JPH0342572A - ラミニン測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なラミニンの測定試薬に関するものであり
、更に詳しくは非フラグメント化ラミニン及び／又はフ
ラグメント化ラミニンの新規な測定試薬に関する。

〔従来の技術〕

基底膜はコラーゲンと非コラーゲンの各成分より成り、
生体内に普遍的に存在する細胞外マトリックスである。

近年、肝疾患、腎疾患、ガンなど不可逆的に進行する話
疾患と基底膜との関連が注目されてきた。ラミニン（以
下、ＬＮと略記する）は基底膜に特異的に存在する高分
子タンパク質であり、特にガン疾患において、基底膜が
分解作用を受けた時に非フラグメント化ラミニン（以下
、ｎＬＮと略記する）又はフラグメント化ラミニン（以
下、ｆＬＮと略記する）として体液中に遊離してくると
考えられている。

したがって、これら体液中のｎＬＮ又はｆＬＮを測定す
ることは、疾患による基底膜分解の進展を診断する上で
臨床検査上重要であり、その簡便で迅速な測定法の確立
が望まれていた。

最近、ペプシン分解によるｆＬＮに対するウサギ抗血清
を用いたラジオイムノアッセイ法が開発されたＣＤ、Ｇ
、ブロックス（口、　Ｇ、　Ｂｒｏ−ｃｋｓ　）　　　
クリニカル　ケミストリー（ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　）第３２巻、第７８７〜７９１頁（１９８
６）］。

この測定法は、あらかじめ放射能で標識されたペプシン
分解ｆＬＮと試料を競合的に抗ペブシン分解ｆＬＮ抗体
に作用させ、約１日反応後、抗つサギＩｇＧ抗体と反応
させて免疫沈降物の放射能活性を測ることにより、試料
中のＬＮ量を測定するものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記のラジオイムノアッセイは、少なくとも２日間にわ
たる操作を要し、操作の煩雑さと共に、放射能物質によ
る環境汚染、人体への影響という点や、目的抗原に対す
る抗体として抗血清を使用しているためその反応の特異
性という点に問題があった。また、この抗血清及び放射
能標識ＬＮを調製するためには、多量のＬＮを精製しな
ければならず、この点でも問題があった。

更に、血中及び尿中に可溶化しているＬＮはそのほとん
どが分解フラグメント化されており、極めて低分子化さ
れていると考えられている〔井戸英司はか、肝臓、第２
９巻、第５３７〜５４５頁（１９８８）］。目的抗原に
対する抗体として抗血清を使用する場合、このようにフ
ラグメント化された抗原に対する抗体の結合力が低下す
るため、正確な測定が不可能であると考えられており、
この点でも大きな問題を含んでいた。

本発明は、上記従来技術の測定法の課題を克服するため
になされたものであり、その目的は体液などの試料中の
ｎＬＮ又はｆＬＮ量を免疫学的に測定する試薬を提供す
ることにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明はＬＮ測定試薬に関する発
明であって、被検試料中のｎＬＮ又はｆＬＮを測定する
試薬において、同−ＬＮフラグメントを認識するが、抗
原認識部位を異にするモノクローナル抗体を構成成分と
することを特徴とする。

本発明者らは、鋭意検討を重ね、ＬＮに対するドメイン
特異なモノクローナル抗体を用いることで、ＬＮを正確
に定量する測定試薬を開発した。更にガン患者の血中あ
るいは尿中に正常人には認められないｆＬＮが大量に出
現することを発見し、本発明による新規ＬＮ測定試薬を
用いることでガンの診断が可能であることを確認し、本
発明を完成するに至った。

なお、本明細書中にいうドメインとは抗原認識部位のこ
とを意味する。

本発明におけるＬＮに対するドメイン特異抗体を得るた
めのヒトｎＬＮは、例えばヒト胎盤から、それ自体公知
の方法により、例えば塩沈殿、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を
単独で又は組合せて用いて分離精製することにより取得
することができる〔ジャーナル　オブ　バイオロジカル
　ケミストリー（Ｊ、Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、）、第２
５８巻、第１２６５４〜１２６６０頁（１９８３）　］
。また、ヒトｆＬＮは例えば上記の方法によって取得し
たヒ）ｎＬＮを、それ自体公知の方法により、例えばペ
プシン、トリプシン、スロンビン、プラスミン、キモト
リプシン等のプロテアーゼを単独で又は組合せて用いて
限定分解又は完全分解し、種々の分離方法、例えばゲル
ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー等の方法を用いて分離精製すること
により取得することができる。

また、例えば肺ガン、胃ガン、結腸ガン、乳ガン、膵ガ
ンなどのガン患者の血清又は尿を原料として精製、回収
することも可能である。更に、近年ヒ）ＬＮの一部アミ
ノ酸配列が決定されたことにより特異フラグメントのア
ミノ酸配列を有する台底ペプチドも用いられる。

一方、ヒトＬＮに対するドメイン特異抗体は、例えば上
記のヒ）ｆＬＮを抗原として、ヒト以外のホ乳動物、例
えば、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ヤギなど
の抗体産生能のある動物を用い通常の方法に従って免疫
した後、採血して抗血清を得、更に抗体を分離する。抗
体を得るに当っては例えば上述のヒ）ｆＬＮｏ、１〜１
ｍｇを生理食塩水０．１〜５ｒｎｌに溶解し、これに同
量の完全フロイント・アジュバントを加え、充分乳化し
た後、用いるホ乳動物、例えばウサギやマウス等の皮下
又は皮肉に注射し、１〜３週間ごとに数回注射して免疫
させる。その後、最終免疫の日より一定期間後、採血し
ヒ）ｆＬＮに対する抗体を含有する抗血清を得る。

またこの場合に用いる動物としては、抗体生産能のある
動物であればいずれを用いてもよく、大量の抗体を得る
には大型動物を用いるのが好ましく、通常はウサギ、ヤ
ギを用いるが、何ら限定されるものではない。更にこれ
らの動物から得られた抗ヒ）ｆＬＮ抗体を含有する抗血
清から抗ヒ）ｆＬＮ抗体を得るには通常用いられる抗体
の精製手段の方法によって、行えるもので例えば、抗血
清を硫安分画し、次いでイオン交換クロマトグラフィー
　あるいはゲルろ過によって精製採取すれば良い。更に
高純度に精製するにはヒ）ｆＬＮを固定化した不溶化担
体を基材として用いるアフィニティークロマトグラフィ
ーにて吸着し、次いで溶出を行って得ればよい。更に別
法としてはヒトｆＬＮを抗原として免疫させたヒト以外
のホ乳動物の肺細胞とミエローマ細胞とを用いて融合さ
せ、この融合細胞からヒトｆＬＮに対するモノクローナ
ル抗体産生細胞を分離し、この融合細胞を用いる抗ヒ）
ｆＬＮモノクローナル抗体を製造する方法があり、特に
ホ乳動物としてマウスを用いる方法がよく利用されてい
る〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）第２５６巻、第４９
５頁（１９７５）］。以上のようにしてヒトＬＮに対す
るドメイン特異抗体が得られる。

一方上記のヒ）ｎＬＮを抗原としてヒ）ＬＮに対するド
メイン特異抗体を得ることもできる。

すなわちヒ）ｎＬＮを抗原として免疫をしたヒト以外の
ホ乳動物の肺細胞とミエローマ細胞とを用いて融合させ
、この融合細胞からヒ）ｎＬＮに対するモノクローナル
抗体を生産するクローンを分離する。このようにして得
られるモノクローナル抗体はヒトＬＮのある特異ドメイ
ンのみと反応するドメイン特異抗体である。動物として
はマウスがよく用いられる。

以上のようにして得られたヒ）ＬＮに対するドメイン特
異抗体は、各々ｆＬＮに対する反応性を調べることによ
り、同一ドメイン特異性をもつ抗体を選び出すこともで
きる。同一ドメイン特異性をもつ抗体を測定に用いるこ
とによりｆＬＮを効果的に検出することが可能となる。

これらのヒトＬＮに対するドメイン特異抗体を用いた測
定法としては、従来この分野でよく知られた免疫測定法
すなわち、酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ免疫
比濁法、ラテックス凝集法、赤血球凝集法、５ＲＩＤ法
（免疫拡散法〉等が用いられる。中でも酵素免疫測定法
が、感度、簡便さ等において最も実用的である。すなわ
ち抗ヒトＬＮドメイン特異抗体をポリスチレンビーズ、
ガラスピーズ、ポリスチレンマイクロタイタープレート
などの不溶性担体で処理して、これらの担体に共有′結
合又は物理的に吸着させて抗ヒ）ＬＮドメイン特異抗体
の結合した不溶性担体を得る。一方で抗ヒ）ＬＮドメイ
ン特異抗体に従来公知の方法を用いて酵素標識を行う。

例えば、使用する酵素に最適な化合物（例えばβ−ガラ
クトシダーゼに対しｍ−マレイミドエステル、ペルオキ
シダーゼに対し過ヨウ素酸）、次いで抗体をこの反応物
に結合させて酵素標識抗ヒ）ＬＮドメイン特異抗体を得
る。

このようにして得られた、抗ヒトＬＮドメイン特異抗体
結合担体（不溶性抗体〉と酵素標識抗ヒ）ＬＮドメイン
特異抗体（標識抗体）を用い、血中及び尿中のｎＬＮ又
はｆＬＮを測定したところ、健常人に比ベガン患者の血
中及び尿中では、ｎＬＮ又はｆＬＮｍ度が上昇すること
が判明し、ガンの診断に有用であることが示された。

〔実施例〕

以下に実施例を示し本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ （１）　　ヒトＬＮ抗原の単離 ヒ）ＬＮ抗原の抽出のために、ヒト胎盤を０、５　Ｍ　
　ＮａＣ１を含む０．０５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，２’）中でホモジナイズし、遠心分離により不溶化物
を除いたのちに、終濃度４ＭとなるようにＮａＣ１を添
加して、その際に生じる沈殿画分を集める。集めた沈殿
を０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む０．０５Ｍ）リス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，２）に可溶化したものを、同緩衝液にて平
衡化させたＣＬ−６Ｂセフアロースカラムにて分画し、
最初のピークに溶出されてくるフラクションをヒトＬＮ
標品として集めた。

（２）　　ヒトＬＮに対するモノクローナル抗体の作製 ヒトＬＮ５０μｇを生理食塩水０．１　ｒｎｌに溶解し
等量の完全フロイント・アジュバントを加え乳化させ、
Ｂａ１ｂ／ｃマウスの腹腔内に注射した。４週間後に抗
原５０μｇのみを同マウスの腹腔内に注射した。その３
日後にマウスより摘出した膵臓より、＊ｍ細胞を得、マ
ウスミエローマ細胞（Ｐ　３−　Ｘ　６３−Ａｇ３−　
Ｕｌ）と細胞数１０＝１の比で混合し、５０％ポリエチ
レングリコール及び２０％ジメチルスルホキシドの存在
下で１分間放置し、細胞融合を行った。無血清ＤＭＥＭ
培地を加え希釈したのち、遠心分離によりその上清を除
き、１０％牛脂児血清含有ＤＭＥＭ培地にて細胞を懸濁
し、９６穴マイクロタイタープレートに１穴当り２Ｘ１
０’細胞となるように分注した。その後１〜３日ごとに
培地の半分量をＨＡＴ培地で交換し、１０〜２０日後に
融合細胞（ハイブリドーマ〉の生育してきたウェルの培
養上清を採取し、抗体産生の有無をＥＬＩＳＡ法等によ
り調べ、ヒトＬＮに対する抗体を産生しているハイブリ
ドーマを５株選択した。

これらのハイブリドーマについて限界希釈法により２回
クローニングを行い、最も力価の高い抗体を産生ずるハ
イブリドーマのクローンとして、クローン株ＨＬＮ４１
及びＨＬＮ８２の２株を取得した。

前記クローン株は、各々　ｔｌｙｂｒｉｃｉｏｍａ　Ｈ
ＬＮ４１と表示し微工研菌寄第１０８００号（ＦＥＲＭ
　　Ｐ　−１０８００）　、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＨＬ
Ｎ８２と表示し微工研菌寄第１０７９９号（ＦＥＲＭ　
　Ｐ−１０７９９）として、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている。

この２株のハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗
体が同一フラグメント特異性を有することを確認するた
めに、ＬＮをｖ８プロテアーゼにより分解しｆＬＮを作
製し、ウェスタンブロッティングにより同−ｆＬＮに両
者が反応することを確めた。これらのモノクローナル抗
体を大量に得るために、Ｂａ１ｂ／Ｃマウス腹腔内に約
２Ｘ１０’個のハイブリドーマを注射し、腹水腫瘍を作
らせ、１０日後に腹水を採取し、抗ヒ）ＬＮドメイン特
異モノクローナル抗体ＨＬＮ４１及びＨＬＮ８２を取得
した。

（３）抗ヒ）ＬＮ抗体結合ビーズの作製上記（２）で得
た抗ヒ）ＬＮドメイン特異抗体ＨＬＮ８２のＩｍｇを含
有する０、１Ｍリン酸バッフｙ−（ｐＨ８，０）２０ｍ
ｌにポリスチレンボール（種水化学社製、粒径６．３５
　ｍｍ）　１００粒を加え、５℃で１６時間、３７℃で
１時間反応させ、抗体をビーズに固定化させた。ビーズ
は生理食塩水で充分洗浄後、１％牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）　、０．０５％アジ化ナトリウム、０．９％Ｎａ
Ｃ１を含む１０ｍＭリン酸バッファ゛−（ｐｔ１７．４
）に浸漬し、５℃で一晩放置し、抗ヒ）ＬＮドメイン特
異抗体結合ビーズを得た。

（４）抗ヒ）ＬＮ抗体酵素標識物の作製上記（２）で得
られた抗ヒ）ＬＮドメイン抗体ＨＬＮ４１にペルオキシ
ダーゼ（ベーリンガーーマンハイム社製）をナカネ（Ｎ
ａｋａｎｅ　）らの方法〔ジャーナル　オブ　ヒストケ
ミストリー　アンド　シトケミストリー　（Ｊ。

Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）第２２巻
、第１０８４頁（１９７４）　〕によって結合させ、標
識抗体を得た。すなわち１０ｍｇのペルオキシダーゼを
２ｗＬＩ！の精製水に溶かし、０．１　Ｍ過ヨウ素酸カ
リウムを０．２記加える。室温で２０分反応させた後１
ｍＭ酢酸バッファー（ｐｔｌ　４．０　）に対し４℃で
一晩透析する。これに０．２Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９
，５）を加えｐ＋を９〜９．５に調整する。一方、抗ヒ
トＬＮドメイン特異抗体２ｍｇを１．５ｍ！！のリン酸
緩衝生理食塩水（ｐ）１７．４）に溶かし、１０ｍＭ炭
酸バッファー（ｐＨ９，５）に対し、−晩４℃で透析し
ておき、これを上記の過ヨウ素酸処理したペルオキシダ
ーゼと混合し、室温で２時間反応させた後、水素化ホウ
素ナトリウム（４ｍｇ／−〉を０．１−添加し、４℃で
２時間反応後、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｔｌ　７．４
　）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ２２（ＬＫＢ社製
）を用いゲルろ過により分画した。ペルオキシダーゼ活
性と抗体活性の一致する画分を集め、メルチオレートナ
トリウムを終濃度０．０１％となるよう添加し、４℃で
保存した。

（５）　　ヒトＬＮの測定 ＥＩＡ法は以下のようにして行った。試料２００μｌを
チューブに入れ、不溶化抗体ビーズをチューブの中に１
つずつ入れ３７℃で１時間第１インキユベーシヨンを行
う。次にビーズを、３ｍ！！、の生理食塩水で３回洗い
、標識抗体液（３００倍希釈）２００μｌをビーズの入
ったチューブに入れ、３７℃で１時間第２インキユベー
シヨンを行う。次にビーズを３−の生理食塩水で３回洗
い、ビーズを別のチューブに移し、これに発色試薬３０
０μ１（０−フェニレンジアミン１．　ｍｇ／　ｍｌ　
。

Ｈ２Ｏ２の０．０１％、０．１Ｍクエン酸バッファーｐ
Ｈ５，０に溶解したもの）を加え、３７℃で３０分間反
応させ、ｌ　Ｎ　Ｈ，ＳＯ，の１ｍｌを加え反応を停止
させた。波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。

このような手順でガン患者及び健常人の血清、尿を測定
した。尿は同時にタレアチニン量を市販のキット（クレ
アチニンテストヮコー二和光純薬工業社製）を用いて測
定して、尿量を補正するために、タレアチニン量に対す
るＬＮの量の比（ＬＮμｇ　／ｇ−Ｃｒ）で表した。

第１図はガン患者と健常人とで血清中ＬＮ量の分布を比
較したグラフであり、第２図はガン患者と健常人とで尿
中ＬＮ量の分布を比較したグラフである。

この結果、モノクローナル抗体ＨＬＮ４１とＨＬＮ８２
の組合せにおいて１、ガン患者の血清中及び尿中ＬＮ量
は健常人に比べ明らかに高い値を示し、ガン診断におい
て本測定試薬が有用であることが示された。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明した通り、本発明により生体試料中のＬ
Ｎ測定試薬が提供された。本発明の測定試薬により新規
なガン診断が可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は血清中ＬＮ量を、第２図は尿中ＬＮ量をそれぞ
れ各ガン患者と健常人別に本測定試薬にて測定した時の
結果を示すグラフである。 第 図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、被検試料中の非フラグメント化ラミニン又はフラグ
   メント化ラミニンを測定する試薬において、同一ラミニ
   ンフラグメントを認識するが、抗原認識部位を異にする
   モノクローナル抗体を構成成分とすることを特徴とする
   ラミニン測定試薬。