JPS63209596A - モノクロ−ナル抗体及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はオステオカルクン（以下ＯＣと略称する）に対
して特異注全有するモノクローナル抗体及びその使用方
法に関する。

〔従来の技術〕

ＯＣは骨で生産されるビタミンに依存性カルシウム結合
蛋白である。Ｏａの生理作用は遺骨過程において重要な
役割を担っている。ＯＣの生合成は骨組織、特に骨芽細
胞で行われ、骨代謝の良好な指標として骨の石灰化、異
所石灰化、骨転移、ベーチェット病、原発性副甲状腺機
能先進症、オステオベニアの臨床診断上重要な測定意義
を有する。

この目的のため、Ｐ、Ａ、グライスら（Ｐ、Ａ、Ｐｒ工
Ｃ６らプロシーディング　オブ　ナショナル　アカデミ
−オブ　ザ　ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、
Ｓｏｃ。

ＵＳＡ　）第７７巻、第２２５４頁（１９８０））によ
ってポリクローナル抗体を用いたラジオイムノアッセイ
法が開発され、ヒト血中のＯＣ濃度を測定することが可
能となった。また、ポリクローナル抗体を用いるエンザ
イムイムノアンセイ法も報告されている［　Ｈ，タナ力
（Ｈ，ＴＩＬｎａｋａ）ら、ジャーナル　オブ　イムノ
ロジカル　メソンズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ／、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　）第９４巻、第１９頁（１９８６））。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながらこれらの方法はポリクローナル抗体を用い
ているため、感度、精度の面で満足なものでなく改良が
望まれている。

本発明の目的は、ポリクローナル抗体の問題方法を提供
することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は抗Ｏａモノ
クローナル抗体に関し、また第２の発明は生体試料中の
ＱＣの検出に当り、抗ＯＣモノクローナル抗体を使用す
るＯＣの検出方法に関する。

本発明者らは、前述した問題点を克服するため鋭意研究
を重ねた結果、細胞融合によりｏＣに対して特異性を有
するモノクローナル抗体を取得することに成功し、この
モノクロ−カル抗体を用いれば、００を高感度で精度よ
く測定可能であることを見出し、本発明を完成するに至
った。

本発明のモノクロルナル抗体は、いわゆる細胞融合法に
よって製造される。ｔなわち、抗体産生細胞と骨髄１１
細砲との間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイ
ブリドーマラフローン化し、ＯＣに対し特異性を示す抗
体を産生ずるクローンを選択することによって製造され
る。

抗体産生細胞は例えばＱＣによって免疫された動物から
の牌細胞、リンパ節細胞Ｂ　リンパ球が使用できる。免
疫させる動物としては、マウス、ラット、馬、ヤギ、ウ
サギなどが例示される。

抗原と１〜では動物の骨由来のＯＣが利用可能であり、
例えば次のようにして製造され、免疫に使用さｎる。ウ
シ骨粉末をＥＤＴＡ　Ｑ液で抽出しゲル濾過及びイオン
交換クロマ・トゲラフイーによりウシＯＣを精製する。

かくして得られたウシＯａは例えばＫ　Ｌ　Ｈ（Ｋｅｙ
ｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔＨｅ＋＊ｏｃｙａｎｉｎ　）に
代表されるキャリア蛋白と結合後、又はｐｖｐ（ポリビ
ニルピロリドン）と混合後、フロイントのアジュバント
と混合し、動物の免疫用として使用する。又はウシＯＣ
を直接フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫
用として使用する。

免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１０に２０
〜２００／Ｊ、９．２〜５週間ＶＣ１回、５〜７週間投
与することによって行われる。最終免疫より約５〜５日
後、免疫動物から抗体産生細胞を分取する。

骨髄権細胞としてはマウスへラット１ヒト等由来のもの
が使用される。細胞融合は例えばネーチャー（（Ｎａｔ
ｕｒｅ　）　　第２５６巻、第４９５頁（１９７５））
に記載の方法又はこれに準する方法によって行われる。

この際３０〜５（ＩＩｅＸポリエチレングリコール（分
子量１００ｏ〜４０００）を用い、３０〜４０ｒの温度
下約１〜３分間程度反応させることによって行われる。

細胞融合によって得られたハイブリドーマはスクリーニ
ングに付される。すなわち、スクリーニングは酵素抗体
法等によって行われる。得られた抗体産生ハイブリドー
マはクローニングに付さ九る。すなわち、当該ハイブリ
ドーマを例えば限界希釈法によってクローニングを行っ
てクローンを得る。得られたクローンは、次いで目的と
するモノクローナル抗体を産生ずるクローンのスクリー
ニングに付され、例えば酵素抗体法等によって行わｎる
。選ばれたクローンは、例えばあらかじめグリスタン（
２，ｉ５，１０．１４−テトラメテルベンタデカン）を
投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移植し、１ｏ“
−１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を
採取する。この腹水からのモノクローナル抗体の回収は
Ｉｇ　　のｎｔ製法として従来既知の硫安分画法、ポリ
エチレングリコール分画法、イオン交換クロマトグラフ
法、ゲルクロマトグラフ法等を応用することで容易に達
成される。

次に本発明の抗ＯＣモノクローナル抗体の１例（ＯＣ−
ａ）について、理化学的性質を示す。

＋ａ＋　　分子ｉ１：６００，０００±５，０００ｆｂ
Ｊ　　Ｉｇ　　クラス：　ＩｇＭ （Ｃ１等電点ニア、４〜７．７ （（ｆｆ＋　　抗原との結合部位二〇ＣのＣ末端アミノ
酸配列Ａｒｇ−Ｇ／’ａ−Ｖａｌ！−０ｙｓ−ＧＪａ−
Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇ
！’ｕ−Ｌａｕ−Ａ／／ａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−ＩＪｓ−
Ｇ／ｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌ！ｎ−Ｇ／ｕ−１’ａ−Ｔｙｒ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇ／ｙ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ！（式中Ｇｌａはｒ−カルボキシグルタミン酸を示
す）の少なくとも１アミノ酸以上を含むベグチドを認識
する ｔｅｌ　　反応性：少なくともウシ・ＯＣに対して反応
性を示す。

前記モノクローナル抗体（００−４）は０Ｃ（Ｄへ’：
ｆｆｈ”７ラクメン）　ＯＣ（２０−４９）Ｉｃ反応性
を有するものであるが、本発明と同様の方法により異な
る抗原決定基に対して反応性を有するモノクローナル抗
体も得られる。すなわち （１）　ｏａ全全体コンホメーションを認識するモノク
ローナル抗体 （２１０Ｃをツーロチアーゼで消化して生じるＯＯフラ
グメント・ベグチドを認識°するモノクローナル抗体 （３）　　デカルボキシル化したＯＣを認識するモノク
ローナル抗体 である。

かくして得られた抗ＯＣモノクローナル抗体は、生体由
来の試料、例えば血清、廂しよう又は尿中のＱＣを特異
的に高感度で精度良く測定するために極めて好適である
。この測定のために、モノクローナル抗体そのもの又は
それからの相応する免疫学的特性を有する７ラグメント
、例えばＦａｂフラグメントを使用することができる。

〔実施例〕

以下に実施例を示し、本発明をよう具体的に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１　モノクローナル抗体の作製 （１）　　抗原の精製 ウシ大褪骨を細砕し、水洗後アセトンで脱脂したものを
凍結乾燥して得られた粉末を０．５ＭＥＤＴＡ　（１）
ｌ（８）に懸濁し０．５　Ｍ　ＫＤＴＡ　（ｐＨ８）（
Ｃ対し透析した。透析チューブ内の懸濁液を遠心分離し
、上清を５　ｍ　Ｍ　　ＮＨ４ＨＣＯ３に対し透析し、
凍結乾燥した。こりして得られたＥＤＴ人可人件溶性分
画いてセファデックス（’　５ｅｐｈａｄｅｘ　）Ｇ　
−１００によるゲル濾過並びにＤＥＡＥ−セファデック
スＡ２５によるイオン交換クロマトグラフィーを行って
ウシＯＣを精製した。

（２）　　マウスの免疫 ウシＯＣを１０ｍ９７ａｌ！となるように０．１５ＭＮ
ｅＬｃｌ　　ｉｃ溶解し、ｓｏ！Ｘ（ｗ／ｖ）ポリビニ
ルピロリドンと１：５（Ｖ’／Ｖ）の割合で混合し、室
温で２時間放置した。この混合液をフロイントの完全ア
ジュバントと１：１（Ｖ／Ｖ）の割合でよく混合し、マ
ウス−匹に５０μｙのウシＯＣを腹腔内に免疫した６　
３週間後、上記ウシＯＣとポリビニルピロリドン混合液
をフロイントの不完全アジュバントと混合し、腹腔内に
追加免疫を行った。更にその２週間後、ウシＯＣ全Ｏｊ
　５　Ｍ　ＮＩＬＣｌ　　に溶解し、マウス尾静脈から
最終免疫を行った。

（３）　　細胞融合及びクローニング 漫終免疫の５日後にマウスの牌臓を取出し、その牌細胞
とマウスミエローマＰ３Ｕ１とを８：１の割合で混合し
前記ネーチャー記載の方法を用いて細胞融合を行った。

次に、９６ウエルマイクログレートに植え込み、ＨＡＴ
（ヒボキサンチンｌＸ１０　　Ｍ、アミノグチリン４×
１０−’Ｍ、チミジン１．＋５Ｘ１０　　Ｍ）を含んだ
ＤＭＫＭ　−１０％Ｆ　ＯＳ培地（ＨＡＴ培地）で１゜
〜１７日間培養後、ＨＴ（ヒボキサンチン１×１０−’
Ｍ、チミジン１．６　Ｘ　１０−５Ｍ　）を含んだＤＭ
ＥＭ　−１０％ｒｃｓ培地（ＨＴ培地）に移行し、更に
フラスコ（２５＋＋＋／）に培養できるよってなってか
らＤＭＩｉ：Ｍ　−１０％Ｆｅｓ培地で培養した。増殖
の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵素抗体法に
より測定し、適切なウェルから限界希釈法により、求め
るノ１イブリドーマのクローニングを行った。すなわち
、マイクログレートにウェル当り約２．５　Ｘ　１０’
　　個のマウス胸腺細胞を植え込み、次にＤＭＥＭ培地
で５．２．１．０．３個１０．１ｍｊになるようにノ為
イブリドーマ金希釈し、これを上記マイクログレートに
０．１酎／ウエルずつ植え込み培養した。培養開始後１
０〜１４日で肉眼で認められるコロニーが形成され、ク
ローン株を得た。

（４１スクリーニング法 ハイブリドーマ及びクローンが増殖したウェルの培養上
清を分取し、エンザイム　リンクドイムノンルベント　
アンセイ（Ｅｎｚｙｍｅ　ＬｌｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓ
ｏｒｂａｎｔ　Ａｓ５ａｙ　）　（ＥＬＩｓＡ　　）法
によりウシＱＣに対する抗体産生ハイブリドーマ及びク
ローンを調べた。マイクロタイターグレートにウシＯＣ
を０．１μ、？／１００μ／／ウェルとなるように分注
し、４Ｃで１８時間静置してウィルスＯＣを固相に吸着
させた。５０ｍＭＩＪン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（田７
゜４）２００μｌ　で３回洗浄した後、１％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ２００μｍ／　ウェル
を加え、２５Ｃで１時間静置し、各ウェルの未吸着部分
をブロックした。次いで、検体である培養液を１００μ
ｌ！／ウェル加え２５Ｃで１時間反応させた。

０．０５％ツイ−７（Ｔｗｅｅｎ　）　−２０を含むＰ
ＢＳで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス
エｇ（ダコ社製）を１００μｌ／ウエル添加し、２５Ｃ
で１時間反応させた。ツイーン−２０含有ＰＢＳで洗浄
し、０．００１％過酸化水素０．１５〜／ｍＪＡＢ’ｒ
ｓ　［アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン−６
，６−スルホン酸）〕べ一リすガーマンハイム社製〕の
０．１Ｍクエン酸−水酸化す）　ＩＪウム緩衝液（声４
．０）を加え、波長４１４　ｎｍ　　での吸光度を測定
した。検体中、ウシｏＣに対する抗体が存在したウェル
のみ発色がみられた。

この結果、抗体産生能の高いクローン株０Ｃ−２及びＱ
Ｃ−４が得られた。

（５）　モノクローナル抗体の作火 ７週令以上のＢＡＬＢ／Ｇ系マウスにグリスタン（アル
ドリンチ社製）０゜５！ｎｌを腹腔内に投与し、１週間
以上経過した後、培養、増殖させたクローン株（ＱＣ−
４）１〜９×１０　個／マウスをｒｉ腔内接種した。１
０〜１４日後にマウスを殺し、腹水を採取した。これを
３，０００　ｒｐｍ１０分間遠心分離し、５〜１５ゴ／
匹のモノクローナル抗体含有腹水を得た。

（６）　　モノクローナル抗体の精製 上記、（Ｘ）〜（５）Ｋよって得られた腹水に０．９％
ＮａＣｒ　　液を加え５〜１０倍希釈した後、硫酸アン
モニウムを４０％濃度となるように加え、沈殿画分を分
取した。この両分をなるべく少量の０．９％ＮａＣｒ　
　液で溶解させた後、ＰＢＳに対して透析した。このサ
ンプルをセファクリルＳ−５００でゲル濾過を行い抗つ
シＯＣモノクローナル抗体画分を得た。

上記モノクローナル抗体（００−４）の物理化学的性質
を示す。

（ａｌ　　分子ｉ１：６００，０００±５，００　。

バイオゲルＡ−１，５ｍ（バイオラド社）を用いゲル濾
過法によシモノクローナル抗体の分子量を推定した。分
子量マーカーはバイオラド社のゲル濾過用分子量測定ス
タンダード（テログロブリン６７０　Ｋ、γ−グロブリ
ン１５８Ｋ。

卵白アルブミン４４に１チオグロビ７１７に１ビタミン
Ｂ−１２１，３５Ｋ）を用いた。

（ｂ）　　ｒ、サブクラス：　工ｇＭ ５０ｍＭ　　ｐｓｓ（ｐＨ７，２）にアガロースを１％
加え、煮沸後スライドグラスに５Ｍのせ、固化した。直
径５１１ＩＩの穴を′５朋間隔で開け、各穴に腹水より
精製したモノクローナル抗体、又はウサギで作成した各
種マウスエ、サブクラスに対する抗血清を１５１Ｊ／！
　　入れた。スライドグラスを湿潤箱に入れ、室温で１
８時間静置し、モノクローナル抗体と抗マウスエ５　　
サブクラス血清を入ｎた２穴間に生じた抗原抗体反応に
よる沈降線の形成を観察した。

（ｃｌ　　等電点：　ｐＩ　＝　７．４〜７．７精製モ
ノクローナル抗体の等電点電気泳動を行ったところｐＩ
＝７．４〜７．７　　に相当してバンドを認めた。

（ｄ）　　抗原との結合部位 ウシＯＣをリシルエンドペズチダーゼ（和光紬薬工業社
製）で消化し、ウシＯＣをＮ末端７ラグメントとＣ末端
７ラグメントに断片化した。

表１にはりシルエンドベグチダーゼの切断部位を示した
。

表　　１ １Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｌｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−
ＧｌｌＰＭ−Ａ／ａ−Ｈｙｐ−ＡＩ！ａ−Ｐｒｏ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏ−１４＾５ｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇ／ａ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｙｓ’、　ｋｒｇ−Ｇｌ！ａ−Ｖａ／−Ｃｙｓ
−Ｇ！’ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−２７Ｐｒｏ＝Ａｓｐ−Ｃ
ｙｓ−Ａｓｐ−Ｇ７ｕ−Ｌｅｕ−４１ａ−Ａｓｐ−Ｈｌ
ｓ−Ｉｌａ−Ｇｌ！ｙ−Ｐｈｅ−Ｇ／ｎ−４ＯＡ／ａ−
Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＣＩ！ｙ−
Ｐｒｏ−Ｖａ／’得うしたウシＯＣリシルエンドベグチ
ダーゼ消化物ヲモノｑ　（ＭｏｎｏＱ　）カラム（ファ
ルマシア社製）を用いＦＰＬＯによ９分画しウシ０Ｃ（
１〜１９）とウシ００（２０−４９）を得た。

各分画を前記（４１のスクリーニング法と同様にマイク
ロプレートに分注し、固相に吸着させＥＬＩＳＡ法によ
って、モノクローナル抗体の抗原への結合部位の検索を
行った。その結果、表２に示すごとく、ウシ０Ｃ（１へ
・１９）とは反応せず、ウシＱＣ（２０〜４９）と反応
することが示された。

表　　２ 固相化抗原　　　　　　４１４ｎｍでの吸光度ウシＯＧ
　（１−１９）　　　　　　　　０．０２１ウシＯＯ（
２０−４９）　　　　　　　１．０８５実施例２　モノ
クローナル抗体を用いた競合ＫＩＡによるＯＣの定量 実施例１で得たモノクローナル抗体ＱＣ−４を用いてＱ
Ｉ３測定試薬を調整した。

＋１１　　西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識
ウシＯＣの作製 Ｊ、カールソン（Ｊ、Ｃａｒｌｓｓｏｎ　）　　ら〔ザ
　バイオケミカル　　ジャーナル（Ｂｘｏｃｈｅｍ、Ｊ
、）第１７３巻、第７２５頁（１９７８））の方法に準
じて行った。ＨＲＰ（ベーリンガーマンノ・イム社製）
１０　、Ｖ　′ｊ＆：０．１Ｍ　Ｎａｐ／’　　を含む
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）１ｒＩ
Ｌｔに溶かす。これに２０フＭ　のＮ−スクシンイミジ
ル−５−（２−ピリジルジチオ）グロビオネート（ファ
ルマシア社製）／エタノール液を０．１Ｍ添加し、２５
Ｃで３０分反応させた後、セファデックスＧ−２５カラ
ムにてゲル濾過し、ピリジン−ジスルフィド化）（ＲＰ
を得る。

一方、ウシＯＣＳ〜に同様にしピリジン−ジスルフィド
化ウシＯＣｆ　Ｏ，Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ！　　を含む酢酸
ナトリウム緩衝液（…４．５）中でジチオスレイトール
を５０　ｍＭ　　となるように添加し、３０分室温放置
し、セファデックスＧ−２５カラムでゲル濾過し、チオ
ール化ウシＯＣを得た。このチオール化ウシＯＣとピリ
ジンジスルフィド化ＨＲＰを０．Ｉ　Ｍ　Ｎａ１ｌ　　
を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７゜５）
中で４Ｃで１８時間反応させ、反応物をセファデックス
Ｇ−１００カラムでゲル濾過し、同上の緩衝液で溶出さ
せ、目的とするＨ　ＲＰ標識ウシＯＯを分取した。

（２）競合ＥＩＡ測定系 ９６ウエルマイクロタイターグレートの各ウェルＫ　Ｏ
，０５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９，０）Ｋ溶解したモノ
クローナル抗体０Ｏ−４（２μｌ／ＬＩＬ１２＞を２０
０μｌずつ添加し、２５Ｃで３時間インキユベートシ、
溶液を捨てた後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を２００
μｉ　ずつ各ウェルに添加し、２５Ｃで１時間反応させ
た。ＰＢＳでよく洗浄したのち、サングル１００μｚｌ
添加し、次いで５００倍希釈したＨＲＰ標識ウシつＣ液
を添加し、室温で１時間、４Ｃで１８時間静置した。溶
液を捨て、０．０５％ンイーン２０を含むＰＢＳで各ウ
ェルを３回洗浄したのち酵素基質として０．００１％過
酸化水素、Ｏ−フェニレンジアミン（ｏ、４　ｍｙ／　
ｔｎｌ　）を含むクエン酸ナトリウム緩衝液（〆（５，
０）２００μｌ　を添加し、５７Ｃで５０分間反応させ
た。４．５　Ｍ　）（２Ｓｏ４５０μｌを加え反応を停
止させ、４９２ｎｍの吸光度＋Ｂ＋を測定した。別に、
サン７−ルの代シにＰＢＳ″ｆｆ：用いて、同上の操作
によりマイクロタイタープレートに結合しているＨＲＰ
活性（Ｂｏ）を測定した。次式によ、りＢ／Ｂ０（％）
を求めた。

ａ／ａ　（％）＝　−Ｘ　１ＯＯ （３）測定系の感度 各種濃度のウシｏ　ｃ　（ｏ、ｏ　ｓ　〜１ｏ　ｎ、９
／ｇ）を用い１０回測定した平均値で検量線を作成し、
（シｖ値を求めた。結果を第１図に示す。すなわち第１
図はｏｃｇ度（ｎ、ｓ’／ｄ、横軸）とａ／ｓ０（％、
縦軸）との関係を示すグラフである。第１図において黒
丸は上記ウシＯＯｏ場合、白丸は後記ヒｈｏＣの場合を
示す。この結果から、本測定法を用いれば、０．１ｎ、
ｉ？／ｍｊまで精度よく測定可能であることが示さハ、
る。

一方、ヒトＯＣとの反応性を各種濃度のヒト００　（０
，０５〜１０　ｎ、９／ｄ）を用い検討した。

結果を第１図に白丸印で示す。この結果から本測定法は
ヒトＯＣの測定にも適応できることが示される。

実施例３　ヒト血清中のＯＣの定量 実施例２で調整したＥＩＡ糸により健常人１８名より採
取した血清を用い人血清中のＯＣの定量を行った。結果
を第２図にグラフとして示す。第２図において縦軸は血
清中のＯＣ濃度（ｎｊｊ／ｄ）を示す。この結果から健
常人血清中のヒトＯＣは平均２．１±０゜４４ｎ、９７
ｍであった。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明した通り、本発明によりＯＣに対するモ
ノクローナル抗体が提供された。本発明のモノクローナ
ル抗体を利用することにより、精度及び感度の高いＱＣ
の微量定量が可能となＦ）、ＱＣの臨床診断や基礎的研
究に非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はモノクローナル抗体を用いた競合ＥＩＡによる
ＯＣ測定の感度と精度をＯＣ濃度とａ　／　ａ。との関
係で示すグラフ、第２図は健常人血清中のＯＣの量を測
定した結果を示すグラフでちる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗オステオカルシンモノクローナル抗体。 ２、該抗オステオカルシンモノクローナル抗体が、下記
   の性質を有するモノクローナル抗体である特許請求の範
   囲第１項記載のモノクローナル抗体。 （ａ）分子量：６００，０００±５，０００ （ｂ）Ｉ＿ｇクラス：Ｉ＿ｇＭ （ｃ）等電点：７．４〜７．７ （ｄ）抗原との結合部位：オステオカルシンのＣ末端ア
   ミノ酸配列【アミノ酸配列があります】（式中Ｇｌａは
   γ−カルボキシグルタミン酸を示す）の少なくとも１ア
   ミノ酸以上を含むペプチドを認識する （ｅ）反応性：少なくともウシ・オステオカルシンに対
   して反応性を示す ３、生体試料中のオステオカルシンの検出に当り、抗オ
   ステオカルシンモノクローナル抗体を使用することを特
   徴とするオステオカルシンの検出方法。