JP2603822B2 - ヒトｉ型プロコラーゲンｃ末端ペプチドの定量用キツト - Google Patents
ヒトｉ型プロコラーゲンｃ末端ペプチドの定量用キツトInfo
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- JP2603822B2 JP2603822B2 JP60254873A JP25487385A JP2603822B2 JP 2603822 B2 JP2603822 B2 JP 2603822B2 JP 60254873 A JP60254873 A JP 60254873A JP 25487385 A JP25487385 A JP 25487385A JP 2603822 B2 JP2603822 B2 JP 2603822B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒトＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチド（以
下プロコラーゲンＣ末端と略記する）の定量用キツトに
関し、更に詳細には、酵素免疫測定法を用いるプロコラ
ーゲンＣ末端の定量用キツトに関する。
下プロコラーゲンＣ末端と略記する）の定量用キツトに
関し、更に詳細には、酵素免疫測定法を用いるプロコラ
ーゲンＣ末端の定量用キツトに関する。
生体内タン白質コラーゲンは主に線維芽細胞内で、そ
の前駆体プロコラーゲとして合成され、分泌時に特異的
ペプチダーゼにより、そのＣ末端ペプチドが切断されて
完全なタン白分子に変換する。
の前駆体プロコラーゲとして合成され、分泌時に特異的
ペプチダーゼにより、そのＣ末端ペプチドが切断されて
完全なタン白分子に変換する。
肝線維症などの種々の線維化症の主な症状は、その組
織におけるコラーゲンの過剰合成、過剰沈着であり、体
内コラーゲン形成の測定は、肝線維症などの種々の線維
化症の診断、あるいは治療の重要な指針となりうるもの
である。
織におけるコラーゲンの過剰合成、過剰沈着であり、体
内コラーゲン形成の測定は、肝線維症などの種々の線維
化症の診断、あるいは治療の重要な指針となりうるもの
である。
プロコラーゲンＣ末端はプロコラーゲンから遊離後
も、血中に一定時間存在する。したがつて、血中のプロ
コラーゲンＣ末端量の測定は、組織における線維形成を
診断するという点で臨床検査上重要であり、その簡便で
迅速な定量法の確立が望まれていた。
も、血中に一定時間存在する。したがつて、血中のプロ
コラーゲンＣ末端量の測定は、組織における線維形成を
診断するという点で臨床検査上重要であり、その簡便で
迅速な定量法の確立が望まれていた。
今日まで組織線維化の診断は、組織生検、尿中及び組
織中のヒドロキシプロリン量、血中プロリンヒドロキシ
ラーゼ活性、血中リジンオキシダーゼ活性の測定などに
より行われていたが、操作が煩雑であり、特異性にも問
題があるといつた欠点があつた。
織中のヒドロキシプロリン量、血中プロリンヒドロキシ
ラーゼ活性、血中リジンオキシダーゼ活性の測定などに
より行われていたが、操作が煩雑であり、特異性にも問
題があるといつた欠点があつた。
更に最近、プロコラーゲンＣ末端に対するウサギ抗血
清を用いたラジオイムノアツセイ法が開発された〔幸田
久平，肝臓，第25巻第192−203頁（1984年）〕。この定
量法は、あらかじめ放射能で標識されたプロコラーゲン
Ｃ末端と検体を同時にかつ競合的に抗プロコラーゲンＣ
末端抗体に作用させ、約１〜２日間反応後、抗ウサギIg
G抗体と約１日間反応させて、免疫沈降物の放射能活性
あるいは上清に残存した放射能活性を測ることにより、
検体中のプロコラーゲンＣ末端量を定量するものであ
る。
清を用いたラジオイムノアツセイ法が開発された〔幸田
久平，肝臓，第25巻第192−203頁（1984年）〕。この定
量法は、あらかじめ放射能で標識されたプロコラーゲン
Ｃ末端と検体を同時にかつ競合的に抗プロコラーゲンＣ
末端抗体に作用させ、約１〜２日間反応後、抗ウサギIg
G抗体と約１日間反応させて、免疫沈降物の放射能活性
あるいは上清に残存した放射能活性を測ることにより、
検体中のプロコラーゲンＣ末端量を定量するものであ
る。
上記のラジオイムノアツセイは少なくとも２日間の操
作時間を要し、操作の煩雑さと共に、放射能物質による
環境汚染、人体への影響という点や、目的抗原に対する
抗体としての抗血清を使用しているため、その反応性の
特異性という点に問題があつた。また、この抗血清及び
放射能標識プロコラーゲンＣ末端を調製するためには、
多量のプロコラーゲンＣ末端を精製しなければならず、
この点でも大きな問題を含んでいた。
作時間を要し、操作の煩雑さと共に、放射能物質による
環境汚染、人体への影響という点や、目的抗原に対する
抗体としての抗血清を使用しているため、その反応性の
特異性という点に問題があつた。また、この抗血清及び
放射能標識プロコラーゲンＣ末端を調製するためには、
多量のプロコラーゲンＣ末端を精製しなければならず、
この点でも大きな問題を含んでいた。
本発明は、上記従来技術の定量法の問題点を克服する
ためになされたものであり、その目的は体液などの試料
中のプロコラーゲンＣ末端量を免疫学的に定量する方
法、及びそれに使用する定量用キツトを提供することに
ある。
ためになされたものであり、その目的は体液などの試料
中のプロコラーゲンＣ末端量を免疫学的に定量する方
法、及びそれに使用する定量用キツトを提供することに
ある。
本発明を概説すれば、本発明は、ヒトＩ型プロコラー
ゲンＣ末端ペプチドの定量用キツトに関する発明であつ
て、下記（イ）（ロ）及び（ハ）を必須成分とするヒト
Ｉ型プロコラーゲンＣ末端ペプチド定量用キツトにあ
る。
ゲンＣ末端ペプチドの定量用キツトに関する発明であつ
て、下記（イ）（ロ）及び（ハ）を必須成分とするヒト
Ｉ型プロコラーゲンＣ末端ペプチド定量用キツトにあ
る。
（イ）ウエスタンブロツテイング法によりヒトＩ型プロ
コラーゲンＣ末端ペプチドと特異的に反応することが確
認された抗ヒトＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチドモノ
クローナル抗体結合固相物 （ロ）（イ）の固相物との組合せでサンドウイツチ法に
より、ヒトＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチドの定量測
定が可能であり、かつウエスタンブロツテイング法によ
りヒトＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチドと特異的に反
応することが確認された酵素標識抗ヒトＩ型プロコラー
ゲンＣ末端ペプチドモノクローナル抗体 （ハ）該酵素（ロ）に特異的な基質 抗体を調製する際に、その抗原とするプロコラーゲン
Ｃ末端はホフマンらの方法〔H.P.ホフマン（H.P.Hoffma
n）プロシーデイングス オブ ザ ナシヨナル アカ
デミー オブ サイエンス U.S.A.（Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A），第73巻第4304〜4308頁（1976）〕により、
ヒト線維芽細胞の培養液により得ることができる。線
維芽細胞を血清を含まない培地中で通常24時間培養し培
養液を集める。プロコラーゲンを含むタン白画分を硫安
で沈殿させ、そして以下に例示した実施例におけるよう
に、酵素処理、カラムクロマトグラフイーによりプロコ
ラーゲンＣ末端を精製する。プロコラーゲンＣ末端の分
離精製により、その特異的抗体の作製が可能となる。こ
の精製抗原に対する抗血清は、既に確立している方法に
より調製することができる。すなわちウサギなどの実験
動物に精製したプロコラーゲンＣ末端を数回にわたつて
免疫し、そして適当な期間の後、その動物から血清を抜
取ればよい。酵素免疫測定法（ELISA）、ウエスタン
ブロツテイング法などの技術により、特異的抗体が抗血
清中に存在することを試験することができる。しかし、
この方法により特異抗体を得るためには、免疫に用いる
抗原は純度の高い単一のタン白質でなければならない。
また、ウサギやヤギなどの大型の実験動物を免疫するた
めには多量の抗原を調製する必要がある。それ故、従来
法により、特異抗体を得ることは極めて困難であつた。
コラーゲンＣ末端ペプチドと特異的に反応することが確
認された抗ヒトＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチドモノ
クローナル抗体結合固相物 （ロ）（イ）の固相物との組合せでサンドウイツチ法に
より、ヒトＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチドの定量測
定が可能であり、かつウエスタンブロツテイング法によ
りヒトＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチドと特異的に反
応することが確認された酵素標識抗ヒトＩ型プロコラー
ゲンＣ末端ペプチドモノクローナル抗体 （ハ）該酵素（ロ）に特異的な基質 抗体を調製する際に、その抗原とするプロコラーゲン
Ｃ末端はホフマンらの方法〔H.P.ホフマン（H.P.Hoffma
n）プロシーデイングス オブ ザ ナシヨナル アカ
デミー オブ サイエンス U.S.A.（Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A），第73巻第4304〜4308頁（1976）〕により、
ヒト線維芽細胞の培養液により得ることができる。線
維芽細胞を血清を含まない培地中で通常24時間培養し培
養液を集める。プロコラーゲンを含むタン白画分を硫安
で沈殿させ、そして以下に例示した実施例におけるよう
に、酵素処理、カラムクロマトグラフイーによりプロコ
ラーゲンＣ末端を精製する。プロコラーゲンＣ末端の分
離精製により、その特異的抗体の作製が可能となる。こ
の精製抗原に対する抗血清は、既に確立している方法に
より調製することができる。すなわちウサギなどの実験
動物に精製したプロコラーゲンＣ末端を数回にわたつて
免疫し、そして適当な期間の後、その動物から血清を抜
取ればよい。酵素免疫測定法（ELISA）、ウエスタン
ブロツテイング法などの技術により、特異的抗体が抗血
清中に存在することを試験することができる。しかし、
この方法により特異抗体を得るためには、免疫に用いる
抗原は純度の高い単一のタン白質でなければならない。
また、ウサギやヤギなどの大型の実験動物を免疫するた
めには多量の抗原を調製する必要がある。それ故、従来
法により、特異抗体を得ることは極めて困難であつた。
本発明者らは、従来法により抗プロコラーゲンＣ末端
抗体を調製する際のいろいろな問題点を解決するために
ケーラーとミルシュテインの方法〔Ｋhler,Milstein,
ネーチヤー（Nature）、第256巻第476頁（1975）〕を用
いている。この方法を用いることにより、多量の抗原を
用意する必要なく、かつその抗原を絶対的に純粋にまで
精製する必要もなくなる。なぜなら、ヒトＩ型プロコラ
ーゲンを免疫した実験動物の脾臓細胞とミエローマ細胞
とを融合し、試験管条件下で特異的抗体を産生するクロ
ーン細胞を選択するからである。特に実験動物としてマ
ウスがよく用いられる。例えばBalb/cマウスの腹腔内に
線維芽細胞の培養液より抽出したヒトＩ型プロコラーゲ
ンを免疫し、４週間後に追加免疫を行い、その３日後に
マウスより脾臓を摘出する。脾臓細胞とマウスミエロー
マ細胞とを、ポリエチレングリコールの作用により融合
させ、そして常法により96穴プレート中にて培養する。
各培養液の上清を採取し、ELISA法により特異的抗体を
産生している細胞を選択し、更に限界希釈法によりクロ
ーニングを行い、抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナ
ル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を取得する。これら
のハイブリドーマは培養液中にモノクローナル抗体を分
泌する。
抗体を調製する際のいろいろな問題点を解決するために
ケーラーとミルシュテインの方法〔Ｋhler,Milstein,
ネーチヤー（Nature）、第256巻第476頁（1975）〕を用
いている。この方法を用いることにより、多量の抗原を
用意する必要なく、かつその抗原を絶対的に純粋にまで
精製する必要もなくなる。なぜなら、ヒトＩ型プロコラ
ーゲンを免疫した実験動物の脾臓細胞とミエローマ細胞
とを融合し、試験管条件下で特異的抗体を産生するクロ
ーン細胞を選択するからである。特に実験動物としてマ
ウスがよく用いられる。例えばBalb/cマウスの腹腔内に
線維芽細胞の培養液より抽出したヒトＩ型プロコラーゲ
ンを免疫し、４週間後に追加免疫を行い、その３日後に
マウスより脾臓を摘出する。脾臓細胞とマウスミエロー
マ細胞とを、ポリエチレングリコールの作用により融合
させ、そして常法により96穴プレート中にて培養する。
各培養液の上清を採取し、ELISA法により特異的抗体を
産生している細胞を選択し、更に限界希釈法によりクロ
ーニングを行い、抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナ
ル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を取得する。これら
のハイブリドーマは培養液中にモノクローナル抗体を分
泌する。
市販の無血清培地などを用いてハイブリドーマを培養
しその上清から硫安塩析などの操作により抗体画分を得
ることができる。また同系のマスウ体内にて、ハイブリ
ドーマを培養し、その動物の体液より同様の操作により
抗体画分を得ることもできる。
しその上清から硫安塩析などの操作により抗体画分を得
ることができる。また同系のマスウ体内にて、ハイブリ
ドーマを培養し、その動物の体液より同様の操作により
抗体画分を得ることもできる。
これらの抗プロコラーゲンＣ末端抗体は、不溶化担体
に固定化した抗体結合固相物や、酵素との結合体として
の酵素標識抗体として本発明の一部を形成する定量用キ
ツトに用いられる。本発明で使用する抗体は、抗血清又
はモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクロー
ナル抗体が特に適している。例えば、上記（イ），
（ロ）に用いる抗体として、２種の異なる抗プロコラー
ゲンＣ末端モノクローナル抗体が使用できる。この場
合、両者共プロコラーゲンＣ末端に対して指向性を示す
が、特に、プロコラーゲンＣ末端の別個のエピトープに
対して指向性を示すものが用いられる。更に、これらの
抗体は免疫グロブリンのまま使用されるに限られず、こ
れらの抗体をペプシン処理して得られるＦ（ab′）2,Fa
b′などのフラグメントとしても用いることができる。
これらのフラグメントを用いた場合、非特異的吸着を防
ぐことができる。
に固定化した抗体結合固相物や、酵素との結合体として
の酵素標識抗体として本発明の一部を形成する定量用キ
ツトに用いられる。本発明で使用する抗体は、抗血清又
はモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクロー
ナル抗体が特に適している。例えば、上記（イ），
（ロ）に用いる抗体として、２種の異なる抗プロコラー
ゲンＣ末端モノクローナル抗体が使用できる。この場
合、両者共プロコラーゲンＣ末端に対して指向性を示す
が、特に、プロコラーゲンＣ末端の別個のエピトープに
対して指向性を示すものが用いられる。更に、これらの
抗体は免疫グロブリンのまま使用されるに限られず、こ
れらの抗体をペプシン処理して得られるＦ（ab′）2,Fa
b′などのフラグメントとしても用いることができる。
これらのフラグメントを用いた場合、非特異的吸着を防
ぐことができる。
すなわち、本発明によるプロコラーゲンＣ末端の定量
法は ａ）検体を抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体
又は該抗体フラグメント結合固相物と、酵素標識抗プロ
コラーゲンＣ末端モノクローナル抗体又は該抗体フラグ
メントとに同時に一工程で反応させ、検体中のプロコラ
ーゲンＣ末端を固相化モノクローナル抗体又は該抗体フ
ラグメントと酵素標識モノクローナル抗体又は該抗体フ
ラグメントとの間でサンドウイツチを形成させ ｂ）得られたサンドウイツチ上の酵素を該酵素に特異的
な基質と反応させて酵素活性を測定することよりなる。
法は ａ）検体を抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体
又は該抗体フラグメント結合固相物と、酵素標識抗プロ
コラーゲンＣ末端モノクローナル抗体又は該抗体フラグ
メントとに同時に一工程で反応させ、検体中のプロコラ
ーゲンＣ末端を固相化モノクローナル抗体又は該抗体フ
ラグメントと酵素標識モノクローナル抗体又は該抗体フ
ラグメントとの間でサンドウイツチを形成させ ｂ）得られたサンドウイツチ上の酵素を該酵素に特異的
な基質と反応させて酵素活性を測定することよりなる。
抗体結合固相物に用いられる不溶化担体としては抗体
を結合する能力を有するものが使用可能であり、例えば
ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリボリビニルクロラ
イド、あるいはポリカーボネート製のマイクロプレー
ト、ビーズ、ステイツク又は試験管などが用いられる。
を結合する能力を有するものが使用可能であり、例えば
ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリボリビニルクロラ
イド、あるいはポリカーボネート製のマイクロプレー
ト、ビーズ、ステイツク又は試験管などが用いられる。
また、酵素標識抗体は、例えばマレイミド法、ピリジ
ム・ジスルフイド法などの当業者によりよく知られた方
法により酵素標識して製造される。酵素標識に用いる酵
素の例としては、アルカリホスフアターゼ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコ
リンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミ
ラーゼ、チロシナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
ラクトペルオキシダーゼ等が挙げられ、中でもアルカリ
ホスフアターゼが好ましい。
ム・ジスルフイド法などの当業者によりよく知られた方
法により酵素標識して製造される。酵素標識に用いる酵
素の例としては、アルカリホスフアターゼ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコ
リンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミ
ラーゼ、チロシナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
ラクトペルオキシダーゼ等が挙げられ、中でもアルカリ
ホスフアターゼが好ましい。
基質としては、酵素標識に用いた酵素に特異的な基質
であればよい。例えば酵素がアルカリホスフアターゼの
場合には、ｐ−ニトロフエニルリン酸を基質とし、その
酵素反応によつて生じるｐ−ニトロフエノールの濃度を
波長420nmにおける吸光度として測定すればよい。かく
して求められた酵素活性からプロコラーゲンＣ末端量を
換算し、定量することができる。
であればよい。例えば酵素がアルカリホスフアターゼの
場合には、ｐ−ニトロフエニルリン酸を基質とし、その
酵素反応によつて生じるｐ−ニトロフエノールの濃度を
波長420nmにおける吸光度として測定すればよい。かく
して求められた酵素活性からプロコラーゲンＣ末端量を
換算し、定量することができる。
以上のとおり、本発明は検体中のプロコラーゲンＣ末
端の測定における新規な定量法を提供するもので、肝硬
変などの組織線維化の診断に利用されるものである。
端の測定における新規な定量法を提供するもので、肝硬
変などの組織線維化の診断に利用されるものである。
次に本発明は実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明は何らこれによつて限定されるものではない。
明は何らこれによつて限定されるものではない。
なお、第１図及び第２図は、本八栄の定量法で使用す
る検量線を、420nmにおける吸光度（縦軸）とプロコラ
ーゲンＣ末端濃度（ng/ml、横軸）との関係で示したグ
ラフである。
る検量線を、420nmにおける吸光度（縦軸）とプロコラ
ーゲンＣ末端濃度（ng/ml、横軸）との関係で示したグ
ラフである。
実施例１ （１） プロコラーゲンＣ末端抗原の単離 プロコラーゲンＣ末端抽出のために、ヒト胎児肺由来
の線維芽細胞（IMR−90）を10％牛胎児血清を含むダル
ベツコ改変イーグル（DMEM）培地中にて37℃で培養す
る。細胞が適当な密度に増殖したところで、50mg/ア
スコルビン酸と20mg/ Ｌ−プロリンを添加した血清
無添加のDMEM培地に交換し、24時間培養した後、培養上
清を集めた。この培養上清にタン白質分解酵素阻害剤と
して25mM エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム（ED
TA）、10mM Ｎ−エチルマレイミド（NEN）、1mM フエ
ニルメチルホニルフルオライド（PMSF）、1mM ｐ−ア
ミノベンズアミド塩酸を加えたのち、硫酸アンモニウム
（176mg/ml）にてタン白質を塩析沈殿させた。その沈殿
を2M尿素、25mM EDTAを含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.8）に溶解したものをDEAEセフアセルカラムに添
加し、同緩衝液150mlと0.2M NaClを含む同緩衝液150ml
のグラジユエントを用いて溶出し、NaCl濃度0.005Mにて
溶出されたピークを集めた。SDSポリアクリルアミド電
気泳動によりこのピークがヒトＩ型プロコラーゲン分画
であることを確かめた。このようにして得たヒトＩ型プ
ロコラーゲンと精製バクテリア由来コラゲナーゼ（シグ
マ社製、アメリカ）を量比50:1にて混合し４℃で20時間
インキユベートし、ヒトＩ型プロコラーゲン分子中のコ
ラーゲン部分のみの分解を行つた。この分解産物からの
プロコラーゲンＣ末端の最終的な精製はバイオ・ゲルＡ
−1.5m（バイオ−ラツド社製−アメリカ）カラムクロマ
トグラフイーにより行い、分子量約10万に相当するピー
クを精製プロコラーゲンＣ末端分画として収集した。
の線維芽細胞（IMR−90）を10％牛胎児血清を含むダル
ベツコ改変イーグル（DMEM）培地中にて37℃で培養す
る。細胞が適当な密度に増殖したところで、50mg/ア
スコルビン酸と20mg/ Ｌ−プロリンを添加した血清
無添加のDMEM培地に交換し、24時間培養した後、培養上
清を集めた。この培養上清にタン白質分解酵素阻害剤と
して25mM エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム（ED
TA）、10mM Ｎ−エチルマレイミド（NEN）、1mM フエ
ニルメチルホニルフルオライド（PMSF）、1mM ｐ−ア
ミノベンズアミド塩酸を加えたのち、硫酸アンモニウム
（176mg/ml）にてタン白質を塩析沈殿させた。その沈殿
を2M尿素、25mM EDTAを含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.8）に溶解したものをDEAEセフアセルカラムに添
加し、同緩衝液150mlと0.2M NaClを含む同緩衝液150ml
のグラジユエントを用いて溶出し、NaCl濃度0.005Mにて
溶出されたピークを集めた。SDSポリアクリルアミド電
気泳動によりこのピークがヒトＩ型プロコラーゲン分画
であることを確かめた。このようにして得たヒトＩ型プ
ロコラーゲンと精製バクテリア由来コラゲナーゼ（シグ
マ社製、アメリカ）を量比50:1にて混合し４℃で20時間
インキユベートし、ヒトＩ型プロコラーゲン分子中のコ
ラーゲン部分のみの分解を行つた。この分解産物からの
プロコラーゲンＣ末端の最終的な精製はバイオ・ゲルＡ
−1.5m（バイオ−ラツド社製−アメリカ）カラムクロマ
トグラフイーにより行い、分子量約10万に相当するピー
クを精製プロコラーゲンＣ末端分画として収集した。
（２） プロコラーゲンＣ末端に対する抗血清の調製 精製プロコラーゲンＣ末端抗原0.5mgを生理食塩水0.5
mlに溶解し、これに等量の完全フロイント・アジユバン
トを加え、乳化させた後ウサギ皮下に注射した。２週間
置きに、同量の抗原を不完全フロイント・アジユバント
と乳化させたものを４回皮下注射し、最終免疫より10日
後にその全血を採血し、60分間室温で放置した後、遠心
分離することにより抗プロコラーゲンＣ末端抗体を含有
する抗血清を得た。その抗体の特異性と力価は当業者に
よりよく知られた方法、すなわちELISA法、ウエスタン
ブロツテイング法により確かめた （３） プロコラーゲンＣ末端に対するモノクローナル
抗体の調製 精製ヒトＩ型プロコラーゲン50μｇを生理食塩水0.1m
lに溶解し等量の完全フロイント・アジユバントを加え
乳化させ、Balb/cマウスの腹腔内に注射した。４週間後
に抗原50μｇのみを同マウスの腹腔内に注射した。その
３日後にマウスより摘出した脾臓より、脾臓細胞を得、
マウスミエローマ細胞（SP2/0）と細胞数10:1の比で混
合し、50％ポリエチレングリコール及び20％ジメチルス
ルホキシドの存在下で１分間放置し、細胞融合を行つ
た。無血清DMEM培地を加え希釈したのち、遠心分離によ
りその上清を除き、10％牛胎児血清含有DMEM培地にて細
胞を懸濁し、96穴マイクロタイタープレートに１穴当り
２×104細胞となるように分注した。その後１〜３日ご
とに培地の半分量をHAT培地で交換し、10〜20日後に融
合細胞（ハイブリドーマ）の生育してきたウエルの培養
上清を採取し、抗体産生の有無をELISA法等により調
べ、プロコラーゲンＣ末端に対する抗体を産生している
ハイブリドーマを５株選択した。
mlに溶解し、これに等量の完全フロイント・アジユバン
トを加え、乳化させた後ウサギ皮下に注射した。２週間
置きに、同量の抗原を不完全フロイント・アジユバント
と乳化させたものを４回皮下注射し、最終免疫より10日
後にその全血を採血し、60分間室温で放置した後、遠心
分離することにより抗プロコラーゲンＣ末端抗体を含有
する抗血清を得た。その抗体の特異性と力価は当業者に
よりよく知られた方法、すなわちELISA法、ウエスタン
ブロツテイング法により確かめた （３） プロコラーゲンＣ末端に対するモノクローナル
抗体の調製 精製ヒトＩ型プロコラーゲン50μｇを生理食塩水0.1m
lに溶解し等量の完全フロイント・アジユバントを加え
乳化させ、Balb/cマウスの腹腔内に注射した。４週間後
に抗原50μｇのみを同マウスの腹腔内に注射した。その
３日後にマウスより摘出した脾臓より、脾臓細胞を得、
マウスミエローマ細胞（SP2/0）と細胞数10:1の比で混
合し、50％ポリエチレングリコール及び20％ジメチルス
ルホキシドの存在下で１分間放置し、細胞融合を行つ
た。無血清DMEM培地を加え希釈したのち、遠心分離によ
りその上清を除き、10％牛胎児血清含有DMEM培地にて細
胞を懸濁し、96穴マイクロタイタープレートに１穴当り
２×104細胞となるように分注した。その後１〜３日ご
とに培地の半分量をHAT培地で交換し、10〜20日後に融
合細胞（ハイブリドーマ）の生育してきたウエルの培養
上清を採取し、抗体産生の有無をELISA法等により調
べ、プロコラーゲンＣ末端に対する抗体を産生している
ハイブリドーマを５株選択した。
これらのハイブリドーマについて限界希釈法により２
回クローニングを行い、最も力価の高い抗体を産生する
ハイブリドーマのクローンとして、PC5−５とPC8−７の
２株を取得した。
回クローニングを行い、最も力価の高い抗体を産生する
ハイブリドーマのクローンとして、PC5−５とPC8−７の
２株を取得した。
これらのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗
体がプロコラーゲンＣ末端と特異的に反応することをウ
エスタンブロツテイングにより確かめた。これらのモノ
クローナル抗体を大量に得るために、Balb/cマウス腹腔
内に約２×107個のハイブリドーマを注射し、腹水腫瘍
を作らせ、10日後に腹水を採取し、抗プロコラーゲンＣ
末端モノクローナル抗体を取得した。
体がプロコラーゲンＣ末端と特異的に反応することをウ
エスタンブロツテイングにより確かめた。これらのモノ
クローナル抗体を大量に得るために、Balb/cマウス腹腔
内に約２×107個のハイブリドーマを注射し、腹水腫瘍
を作らせ、10日後に腹水を採取し、抗プロコラーゲンＣ
末端モノクローナル抗体を取得した。
（４） 抗体の不溶化担体への結合 （２）で得られた抗血清を常法に従い硫安塩析を行い
DEAEセルロースカラムクロマトグラフイーにより抗プロ
コラーゲンＣ末端抗体を精製した。得られた抗体を石川
らの方法〔E.石川（E.Ishikawa），スカンジナビアン
ジヤーナル オブ イムノロジー（Scan.J.Immuno
l.）、第８巻第43頁（1978）〕によりペプシン処理し、
抗体フラグメントＦ（ab′）２を得た。
DEAEセルロースカラムクロマトグラフイーにより抗プロ
コラーゲンＣ末端抗体を精製した。得られた抗体を石川
らの方法〔E.石川（E.Ishikawa），スカンジナビアン
ジヤーナル オブ イムノロジー（Scan.J.Immuno
l.）、第８巻第43頁（1978）〕によりペプシン処理し、
抗体フラグメントＦ（ab′）２を得た。
この抗体フラグメントを10mM 炭酸ナトリウム緩衝液
（PH 8.5）に100μg/mlとなるように溶解し、これにポ
リスチレンボール（積水化学社製、粒径6.4mm）を浸
し、４℃にて18時間インキユベートして抗体フラグメン
トをボールに固定化した。これは１％牛血清アルブミ
ン、0.1％NaN3を含むトリス緩衝生理食塩水（TBS）中に
４℃にて保存した。
（PH 8.5）に100μg/mlとなるように溶解し、これにポ
リスチレンボール（積水化学社製、粒径6.4mm）を浸
し、４℃にて18時間インキユベートして抗体フラグメン
トをボールに固定化した。これは１％牛血清アルブミ
ン、0.1％NaN3を含むトリス緩衝生理食塩水（TBS）中に
４℃にて保存した。
（５） アルカリホスフアターゼ標識抗プロコラーゲン
Ｃ末端モノクローナル抗体の調製 （３）で得られた抗プロコラーゲンＣ末端モノクロー
ナル抗体（PC ８−７）を含む腹水より常法に従い、抗
プロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体（PC ８−
７）を精製し、前記石川らの方法によりモノクローナル
抗体フラグメントFab′を得た。
Ｃ末端モノクローナル抗体の調製 （３）で得られた抗プロコラーゲンＣ末端モノクロー
ナル抗体（PC ８−７）を含む腹水より常法に従い、抗
プロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体（PC ８−
７）を精製し、前記石川らの方法によりモノクローナル
抗体フラグメントFab′を得た。
このようにして得たモノクローナル抗体（PC ８−
７）フラグメントをＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ジ−ベンケミカル社製、東京）を用い、石川ら
の方法（酵素免疫測定法 第２版 第92頁 1982年12月
15日発行、医学書院）に従つてアルカリホスフアターゼ
（ベーリンガー社製、西ドイツ）に結合させた。
７）フラグメントをＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ジ−ベンケミカル社製、東京）を用い、石川ら
の方法（酵素免疫測定法 第２版 第92頁 1982年12月
15日発行、医学書院）に従つてアルカリホスフアターゼ
（ベーリンガー社製、西ドイツ）に結合させた。
（６） プロコラーゲンＣ末端の測定 プロコラーゲンＣ末端を含む検体50μを試験管に採
り（４）で調製した抗体固定化ポリスチレンボールを１
個添加し、（５）で調製した酵素標識抗体フラグメント
を0.1％牛血清アルブミン含有TBSで１μg/mlに希釈した
液を直ちに0.6ml加え、室温で30分間インキユベートす
る。次いでポリスチレンボールを分取し、0.1％トウイ
ーン（Tween）20（半井化学薬品社製、京都）を含むTBS
2mlで４回洗浄し、基質としてｐ−ニトロフエニルリン
酸（和光純薬工業社製、大阪）を10mMとなるように0.05
Mトリス−塩酸緩衝液（pH9.7,2mM MgCl2含有）で溶解
した液を0.6ml添加し、室温で15分間インキユベートす
る。その後0.1N NaOH 2mlを添加し反応を停止させ、
波長420nmにおける吸光度を測定した。測定結果より求
めた検量線を第１図に示す。
り（４）で調製した抗体固定化ポリスチレンボールを１
個添加し、（５）で調製した酵素標識抗体フラグメント
を0.1％牛血清アルブミン含有TBSで１μg/mlに希釈した
液を直ちに0.6ml加え、室温で30分間インキユベートす
る。次いでポリスチレンボールを分取し、0.1％トウイ
ーン（Tween）20（半井化学薬品社製、京都）を含むTBS
2mlで４回洗浄し、基質としてｐ−ニトロフエニルリン
酸（和光純薬工業社製、大阪）を10mMとなるように0.05
Mトリス−塩酸緩衝液（pH9.7,2mM MgCl2含有）で溶解
した液を0.6ml添加し、室温で15分間インキユベートす
る。その後0.1N NaOH 2mlを添加し反応を停止させ、
波長420nmにおける吸光度を測定した。測定結果より求
めた検量線を第１図に示す。
実施例２ （１） プロコラーゲンＣ末端抗原の単離 実施例１に準じて行つた。
（２） 抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体の
調製 実施例１に準じて行つた。
調製 実施例１に準じて行つた。
（３） 抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体の
不溶化担体への結合 実施例１の（４）と同様に行つた。すなわち、モノク
ローナル抗体（PC ５−５）を含む腹水からモノクロー
ナル抗体（PC ５−５）を精製し、ペプシン処理により
抗体フラグメントＦ（ab′）２を得た。これを10mM炭酸
ナトリウム緩衝液（pH8.5）に100μg/mlとなるように溶
解し、この溶液中にてポリスチレンボールを４℃で18時
間インキユベートすることにより製造した。
不溶化担体への結合 実施例１の（４）と同様に行つた。すなわち、モノク
ローナル抗体（PC ５−５）を含む腹水からモノクロー
ナル抗体（PC ５−５）を精製し、ペプシン処理により
抗体フラグメントＦ（ab′）２を得た。これを10mM炭酸
ナトリウム緩衝液（pH8.5）に100μg/mlとなるように溶
解し、この溶液中にてポリスチレンボールを４℃で18時
間インキユベートすることにより製造した。
（４） 酵素標識抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナ
ル抗体の調製 実施例１に準じて行なつた。
ル抗体の調製 実施例１に準じて行なつた。
（５） プロコラーゲンＣ末端の測定 実施例１に準じて行つた。測定結果より求めた検量線
を第２図に示す。
を第２図に示す。
以上詳細に説明したように、本発明により、プロコラ
ーゲンＣ末端量が１時間で迅速にしかも5ng/mlという高
感度で定量することが可能となつた。
ーゲンＣ末端量が１時間で迅速にしかも5ng/mlという高
感度で定量することが可能となつた。
第１図及び第２図は本発明の定量法で使用する検量線
を、420nmでの吸光度とプロコラーゲンＣ末端量との関
係で示したグラフである。
を、420nmでの吸光度とプロコラーゲンＣ末端量との関
係で示したグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大林 晃 大津市瀬田３丁目４番１号 寶酒造株式 会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭57−208458（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−16355（ＪＰ，Ａ) Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏ ｌｏｇｙ Ｂ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 59，Ｎｏ．１（1978）Ｐ．47−50 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ. 108（1982）Ｐ．310−318 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔ ｉｇａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．48，Ｎｏ．５ （1983）Ｐ．639−649 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔ ｉｇａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．50，Ｎｏ．１ （1984）Ｐ．101−102
Claims (2)
- 【請求項１】下記（イ）、（ロ）及び（ハ） （イ）ウエスタンブロツテイング法によりヒトＩ型プロ
コラーゲンＣ末端ペプチドと特異的に反応することが確
認された抗ヒトＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチドモノ
クローナル抗体結合固相物 （ロ）（イ）の固相物との組合せでサンドウイツチ法に
より、ヒトＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチドの定量測
定が可能であり、かつウエスタンブロツテイング法によ
りヒトＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチドと特異的に反
応することが確認された酵素標識抗ヒトＩ型プロコラー
ゲンＣ末端ペプチドモノクローナル抗体 （ハ）該酵素（ロ）に特異的な基質 を必須成分とすることを特徴とするヒトＩ型プロコラー
ゲンＣ末端ペプチド定量用キツト。 - 【請求項２】特許請求の範囲第１項（ロ）に記載の抗体
が、抗ヒトＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチドモノクロ
ーナル抗体（PC8−７）である特許請求の範囲第１項に
記載の定量用キツト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60254873A JP2603822B2 (ja) | 1985-11-15 | 1985-11-15 | ヒトｉ型プロコラーゲンｃ末端ペプチドの定量用キツト |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60254873A JP2603822B2 (ja) | 1985-11-15 | 1985-11-15 | ヒトｉ型プロコラーゲンｃ末端ペプチドの定量用キツト |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8147819A Division JP2712018B2 (ja) | 1996-05-20 | 1996-05-20 | モノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62116262A JPS62116262A (ja) | 1987-05-27 |
| JP2603822B2 true JP2603822B2 (ja) | 1997-04-23 |
Family
ID=17271018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60254873A Expired - Lifetime JP2603822B2 (ja) | 1985-11-15 | 1985-11-15 | ヒトｉ型プロコラーゲンｃ末端ペプチドの定量用キツト |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2603822B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2535426B2 (ja) * | 1988-05-10 | 1996-09-18 | 帝人株式会社 | コンドロカルシンの測定方法 |
| US5374533A (en) * | 1988-05-10 | 1994-12-20 | Tetjin Limited | Method for determining chondrocalcin |
| DE68917732T2 (de) * | 1988-05-10 | 1994-12-15 | Teijin Ltd | Immuntestverfahren von chondrocalcin. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH642458A5 (en) * | 1980-04-25 | 1984-04-13 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
| JPS57208458A (en) * | 1981-06-18 | 1982-12-21 | Mitsui Toatsu Chem Inc | Labeled antibody for immunochemical measurement |
-
1985
- 1985-11-15 JP JP60254873A patent/JP2603822B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０８（１９８２）Ｐ．３１０−３１８ |
| Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｂ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５９，Ｎｏ．１（１９７８）Ｐ．４７−５０ |
| Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．４８，Ｎｏ．５（１９８３）Ｐ．６３９−６４９ |
| Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．１（１９８４）Ｐ．１０１−１０２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62116262A (ja) | 1987-05-27 |
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