
トメダラシンモノクローナル抗体とを用い、試料中のヒ
トメダラシンと抗原抗体反応によりサンドイッチ錯体を
形成させてヒトメダラシンを不溶性担体上に捕捉した
後、該錯体中の標識を定量することを特徴とするヒトメ
ダラシンの免疫学的測定方法に関するものである。
化した抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体と標識抗ヒ
トメダラシンモノクローナル抗体とを用い、試料中のヒ
トメダラシンと抗原抗体反応によりサンドイッチ錯体を
形成させてヒトメダラシンを不溶性担体上に捕捉した
後、該錯体中の標識を定量することを特徴とするヒトメ
ダラシンの免疫学的測定方法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の抗ヒトメダラシンモノク
ローナル抗体は、健常人血液から分離した顆粒球より抽
出したヒトメダラシンで免疫した動物から採取した抗体
産生細胞と骨髄腫細胞の細胞融合によって作製したハイ
ブリドーマを培地上で培養するか、又は、動物腹腔内に
投与して腹水中で増殖させた後、該培養物又は腹水から
採取することにより製造される。
ローナル抗体は、健常人血液から分離した顆粒球より抽
出したヒトメダラシンで免疫した動物から採取した抗体
産生細胞と骨髄腫細胞の細胞融合によって作製したハイ
ブリドーマを培地上で培養するか、又は、動物腹腔内に
投与して腹水中で増殖させた後、該培養物又は腹水から
採取することにより製造される。
【０００９】本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、いわゆる細胞融合に
よって製造される。即ち、抗原としてヒトメダラシンを
用いて免疫した動物から抗体産生細胞を調製し、これを
骨髄腫細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを選択
的に増殖させ、該ハイブリドーマから抗体産生ハイブリ
ドーマを検索し、クローニングにより目的とするモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。
抗体を産生するハイブリドーマは、いわゆる細胞融合に
よって製造される。即ち、抗原としてヒトメダラシンを
用いて免疫した動物から抗体産生細胞を調製し、これを
骨髄腫細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを選択
的に増殖させ、該ハイブリドーマから抗体産生ハイブリ
ドーマを検索し、クローニングにより目的とするモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。
【００１０】抗体産生細胞としては、例えばヒトメダラ
シン又はこれを含有する組成物もしくは細胞を投与して
免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ
−リンパ球等が挙げられる。免疫する動物としてはマウ
ス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられ
る。免疫は、例えばヒトメダラシンをそのまま又は適当
なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内或いは腹腔内
に約１μｇ〜１ｍｇ／回を１〜２回／月、１〜６ケ月間
投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離
は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取するこ
とにより行なわれる。
シン又はこれを含有する組成物もしくは細胞を投与して
免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ
−リンパ球等が挙げられる。免疫する動物としてはマウ
ス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられ
る。免疫は、例えばヒトメダラシンをそのまま又は適当
なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内或いは腹腔内
に約１μｇ〜１ｍｇ／回を１〜２回／月、１〜６ケ月間
投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離
は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取するこ
とにより行なわれる。
【００１１】骨髄腫細胞としては、マウス、ラット由来
のもの等が使用できる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは
同種動物由来であることが好ましい。
のもの等が使用できる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは
同種動物由来であることが好ましい。
【００１２】細胞融合の方法は任意であるが、例えばダ
ルコッペ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗
体産生細胞と骨髄腫細胞とポリエチレングリコール等の
融合促進剤の存在で混合することにより行なうことがで
きる。
ルコッペ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗
体産生細胞と骨髄腫細胞とポリエチレングリコール等の
融合促進剤の存在で混合することにより行なうことがで
きる。
【００１３】細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈
し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁
して培養することによりハイブリドーマを選択する。次
いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイ
ブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニング
を行ない、本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを得る。
し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁
して培養することによりハイブリドーマを選択する。次
いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイ
ブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニング
を行ない、本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを得る。
【００１４】斯くして得られた抗体産生ハイブリドーマ
を利用して本発明のモノクローナル抗体を製造するに
は、該ハイブリドーマを適当な培地中又は生体内で培養
し、該培養物からモノクローナル抗体を採取することに
よって行なわれる。就中、モノクローナル抗体を大量に
製造するには、該ハイブリドーマを骨髄腫細胞の由来細
胞と同種の動物の腹腔内に投与し、その腹水中に本発明
のモノクローナル抗体を蓄積させ、該腹水から採取する
方法が好ましい。抗体産生ハイブリドーマの腹腔内投与
に先だって動物にプリスタン等の鉱物油を投与するのが
好ましい。
を利用して本発明のモノクローナル抗体を製造するに
は、該ハイブリドーマを適当な培地中又は生体内で培養
し、該培養物からモノクローナル抗体を採取することに
よって行なわれる。就中、モノクローナル抗体を大量に
製造するには、該ハイブリドーマを骨髄腫細胞の由来細
胞と同種の動物の腹腔内に投与し、その腹水中に本発明
のモノクローナル抗体を蓄積させ、該腹水から採取する
方法が好ましい。抗体産生ハイブリドーマの腹腔内投与
に先だって動物にプリスタン等の鉱物油を投与するのが
好ましい。
【００１５】培養物または腹水からの本発明のモノクロ
ーナル抗体の分離は、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安
分画法、陰イオン交換体もしくはプロテインＡ、Ｇ等の
カラムによるクロマトグラフィーによって行なうことが
できる。
ーナル抗体の分離は、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安
分画法、陰イオン交換体もしくはプロテインＡ、Ｇ等の
カラムによるクロマトグラフィーによって行なうことが
できる。
【００１６】斯くして得られた本発明の抗ヒトメダラシ
ンモノクローナル抗体は、これを産生するハイブリドー
マの種類により３Ｆ０３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１
Ｇ１２の４種類存在する。これらのモノクローナル抗体
は、いずれもグロブリンクラスはＩｇＧで、サブクラス
はＩｇＧ1 であり、いずれの抗体も抗原であるヒトメダ
ラシンと特異的に反応する。
ンモノクローナル抗体は、これを産生するハイブリドー
マの種類により３Ｆ０３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１
Ｇ１２の４種類存在する。これらのモノクローナル抗体
は、いずれもグロブリンクラスはＩｇＧで、サブクラス
はＩｇＧ1 であり、いずれの抗体も抗原であるヒトメダ
ラシンと特異的に反応する。
【００１７】従って、本発明の抗ヒトメダラシンモノク
ローナル抗体を利用することによりヒトメダラシンを免
疫学的に測定することができる。本発明のモノクローナ
ル抗体を利用してヒトメダラシンを測定する方法は任意
であるが、不溶性担体に固定化した該モノクローナル抗
体に標識化抗原の存在で試料中の抗原を反応させる競合
法、又は不溶性担体に固定化した該モノクローナル抗体
に試料中の抗原を反応させて捕捉した後標識化した該モ
ノクローナル抗体を反応させて抗体−抗原−抗体からな
るサンドイッチ錯体を形成させるサンドイッチ法等が好
適に用いられる。このサンドイッチ法による酵素免疫測
定方法においては、サンドイッチ錯体を形成させるため
には不溶性担体に固定化した固定化抗体と標識化抗体と
は抗原に対する反応部位が異なることが必要であり、従
って、一般的にはエピトープの異なるモノクローナル抗
体の組み合わせを用いて測定系を構成するが、本発明の
モノクローナル抗体２Ｅ０４においては同一のモノクロ
ーナル抗体を固定化抗体及び標識抗体に用いてもヒトメ
ダラシンの免疫学的測定系を構成することが可能であっ
た。これはヒトメダラシンが分子内に同一アミノ酸配列
を有するエピトープを有するためである。これらの測定
方法に使用される不溶性担体としては、ポリスチレン等
のプラスチック製ビーズ、又はマイクロプレート等が挙
げられる。標識化抗体の標識物質としては、酵素、蛍光
物質、発光物質及び放射性物質等を使用するのが有利で
ある。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、蛍光物質と
しては、フルオレッセインイソシアネート、フィコビリ
プロテイン等、発光物質としては、ルミノール類、ジオ
キセタン類、アクリジニウム塩類等、放射性物質として
は 125Ｉ、 131Ｉ、 111Ｉｎ、 99mＴｃ等を非限定的に
挙げることができる。標識物質が酵素である場合には、
その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍
光剤、及び発光剤等が用いられる。酵素としてペルオキ
シダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素等を
用い、発色剤として２，２’−アジノジ［３−エチルベ
ンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴ
Ｓ）、５−アミノサリチル酸、ｏ−フェニレンジアミ
ン、４−アミノアンチピリン、３，３’，５，５’−テ
トラメチルベンジジン等、蛍光剤としては４−ヒドロキ
シフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロ
ピオン酸等、発光剤としてはルミノール類等、酵素とし
てアルカリホスファターゼを用いる場合には、基質とし
て４−ニトロフェニルホスフェート、４−メチルウムベ
リフェリルホスフェート、コルチゾール−２１−ホスフ
ェート等、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用い
る場合には、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド、４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ
−４（３''−β−Ｄ−ガラクトシルオキシフェニル）−
１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）等を用いることが
できる。
ローナル抗体を利用することによりヒトメダラシンを免
疫学的に測定することができる。本発明のモノクローナ
ル抗体を利用してヒトメダラシンを測定する方法は任意
であるが、不溶性担体に固定化した該モノクローナル抗
体に標識化抗原の存在で試料中の抗原を反応させる競合
法、又は不溶性担体に固定化した該モノクローナル抗体
に試料中の抗原を反応させて捕捉した後標識化した該モ
ノクローナル抗体を反応させて抗体−抗原−抗体からな
るサンドイッチ錯体を形成させるサンドイッチ法等が好
適に用いられる。このサンドイッチ法による酵素免疫測
定方法においては、サンドイッチ錯体を形成させるため
には不溶性担体に固定化した固定化抗体と標識化抗体と
は抗原に対する反応部位が異なることが必要であり、従
って、一般的にはエピトープの異なるモノクローナル抗
体の組み合わせを用いて測定系を構成するが、本発明の
モノクローナル抗体２Ｅ０４においては同一のモノクロ
ーナル抗体を固定化抗体及び標識抗体に用いてもヒトメ
ダラシンの免疫学的測定系を構成することが可能であっ
た。これはヒトメダラシンが分子内に同一アミノ酸配列
を有するエピトープを有するためである。これらの測定
方法に使用される不溶性担体としては、ポリスチレン等
のプラスチック製ビーズ、又はマイクロプレート等が挙
げられる。標識化抗体の標識物質としては、酵素、蛍光
物質、発光物質及び放射性物質等を使用するのが有利で
ある。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、蛍光物質と
しては、フルオレッセインイソシアネート、フィコビリ
プロテイン等、発光物質としては、ルミノール類、ジオ
キセタン類、アクリジニウム塩類等、放射性物質として
は 125Ｉ、 131Ｉ、 111Ｉｎ、 99mＴｃ等を非限定的に
挙げることができる。標識物質が酵素である場合には、
その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍
光剤、及び発光剤等が用いられる。酵素としてペルオキ
シダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素等を
用い、発色剤として２，２’−アジノジ［３−エチルベ
ンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴ
Ｓ）、５−アミノサリチル酸、ｏ−フェニレンジアミ
ン、４−アミノアンチピリン、３，３’，５，５’−テ
トラメチルベンジジン等、蛍光剤としては４−ヒドロキ
シフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロ
ピオン酸等、発光剤としてはルミノール類等、酵素とし
てアルカリホスファターゼを用いる場合には、基質とし
て４−ニトロフェニルホスフェート、４−メチルウムベ
リフェリルホスフェート、コルチゾール−２１−ホスフ
ェート等、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用い
る場合には、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド、４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ
−４（３''−β−Ｄ−ガラクトシルオキシフェニル）−
１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）等を用いることが
できる。
【００１８】
【実施例】以下、参考例と共に実施例を示し、本発明を
具体的に説明するが、本発明は実施例等に限定されるも
のではない。尚、実施例中の％は重量％を意味する。
具体的に説明するが、本発明は実施例等に限定されるも
のではない。尚、実施例中の％は重量％を意味する。
【００１９】［参考例１］健常人血液４００ｍｌに、デ
キストラン（分子量２００，０００〜３００．０００）
の６％生理食塩水溶液を血液：デキストラン水溶液＝
２：１の割合で混合し、ガラス棒等で軽くかき混ぜてか
ら、４〜８℃の温度で約１時間静置した後、沈殿した赤
血球を上清と分離し、この上清を１５，０００ｒｐｍで
遠心分離して沈殿を採取して白血球を得た。次に、この
白血球に１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩
（ＥＤＴＡ）、１ｍＭｐ−クロロマーキュリー安息香酸
（ＰＣＭＢ）を含むｐＨ7.0 の１Ｍリン酸カリウム緩衝
液（ＰＫＢ）からなる抽出用液を加えて、攪拌下に３７
℃の温度で２０分間インキュベートした後、１５秒間超
音波破砕機にかけて完全に細胞を破砕し、更に、３７℃
の温度で２０分間インキュベートしてから、４℃の温度
において１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上
清を採取し、この上清を蒸留水に対して透析し、沈渣は
上記と同様の操作を数回繰り返して抽出を行なった。次
いで、この抽出液を５０ｍＭＰＫＢ（ｐＨ6.0 ）で平衡
化したＣＭ−セファロースゲルカラムに通した後、同じ
緩衝液で洗浄してから、１ＭＰＫＢ（ｐＨ6.0 ）で吸着
物を溶出し、溶出液を蒸留水に対して一晩透析して脱塩
してから、コロジオン膜で濃縮することにより、精製ヒ
トメダラシン１．５ｍｇが得られた。
キストラン（分子量２００，０００〜３００．０００）
の６％生理食塩水溶液を血液：デキストラン水溶液＝
２：１の割合で混合し、ガラス棒等で軽くかき混ぜてか
ら、４〜８℃の温度で約１時間静置した後、沈殿した赤
血球を上清と分離し、この上清を１５，０００ｒｐｍで
遠心分離して沈殿を採取して白血球を得た。次に、この
白血球に１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩
（ＥＤＴＡ）、１ｍＭｐ−クロロマーキュリー安息香酸
（ＰＣＭＢ）を含むｐＨ7.0 の１Ｍリン酸カリウム緩衝
液（ＰＫＢ）からなる抽出用液を加えて、攪拌下に３７
℃の温度で２０分間インキュベートした後、１５秒間超
音波破砕機にかけて完全に細胞を破砕し、更に、３７℃
の温度で２０分間インキュベートしてから、４℃の温度
において１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上
清を採取し、この上清を蒸留水に対して透析し、沈渣は
上記と同様の操作を数回繰り返して抽出を行なった。次
いで、この抽出液を５０ｍＭＰＫＢ（ｐＨ6.0 ）で平衡
化したＣＭ−セファロースゲルカラムに通した後、同じ
緩衝液で洗浄してから、１ＭＰＫＢ（ｐＨ6.0 ）で吸着
物を溶出し、溶出液を蒸留水に対して一晩透析して脱塩
してから、コロジオン膜で濃縮することにより、精製ヒ
トメダラシン１．５ｍｇが得られた。
【００２０】［実施例１］ 抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の製造 （１）抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合による
ハイブリドーマの作製 参考例１でヒト顆粒球から抽出、精製したヒトメダラシ
ンを、フロイント完全アジュバントで乳化し、７週齢の
ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に５０μｇ／匹の量で投与し
た。そして、４週間後にこのマウスに初回と同様の方法
で追加免疫を行ない、７日後に血中に抗体量が増大した
ことを確認した後、更に、その７日後に最終免疫として
抗原を腹腔に５０μｇ／匹の量で投与した。一方、２０
％の牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ中で、マウスミエロ
ーマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を継
代培養しておき、最終免疫の３日後、このマウスから脾
臓細胞を採取して、これをポリエチレングリコール４０
００を用いてＰ３Ｕ１と細胞融合させた。細胞融合後、
培地を１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプ
テリン、１６μＭチミジンを添加したＤＭＥＭ（ＨＡＴ
培地）に置換して９６穴マイクロプレートに撒き、２〜
３週間選択培養することにより脾臓細胞とミエローマ細
胞との融合体であるハイブリドーマが得られた。
ハイブリドーマの作製 参考例１でヒト顆粒球から抽出、精製したヒトメダラシ
ンを、フロイント完全アジュバントで乳化し、７週齢の
ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に５０μｇ／匹の量で投与し
た。そして、４週間後にこのマウスに初回と同様の方法
で追加免疫を行ない、７日後に血中に抗体量が増大した
ことを確認した後、更に、その７日後に最終免疫として
抗原を腹腔に５０μｇ／匹の量で投与した。一方、２０
％の牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ中で、マウスミエロ
ーマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を継
代培養しておき、最終免疫の３日後、このマウスから脾
臓細胞を採取して、これをポリエチレングリコール４０
００を用いてＰ３Ｕ１と細胞融合させた。細胞融合後、
培地を１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプ
テリン、１６μＭチミジンを添加したＤＭＥＭ（ＨＡＴ
培地）に置換して９６穴マイクロプレートに撒き、２〜
３週間選択培養することにより脾臓細胞とミエローマ細
胞との融合体であるハイブリドーマが得られた。
【００２１】（２）抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブ
リドーマのスクリーニング 次に、このハイブリドーマの培養液中の抗体活性を、Ｅ
ＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）でス
クリーニングした。即ち、ヒトメダラシンをＥＬＩＳＡ
用のマイクロプレートに吸着させ、ｐＨ7.4 の１０ｍＭ
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１％の牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を添加した溶液でブロッキング処理を行
なった後、ハイブリドーマ培養液５０μｌをこのマイク
ロプレートに添加して１時間放置してから、ハイブリド
ーマ培養液を除去して洗浄し、これにペルオキシダーゼ
標識山羊抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ特異抗体の２μｇ／ｍｌ
ＰＢＳ溶液１００μｌを添加し、３７℃で１時間反応さ
せた。次いで、この酵素標識抗体溶液を除去し洗浄した
後、０．０５％ＡＢＴＳ及び０．００３４％過酸化水素
を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.6 ）を２
００μｌ添加して発色させることにより抗ヒトメダラシ
ン抗体産生性ハイブリドーマを選別した。
リドーマのスクリーニング 次に、このハイブリドーマの培養液中の抗体活性を、Ｅ
ＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）でス
クリーニングした。即ち、ヒトメダラシンをＥＬＩＳＡ
用のマイクロプレートに吸着させ、ｐＨ7.4 の１０ｍＭ
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１％の牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を添加した溶液でブロッキング処理を行
なった後、ハイブリドーマ培養液５０μｌをこのマイク
ロプレートに添加して１時間放置してから、ハイブリド
ーマ培養液を除去して洗浄し、これにペルオキシダーゼ
標識山羊抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ特異抗体の２μｇ／ｍｌ
ＰＢＳ溶液１００μｌを添加し、３７℃で１時間反応さ
せた。次いで、この酵素標識抗体溶液を除去し洗浄した
後、０．０５％ＡＢＴＳ及び０．００３４％過酸化水素
を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.6 ）を２
００μｌ添加して発色させることにより抗ヒトメダラシ
ン抗体産生性ハイブリドーマを選別した。
【００２２】（３）抗体産生株のクローニング及びモノ
クローナル抗体の作製 この抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマ培養液
を採取し、限界希釈法によるクローニングを行なって最
終的に単一クローンのハイブリドーマ４種類を得た。こ
のハイブリドーマを、夫々、プリスタン投与ＢＡＬＢ／
ｃマウスの腹腔に投与して増殖させ、モノクローナル抗
体を含む腹水を得た。次いで、得られた腹水に５０％飽
和硫安を加えて抗体を沈殿させ、この沈殿を分離してＰ
ＢＳに溶解させ、３Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭトリスー
塩酸緩衝液（ｐＨ7.8 ）に対して透析してから、プロテ
インＡ−セファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社
製）にかけた後、吸着した抗体を０．１Ｍグリシン−塩
酸緩衝液（ｐＨ6.0 ）で溶出し中和して精製することに
より３Ｆ０３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１Ｇ１２から
なる４種類のモノクローナル抗体を得た。
クローナル抗体の作製 この抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマ培養液
を採取し、限界希釈法によるクローニングを行なって最
終的に単一クローンのハイブリドーマ４種類を得た。こ
のハイブリドーマを、夫々、プリスタン投与ＢＡＬＢ／
ｃマウスの腹腔に投与して増殖させ、モノクローナル抗
体を含む腹水を得た。次いで、得られた腹水に５０％飽
和硫安を加えて抗体を沈殿させ、この沈殿を分離してＰ
ＢＳに溶解させ、３Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭトリスー
塩酸緩衝液（ｐＨ7.8 ）に対して透析してから、プロテ
インＡ−セファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社
製）にかけた後、吸着した抗体を０．１Ｍグリシン−塩
酸緩衝液（ｐＨ6.0 ）で溶出し中和して精製することに
より３Ｆ０３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１Ｇ１２から
なる４種類のモノクローナル抗体を得た。
【００２３】（４）モノクローナル抗体の性質 ［ウェスタンブロッティング法］モノクローナル抗体に
特異的な抗原をウェスタンブロッティング（Westernblo
tting ）法を用いて固定した。先ず、ヒト顆粒球由来メ
ダラシンをLaemmli の方法によるＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけた後、電解液バッファーに２
５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１９
２ｍＭグリシン及び２０％メタノールを含む溶液を用
い、電圧傾斜が７Ｖ／ｃｍ、２時間の条件でスラブゲル
から蛋白をニトロセルロースシートへ移した。次に、ニ
トロセルロースシートの各レーンを切り離し、一方のシ
ートをアミドブラックで蛋白染色し、他方は次の様な酵
素免疫アッセイを行なった。即ち、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ
でブロッキング処理した後、１次抗体としてマウス抗ヒ
トメダラシンモノクローナル抗体を加え、２次抗体とし
てアルカリフォスファターゼ標識山羊抗マウスＩｇＧ−
Ｆｃ特異抗体を加えて反応させ、洗浄してから、５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト
（０．７×１０3 Ｍ）／ニトロブルーテトラゾリウム塩
（０．７×１０3 Ｍ）を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ9.5 ）からなる基質溶液を加えて発色させること
により、４種のマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル
抗体は、ヒト顆粒球由来メダラシンを認識することが確
認された。
特異的な抗原をウェスタンブロッティング（Westernblo
tting ）法を用いて固定した。先ず、ヒト顆粒球由来メ
ダラシンをLaemmli の方法によるＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけた後、電解液バッファーに２
５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１９
２ｍＭグリシン及び２０％メタノールを含む溶液を用
い、電圧傾斜が７Ｖ／ｃｍ、２時間の条件でスラブゲル
から蛋白をニトロセルロースシートへ移した。次に、ニ
トロセルロースシートの各レーンを切り離し、一方のシ
ートをアミドブラックで蛋白染色し、他方は次の様な酵
素免疫アッセイを行なった。即ち、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ
でブロッキング処理した後、１次抗体としてマウス抗ヒ
トメダラシンモノクローナル抗体を加え、２次抗体とし
てアルカリフォスファターゼ標識山羊抗マウスＩｇＧ−
Ｆｃ特異抗体を加えて反応させ、洗浄してから、５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト
（０．７×１０3 Ｍ）／ニトロブルーテトラゾリウム塩
（０．７×１０3 Ｍ）を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ9.5 ）からなる基質溶液を加えて発色させること
により、４種のマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル
抗体は、ヒト顆粒球由来メダラシンを認識することが確
認された。
【００２４】［インヒビション・アッセイ法］ＥＬＩＳ
Ａ用マイクロプレートに固定したヒトメダラシンに対し
て、ビオチン化した第一の抗体と非標識の第二の抗体を
共存させて反応させた後、アビジン化ペルオキシダーゼ
を反応させ、次いで、このペルオキシダーゼを基質溶液
の添加により発色させてビオチン化抗体の反応量を測定
するインヒビション・アッセイ（Inhibition assay）法
により、いずれの２つの組み合わせにおいてもビオチン
化抗体の反応量に変化がないことより、４種のモノクロ
ーナル抗体はいずれも互いに異なるエピトープ（抗原部
位）を認識することが確認された。
Ａ用マイクロプレートに固定したヒトメダラシンに対し
て、ビオチン化した第一の抗体と非標識の第二の抗体を
共存させて反応させた後、アビジン化ペルオキシダーゼ
を反応させ、次いで、このペルオキシダーゼを基質溶液
の添加により発色させてビオチン化抗体の反応量を測定
するインヒビション・アッセイ（Inhibition assay）法
により、いずれの２つの組み合わせにおいてもビオチン
化抗体の反応量に変化がないことより、４種のモノクロ
ーナル抗体はいずれも互いに異なるエピトープ（抗原部
位）を認識することが確認された。
【００２５】［実施例２］ ヒトメダラシンの免疫学的測定方法Ｉ （１）モノクローナル抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径６ｍｍ）をよく洗浄してか
ら、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ
０４）１０μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ（ｐＨ7.4）溶液中
に４℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１
％ＢＳＡ水溶液に４℃の温度で１昼夜放置してブロッキ
ング処理を施すことによりモノクローナル抗体固定化ビ
ーズが得られた。
ら、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ
０４）１０μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ（ｐＨ7.4）溶液中
に４℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１
％ＢＳＡ水溶液に４℃の温度で１昼夜放置してブロッキ
ング処理を施すことによりモノクローナル抗体固定化ビ
ーズが得られた。
【００２６】（２）ペルオキシダーゼ標識モノクローナ
ル抗体の調製 マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０
４）１．０ｍｇ／ｍｌを含むＰＢＳ溶液に、Ｎ−（ｍ−
マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル
（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のジメチルホルムア
ミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃の温度で３０分間
反応させる。次いで、この反応混合液をセファデックス
Ｇ−２５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ6.0）でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノ
クローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
ル抗体の調製 マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０
４）１．０ｍｇ／ｍｌを含むＰＢＳ溶液に、Ｎ−（ｍ−
マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル
（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のジメチルホルムア
ミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃の温度で３０分間
反応させる。次いで、この反応混合液をセファデックス
Ｇ−２５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ6.0）でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノ
クローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
【００２７】一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホース
ラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍ
ｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１
０ｍｇ／ｍｌの濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃
の温度で３０分間反応させる。次いで、この反応混合液
をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、１
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ4.5 ）でゲル濾過して精製、ピ
リジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、
これをコロジオンバック中において氷冷下に約１０倍に
濃縮する。次に、これに０．１Ｍジチオスレイトールを
含有する０．１Ｍ酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ4.5 ）１ｍ
ｌを添加して、２５℃の温度で３０分間攪拌してＨＲＰ
分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した
後、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填し
たカラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有
する画分が得られた。
ラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍ
ｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１
０ｍｇ／ｍｌの濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃
の温度で３０分間反応させる。次いで、この反応混合液
をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、１
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ4.5 ）でゲル濾過して精製、ピ
リジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、
これをコロジオンバック中において氷冷下に約１０倍に
濃縮する。次に、これに０．１Ｍジチオスレイトールを
含有する０．１Ｍ酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ4.5 ）１ｍ
ｌを添加して、２５℃の温度で３０分間攪拌してＨＲＰ
分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した
後、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填し
たカラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有
する画分が得られた。
【００２８】次に、マレイミド化モノクローナル抗体と
チオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用い
て氷冷下に４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃
で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（SEPRAC
OR社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキ
シダーゼ酵素標識モノクローナル抗体が得られた。
チオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用い
て氷冷下に４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃
で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（SEPRAC
OR社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキ
シダーゼ酵素標識モノクローナル抗体が得られた。
【００２９】（３）ヒトメダラシンのサンドイッチ酵素
免疫測定方法 マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０
４）を固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラ
シン（標準物質）０，１，１０，１００，２００ｎｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液５０μ
ｌとＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル
抗体（２Ｅ０４）０．２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２
％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液３５０μｌを試験管に充填して
３７℃の温度で３０分間インキュベートした。次に、試
験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄して
から、０．０５％ＡＢＴＳ及び０．００３４％過酸化水
素を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.6 ）を
４００μｌずつ各試験管内に加え、３７℃の温度で３０
分間インキュベートした後、反応停止剤として０．１Ｎ
シュウ酸水溶液を１ｍｌずつ加えて酵素反応を停止させ
た。次いで、この溶液を分光光度計を用いて４２０ｎｍ
の波長の吸光度を測定し、これを標準物質濃度に対して
プロットすることにより、同一のモノクローナル抗体を
固定化抗体及び酵素標識抗体として用い、図１に示され
るような濃度依存性の良い検量線が得られた。
免疫測定方法 マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０
４）を固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラ
シン（標準物質）０，１，１０，１００，２００ｎｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液５０μ
ｌとＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル
抗体（２Ｅ０４）０．２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２
％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液３５０μｌを試験管に充填して
３７℃の温度で３０分間インキュベートした。次に、試
験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄して
から、０．０５％ＡＢＴＳ及び０．００３４％過酸化水
素を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.6 ）を
４００μｌずつ各試験管内に加え、３７℃の温度で３０
分間インキュベートした後、反応停止剤として０．１Ｎ
シュウ酸水溶液を１ｍｌずつ加えて酵素反応を停止させ
た。次いで、この溶液を分光光度計を用いて４２０ｎｍ
の波長の吸光度を測定し、これを標準物質濃度に対して
プロットすることにより、同一のモノクローナル抗体を
固定化抗体及び酵素標識抗体として用い、図１に示され
るような濃度依存性の良い検量線が得られた。
【００３０】［実施例３］ ヒトメダラシンの免疫学的測定方法II （１）モノクローナル抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径６ｍｍ）をよく洗浄してか
ら、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（３Ｆ
０３）１０μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ（ｐＨ7.4）溶液中
に４℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１
％ＢＳＡ水溶液に４℃の温度で１昼夜放置してブロッキ
ング処理を施すことによりモノクローナル抗体固定化ビ
ーズが得られた。
ら、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（３Ｆ
０３）１０μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ（ｐＨ7.4）溶液中
に４℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１
％ＢＳＡ水溶液に４℃の温度で１昼夜放置してブロッキ
ング処理を施すことによりモノクローナル抗体固定化ビ
ーズが得られた。
【００３１】（２）ヒトメダラシンのサンドイッチ酵素
免疫測定方法 マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（３Ｆ０
３）を固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラ
シン（標準物質）０，１，１０，１００，２００ｎｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液５０μ
ｌとＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル
抗体（２Ｅ０４）０．２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２
％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液３５０μｌを試験管に充填して
３７℃の温度で３０分間インキュベートした。次に、試
験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄して
から、０．０５％ＡＢＴＳ、及び０．００３４％過酸化
水素を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.6 ）
を４００μｌずつ各試験管内に加え、３７℃の温度で３
０分間インキュベートした後、反応停止剤として０．１
Ｎシュウ酸水溶液を１ｍｌずつ加えて酵素反応を停止さ
せた。次いで、この溶液を分光光度計を用いて４２０ｎ
ｍの波長の吸光度を測定し、これを標準物質濃度に対し
てプロットすることにより、図２に示されるような濃度
依存性の良い検量線が得られた。
免疫測定方法 マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（３Ｆ０
３）を固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラ
シン（標準物質）０，１，１０，１００，２００ｎｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液５０μ
ｌとＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル
抗体（２Ｅ０４）０．２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２
％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液３５０μｌを試験管に充填して
３７℃の温度で３０分間インキュベートした。次に、試
験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄して
から、０．０５％ＡＢＴＳ、及び０．００３４％過酸化
水素を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.6 ）
を４００μｌずつ各試験管内に加え、３７℃の温度で３
０分間インキュベートした後、反応停止剤として０．１
Ｎシュウ酸水溶液を１ｍｌずつ加えて酵素反応を停止さ
せた。次いで、この溶液を分光光度計を用いて４２０ｎ
ｍの波長の吸光度を測定し、これを標準物質濃度に対し
てプロットすることにより、図２に示されるような濃度
依存性の良い検量線が得られた。
【００３２】［実施例４］ 酵素免疫測定方法による臨床検体中のメダラシンの測定 健常人及び多発性硬化症患者血液を採取して凍結保存し
た試料を室温に戻して融解させ、その１０μｌを採取し
ＰＢＳ（ｐＨ7.4 ）２ｍｌ中に加えて均一に混合して検
体溶液とした後、その１０μｌを試験管に添加し、これ
に２．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ7.4 ）４０μを加え
て希釈し、次いで、この試験管にマウス抗ヒトメダラシ
ンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）もしくは（３Ｆ０
３）を固定化したビーズ各１個とＨＲＰ標識マウス抗ヒ
トメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）０．２μ
ｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液３
５０μｌを試験管に充填して３７℃の温度で３０分間イ
ンキュベートした。次に、前述の検量線を作成する場合
と全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停止を
行なった後、分光光度計を用いて４２０ｎｍの波長の吸
光度を測定し、検量線よりヒトメダラシン濃度を求め
た。その結果、検体血液中のヒトメダラシン濃度は、測
定法Ｉ及びＩＩにより健常人が夫々１０．０μｇ／ｍｌ
及び９．６μｇ／ｍｌであり、多発性硬化患者が夫々３
７．３μｇ／ｍｌ及び３５．８μｇ／ｍｌであった。
た試料を室温に戻して融解させ、その１０μｌを採取し
ＰＢＳ（ｐＨ7.4 ）２ｍｌ中に加えて均一に混合して検
体溶液とした後、その１０μｌを試験管に添加し、これ
に２．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ7.4 ）４０μを加え
て希釈し、次いで、この試験管にマウス抗ヒトメダラシ
ンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）もしくは（３Ｆ０
３）を固定化したビーズ各１個とＨＲＰ標識マウス抗ヒ
トメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）０．２μ
ｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液３
５０μｌを試験管に充填して３７℃の温度で３０分間イ
ンキュベートした。次に、前述の検量線を作成する場合
と全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停止を
行なった後、分光光度計を用いて４２０ｎｍの波長の吸
光度を測定し、検量線よりヒトメダラシン濃度を求め
た。その結果、検体血液中のヒトメダラシン濃度は、測
定法Ｉ及びＩＩにより健常人が夫々１０．０μｇ／ｍｌ
及び９．６μｇ／ｍｌであり、多発性硬化患者が夫々３
７．３μｇ／ｍｌ及び３５．８μｇ／ｍｌであった。
【００３３】
【発明の効果】顆粒球に存在するセリンプロテアーゼの
一種であるメダラシンを特異的に認識する抗ヒトメダラ
シンモノクローナル抗体を製造することにより、ヒトメ
ダラシンの免疫学的測定を迅速、簡便に行なうことが可
能となり、更に、慢性炎症性疾患、特に多発性硬化症の
血液診断等に利用することができる。
一種であるメダラシンを特異的に認識する抗ヒトメダラ
シンモノクローナル抗体を製造することにより、ヒトメ
ダラシンの免疫学的測定を迅速、簡便に行なうことが可
能となり、更に、慢性炎症性疾患、特に多発性硬化症の
血液診断等に利用することができる。
【図１】実施例２記載の酵素免疫測定方法（測定法Ｉ）
を用いてヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸
光度を抗原濃度の関数としてプロットして作成したヒト
メダラシン測定用の検量線である。
を用いてヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸
光度を抗原濃度の関数としてプロットして作成したヒト
メダラシン測定用の検量線である。
【図２】実施例３記載の酵素免疫測定方法（測定法II）
を用いてヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸
光度を抗原濃度の関数としてプロットして作成したヒト
メダラシン測定用の検量線である。
を用いてヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸
光度を抗原濃度の関数としてプロットして作成したヒト
メダラシン測定用の検量線である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内
Claims (5)
- 【請求項１】 ヒトメダラシンを特異的に認識する抗
ヒトメダラシンモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 前記抗ヒトメダラシンモノクローナル
抗体の免疫グロブリンのクラスがＩｇＧである請求項１
記載の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 前記抗ヒトメダラシンモノクローナル
抗体がマウス由来である請求項１記載の抗ヒトメダラシ
ンモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 ヒトメダラシンで免疫した動物から採
取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞との細胞融合により作
製したハイブリドーマを培養し、その培養物よりヒトメ
ダラシンを特異的に認識する抗ヒトメダラシンモノクロ
ーナル抗体を採取することを特徴とする抗ヒトメダラシ
ンモノクローナル抗体の製造方法。 - 【請求項５】 不溶性担体に固定化した抗ヒトメダラ
シンモノクローナル抗体と標識抗ヒトメダラシンモノク
ローナル抗体とを用い、試料中のヒトメダラシンと抗原
抗体反応によりサンドイッチ錯体を形成させてヒトメダ
ラシンを不溶性担体上に捕捉した後、該錯体中の標識を
定量することを特徴とするヒトメダラシンの免疫学的測
定方法。
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| JP33630397A JP4071330B2 (ja) | 1997-11-20 | 1997-11-20 | 抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及びそれを用いる免疫学的測定方法 |
| US09/384,379 US6764827B1 (en) | 1997-11-20 | 1999-08-27 | Anti-human medullasin monoclonal antibody process for producing the same and immunoassay using the same |
| CA2281262A CA2281262C (en) | 1997-11-20 | 1999-08-31 | Anti-human medullasin monoclonal antibody, process for producing the same and immunoassay using the same |
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| JP33630397A Expired - Fee Related JP4071330B2 (ja) | 1997-11-20 | 1997-11-20 | 抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及びそれを用いる免疫学的測定方法 |
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| JP (1) | JP4071330B2 (ja) |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6764827B1 (en) | 1997-11-20 | 2004-07-20 | Dainichiseika Color & Chemicals Mfg. Co., Ltd. | Anti-human medullasin monoclonal antibody process for producing the same and immunoassay using the same |
| US6767709B1 (en) * | 2000-02-03 | 2004-07-27 | Dainichiseika Color & Chemicals Mfg. Co., Ltd. | Immunoassay of human medullasin and diagnosis of multiple sclerosis using the same |
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|---|---|---|---|---|
| DE102009010563A1 (de) | 2009-02-16 | 2010-08-26 | Matthias W. Engel | Vorrichtung zum Nachweis von Analyten in Körperflüssigkeiten |
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| US9874556B2 (en) | 2012-07-18 | 2018-01-23 | Symbolics, Llc | Lateral flow assays using two dimensional features |
| US9599615B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-03-21 | Symbolics, Llc | Lateral flow assays using two dimensional test and control signal readout patterns |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5661000A (en) * | 1987-03-05 | 1997-08-26 | Toray Industries, Inc. | Serine protease and serine protease gene |
| JP4071330B2 (ja) | 1997-11-20 | 2008-04-02 | 大日精化工業株式会社 | 抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及びそれを用いる免疫学的測定方法 |
-
1997
- 1997-11-20 JP JP33630397A patent/JP4071330B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-08-27 US US09/384,379 patent/US6764827B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-31 CA CA2281262A patent/CA2281262C/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6764827B1 (en) | 1997-11-20 | 2004-07-20 | Dainichiseika Color & Chemicals Mfg. Co., Ltd. | Anti-human medullasin monoclonal antibody process for producing the same and immunoassay using the same |
| US6767709B1 (en) * | 2000-02-03 | 2004-07-27 | Dainichiseika Color & Chemicals Mfg. Co., Ltd. | Immunoassay of human medullasin and diagnosis of multiple sclerosis using the same |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2281262C (en) | 2010-08-31 |
| US6764827B1 (en) | 2004-07-20 |
| JP4071330B2 (ja) | 2008-04-02 |
| CA2281262A1 (en) | 2001-02-28 |
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