JPH08226918A - 遊離の活性型マトリックスメタロプロテアーゼ類の分別定量法 - Google Patents
遊離の活性型マトリックスメタロプロテアーゼ類の分別定量法Info
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- JPH08226918A JPH08226918A JP7053794A JP5379495A JPH08226918A JP H08226918 A JPH08226918 A JP H08226918A JP 7053794 A JP7053794 A JP 7053794A JP 5379495 A JP5379495 A JP 5379495A JP H08226918 A JPH08226918 A JP H08226918A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 組織や体液中に存在するマトリックスメタロ
プロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）のうちマトリックス成分の
分解に直接関与する活性型ＭＭＰｓの簡単且つ迅速な分
別定量法を提供し、ＭＭＰｓ活性が亢進する疾患、例え
ば関節症、癌の浸潤、転移及び肺線維症のような病態の
診断及びモニターを可能にせしめる。 【構成】 簡単な操作及び試薬を用い、感度並びに精度
良く、また迅速な遊離の活性型ＭＭＰｓの分別定量法
は、各ＭＭＰに特異的に結合するモノクローナル抗体
と、ティシュ インヒビター オブ メタロプロテアー
ゼ類（ＴＩＭＰｓ）あるいはＴＩＭＰｓと各ＴＩＭＰに
特異的に結合するモノクローナル抗体との複合物を組合
せて使用することにより達成できる。特には固相担体結
合物及び標識物付与物のいずれか一方がマトリックスメ
タロプロテアーゼに対し特異的に結合するモノクローナ
ル抗体で、他方がマトリックスメタロプロテアーゼのイ
ンヒビターであり、それらをそれぞれ組み合わせて用い
ることが好ましい。
プロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）のうちマトリックス成分の
分解に直接関与する活性型ＭＭＰｓの簡単且つ迅速な分
別定量法を提供し、ＭＭＰｓ活性が亢進する疾患、例え
ば関節症、癌の浸潤、転移及び肺線維症のような病態の
診断及びモニターを可能にせしめる。 【構成】 簡単な操作及び試薬を用い、感度並びに精度
良く、また迅速な遊離の活性型ＭＭＰｓの分別定量法
は、各ＭＭＰに特異的に結合するモノクローナル抗体
と、ティシュ インヒビター オブ メタロプロテアー
ゼ類（ＴＩＭＰｓ）あるいはＴＩＭＰｓと各ＴＩＭＰに
特異的に結合するモノクローナル抗体との複合物を組合
せて使用することにより達成できる。特には固相担体結
合物及び標識物付与物のいずれか一方がマトリックスメ
タロプロテアーゼに対し特異的に結合するモノクローナ
ル抗体で、他方がマトリックスメタロプロテアーゼのイ
ンヒビターであり、それらをそれぞれ組み合わせて用い
ることが好ましい。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医学的生理学的分野に
係るものであり、遊離のマトリックスメタロプロテアー
ゼ類（ＭＭＰｓ）、とりわけ遊離の活性型ＭＭＰｓの分
別定量法に関する。さらに詳しく言えば、本発明はＭＭ
Ｐｓに対し特異的に結合する各々のモノクローナル抗体
及びＭＭＰｓのインヒビターであるティシュ インヒビ
ター オブメタロプロテアーゼ類（ＴＩＭＰｓ）を用い
て、遊離の活性型ＭＭＰｓを分別定量する方法に関す
る。
係るものであり、遊離のマトリックスメタロプロテアー
ゼ類（ＭＭＰｓ）、とりわけ遊離の活性型ＭＭＰｓの分
別定量法に関する。さらに詳しく言えば、本発明はＭＭ
Ｐｓに対し特異的に結合する各々のモノクローナル抗体
及びＭＭＰｓのインヒビターであるティシュ インヒビ
ター オブメタロプロテアーゼ類（ＴＩＭＰｓ）を用い
て、遊離の活性型ＭＭＰｓを分別定量する方法に関す
る。
【０００２】
【背景技術】細胞外マトリックスは、コラーゲン、プロ
テオグリカン、エラスチン、フィブロネクチン及びラミ
ニンなどの接着性糖タンパク質から構成されている（Ｍ
ａｒｔｉｎｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４８，６５６−６７７，１９
８３）。これらマトリックス成分の分解にはマトリック
スメタロプロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）が重要な役割を果
たしていることは周知のことである。知られているＭＭ
Ｐの種類とそのナンバーリングは以下のようになってい
る。間質型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、７２キロダル
トン（ｋＤ）ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）、ストロムラ
イシン−１（ＭＭＰ−３）、ＰＵＭＰ−１（ＭＭＰ−
７）、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ−８）、９２ｋＤゼ
ラチナーゼ（ＭＭＰ−９）、ストロムライシン−２（Ｍ
ＭＰ−１０）、ストロムライシン−３（ＭＭＰ−１
１）、マクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＰ−１
２）、コラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）及び膜型ＭＭ
Ｐ（ＭＴ−ＭＭＰ，ＭＭＰ−１４）である（Ｈ．Ｂｉｒ
ｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ
Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，４，１９７−２５０，１９９３；
Ｓ．Ｄ．Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．
Ｃｈｅｍ．，２６８，２３８２４−２３８２９，１９９
３；Ｊ．Ｍ．Ｐ．Ｆｒｅｊｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１６７６６−１６７７３，
１９９４；Ｈ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３７０，６１−６５，１９９４）。
テオグリカン、エラスチン、フィブロネクチン及びラミ
ニンなどの接着性糖タンパク質から構成されている（Ｍ
ａｒｔｉｎｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４８，６５６−６７７，１９
８３）。これらマトリックス成分の分解にはマトリック
スメタロプロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）が重要な役割を果
たしていることは周知のことである。知られているＭＭ
Ｐの種類とそのナンバーリングは以下のようになってい
る。間質型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、７２キロダル
トン（ｋＤ）ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）、ストロムラ
イシン−１（ＭＭＰ−３）、ＰＵＭＰ−１（ＭＭＰ−
７）、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ−８）、９２ｋＤゼ
ラチナーゼ（ＭＭＰ−９）、ストロムライシン−２（Ｍ
ＭＰ−１０）、ストロムライシン−３（ＭＭＰ−１
１）、マクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＰ−１
２）、コラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）及び膜型ＭＭ
Ｐ（ＭＴ−ＭＭＰ，ＭＭＰ−１４）である（Ｈ．Ｂｉｒ
ｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ
Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，４，１９７−２５０，１９９３；
Ｓ．Ｄ．Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．
Ｃｈｅｍ．，２６８，２３８２４−２３８２９，１９９
３；Ｊ．Ｍ．Ｐ．Ｆｒｅｊｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１６７６６−１６７７３，
１９９４；Ｈ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３７０，６１−６５，１９９４）。
【０００３】ＭＭＰｓは、細胞内で合成、産生され、必
要に応じて細胞外へ前駆体（プロ体もしくは潜在型）と
して放出される。潜在型ＭＭＰｓはアミノ末端よりプロ
ペプチド、活性中心領域（中央領域）及びカルボキシル
末端領域などから構成されており、その潜在型ＭＭＰｓ
自身はマトリックス成分の分解には関与せず、体内では
プラスミンやＭＭＰ−３などにより限定分解を受けて活
性化され、あるいは実験的にはチオール基反応性有機水
銀化合物などによりアミノ末端プロペプチドが切断され
活性型ＭＭＰｓとなり、各々の基質に対応するマトリッ
クス成分を分解することが知られている（Ｈ．Ｂｉｒｋ
ｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｂ
ｉｏｌ．Ｍｅｄ．，４，１９７−２５０，１９９３）。
また組織や体液中においてＭＭＰｓ活性を特異的に阻害
するＭＭＰｓのインヒビターであるティシュ インヒビ
ター オブ メタロプロテアーゼ類（ＴＩＭＰｓ）が存
在することが知られている（Ｔ．Ｈａｙａｋａｗａ，Ｃ
ｅｌｌ ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，１９，１０９−
１１４，１９９４）。ＴＩＭＰｓは現在３種類報告され
ており、各々ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２及びＴＩＭＰ
−３と呼ばれている。これらＴＩＭＰｓは、通常活性型
ＭＭＰｓに結合し、組織の修復、組織破壊の阻止、癌転
移抑制あるいは細胞増殖促進などの生理的作用を持って
いると考えられている。またＴＩＭＰ−１は潜在型ＭＭ
Ｐ−９に、ＴＩＭＰ−２は潜在型ＭＭＰ−２に結合し、
各々のＭＭＰｓの活性化及び自己分解活性を制御してい
ると考えられている。
要に応じて細胞外へ前駆体（プロ体もしくは潜在型）と
して放出される。潜在型ＭＭＰｓはアミノ末端よりプロ
ペプチド、活性中心領域（中央領域）及びカルボキシル
末端領域などから構成されており、その潜在型ＭＭＰｓ
自身はマトリックス成分の分解には関与せず、体内では
プラスミンやＭＭＰ−３などにより限定分解を受けて活
性化され、あるいは実験的にはチオール基反応性有機水
銀化合物などによりアミノ末端プロペプチドが切断され
活性型ＭＭＰｓとなり、各々の基質に対応するマトリッ
クス成分を分解することが知られている（Ｈ．Ｂｉｒｋ
ｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｂ
ｉｏｌ．Ｍｅｄ．，４，１９７−２５０，１９９３）。
また組織や体液中においてＭＭＰｓ活性を特異的に阻害
するＭＭＰｓのインヒビターであるティシュ インヒビ
ター オブ メタロプロテアーゼ類（ＴＩＭＰｓ）が存
在することが知られている（Ｔ．Ｈａｙａｋａｗａ，Ｃ
ｅｌｌ ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，１９，１０９−
１１４，１９９４）。ＴＩＭＰｓは現在３種類報告され
ており、各々ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２及びＴＩＭＰ
−３と呼ばれている。これらＴＩＭＰｓは、通常活性型
ＭＭＰｓに結合し、組織の修復、組織破壊の阻止、癌転
移抑制あるいは細胞増殖促進などの生理的作用を持って
いると考えられている。またＴＩＭＰ−１は潜在型ＭＭ
Ｐ−９に、ＴＩＭＰ−２は潜在型ＭＭＰ−２に結合し、
各々のＭＭＰｓの活性化及び自己分解活性を制御してい
ると考えられている。
【０００４】
【解決すべき課題】遊離の活性型ＭＭＰｓの測定は、組
織や体液中に存在するＭＭＰｓのうちマトリックス成分
の分解に直接関与する活性型ＭＭＰｓ量を知る手段とな
り得るものである。従って、遊離の活性型ＭＭＰｓを定
量することにより、ＭＭＰｓ活性が亢進する疾患、例え
ば関節症、癌の浸潤、転移、歯周病及び肺線維症のよう
な病態の診断あるいはモニターを行うことが可能とな
る。ところが、活性型ＭＭＰｓ量を測定する方法として
は、一般的に考えられるのは各々の基質を分解させると
ころの酵素活性による方法であるが、組織中や体液中に
は、他のＭＭＰｓやＴＩＭＰｓが存在しており、また各
ＭＭＰの基質特異性が広いことからＭＭＰｓの分別定量
は困難であった。Ｚｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（ＰＣＴ
ＷＯ９３／２０４４７）は二種類の抗体すなわち各Ｍ
ＭＰに対する抗体及び各ＴＩＭＰに対する抗体を用い、
ＭＭＰ−ＴＩＭＰ複合体を測定している。この方法では
既に形成された不活性なＭＭＰ−ＴＩＭＰ複合体を測定
するのみで、マトリックス成分の分解に直接関わる遊離
状態にある活性型ＭＭＰｓ（遊離の活性型ＭＭＰｓ）を
測定することはできない。またＴＩＭＰｓは全ての活性
型ＭＭＰｓと結合し、さらにＴＩＭＰ−１あるいはＴＩ
ＭＰ−２は各々潜在型ＭＭＰ−９あるいは潜在型ＭＭＰ
−２とも結合することから、一つの活性型ＭＭＰを定量
するには、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２及びＴＩＭＰ−
３との複合体をすべて定量しなければならず、さらには
ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９については潜在型ＭＭＰｓと
複合体との分別定量が必要となるため正確な活性型ＭＭ
Ｐｓ量を定量するのは困難である。こうして現在まで遊
離状態にある活性型ＭＭＰｓのみの定量法については報
告がない。さらに潜在型ＭＭＰを認識せず活性型ＭＭＰ
ｓのみに特異的な抗体を用いれば活性型ＭＭＰｓを測定
できると考えられるが、未だこのような抗体が得られた
という報告もない。
織や体液中に存在するＭＭＰｓのうちマトリックス成分
の分解に直接関与する活性型ＭＭＰｓ量を知る手段とな
り得るものである。従って、遊離の活性型ＭＭＰｓを定
量することにより、ＭＭＰｓ活性が亢進する疾患、例え
ば関節症、癌の浸潤、転移、歯周病及び肺線維症のよう
な病態の診断あるいはモニターを行うことが可能とな
る。ところが、活性型ＭＭＰｓ量を測定する方法として
は、一般的に考えられるのは各々の基質を分解させると
ころの酵素活性による方法であるが、組織中や体液中に
は、他のＭＭＰｓやＴＩＭＰｓが存在しており、また各
ＭＭＰの基質特異性が広いことからＭＭＰｓの分別定量
は困難であった。Ｚｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（ＰＣＴ
ＷＯ９３／２０４４７）は二種類の抗体すなわち各Ｍ
ＭＰに対する抗体及び各ＴＩＭＰに対する抗体を用い、
ＭＭＰ−ＴＩＭＰ複合体を測定している。この方法では
既に形成された不活性なＭＭＰ−ＴＩＭＰ複合体を測定
するのみで、マトリックス成分の分解に直接関わる遊離
状態にある活性型ＭＭＰｓ（遊離の活性型ＭＭＰｓ）を
測定することはできない。またＴＩＭＰｓは全ての活性
型ＭＭＰｓと結合し、さらにＴＩＭＰ−１あるいはＴＩ
ＭＰ−２は各々潜在型ＭＭＰ−９あるいは潜在型ＭＭＰ
−２とも結合することから、一つの活性型ＭＭＰを定量
するには、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２及びＴＩＭＰ−
３との複合体をすべて定量しなければならず、さらには
ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９については潜在型ＭＭＰｓと
複合体との分別定量が必要となるため正確な活性型ＭＭ
Ｐｓ量を定量するのは困難である。こうして現在まで遊
離状態にある活性型ＭＭＰｓのみの定量法については報
告がない。さらに潜在型ＭＭＰを認識せず活性型ＭＭＰ
ｓのみに特異的な抗体を用いれば活性型ＭＭＰｓを測定
できると考えられるが、未だこのような抗体が得られた
という報告もない。
【０００５】
【課題の解決】本発明の目的は、簡単な操作及び試薬を
用い、感度並びに精度良く、また迅速にそれぞれの活性
型ＭＭＰｓ量を分別して定量し得る方法を提供すること
にある。こうした方法に用いる試薬キットを提供するこ
とも本発明の目的の一つである。本発明者らは、活性型
ＭＭＰｓに結合し、その活性を抑制するインヒビター、
例えばＴＩＭＰｓ、α2 −マクログロブリン、ペプチド
インヒビター及び合成化合物などのうち、ＴＩＭＰｓが
すべてのＭＭＰｓの活性型に特異的に結合することに着
目し、各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とＴＩＭＰｓと
の組合せにより簡便な遊離の活性型ＭＭＰｓの分別定量
法を提供できるのではないかと考えて、鋭意研究の結
果、各ＭＭＰに特異的に結合する抗体と、ＴＩＭＰｓあ
るいはＴＩＭＰｓと各ＴＩＭＰに特異的に結合する抗体
との複合物を組合せて使用する遊離の活性型ＭＭＰｓの
分別定量法を確立した。さらにＴＩＭＰｓを標識付与用
として用いる場合、ＴＩＭＰｓの活性型ＭＭＰｓに対す
る結合能を損することなく直接または間接的に標識物を
付与することに成功し、この標識物を付与したＴＩＭＰ
ｓと各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とを組合せること
により、簡便な遊離の活性型ＭＭＰｓの分別定量法を確
立した。特に直接標識物を付与したＴＩＭＰ−１と各Ｍ
ＭＰに特異的に結合する抗体とを組み合わせて用いる場
合、遊離の活性型ＭＭＰ−１、−２、−３、−７、−
８、−１０、−１１、−１２、−１３及び−１４を定量
することができ、直接標識物を付与したＴＩＭＰ−２と
各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とを組み合わせて用い
る場合、遊離の活性型ＭＭＰ−１、−３、−７、−８、
−９、−１０、−１１、−１２、−１３及び−１４を定
量することができる。さらに固相用にＴＩＭＰ−１ある
いはＴＩＭＰ−２を用いる場合も上記と同様各々の遊離
の活性型ＭＭＰｓを定量することができる。
用い、感度並びに精度良く、また迅速にそれぞれの活性
型ＭＭＰｓ量を分別して定量し得る方法を提供すること
にある。こうした方法に用いる試薬キットを提供するこ
とも本発明の目的の一つである。本発明者らは、活性型
ＭＭＰｓに結合し、その活性を抑制するインヒビター、
例えばＴＩＭＰｓ、α2 −マクログロブリン、ペプチド
インヒビター及び合成化合物などのうち、ＴＩＭＰｓが
すべてのＭＭＰｓの活性型に特異的に結合することに着
目し、各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とＴＩＭＰｓと
の組合せにより簡便な遊離の活性型ＭＭＰｓの分別定量
法を提供できるのではないかと考えて、鋭意研究の結
果、各ＭＭＰに特異的に結合する抗体と、ＴＩＭＰｓあ
るいはＴＩＭＰｓと各ＴＩＭＰに特異的に結合する抗体
との複合物を組合せて使用する遊離の活性型ＭＭＰｓの
分別定量法を確立した。さらにＴＩＭＰｓを標識付与用
として用いる場合、ＴＩＭＰｓの活性型ＭＭＰｓに対す
る結合能を損することなく直接または間接的に標識物を
付与することに成功し、この標識物を付与したＴＩＭＰ
ｓと各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とを組合せること
により、簡便な遊離の活性型ＭＭＰｓの分別定量法を確
立した。特に直接標識物を付与したＴＩＭＰ−１と各Ｍ
ＭＰに特異的に結合する抗体とを組み合わせて用いる場
合、遊離の活性型ＭＭＰ−１、−２、−３、−７、−
８、−１０、−１１、−１２、−１３及び−１４を定量
することができ、直接標識物を付与したＴＩＭＰ−２と
各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とを組み合わせて用い
る場合、遊離の活性型ＭＭＰ−１、−３、−７、−８、
−９、−１０、−１１、−１２、−１３及び−１４を定
量することができる。さらに固相用にＴＩＭＰ−１ある
いはＴＩＭＰ−２を用いる場合も上記と同様各々の遊離
の活性型ＭＭＰｓを定量することができる。
【０００６】またさらに各ＭＭＰに特異的に結合する抗
体と各ＴＩＭＰとを組み合わせて用いる場合、標識物を
付与した抗ＴＩＭＰ抗体を用いて間接的に標識物を付与
した各ＴＩＭＰを用いることにより、すべての遊離の活
性型ＭＭＰｓ、すなわちＭＭＰ−１、−２、−３、−
７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３及び
−１４を定量することができる。本発明は、ＴＩＭＰｓ
から成る群から選ばれたものと各ＭＭＰに対するモノク
ローナル抗体から成る群から選ばれたものとを組合わせ
て用い、その組合わせ成分の一方を直接あるいは間接に
検知可能な標識物を付与した成分とし、他の組合わせ成
分を固相化した成分として用い、被検試料中の遊離の活
性型ＭＭＰｓを分別定量する方法及びその方法に用いる
試薬を提供することにある。こうして典型的には本発明
の目的は、上記の標識物を付与したＴＩＭＰｓ（各ＴＩ
ＭＰに対する標識物を付与した各モノクローナル抗体で
間接的に標識物を付与したＴＩＭＰｓを含む）あるいは
各ＭＭＰに対するモノクローナル抗体及び固相担体用と
して各ＭＭＰに対するモノクローナル抗体あるいはＴＩ
ＭＰｓを用い、被検試料中の遊離の活性型ＭＭＰｓを分
別定量する優れた方法及びその為の試薬キットを提供す
ることにある。本発明はこうした遊離の活性型ＭＭＰｓ
を分別定量することのできる試薬キットのうちの各試薬
をすべてその実施態様のうちに含むと理解される。さら
に本発明の目的は、上記定量法を用いて遊離の活性型Ｍ
ＭＰｓを分別定量することにより、組織破壊や癌転移な
どの病態をモニターし得る方法並びに試薬あるいは診断
剤を提供することにある。したがって、医学的生理学的
分野における上記試薬の各種利用、組織破壊や癌転移、
組織の修復の程度の判断、あるいは細胞増殖促進などの
生理的作用の指標として上記試薬を使用することはすべ
て本発明のその実施態様のうちに含むと理解される。
体と各ＴＩＭＰとを組み合わせて用いる場合、標識物を
付与した抗ＴＩＭＰ抗体を用いて間接的に標識物を付与
した各ＴＩＭＰを用いることにより、すべての遊離の活
性型ＭＭＰｓ、すなわちＭＭＰ−１、−２、−３、−
７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３及び
−１４を定量することができる。本発明は、ＴＩＭＰｓ
から成る群から選ばれたものと各ＭＭＰに対するモノク
ローナル抗体から成る群から選ばれたものとを組合わせ
て用い、その組合わせ成分の一方を直接あるいは間接に
検知可能な標識物を付与した成分とし、他の組合わせ成
分を固相化した成分として用い、被検試料中の遊離の活
性型ＭＭＰｓを分別定量する方法及びその方法に用いる
試薬を提供することにある。こうして典型的には本発明
の目的は、上記の標識物を付与したＴＩＭＰｓ（各ＴＩ
ＭＰに対する標識物を付与した各モノクローナル抗体で
間接的に標識物を付与したＴＩＭＰｓを含む）あるいは
各ＭＭＰに対するモノクローナル抗体及び固相担体用と
して各ＭＭＰに対するモノクローナル抗体あるいはＴＩ
ＭＰｓを用い、被検試料中の遊離の活性型ＭＭＰｓを分
別定量する優れた方法及びその為の試薬キットを提供す
ることにある。本発明はこうした遊離の活性型ＭＭＰｓ
を分別定量することのできる試薬キットのうちの各試薬
をすべてその実施態様のうちに含むと理解される。さら
に本発明の目的は、上記定量法を用いて遊離の活性型Ｍ
ＭＰｓを分別定量することにより、組織破壊や癌転移な
どの病態をモニターし得る方法並びに試薬あるいは診断
剤を提供することにある。したがって、医学的生理学的
分野における上記試薬の各種利用、組織破壊や癌転移、
組織の修復の程度の判断、あるいは細胞増殖促進などの
生理的作用の指標として上記試薬を使用することはすべ
て本発明のその実施態様のうちに含むと理解される。
【０００７】本発明に従った態様によれば、例えば下記
の定量法が提供される。 （１）標識物が付与されたＴＩＭＰｓと各ＭＭＰに特異
的に結合するモノクローナル抗体あるいは（２）ＴＩＭ
Ｐに特異的に結合するモノクローナル抗体を介して標識
物が付与されたＴＩＭＰｓと各ＭＭＰに特異的に結合す
るモノクローナル抗体をそれぞれ用い、個々の活性型Ｍ
ＭＰを標準物質として、被検試料中の個々の遊離の活性
型ＭＭＰの分別定量を行うことを特徴とする遊離の活性
型ＭＭＰｓの定量法及びそれに用いる試薬。本発明の定
量法において、使用されるＭＭＰに特異的に結合するモ
ノクローナル抗体は、各々のＭＭＰに特異的に結合し、
別のＭＭＰｓと交差反応しないモノクローナル抗体で、
特には各ＭＭＰの中央領域またはカルボキシル末端領域
を認識するものが挙げられる。
の定量法が提供される。 （１）標識物が付与されたＴＩＭＰｓと各ＭＭＰに特異
的に結合するモノクローナル抗体あるいは（２）ＴＩＭ
Ｐに特異的に結合するモノクローナル抗体を介して標識
物が付与されたＴＩＭＰｓと各ＭＭＰに特異的に結合す
るモノクローナル抗体をそれぞれ用い、個々の活性型Ｍ
ＭＰを標準物質として、被検試料中の個々の遊離の活性
型ＭＭＰの分別定量を行うことを特徴とする遊離の活性
型ＭＭＰｓの定量法及びそれに用いる試薬。本発明の定
量法において、使用されるＭＭＰに特異的に結合するモ
ノクローナル抗体は、各々のＭＭＰに特異的に結合し、
別のＭＭＰｓと交差反応しないモノクローナル抗体で、
特には各ＭＭＰの中央領域またはカルボキシル末端領域
を認識するものが挙げられる。
【０００８】本発明で使用されるＭＭＰｓに対するイン
ヒビターは、ＭＭＰ遺伝子ファミリー由来のＭＭＰｓに
対するインヒビターを含んでいてよく、例えばＴＩＭＰ
−１、ＴＩＭＰ−２といったＭＭＰｓに対するインヒビ
ターであることができる。ＴＩＭＰ−１は、最初ＭＭＰ
−１を阻害することからコラゲナーゼインヒビターと呼
ばれていたが、その後ゼラチナーゼやストロムライシン
も阻害することからＴＩＭＰと呼ばれるようになったも
ので、オタマジャクシからヒトに至る由来の異なるコラ
ゲナーゼを広く阻害する。ＴＩＭＰ−１は、多くの体外
培養組織、例えば大動脈、軟骨、胎児骨、腱、歯髄、歯
肉、滑膜、子宮など、培養細胞、例えば線維芽、上皮、
内皮、骨芽、軟骨、平滑筋などの細胞、血小板、単球、
マクロファージ、腫瘍細胞などにより産生されているこ
とが認められ、歯髄由来細胞、ヒト胎盤などから得るこ
とができ、例えばＫｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌ
ｌａｇｅｎ Ｒｅｌ． Ｒｅｓ．，７，３４１−３５
０，１９８７及びＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６，３９５〜
４０４，１９８４に記載の方法に従い、ウシの未萌出知
歯の根部歯髄といったウシ歯髄由来細胞の培養液から単
離したり、Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２７，１０３−１０８，１
９９０に記載の方法に従いヒト胎盤などから得ることが
できる。
ヒビターは、ＭＭＰ遺伝子ファミリー由来のＭＭＰｓに
対するインヒビターを含んでいてよく、例えばＴＩＭＰ
−１、ＴＩＭＰ−２といったＭＭＰｓに対するインヒビ
ターであることができる。ＴＩＭＰ−１は、最初ＭＭＰ
−１を阻害することからコラゲナーゼインヒビターと呼
ばれていたが、その後ゼラチナーゼやストロムライシン
も阻害することからＴＩＭＰと呼ばれるようになったも
ので、オタマジャクシからヒトに至る由来の異なるコラ
ゲナーゼを広く阻害する。ＴＩＭＰ−１は、多くの体外
培養組織、例えば大動脈、軟骨、胎児骨、腱、歯髄、歯
肉、滑膜、子宮など、培養細胞、例えば線維芽、上皮、
内皮、骨芽、軟骨、平滑筋などの細胞、血小板、単球、
マクロファージ、腫瘍細胞などにより産生されているこ
とが認められ、歯髄由来細胞、ヒト胎盤などから得るこ
とができ、例えばＫｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌ
ｌａｇｅｎ Ｒｅｌ． Ｒｅｓ．，７，３４１−３５
０，１９８７及びＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６，３９５〜
４０４，１９８４に記載の方法に従い、ウシの未萌出知
歯の根部歯髄といったウシ歯髄由来細胞の培養液から単
離したり、Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２７，１０３−１０８，１
９９０に記載の方法に従いヒト胎盤などから得ることが
できる。
【０００９】ＴＩＭＰ−２は、その含有アミノ酸配列が
ＴＩＭＰ−１とホモロジーを有する部位を持つことが知
られている。ＴＩＭＰ−２は、マウス結腸癌細胞、例え
ばｃｏｌｏｎ２６細胞、ヒト胎盤などから得ることがで
き、例えばＦｕｊｉｍｏｔｏｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９３、
特開平６−３００７５７号公報などに記載の方法に従い
ヒト胎盤などから得ることができる。ＴＩＭＰ−１及び
ＴＩＭＰ−２は、遺伝子組換えの技術で得ることもで
き、例えばＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６８，２６７−２７４，１９９
０、Ｂｏｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２８００−２８０
４，１９９０に記載の方法を参考にして得ることができ
る。これらＴＩＭＰｓは、従来公知の方法、例えば硫酸
アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどに
よるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電
気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマト
グラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などによ
り精製してから用いることができる。基本的にはＭＭＰ
ｓに対するインヒビターであるものを、限定されること
無く利用できるが、好ましくは活性型ＭＭＰｓに特異的
に結合できるものが挙げられる。
ＴＩＭＰ−１とホモロジーを有する部位を持つことが知
られている。ＴＩＭＰ−２は、マウス結腸癌細胞、例え
ばｃｏｌｏｎ２６細胞、ヒト胎盤などから得ることがで
き、例えばＦｕｊｉｍｏｔｏｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９３、
特開平６−３００７５７号公報などに記載の方法に従い
ヒト胎盤などから得ることができる。ＴＩＭＰ−１及び
ＴＩＭＰ−２は、遺伝子組換えの技術で得ることもで
き、例えばＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６８，２６７−２７４，１９９
０、Ｂｏｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２８００−２８０
４，１９９０に記載の方法を参考にして得ることができ
る。これらＴＩＭＰｓは、従来公知の方法、例えば硫酸
アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどに
よるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電
気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマト
グラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などによ
り精製してから用いることができる。基本的にはＭＭＰ
ｓに対するインヒビターであるものを、限定されること
無く利用できるが、好ましくは活性型ＭＭＰｓに特異的
に結合できるものが挙げられる。
【００１０】本発明で使用されるモノクローナル抗体
は、ケラー及びミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，
４９５−４９７，１９７５）などにより開示されたミエ
ローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して得られた
モノクローナル抗体であってもよいことはいうまでもな
い。本発明で使用されるモノクローナル抗体は、次のよ
うな工程で作製できる。 １．免疫原性抗原の調製 ２．免疫原性抗原による動物の免疫 ３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 ４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 ５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクロー
ン化 ６．モノクローナル抗体の製造
は、ケラー及びミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，
４９５−４９７，１９７５）などにより開示されたミエ
ローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して得られた
モノクローナル抗体であってもよいことはいうまでもな
い。本発明で使用されるモノクローナル抗体は、次のよ
うな工程で作製できる。 １．免疫原性抗原の調製 ２．免疫原性抗原による動物の免疫 ３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 ４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 ５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクロー
ン化 ６．モノクローナル抗体の製造
【００１１】１．免疫原性抗原の調製 抗原としては、例えばＫｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｏｌｌａｇｅｎＲｅｌ． Ｒｅｓ．，７，３４１−３５
０，１９８７及びＫｏｄａｍａ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２７，１０３−１０
８，１９９０に記載の方法により調製したＴＩＭＰ−
１、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９３に記載
の方法により調製したＴＩＭＰ−２、特開平５−１９９
８６８号に記載の方法に従い調製したリコンビナントＴ
ＩＭＰ−１（ｒＴＩＭＰ−１）、Ａｏｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ，１９９
４，ｉｎ ｐｒｅｓｓに記載の方法に従い調製したリコ
ンビナントＴＩＭＰ−２（ｒＴＩＭＰ−２）などを用い
ることができる。ここでは、ＭＭＰｓ活性を阻害するＴ
ＩＭＰｓであればどのＴＩＭＰｓでも使用できる。
ｏｌｌａｇｅｎＲｅｌ． Ｒｅｓ．，７，３４１−３５
０，１９８７及びＫｏｄａｍａ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２７，１０３−１０
８，１９９０に記載の方法により調製したＴＩＭＰ−
１、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９３に記載
の方法により調製したＴＩＭＰ−２、特開平５−１９９
８６８号に記載の方法に従い調製したリコンビナントＴ
ＩＭＰ−１（ｒＴＩＭＰ−１）、Ａｏｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ，１９９
４，ｉｎ ｐｒｅｓｓに記載の方法に従い調製したリコ
ンビナントＴＩＭＰ−２（ｒＴＩＭＰ−２）などを用い
ることができる。ここでは、ＭＭＰｓ活性を阻害するＴ
ＩＭＰｓであればどのＴＩＭＰｓでも使用できる。
【００１２】また抗原としては、例えばＺｈａｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１９，
１−１４，１９９３に記載の方法に従い調製したＭＭＰ
−１、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２１，９１−１０３，１９９３に
記載の方法に従い調製したＭＭＰ−２、Ｏｋａｄａｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５４，７３１−７
４１，１９８８に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−
３、Ｋｎａｕｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ．，３７１，２９５−３
０４，１９９０に記載の方法により調製したＭＭＰ−
８、Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６７，２１７１２−２１７１９，１９９２に記
載の方法に従い調製したＭＭＰ−９、Ｐａｒｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１５８４
−１５９０，１９９１に記載の方法に従い調製したリコ
ンビナントＭＭＰ−１０、Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８４９−２５８５
５，１９９４に記載の方法に従い調製したリコンビナン
トＭＭＰ−１１、Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２３８２４−２３８２
９，１９９３に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−１２
及びリコンビナントＭＭＰ−１２、Ｆｒｅｉｊｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１６７
６６−１６７７３，１９９４に記載の方法に従い調製し
たリコンビナントＭＭＰ−１３、特願平６−３３１３０
５号に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−１４などで、
それらの文献やそこで引用する文献に記載の方法に従い
調製したＭＭＰｓ、さらには遺伝子組み換え等によって
得られたＭＭＰｓなどを用いることができる。
ｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１９，
１−１４，１９９３に記載の方法に従い調製したＭＭＰ
−１、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２１，９１−１０３，１９９３に
記載の方法に従い調製したＭＭＰ−２、Ｏｋａｄａｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５４，７３１−７
４１，１９８８に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−
３、Ｋｎａｕｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ．，３７１，２９５−３
０４，１９９０に記載の方法により調製したＭＭＰ−
８、Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６７，２１７１２−２１７１９，１９９２に記
載の方法に従い調製したＭＭＰ−９、Ｐａｒｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１５８４
−１５９０，１９９１に記載の方法に従い調製したリコ
ンビナントＭＭＰ−１０、Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８４９−２５８５
５，１９９４に記載の方法に従い調製したリコンビナン
トＭＭＰ−１１、Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２３８２４−２３８２
９，１９９３に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−１２
及びリコンビナントＭＭＰ−１２、Ｆｒｅｉｊｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１６７
６６−１６７７３，１９９４に記載の方法に従い調製し
たリコンビナントＭＭＰ−１３、特願平６−３３１３０
５号に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−１４などで、
それらの文献やそこで引用する文献に記載の方法に従い
調製したＭＭＰｓ、さらには遺伝子組み換え等によって
得られたＭＭＰｓなどを用いることができる。
【００１３】ここでは、潜在型や活性型のものが好まし
く使用できる。こうした抗原は、各種原料、例えば培養
細胞、培養組織など、形質転換体細胞などの抗原産生材
料から従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法
などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限
外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速
液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ること
ができる。好ましくは、ポリアクリルアミド電気泳動、
モノクローナル抗体などの抗原を特異的に認識する抗体
あるいはインヒビターを固定化したを固定化したアフィ
ニティー・クロマトグラフィーなどで処理し精製分離処
理できる。特に好ましくはゼラチン−アガロース・アフ
ィニティー・クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロー
ス・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
く使用できる。こうした抗原は、各種原料、例えば培養
細胞、培養組織など、形質転換体細胞などの抗原産生材
料から従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法
などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限
外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速
液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ること
ができる。好ましくは、ポリアクリルアミド電気泳動、
モノクローナル抗体などの抗原を特異的に認識する抗体
あるいはインヒビターを固定化したを固定化したアフィ
ニティー・クロマトグラフィーなどで処理し精製分離処
理できる。特に好ましくはゼラチン−アガロース・アフ
ィニティー・クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロー
ス・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１４】こうして得られた抗原は、さらに免疫原性
コンジュゲートなどにしてもよいが、そのまま適当なア
ジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できる。
さらに抗原は、それを断片化したものを適当な縮合剤を
介して種々の担体タンパク質類と結合させてハプテン−
タンパク質の如き免疫原性コンジュゲートとし、これを
用いて特定の配列のみを認識できるモノクローナル抗体
をデザインするのに用いることもできる。例えば、Ｂｏ
ｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２８００−２８０４，１９
９０に記載のヒトＴＩＭＰ−２のｃＤＮＡ配列から予測
されるアミノ酸配列をもつポリペプチドをデザインして
合成して得られたポリペプチドを用いることが挙げられ
る。デザインされるポリペプチドには予めシステイン残
基などを付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易
にできるようにしておくことができる。担体タンパク質
類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず
活性化されることができる。こうした活性化にあたり活
性化結合基を導入することが挙げられる。
コンジュゲートなどにしてもよいが、そのまま適当なア
ジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できる。
さらに抗原は、それを断片化したものを適当な縮合剤を
介して種々の担体タンパク質類と結合させてハプテン−
タンパク質の如き免疫原性コンジュゲートとし、これを
用いて特定の配列のみを認識できるモノクローナル抗体
をデザインするのに用いることもできる。例えば、Ｂｏ
ｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２８００−２８０４，１９
９０に記載のヒトＴＩＭＰ−２のｃＤＮＡ配列から予測
されるアミノ酸配列をもつポリペプチドをデザインして
合成して得られたポリペプチドを用いることが挙げられ
る。デザインされるポリペプチドには予めシステイン残
基などを付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易
にできるようにしておくことができる。担体タンパク質
類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず
活性化されることができる。こうした活性化にあたり活
性化結合基を導入することが挙げられる。
【００１５】活性化結合基としては、（１）活性化エス
テルあるいは活性化カルボキシル基、例えばニトロフェ
ニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、
１−ベンゾトリアゾールエステル基、Ｎ−スクシンイミ
ドエステル基など、（２）活性化ジチオ基、例えば２−
ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タンパク質類
としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ），牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミ
ン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイド、細
菌菌体成分、例えばＢＣＧなどが挙げられる。
テルあるいは活性化カルボキシル基、例えばニトロフェ
ニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、
１−ベンゾトリアゾールエステル基、Ｎ−スクシンイミ
ドエステル基など、（２）活性化ジチオ基、例えば２−
ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タンパク質類
としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ），牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミ
ン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイド、細
菌菌体成分、例えばＢＣＧなどが挙げられる。
【００１６】２．免疫原性抗原による動物の免疫 動物を免疫するには、例えば村松繁、他編、実験生物学
講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日
本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究
法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生
化学実験講座１２、分子免疫学 III、抗原・抗体・補
体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じ
て行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバン
トとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ
（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、
リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ
などが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどの
マウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の
投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動
物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後
１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔
内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０
回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ
／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウス
とのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応
じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫
の程度を確認できる。
講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日
本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究
法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生
化学実験講座１２、分子免疫学 III、抗原・抗体・補
体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じ
て行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバン
トとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ
（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、
リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ
などが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどの
マウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の
投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動
物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後
１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔
内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０
回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ
／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウス
とのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応
じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫
の程度を確認できる。
【００１７】３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）と
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−
１，Eur. J. Immunology, 6, 511〜519, 1976)、ＳＰ２
／０−Ａｇ１４（ＳＰ２，Nature, 276, 269〜270, 197
8 ) 、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来
のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Current to
pics in Microbiol. and Immunol., 81, 1〜7, 1978
）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３，Nature, 256, 49
5〜497, 1975 ) 、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３ (６
５３，J.Immunol., 123, 1548〜1550, 1979) などを用
いることができる。８−アザグアニン耐性のマウスミエ
ローマ細胞株はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培
地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地に、例え
ばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清
（ＦＣＳ）などを加え、さらに８−アザグアニン（例え
ば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、
細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細
胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結
保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６
４０培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で
培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよ
い。
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−
１，Eur. J. Immunology, 6, 511〜519, 1976)、ＳＰ２
／０−Ａｇ１４（ＳＰ２，Nature, 276, 269〜270, 197
8 ) 、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来
のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Current to
pics in Microbiol. and Immunol., 81, 1〜7, 1978
）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３，Nature, 256, 49
5〜497, 1975 ) 、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３ (６
５３，J.Immunol., 123, 1548〜1550, 1979) などを用
いることができる。８−アザグアニン耐性のマウスミエ
ローマ細胞株はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培
地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地に、例え
ばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清
（ＦＣＳ）などを加え、さらに８−アザグアニン（例え
ば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、
細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細
胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結
保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６
４０培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で
培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよ
い。
【００１８】４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細
胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、脾細胞
懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を
得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうし
て得られた脾細胞懸濁液と上記４．の工程に従い得られ
たミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培
地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細
胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリ
コールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当
該分野で知られたものを用いることができ、この様なも
のとしては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ
Ｊａｐａｎ）などが挙げられる。好ましくは、例えば３
０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ
加えることができ、分子量が１，０００〜８，０００の
ポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分
子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコー
ルがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチ
レングリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるよ
うにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチル
スルホキシドなどを少量加え、融合を促進することもで
きる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ
細胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが
挙げられるが、より好ましくは４：１〜７：１とするこ
とができる。融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応処
理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心な
どにより細胞を分離した後選択用培地に移す。
胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、脾細胞
懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を
得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうし
て得られた脾細胞懸濁液と上記４．の工程に従い得られ
たミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培
地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細
胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリ
コールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当
該分野で知られたものを用いることができ、この様なも
のとしては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ
Ｊａｐａｎ）などが挙げられる。好ましくは、例えば３
０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ
加えることができ、分子量が１，０００〜８，０００の
ポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分
子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコー
ルがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチ
レングリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるよ
うにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチル
スルホキシドなどを少量加え、融合を促進することもで
きる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ
細胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが
挙げられるが、より好ましくは４：１〜７：１とするこ
とができる。融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応処
理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心な
どにより細胞を分離した後選択用培地に移す。
【００１９】５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及
びモノクローン化 選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙
げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレ
ートに分注した容量と当容量を翌日加え、その後１〜３
日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというようにす
ることができるが、適宜これに変更を加えて行うことも
できる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリン
を除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をす
ることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺
細胞を使用することもでき、それが好ましい場合があ
る。ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養
上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、
蛍光免疫分析（ＦＩＡ）などの測定系、あるいは蛍光惹
起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）などで、各ＴＩＭＰあるい
は各ヒトＭＭＰ抗原あるいはその断片ペプチドを抗原と
して用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的
抗体を測定するなどして、スクリーニングしたり分離す
る。目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニ
ングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピ
ック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなされ
うる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。ク
ローニングは複数回行うことが好ましい。
びモノクローン化 選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙
げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレ
ートに分注した容量と当容量を翌日加え、その後１〜３
日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというようにす
ることができるが、適宜これに変更を加えて行うことも
できる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリン
を除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をす
ることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺
細胞を使用することもでき、それが好ましい場合があ
る。ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養
上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、
蛍光免疫分析（ＦＩＡ）などの測定系、あるいは蛍光惹
起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）などで、各ＴＩＭＰあるい
は各ヒトＭＭＰ抗原あるいはその断片ペプチドを抗原と
して用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的
抗体を測定するなどして、スクリーニングしたり分離す
る。目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニ
ングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピ
ック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなされ
うる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。ク
ローニングは複数回行うことが好ましい。
【００２０】６．モノクローナル抗体の製造 得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培
養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得
ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリ
ドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエロ
ーマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に
各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、例えばヌー
ド・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖さ
せ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を
回収して得ることが出来る。ハイブリドーマの移植に先
立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、ハイ
ブリドーマを増殖させ、腹水を採取すればよい。腹水液
はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アン
モニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによる
ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳
動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラ
フィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精
製してモノクローナル抗体として用いることができる。
好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫
安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオ
ン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ
ーカラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好まし
くは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗
原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識す
る部位など）を固定化したアフィニティー・クロマトグ
ラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティー・
クロマトグラフィーなどが挙げられる。
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培
養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得
ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリ
ドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエロ
ーマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に
各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、例えばヌー
ド・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖さ
せ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を
回収して得ることが出来る。ハイブリドーマの移植に先
立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、ハイ
ブリドーマを増殖させ、腹水を採取すればよい。腹水液
はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アン
モニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによる
ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳
動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラ
フィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精
製してモノクローナル抗体として用いることができる。
好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫
安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオ
ン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ
ーカラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好まし
くは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗
原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識す
る部位など）を固定化したアフィニティー・クロマトグ
ラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティー・
クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２１】こうして得られたモノクローナル抗体は、
市販のアイソタイプ特異的抗マウスＩｇ抗体、例えばア
イソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体などを用いて
その抗体構成鎖の重鎖及び軽鎖のタイプについて調べる
ことができる。モノクローナル抗体は、また特開平６−
３００７５７号及びＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ
（Ｊ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２１９，１−１４，
１９９３）記載の方法で調製されたもの、例えば該文献
記載のクローン７８−１２Ｇ８（微工研受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３１１５）からのモノクローナル抗体、特開
平６−２１３８８８号及びＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ
ａ（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏｅｔ ａｌ．，２２１，９１
−１０３，１９９３）記載の方法で調製されたもの、例
えば該文献記載のクローン７５−７Ｆ７（微工研受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３５）からのモノクローナル抗
体、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏ
ｔｏ ｅｔ ａｌ．，２３１，７９−８８，１９９４）
記載の方法で調製されたもの、例えば該文献記載のクロ
ーン７３−１８Ｂ３（微工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
３６９５）からのモノクローナル抗体などであることが
できる。この各ＭＭＰに対し特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体は、各ＭＭＰの潜在型及び活性型を認識する
ものが好ましいものとして挙げられる。
市販のアイソタイプ特異的抗マウスＩｇ抗体、例えばア
イソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体などを用いて
その抗体構成鎖の重鎖及び軽鎖のタイプについて調べる
ことができる。モノクローナル抗体は、また特開平６−
３００７５７号及びＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ
（Ｊ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２１９，１−１４，
１９９３）記載の方法で調製されたもの、例えば該文献
記載のクローン７８−１２Ｇ８（微工研受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３１１５）からのモノクローナル抗体、特開
平６−２１３８８８号及びＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ
ａ（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏｅｔ ａｌ．，２２１，９１
−１０３，１９９３）記載の方法で調製されたもの、例
えば該文献記載のクローン７５−７Ｆ７（微工研受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３５）からのモノクローナル抗
体、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏ
ｔｏ ｅｔ ａｌ．，２３１，７９−８８，１９９４）
記載の方法で調製されたもの、例えば該文献記載のクロ
ーン７３−１８Ｂ３（微工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
３６９５）からのモノクローナル抗体などであることが
できる。この各ＭＭＰに対し特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体は、各ＭＭＰの潜在型及び活性型を認識する
ものが好ましいものとして挙げられる。
【００２２】またこうして大量に得られた抗体の配列を
決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコー
ドする塩基配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗
体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をト
リプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理し
て、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）2 といった抗体フラグメントにして使用して
もよい。これらフラグメントは、ＣＭ−又はＤＥＡＥ−
セルロースクロマトグラフィー、ゲルろ過及びアフィニ
ティクロマトグラフィーなどの方法で精製できる。標識
物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、更にはペプシ
ン消化後還元して得られる特異的結合部Ｆａｂ’を用い
ることができる。これらの場合の標識物の例としては、
下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、
化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などがあ
る。
決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコー
ドする塩基配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗
体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をト
リプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理し
て、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）2 といった抗体フラグメントにして使用して
もよい。これらフラグメントは、ＣＭ−又はＤＥＡＥ−
セルロースクロマトグラフィー、ゲルろ過及びアフィニ
ティクロマトグラフィーなどの方法で精製できる。標識
物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、更にはペプシ
ン消化後還元して得られる特異的結合部Ｆａｂ’を用い
ることができる。これらの場合の標識物の例としては、
下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、
化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などがあ
る。
【００２３】本発明では、こうして得られた各ＭＭＰに
対し特異的に結合するモノクローナル抗体とＴＩＭＰｓ
を組合わせて用いて検体試料中の遊離の各活性型ＭＭＰ
を免疫学的に分別して定量する方法が提供される。さら
にこうして得られた各ＭＭＰに対し特異的に結合するモ
ノクローナル抗体とＴＩＭＰｓあるいは各ＴＩＭＰに対
し特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたＴ
ＩＭＰｓとを組合わせて用いて検体試料中の遊離の各活
性型ＭＭＰを免疫学的に分別して定量する方法が提供さ
れる。特に各ＴＩＭＰを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体としては、ＴＩＭＰ−１を特異的に認識するモノ
クローナル抗体、ＴＩＭＰ−２を特異的に認識するモノ
クローナル抗体が挙げられる。特開平５−２４４９８５
号の記載に従い調製し、得られた抗体が挙げられるが、
そのうち特異性が高く且つ親和性の強いマウス抗ＴＩＭ
Ｐ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ１１、微工研受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６９０）あるいはそれと実質的
に同様の特異性を持つものなどが挙げられる。各ＭＭＰ
を特異的に認識するモノクローナル抗体としては、各Ｍ
ＭＰの少なくとも活性型を認識するモノクローナル抗体
が用いられ、各ＭＭＰの中央領域を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体、各ＭＭＰのカルボキシル末端領域を
認識するモノクローナル抗体が挙げられる。各ＴＩＭＰ
と各ＴＩＭＰを特異的に認識し且つ標識化されたモノク
ローナル抗体は、活性型ＭＭＰｓとの反応前に相互に結
合されていてよい。その結合は架橋結合などの比較的安
定で、各ＴＩＭＰの各ＭＭＰに対する反応性に比較的影
響しない方法が挙げられる。より強い結合形態にある場
合には、潜在型ＭＭＰ−２あるいは潜在型ＭＭＰ−９と
の反応において各ＴＩＭＰと各ＴＩＭＰを特異的に認識
し且つ標識化されたモノクローナル抗体との間の解離の
問題などがなくより好ましい。その結合は上記免疫原性
コンジュゲートに適用される方法、下記標識化に用いる
方法、固相化に用いる方法などの中から適宜選択して用
いることができる。好ましくはホルムアルデヒドなどの
アルデヒド類を架橋剤として使用する方法が挙げられる
が、これには限定されない。
対し特異的に結合するモノクローナル抗体とＴＩＭＰｓ
を組合わせて用いて検体試料中の遊離の各活性型ＭＭＰ
を免疫学的に分別して定量する方法が提供される。さら
にこうして得られた各ＭＭＰに対し特異的に結合するモ
ノクローナル抗体とＴＩＭＰｓあるいは各ＴＩＭＰに対
し特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたＴ
ＩＭＰｓとを組合わせて用いて検体試料中の遊離の各活
性型ＭＭＰを免疫学的に分別して定量する方法が提供さ
れる。特に各ＴＩＭＰを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体としては、ＴＩＭＰ−１を特異的に認識するモノ
クローナル抗体、ＴＩＭＰ−２を特異的に認識するモノ
クローナル抗体が挙げられる。特開平５−２４４９８５
号の記載に従い調製し、得られた抗体が挙げられるが、
そのうち特異性が高く且つ親和性の強いマウス抗ＴＩＭ
Ｐ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ１１、微工研受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６９０）あるいはそれと実質的
に同様の特異性を持つものなどが挙げられる。各ＭＭＰ
を特異的に認識するモノクローナル抗体としては、各Ｍ
ＭＰの少なくとも活性型を認識するモノクローナル抗体
が用いられ、各ＭＭＰの中央領域を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体、各ＭＭＰのカルボキシル末端領域を
認識するモノクローナル抗体が挙げられる。各ＴＩＭＰ
と各ＴＩＭＰを特異的に認識し且つ標識化されたモノク
ローナル抗体は、活性型ＭＭＰｓとの反応前に相互に結
合されていてよい。その結合は架橋結合などの比較的安
定で、各ＴＩＭＰの各ＭＭＰに対する反応性に比較的影
響しない方法が挙げられる。より強い結合形態にある場
合には、潜在型ＭＭＰ−２あるいは潜在型ＭＭＰ−９と
の反応において各ＴＩＭＰと各ＴＩＭＰを特異的に認識
し且つ標識化されたモノクローナル抗体との間の解離の
問題などがなくより好ましい。その結合は上記免疫原性
コンジュゲートに適用される方法、下記標識化に用いる
方法、固相化に用いる方法などの中から適宜選択して用
いることができる。好ましくはホルムアルデヒドなどの
アルデヒド類を架橋剤として使用する方法が挙げられる
が、これには限定されない。
【００２４】さらに本発明では、各ＭＭＰに対し特異的
に結合するモノクローナル抗体と、ＴＩＭＰｓに特異的
に結合する抗体とＴＩＭＰｓとの複合体を用いて、検体
試料中の遊離の各活性型ＭＭＰを免疫学的に分別して定
量する方法も提供される。特にＴＩＭＰ−１を特異的に
認識するモノクローナル抗体あるいはＴＩＭＰ−２を特
異的に認識するモノクローナル抗体とＴＩＭＰｓとの複
合体を標識試薬として用い、各ＭＭＰに対し特異的に結
合するモノクローナル抗体を固相化試薬として用いて検
体試料中の遊離の各活性型ＭＭＰを免疫学的に分別して
定量する方法が好ましく提供される。糖が結合している
ＭＭＰｓは、糖鎖などにより分子量にバラツキを生じた
り、研究者により報告される測定分子量も異なる。した
がって本発明では実質的に遊離のＭＭＰの活性型を測定
するものであればとくにその分子量は限定されるもので
ない。ＭＭＰｓは、大きく分けてプロペプチド（ｐｒｏ
ｐｅｐｔｉｄｅ）、触媒活性ドメイン（ｃａｔａｌｙｔ
ｉｃ ｄｏｍａｉｎ）、ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅ
ｇｉｏｎ）及びペキシン様ドメイン（ｐｅｘｉｎ−ｌｉ
ｋｅ ｄｏｍａｉｎ）の４つの領域に分けられ、プロペ
プチド領域をアミノ末端領域、ペキシン様ドメイン領域
をカルボキシ末端領域とされ、その間の触媒活性ドメイ
ン及びヒンジ領域を中央領域とされるのが一般的であ
る。
に結合するモノクローナル抗体と、ＴＩＭＰｓに特異的
に結合する抗体とＴＩＭＰｓとの複合体を用いて、検体
試料中の遊離の各活性型ＭＭＰを免疫学的に分別して定
量する方法も提供される。特にＴＩＭＰ−１を特異的に
認識するモノクローナル抗体あるいはＴＩＭＰ−２を特
異的に認識するモノクローナル抗体とＴＩＭＰｓとの複
合体を標識試薬として用い、各ＭＭＰに対し特異的に結
合するモノクローナル抗体を固相化試薬として用いて検
体試料中の遊離の各活性型ＭＭＰを免疫学的に分別して
定量する方法が好ましく提供される。糖が結合している
ＭＭＰｓは、糖鎖などにより分子量にバラツキを生じた
り、研究者により報告される測定分子量も異なる。した
がって本発明では実質的に遊離のＭＭＰの活性型を測定
するものであればとくにその分子量は限定されるもので
ない。ＭＭＰｓは、大きく分けてプロペプチド（ｐｒｏ
ｐｅｐｔｉｄｅ）、触媒活性ドメイン（ｃａｔａｌｙｔ
ｉｃ ｄｏｍａｉｎ）、ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅ
ｇｉｏｎ）及びペキシン様ドメイン（ｐｅｘｉｎ−ｌｉ
ｋｅ ｄｏｍａｉｎ）の４つの領域に分けられ、プロペ
プチド領域をアミノ末端領域、ペキシン様ドメイン領域
をカルボキシ末端領域とされ、その間の触媒活性ドメイ
ン及びヒンジ領域を中央領域とされるのが一般的であ
る。
【００２５】本発明の測定は、イムノアッセイ、例えば
競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで
行うことができ、ラジオイムノメトリックアッセイ、Ｅ
ＬＩＳＡなどを用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行って
もあるいは行わないでその測定を行うことができる。各
ＴＩＭＰは直接検出可能に標識化されてもよいし、アッ
セイ反応前に各ＴＩＭＰに対し特異的に結合する検出可
能に標識化されたモノクローナル抗体でもって間接的に
検出可能に標識化されていてよい。一方各ＭＭＰに対す
る抗体を固相に固定化する。別の態様ではＴＩＭＰｓを
固相に固定化することもでき、この場合各ＭＭＰに対す
る抗体は検出可能に標識化されていてもよい。検体と標
識化ＴＩＭＰｓ及び固相化抗体を必要に応じ順次反応さ
せるためインキュベーション処理し、ここで非結合ＴＩ
ＭＰｓを分離後、標識物を測定する。測定された標識の
量は抗原、すなわち各活性型ＭＭＰの量と比例する。洗
浄、撹拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特
定の状況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用され
る。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキ
ュベーション処理時間などのその他の測定条件は、検体
中の抗原の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変える
ことができる。当業者は通常の実験法を用いながら各測
定に対して有効な最適の条件を適宜選定して測定を行う
ことが出来る。
競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで
行うことができ、ラジオイムノメトリックアッセイ、Ｅ
ＬＩＳＡなどを用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行って
もあるいは行わないでその測定を行うことができる。各
ＴＩＭＰは直接検出可能に標識化されてもよいし、アッ
セイ反応前に各ＴＩＭＰに対し特異的に結合する検出可
能に標識化されたモノクローナル抗体でもって間接的に
検出可能に標識化されていてよい。一方各ＭＭＰに対す
る抗体を固相に固定化する。別の態様ではＴＩＭＰｓを
固相に固定化することもでき、この場合各ＭＭＰに対す
る抗体は検出可能に標識化されていてもよい。検体と標
識化ＴＩＭＰｓ及び固相化抗体を必要に応じ順次反応さ
せるためインキュベーション処理し、ここで非結合ＴＩ
ＭＰｓを分離後、標識物を測定する。測定された標識の
量は抗原、すなわち各活性型ＭＭＰの量と比例する。洗
浄、撹拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特
定の状況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用され
る。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキ
ュベーション処理時間などのその他の測定条件は、検体
中の抗原の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変える
ことができる。当業者は通常の実験法を用いながら各測
定に対して有効な最適の条件を適宜選定して測定を行う
ことが出来る。
【００２６】固相化するための担体としては、抗原ある
いは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、本
発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。担
体としては、抗原抗体反応などに使用されるものが種々
知られており、本発明においても勿論これらの公知のも
のの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるも
のとしては、例えばガラス、例えば活性化ガラス、多孔
質ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナ、
磁化鉄、磁化合金などの無機材料、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、
ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリレート、ポリスチレン、
スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリルアミド、
架橋ポリアクリルアミド、スチレン−メタクリレート共
重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン
−エチレングリコールジメタクリレート共重合体など、
架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラ
ン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶
セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロース
アセテートなどの天然または変成セルロース、架橋デキ
ストラン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、
ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質、さらにそれら
を乳化重合して得られたもの、細胞、赤血球などで、必
要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入
してあるものが挙げられる。さらに、ろ紙、ビーズ、試
験容器の内壁、例えば試験管、タイタープレート、タイ
ターウェル、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材
料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端
を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突
起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状に
した棒などの固体物質（物体）の表面などが挙げられ
る。これら担体へは、抗体を結合させることができ、好
ましくはＭＭＰに対し特異的に結合する各モノクローナ
ル抗体を結合させることができる。担体とこれら抗原抗
体反応に関与するものとの結合は、吸着などの物理的な
手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたも
のなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化
学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出
来る。
いは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、本
発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。担
体としては、抗原抗体反応などに使用されるものが種々
知られており、本発明においても勿論これらの公知のも
のの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるも
のとしては、例えばガラス、例えば活性化ガラス、多孔
質ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナ、
磁化鉄、磁化合金などの無機材料、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、
ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリレート、ポリスチレン、
スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリルアミド、
架橋ポリアクリルアミド、スチレン−メタクリレート共
重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン
−エチレングリコールジメタクリレート共重合体など、
架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラ
ン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶
セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロース
アセテートなどの天然または変成セルロース、架橋デキ
ストラン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、
ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質、さらにそれら
を乳化重合して得られたもの、細胞、赤血球などで、必
要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入
してあるものが挙げられる。さらに、ろ紙、ビーズ、試
験容器の内壁、例えば試験管、タイタープレート、タイ
ターウェル、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材
料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端
を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突
起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状に
した棒などの固体物質（物体）の表面などが挙げられ
る。これら担体へは、抗体を結合させることができ、好
ましくはＭＭＰに対し特異的に結合する各モノクローナ
ル抗体を結合させることができる。担体とこれら抗原抗
体反応に関与するものとの結合は、吸着などの物理的な
手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたも
のなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化
学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出
来る。
【００２７】標識としては、酵素、酵素基質、酵素イン
ヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵
素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、
発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コ
ロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵
素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸
化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル
基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転
移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテ
ル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵
素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げるこ
とができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に
利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利
用することもできる。
ヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵
素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、
発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コ
ロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵
素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸
化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル
基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転
移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテ
ル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵
素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げるこ
とができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に
利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利
用することもできる。
【００２８】代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ
−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラー
ゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリ
ホスファターゼなどのアルカリ・フォスファターゼなど
が挙げられる。アルカリホスファターゼを用いた場合、
４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウン
ベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなど
のリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素
的サイクリング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン
誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光
などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ
系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた
場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その
酸素を電極などで検知することもできる。電極としては
ガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電
極、高分子膜電極などであることもできる。酵素標識
は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトア
ビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数
の異なった種類の標識を使用することもできる。こうし
た場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、
そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすること
もできる。
ルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ
−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラー
ゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリ
ホスファターゼなどのアルカリ・フォスファターゼなど
が挙げられる。アルカリホスファターゼを用いた場合、
４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウン
ベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなど
のリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素
的サイクリング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン
誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光
などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ
系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた
場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その
酸素を電極などで検知することもできる。電極としては
ガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電
極、高分子膜電極などであることもできる。酵素標識
は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトア
ビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数
の異なった種類の標識を使用することもできる。こうし
た場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、
そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすること
もできる。
【００２９】本発明においては、信号の形成に４−ヒド
ロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テ
トラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダ
ーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニル
ガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の
組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾ
キノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合
物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェ
ノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働き
で形成しうるものが使用できる。
ロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テ
トラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダ
ーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニル
ガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の
組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾ
キノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合
物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェ
ノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働き
で形成しうるものが使用できる。
【００３０】蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合
物としては、フルオレセインイソチオシアネート、例え
ばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネートなどのローダミン誘導体、ダ
ンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスサミ
ン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフ
ェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノー
ル、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート
化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。標識するに
は、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスル
フィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基
の反応などを利用して行うことができ、公知の方法ある
いは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらには
それらを修飾した方法の中から適宜選択して適用でき
る。例えば、ＮａＩＯ4 を用いた架橋法（例えば、１−
フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどでアミノ基を
保護した後、メタＮａＩＯ4 で酸化し、次に抗体などの
タンパク質を反応させた後ＮａＢＨ4 により還元する方
法よりなっている）なども挙げられる。また上記免疫原
性複合体作製に使用されることのできる縮合剤、担体と
の結合に使用されることのできる縮合剤などを用いるこ
とができる。
物としては、フルオレセインイソチオシアネート、例え
ばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネートなどのローダミン誘導体、ダ
ンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスサミ
ン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフ
ェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノー
ル、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート
化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。標識するに
は、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスル
フィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基
の反応などを利用して行うことができ、公知の方法ある
いは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらには
それらを修飾した方法の中から適宜選択して適用でき
る。例えば、ＮａＩＯ4 を用いた架橋法（例えば、１−
フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどでアミノ基を
保護した後、メタＮａＩＯ4 で酸化し、次に抗体などの
タンパク質を反応させた後ＮａＢＨ4 により還元する方
法よりなっている）なども挙げられる。また上記免疫原
性複合体作製に使用されることのできる縮合剤、担体と
の結合に使用されることのできる縮合剤などを用いるこ
とができる。
【００３１】縮合剤としては、例えばグルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレン
ジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨ
ードアセトアミド、ｐ−ベンゾキノン、Ｎ，Ｎ’−ｏ−
フェニレンジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレ
イミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシ
ネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシン
イミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート、Ｎ−スクシンイミジル （４−ヨードアセチ
ル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−
（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マ
レイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣ
Ｓ）、イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク
酸無水物（ＡＭＳＡ）、メチル−３−（４’−ジチオピ
リジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプ
トブチリルイミデート（ＭＭＢＩ）、メチル−３−メル
カプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−
Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
ド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレン
ジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨ
ードアセトアミド、ｐ−ベンゾキノン、Ｎ，Ｎ’−ｏ−
フェニレンジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレ
イミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシ
ネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシン
イミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート、Ｎ−スクシンイミジル （４−ヨードアセチ
ル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−
（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マ
レイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣ
Ｓ）、イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク
酸無水物（ＡＭＳＡ）、メチル−３−（４’−ジチオピ
リジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプ
トブチリルイミデート（ＭＭＢＩ）、メチル−３−メル
カプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−
Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
【００３２】本発明の測定法によれば、測定すべき物質
を担体に結合されたＴＩＭＰあるいは抗体と、酵素など
で標識した抗体試薬あるいは酵素などで標識したＴＩＭ
Ｐ試薬に順次反応させることができるし、それらを同時
に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれ
た担体系の型により異なる。感作されたプラスチックな
どのビーズを用いた場合には、該感作されたプラスチッ
クなどのビーズを測定すべき物質を含む検体試料と共に
最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後酵素などで標
識したモノクローナル抗体試薬あるいはＴＩＭＰ試薬を
加えることにより測定を行うことができる。本発明の定
量法においては、免疫学的測定法が用いられるが、その
際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着
するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピ
レン製あるいはポリビニル製のボール、マイクロプレー
ト、スティック、微粒子あるいは試験管などの種々の材
料および形態を任意に選択し、使用することができる。
測定にあたっては至適ｐＨ、例えばｐＨ約４〜９に保つ
ように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切
な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸
塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリ
エタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩
衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝剤などが挙げら
れる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いること
ができる。抗体抗原反応は約０℃〜６０℃の間の温度で
行うことが好ましい。
を担体に結合されたＴＩＭＰあるいは抗体と、酵素など
で標識した抗体試薬あるいは酵素などで標識したＴＩＭ
Ｐ試薬に順次反応させることができるし、それらを同時
に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれ
た担体系の型により異なる。感作されたプラスチックな
どのビーズを用いた場合には、該感作されたプラスチッ
クなどのビーズを測定すべき物質を含む検体試料と共に
最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後酵素などで標
識したモノクローナル抗体試薬あるいはＴＩＭＰ試薬を
加えることにより測定を行うことができる。本発明の定
量法においては、免疫学的測定法が用いられるが、その
際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着
するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピ
レン製あるいはポリビニル製のボール、マイクロプレー
ト、スティック、微粒子あるいは試験管などの種々の材
料および形態を任意に選択し、使用することができる。
測定にあたっては至適ｐＨ、例えばｐＨ約４〜９に保つ
ように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切
な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸
塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリ
エタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩
衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝剤などが挙げら
れる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いること
ができる。抗体抗原反応は約０℃〜６０℃の間の温度で
行うことが好ましい。
【００３３】酵素などで標識した抗体試薬、酵素などで
標識したＴＩＭＰ試薬、担体に結合せしめられた抗体試
薬及び担体に結合せしめられたＴＩＭＰ試薬、さらには
測定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達
するまで行うことができるが、抗体抗原反応の平衡が達
成されるよりもずっと早い時点で固相と液相とを分離し
て限定されたインキュベーション処理の後に反応を止め
ることができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素な
どの標識の存在の程度を測ることができる。測定操作
は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であ
り、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクター
などを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表
示シグナルを検知して測定することもできる。
標識したＴＩＭＰ試薬、担体に結合せしめられた抗体試
薬及び担体に結合せしめられたＴＩＭＰ試薬、さらには
測定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達
するまで行うことができるが、抗体抗原反応の平衡が達
成されるよりもずっと早い時点で固相と液相とを分離し
て限定されたインキュベーション処理の後に反応を止め
ることができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素な
どの標識の存在の程度を測ることができる。測定操作
は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であ
り、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクター
などを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表
示シグナルを検知して測定することもできる。
【００３４】抗体抗原反応及び活性型ＭＭＰｓとＴＩＭ
Ｐｓとの反応においては、それぞれ用いられる試薬、測
定すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化した
り、抗体抗原反応及び活性型ＭＭＰｓとＴＩＭＰｓとの
反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることが
できる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働
く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したり
するため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤、キレ
ート化剤などをインキュベーション溶液中に加えること
もできる。当該分野で普通に採用されていたりあるいは
当業者に知られた非特異的結合反応を防ぐためのブロッ
キング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正
常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク、乳発酵
物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができ
る。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの
方法は特に限定されず用いることが出来る。本発明の測
定方法で測定される試料としては、あらゆる形態の溶液
やコロイド溶液などが使用しうるが、好ましくは生物由
来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、関節液、脳脊
髄液、唾液、羊水、尿、その他の体液、細胞培養液、組
織培養液、組織ホモジュネートなどが挙げられる。特に
好ましくは血漿、血清、関節液、唾液、細胞培養液、組
織培養液、組織ホモジュネートなどが挙げられる。本発
明に従えば、ＭＭＰｓ活性が亢進する病態、例えば関節
症、癌、転移性癌、歯周病などの患者あるいは動物体液
中の遊離の活性型ＭＭＰｓを本発明に係る定量法を用い
て定量することにより、上記疾患群の診断あるいはモニ
ターに応用することができる。
Ｐｓとの反応においては、それぞれ用いられる試薬、測
定すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化した
り、抗体抗原反応及び活性型ＭＭＰｓとＴＩＭＰｓとの
反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることが
できる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働
く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したり
するため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤、キレ
ート化剤などをインキュベーション溶液中に加えること
もできる。当該分野で普通に採用されていたりあるいは
当業者に知られた非特異的結合反応を防ぐためのブロッ
キング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正
常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク、乳発酵
物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができ
る。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの
方法は特に限定されず用いることが出来る。本発明の測
定方法で測定される試料としては、あらゆる形態の溶液
やコロイド溶液などが使用しうるが、好ましくは生物由
来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、関節液、脳脊
髄液、唾液、羊水、尿、その他の体液、細胞培養液、組
織培養液、組織ホモジュネートなどが挙げられる。特に
好ましくは血漿、血清、関節液、唾液、細胞培養液、組
織培養液、組織ホモジュネートなどが挙げられる。本発
明に従えば、ＭＭＰｓ活性が亢進する病態、例えば関節
症、癌、転移性癌、歯周病などの患者あるいは動物体液
中の遊離の活性型ＭＭＰｓを本発明に係る定量法を用い
て定量することにより、上記疾患群の診断あるいはモニ
ターに応用することができる。
【００３５】
【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明
するが、本発明は実施例に限定されること無く様々な態
様が含まれることは理解されるべきである。 実施例１ ＴＩＭＰｓの調製 ＴＩＭＰ−１は、ウシ未萌出知歯の根部歯髄を最小必須
Ｅａｇｌｅ培地（日水製薬）中で培養し、ウシ歯髄由来
細胞の培養液からカラムクロマトグラフィーにかけ精製
した。例えばＫｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌａ
ｇｅｎ Ｒｅｌ． Ｒｅｓ．，７，３４１−３５０，１
９８７の方法に従い、各種材料から調製した。またＴＩ
ＭＰ−２はＦｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９
３及び特開平６−３００７５７号公報）の方法に従い、
各種材料から調製した。例えば胎盤を細切後緩衝液中で
撹拌し、得られた上清を抗ＴＩＭＰ−２モノクローナル
抗体（例えば特開平５−２４４９８５号公報に開示のク
ローンＮｏ．６７−４Ｈ１１など）結合セファロース
４Ｂカラムのクロマトグラフィーにかけて処理し、必要
に応じ限外ろ過、ゲルろ過、例えばＵｌｔｒｏｇｅｌ
ＡｃＡ５４（ＬＫＢ）などで処理し、精製ヒトＴＩＭＰ
−２を調製した。
するが、本発明は実施例に限定されること無く様々な態
様が含まれることは理解されるべきである。 実施例１ ＴＩＭＰｓの調製 ＴＩＭＰ−１は、ウシ未萌出知歯の根部歯髄を最小必須
Ｅａｇｌｅ培地（日水製薬）中で培養し、ウシ歯髄由来
細胞の培養液からカラムクロマトグラフィーにかけ精製
した。例えばＫｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌａ
ｇｅｎ Ｒｅｌ． Ｒｅｓ．，７，３４１−３５０，１
９８７の方法に従い、各種材料から調製した。またＴＩ
ＭＰ−２はＦｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９
３及び特開平６−３００７５７号公報）の方法に従い、
各種材料から調製した。例えば胎盤を細切後緩衝液中で
撹拌し、得られた上清を抗ＴＩＭＰ−２モノクローナル
抗体（例えば特開平５−２４４９８５号公報に開示のク
ローンＮｏ．６７−４Ｈ１１など）結合セファロース
４Ｂカラムのクロマトグラフィーにかけて処理し、必要
に応じ限外ろ過、ゲルろ過、例えばＵｌｔｒｏｇｅｌ
ＡｃＡ５４（ＬＫＢ）などで処理し、精製ヒトＴＩＭＰ
−２を調製した。
【００３６】リコンビナントＴＩＭＰ−１（ｒＴＩＭＰ
−１）はヒト正常歯肉線維芽細胞（ヒトＧｉｎ−１細
胞）などから得られた全ＲＮＡ画分よりオリゴ（ｄＴ）
−セルロースカラムを用いて、ポリＡ+ ｍＲＮＡ画分を
分離し、これを鋳型にしてｃＤＮＡを逆転写酵素を用い
て調製し、Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３１８，６６−６９，１９８５などで知られたＴ
ＩＭＰ−１ｃＤＮＡの配列を参考にＰＣＲプライマーを
作成し、このＰＣＲプライマー（プライマーＴＩＦ１：
５’−ＡＴＧＧＣＣＣＣＣＴＴＴＧＡＧＣＣＣＣＴＧ−
３’及びプライマーＴＩＲ１：５’−ＣＡＧＧＡＴＴＣ
ＡＧＧＣＴＡＴＣＴＧ−３’）を用いてＰＣＲ法により
ＴＩＭＰ遺伝子を増幅し、得られたＤＮＡ断片をプラス
ミドＰＥＸ，ｐＭＥＭｎｅｏなどのベクターに組込み、
大腸菌、ＣＨＯ細胞などで発現させて得ることができ
る。ｒＴＩＭＰ−１は、特開平５−１９９８６８号記載
の方法に従い得られた。調製されたｒＴＩＭＰ−１は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％均一ゲル、還元条件）で約３
０ｋＤａの単一のバンドとして認められ、ウエスタンブ
ロッティング（ペルオキシダーゼ標識マウス抗ＴＩＭＰ
−１モノクローナル抗体で染色）においても約３０ｋＤ
ａの単一のバンドとして認められたものであった。ｒＴ
ＩＭＰ−１のヒト線維芽細胞（ＣＣＤ−４１ＳＫ細胞）
由来ＭＭＰ−１に対する阻害活性は、ＩＣ50が約１×１
０-9Ｍであった。
−１）はヒト正常歯肉線維芽細胞（ヒトＧｉｎ−１細
胞）などから得られた全ＲＮＡ画分よりオリゴ（ｄＴ）
−セルロースカラムを用いて、ポリＡ+ ｍＲＮＡ画分を
分離し、これを鋳型にしてｃＤＮＡを逆転写酵素を用い
て調製し、Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３１８，６６−６９，１９８５などで知られたＴ
ＩＭＰ−１ｃＤＮＡの配列を参考にＰＣＲプライマーを
作成し、このＰＣＲプライマー（プライマーＴＩＦ１：
５’−ＡＴＧＧＣＣＣＣＣＴＴＴＧＡＧＣＣＣＣＴＧ−
３’及びプライマーＴＩＲ１：５’−ＣＡＧＧＡＴＴＣ
ＡＧＧＣＴＡＴＣＴＧ−３’）を用いてＰＣＲ法により
ＴＩＭＰ遺伝子を増幅し、得られたＤＮＡ断片をプラス
ミドＰＥＸ，ｐＭＥＭｎｅｏなどのベクターに組込み、
大腸菌、ＣＨＯ細胞などで発現させて得ることができ
る。ｒＴＩＭＰ−１は、特開平５−１９９８６８号記載
の方法に従い得られた。調製されたｒＴＩＭＰ−１は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％均一ゲル、還元条件）で約３
０ｋＤａの単一のバンドとして認められ、ウエスタンブ
ロッティング（ペルオキシダーゼ標識マウス抗ＴＩＭＰ
−１モノクローナル抗体で染色）においても約３０ｋＤ
ａの単一のバンドとして認められたものであった。ｒＴ
ＩＭＰ−１のヒト線維芽細胞（ＣＣＤ−４１ＳＫ細胞）
由来ＭＭＰ−１に対する阻害活性は、ＩＣ50が約１×１
０-9Ｍであった。
【００３７】またリコンビナントＴＩＭＰ−２（ｒＴＩ
ＭＰ−２）は、ヒトＧｉｎ−１細胞などから得られた全
ＲＮＡ画分よりオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムを用
いてポリＡ+ ｍＲＮＡ画分を分離し、これを鋳型、オリ
ゴｄＴ（１５〜１８個）をプライマーにしてｃＤＮＡを
逆転写酵素を用いて調製し、Ｂｏｏｎｅ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８７，２８００−２８０４，１９９０などで知られ
たＴＩＭＰ−２ｃＤＮＡの配列を参考に作成したプライ
マーＴ２Ｆ７；ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣ
ＣＧＣＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＣＴ及びプライマーＴ２Ｒ
５；ＴＴＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＧＡＴ
ＣＣＴＣＧＡＴＡＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣを用
いてＰＣＲ法によりＴＩＭＰ−２遺伝子を増幅し、得ら
れたＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＧなどのベクターに組
込み、ＣＨＯ細胞などで発現させて得ることができる。
ｒＴＩＭＰ−２は、Ａｏｋｉら（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ
Ｔｉｓｓｕｅ，１９９４，ｉｎ ｐｒｅｓｓ）の方法
に従い調製した。抗ＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体結
合セファロース ４Ｂカラムのクロマトグラフィーにか
けて処理し、必要に応じ限外ろ過、ゲルろ過などで処理
し、精製ｒＴＩＭＰ−２を調製した。調製されたｒＴＩ
ＭＰ−２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％均一ゲル、還元
条件）で約２４ｋＤａの単一のバンドとして認められ、
胎盤から調製された天然型ＴＩＭＰ−２と同じ分子量の
位置に認められた。エピトープの異なる抗ヒトＴＩＭＰ
−２モノクローナル抗体（特開平５−２４４９８５号公
報）によるウエスタンブロッティングを行った結果、約
２４ｋＤａの位置に単一のバンドとして認められたもの
であった。ＣＣＤ−４１ＳＫ細胞由来ＭＭＰ−１に対す
る阻害活性は、ＩＣ50が約１．１×１０-9Ｍであった。
またＮ末端及びＣ末端構造解析の結果、得られたｒＴＩ
ＭＰ−２は、天然型ＴＩＭＰ−２と同一の物質であるこ
とが示唆された。ここでは、ＭＭＰｓ活性を阻害するＴ
ＩＭＰｓであればどのようなＴＩＭＰｓでも使用できる
が、人為的に作成したｒＴＩＭＰｓを使用した。
ＭＰ−２）は、ヒトＧｉｎ−１細胞などから得られた全
ＲＮＡ画分よりオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムを用
いてポリＡ+ ｍＲＮＡ画分を分離し、これを鋳型、オリ
ゴｄＴ（１５〜１８個）をプライマーにしてｃＤＮＡを
逆転写酵素を用いて調製し、Ｂｏｏｎｅ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８７，２８００−２８０４，１９９０などで知られ
たＴＩＭＰ−２ｃＤＮＡの配列を参考に作成したプライ
マーＴ２Ｆ７；ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣ
ＣＧＣＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＣＴ及びプライマーＴ２Ｒ
５；ＴＴＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＧＡＴ
ＣＣＴＣＧＡＴＡＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣを用
いてＰＣＲ法によりＴＩＭＰ−２遺伝子を増幅し、得ら
れたＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＧなどのベクターに組
込み、ＣＨＯ細胞などで発現させて得ることができる。
ｒＴＩＭＰ−２は、Ａｏｋｉら（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ
Ｔｉｓｓｕｅ，１９９４，ｉｎ ｐｒｅｓｓ）の方法
に従い調製した。抗ＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体結
合セファロース ４Ｂカラムのクロマトグラフィーにか
けて処理し、必要に応じ限外ろ過、ゲルろ過などで処理
し、精製ｒＴＩＭＰ−２を調製した。調製されたｒＴＩ
ＭＰ−２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％均一ゲル、還元
条件）で約２４ｋＤａの単一のバンドとして認められ、
胎盤から調製された天然型ＴＩＭＰ−２と同じ分子量の
位置に認められた。エピトープの異なる抗ヒトＴＩＭＰ
−２モノクローナル抗体（特開平５−２４４９８５号公
報）によるウエスタンブロッティングを行った結果、約
２４ｋＤａの位置に単一のバンドとして認められたもの
であった。ＣＣＤ−４１ＳＫ細胞由来ＭＭＰ−１に対す
る阻害活性は、ＩＣ50が約１．１×１０-9Ｍであった。
またＮ末端及びＣ末端構造解析の結果、得られたｒＴＩ
ＭＰ−２は、天然型ＴＩＭＰ−２と同一の物質であるこ
とが示唆された。ここでは、ＭＭＰｓ活性を阻害するＴ
ＩＭＰｓであればどのようなＴＩＭＰｓでも使用できる
が、人為的に作成したｒＴＩＭＰｓを使用した。
【００３８】実施例２ 標識ＴＩＭＰｓの調製 通常、タンパク質の標識物として低分子の放射性同位元
素、化学物質あるいは蛍光物質がタンパク質自身が持っ
ている活性を損なうことを避けるために用いられるが、
ここでは一般的には、ＴＩＭＰに対してはそのタンパク
質自身の活性を損なう恐れが高い高分子の酵素で標識す
る方法を示す。 （ａ）ｒＴＩＭＰｓ−あるいはＩｇＧ−ペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）複合体の調製 １）ＳＨ基標識ｒＴＩＭＰあるいはＳＨ基標識ＩｇＧの
調製 ｒＴＩＭＰ−１、ｒＴＩＭＰ−２あるいはＩｇＧを０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し透析し、その溶
液１ｍｌに含有されている各々のｒＴＩＭＰに対して１
００倍モルのＡＭＳＡをジメチルホルムアミド溶液とし
て加え、３０℃、３０分間インキュベーションした。次
に０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μ
ｌ、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ，ｐ
Ｈ６．０）１０μｌ、１Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐ
Ｈ７．０）１００μｌを加え、３０℃、５分間静置後、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−２５でゲルろ過し、ＳＨ基標識ｒＴＩＭ
Ｐ−１、ＳＨ標識ｒＴＩＭＰ−２あるいはＳＨ基標識Ｉ
ｇＧをそれぞれ得た。
素、化学物質あるいは蛍光物質がタンパク質自身が持っ
ている活性を損なうことを避けるために用いられるが、
ここでは一般的には、ＴＩＭＰに対してはそのタンパク
質自身の活性を損なう恐れが高い高分子の酵素で標識す
る方法を示す。 （ａ）ｒＴＩＭＰｓ−あるいはＩｇＧ−ペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）複合体の調製 １）ＳＨ基標識ｒＴＩＭＰあるいはＳＨ基標識ＩｇＧの
調製 ｒＴＩＭＰ−１、ｒＴＩＭＰ−２あるいはＩｇＧを０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し透析し、その溶
液１ｍｌに含有されている各々のｒＴＩＭＰに対して１
００倍モルのＡＭＳＡをジメチルホルムアミド溶液とし
て加え、３０℃、３０分間インキュベーションした。次
に０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μ
ｌ、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ，ｐ
Ｈ６．０）１０μｌ、１Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐ
Ｈ７．０）１００μｌを加え、３０℃、５分間静置後、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−２５でゲルろ過し、ＳＨ基標識ｒＴＩＭ
Ｐ−１、ＳＨ標識ｒＴＩＭＰ−２あるいはＳＨ基標識Ｉ
ｇＧをそれぞれ得た。
【００３９】２）マレイミド標識ＨＲＰの調製 ＨＲＰを１２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、そのＨＲＰ量に対
して２５倍量のＥＭＣＳをジメチルホルムアミド溶液と
して加え、３０℃、３０分間反応させた。この反応液を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−２５でゲルろ過し、マレイミド標識ＨＲ
Ｐ画分を分取した。
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、そのＨＲＰ量に対
して２５倍量のＥＭＣＳをジメチルホルムアミド溶液と
して加え、３０℃、３０分間反応させた。この反応液を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−２５でゲルろ過し、マレイミド標識ＨＲ
Ｐ画分を分取した。
【００４０】３）ｒＴＩＭＰ−ＨＲＰあるいはＩｇＧ−
ＨＲＰ複合体の調製 上記１）で調製したＳＨ基標識ｒＴＩＭＰ−１、ＳＨ基
標識ｒＴＩＭＰ−２あるいはＳＨ基標識ＩｇＧ １モル
に上記２）で得られたマレイミド標識ＨＲＰを各々３モ
ル、３モルあるいは５モル加え、４℃、２４時間静置し
た。これらの混合液を０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）もしくは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４カラ
ムでゲルろ過し、ｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ、ｒＴＩＭＰ
−２−ＨＲＰあるいはＩｇＧ−ＨＲＰ複合体画分をそれ
ぞれ分取した。得られた標識ｒＴＩＭＰ−１及び標識ｒ
ＴＩＭＰ−２についてＨＲＰの標識の程度をＨＲＰ活性
を指標に比色法で調べた。反応させる上記２）で得られ
たマレイミド標識ＨＲＰの量を増加させることにより、
結合ＨＲＰの量は増加することが確かめられたが、ｒＴ
ＩＭＰ−１あるいはｒＴＩＭＰ−２ １モル当りＨＲＰ
が各々１．８あるいは１．６結合したものが、以下の測
定に用いる試薬としてより好ましいと判断した。
ＨＲＰ複合体の調製 上記１）で調製したＳＨ基標識ｒＴＩＭＰ−１、ＳＨ基
標識ｒＴＩＭＰ−２あるいはＳＨ基標識ＩｇＧ １モル
に上記２）で得られたマレイミド標識ＨＲＰを各々３モ
ル、３モルあるいは５モル加え、４℃、２４時間静置し
た。これらの混合液を０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）もしくは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４カラ
ムでゲルろ過し、ｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ、ｒＴＩＭＰ
−２−ＨＲＰあるいはＩｇＧ−ＨＲＰ複合体画分をそれ
ぞれ分取した。得られた標識ｒＴＩＭＰ−１及び標識ｒ
ＴＩＭＰ−２についてＨＲＰの標識の程度をＨＲＰ活性
を指標に比色法で調べた。反応させる上記２）で得られ
たマレイミド標識ＨＲＰの量を増加させることにより、
結合ＨＲＰの量は増加することが確かめられたが、ｒＴ
ＩＭＰ−１あるいはｒＴＩＭＰ−２ １モル当りＨＲＰ
が各々１．８あるいは１．６結合したものが、以下の測
定に用いる試薬としてより好ましいと判断した。
【００４１】（ｂ）ｒＴＩＭＰ−ＩｇＧ−ＨＲＰの調製 ｒＴＩＭＰをＨＲＰで標識する際、ｒＴＩＭＰに特異的
に結合する物質を介してｒＴＩＭＰを間接的にＨＲＰで
標識することができる。ｒＴＩＭＰに特異的に結合する
物質としては、ここではＴＩＭＰに特異的に結合するモ
ノクローナル抗体を使用した。ヒトＴＩＭＰ−２ポリペ
プチドあるいは天然型ＴＩＭＰ−２を免疫原として調製
されたモノクローナル抗体を使用できる。Ｂｏｏｎｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８７，２８００−２８０４，１９９０に記
載のｃＤＮＡから予測されるアミノ酸配列から三種のポ
リペプチド、例えばＰ−１；ＤＳＧＮＤＩＹＧＮＰＩＫ
ＲＩＱＣ、Ｐ−２；ＤＴＬＳＴＴＱＫＫＳＬＮＨＲＹＱ
ＱＣ及びＰ−３；ＹＲＧＡＡＰＰＫＱＥＦＬＤＩＥＤＣ
を合成し、これらを免疫原としてマウスを免疫し、免疫
マウスからの脾細胞を用い細胞融合法で作成されたハイ
ブリドーマクローンから得られるモノクローナル抗体を
用い、マレイミド標識ＨＲＰを反応させて抗ＴＩＭＰ−
２モノクローナル抗体−ＨＲＰを得ることができる。こ
うした抗体としては潜在型ＭＭＰ−２がＴＩＭＰ−２に
結合することを阻害することのできる抗体が好ましく使
用される。ＴＩＭＰ−２のカルボキシル末端領域を認識
する抗体が使用できる。
に結合する物質を介してｒＴＩＭＰを間接的にＨＲＰで
標識することができる。ｒＴＩＭＰに特異的に結合する
物質としては、ここではＴＩＭＰに特異的に結合するモ
ノクローナル抗体を使用した。ヒトＴＩＭＰ−２ポリペ
プチドあるいは天然型ＴＩＭＰ−２を免疫原として調製
されたモノクローナル抗体を使用できる。Ｂｏｏｎｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８７，２８００−２８０４，１９９０に記
載のｃＤＮＡから予測されるアミノ酸配列から三種のポ
リペプチド、例えばＰ−１；ＤＳＧＮＤＩＹＧＮＰＩＫ
ＲＩＱＣ、Ｐ−２；ＤＴＬＳＴＴＱＫＫＳＬＮＨＲＹＱ
ＱＣ及びＰ−３；ＹＲＧＡＡＰＰＫＱＥＦＬＤＩＥＤＣ
を合成し、これらを免疫原としてマウスを免疫し、免疫
マウスからの脾細胞を用い細胞融合法で作成されたハイ
ブリドーマクローンから得られるモノクローナル抗体を
用い、マレイミド標識ＨＲＰを反応させて抗ＴＩＭＰ−
２モノクローナル抗体−ＨＲＰを得ることができる。こ
うした抗体としては潜在型ＭＭＰ−２がＴＩＭＰ−２に
結合することを阻害することのできる抗体が好ましく使
用される。ＴＩＭＰ−２のカルボキシル末端領域を認識
する抗体が使用できる。
【００４２】こうしてＴＩＭＰ−２のカルボキシル末端
領域のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を特開
平５−２４４９８５号の記載に従い調製し、得られた抗
体のうち、特異性が高く且つ親和性の強いマウス抗ＴＩ
ＭＰ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ１１、微工研受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６９０）を選択し、それを用
い前記（ａ）項記載にしたがってＨＲＰを標識した。こ
のＩｇＧ−ＨＲＰ（１００μｇ）溶液にｒＴＩＭＰ−２
２０μｇを加え、１０℃、３時間静置反応させた。こ
の混合液にさらに最終濃度４％となるようにホルムアル
デヒドを加え（固定反応）、室温で２時間反応させた。
使用した抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ
１１）はＴＩＭＰ−２のカルボキシ末端領域を認識する
抗体で、潜在型ＭＭＰ−２によりＴＩＭＰ−２−抗ＴＩ
ＭＰ−２ ＩｇＧの結合が解離されることがわかってい
る（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９
３）。
領域のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を特開
平５−２４４９８５号の記載に従い調製し、得られた抗
体のうち、特異性が高く且つ親和性の強いマウス抗ＴＩ
ＭＰ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ１１、微工研受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６９０）を選択し、それを用
い前記（ａ）項記載にしたがってＨＲＰを標識した。こ
のＩｇＧ−ＨＲＰ（１００μｇ）溶液にｒＴＩＭＰ−２
２０μｇを加え、１０℃、３時間静置反応させた。こ
の混合液にさらに最終濃度４％となるようにホルムアル
デヒドを加え（固定反応）、室温で２時間反応させた。
使用した抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ
１１）はＴＩＭＰ−２のカルボキシ末端領域を認識する
抗体で、潜在型ＭＭＰ−２によりＴＩＭＰ−２−抗ＴＩ
ＭＰ−２ ＩｇＧの結合が解離されることがわかってい
る（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９
３）。
【００４３】上記固定反応は、形成された免疫複合体
（ｒＴＩＭＰ−２−ＩｇＧ−ＨＲＰ）が潜在型ＭＭＰ−
２により解離しないようにするためで、室温、０．５〜
６時間反応を行った結果、反応２時間が最良の条件であ
った。固定反応後、セファデックスＧ−２５でホルムア
ルデヒドを除いた。この複合体は、潜在型ＭＭＰ−２に
より解離せず、ｒＴＩＭＰ−２とＩｇＧが固定されてい
ることを確認した。このことより調製したｒＴＩＭＰ−
２−ＩｇＧ−ＨＲＰはそのｒＴＩＭＰ−２の潜在型ＭＭ
Ｐ−２への結合領域が抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧでブロッ
クされたため、潜在型ＭＭＰ−２と反応しないことが示
された。すなわち上記ｒＴＩＭＰ−２−ＩｇＧ−ＨＲＰ
はすべての活性型ＭＭＰｓと反応し、さらに潜在型ＭＭ
Ｐ−２と活性型ＭＭＰ−２の分別を可能にした。ｒＴＩ
ＭＰ−２をｒＴＩＭＰ−１に代え、上記と同様の方法で
ｒＴＩＭＰ−１−ＩｇＧ−ＨＲＰも調製できた。抗ヒト
ＴＩＭＰ−１モノクローナル抗体は、実施例１のように
して得られた精製ＴＩＭＰ−１を免疫原としてマウスを
免疫し、免疫マウスからの脾細胞を用い細胞融合法で作
成されるハイブリドーマクローンから得られる。Ｋｏｄ
ａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．
Ｒｅｓ．，７，３４１−３５０，１９８７記載のマウス
抗ＴＩＭＰ−１ ＩｇＧから選んで使用される。
（ｒＴＩＭＰ−２−ＩｇＧ−ＨＲＰ）が潜在型ＭＭＰ−
２により解離しないようにするためで、室温、０．５〜
６時間反応を行った結果、反応２時間が最良の条件であ
った。固定反応後、セファデックスＧ−２５でホルムア
ルデヒドを除いた。この複合体は、潜在型ＭＭＰ−２に
より解離せず、ｒＴＩＭＰ−２とＩｇＧが固定されてい
ることを確認した。このことより調製したｒＴＩＭＰ−
２−ＩｇＧ−ＨＲＰはそのｒＴＩＭＰ−２の潜在型ＭＭ
Ｐ−２への結合領域が抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧでブロッ
クされたため、潜在型ＭＭＰ−２と反応しないことが示
された。すなわち上記ｒＴＩＭＰ−２−ＩｇＧ−ＨＲＰ
はすべての活性型ＭＭＰｓと反応し、さらに潜在型ＭＭ
Ｐ−２と活性型ＭＭＰ−２の分別を可能にした。ｒＴＩ
ＭＰ−２をｒＴＩＭＰ−１に代え、上記と同様の方法で
ｒＴＩＭＰ−１−ＩｇＧ−ＨＲＰも調製できた。抗ヒト
ＴＩＭＰ−１モノクローナル抗体は、実施例１のように
して得られた精製ＴＩＭＰ−１を免疫原としてマウスを
免疫し、免疫マウスからの脾細胞を用い細胞融合法で作
成されるハイブリドーマクローンから得られる。Ｋｏｄ
ａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．
Ｒｅｓ．，７，３４１−３５０，１９８７記載のマウス
抗ＴＩＭＰ−１ ＩｇＧから選んで使用される。
【００４４】実施例３ モノクローナル抗体の選択 抗ヒトＭＭＰ−１モノクローナル抗体は、ヒトプロＭＭ
Ｐ−１を免疫原としてマウスを免疫し、免疫マウスから
の脾細胞を用い細胞融合法で作成されるハイブリドーマ
クローンから得られる。精製ヒトプロＭＭＰ−１は、ヒ
ト正常皮膚線維芽細胞ＣＣＤ−４１ＳＫ（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ． ＣＲＬ１５０５）を１０％ＦＣＳ含有最小必須Ｅ
ａｇｌｅ培地中で培養し、必要に応じインターロイキン
１αで細胞刺激して得られた細胞培養上清から、限外ろ
過（東洋濾紙ＵＰ−７６）による濃縮、ヘパリンセファ
ロース ＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、セファクリル−Ｓ−２０
０（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）、グリーンＡ アクチゲル−ＡＬＤカラム（Ｓｔｅ
ｒｏｇｅｎｅ）などによりクロマトグラフィーにかけ精
製した。得られた抗ヒトＭＭＰ−１モノクローナル抗体
のうち、少なくとも活性型ＭＭＰ−１を認識する抗体を
使用することができる。抗ヒトＭＭＰ−１モノクローナ
ル抗体は、特開平６−３００７５７号及びＣｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１９，１−１４，１９９３記載の
モノクローナル抗体のうち、クローン７８−１２Ｇ８
（微工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３１１５）からの抗
体を選んだ。この抗体は潜在型及び活性型ＭＭＰ−１を
認識し、ＥＤＴＡなどのキレート剤によってはその免疫
反応性の変化が認められないという性質をもっている。
Ｐ−１を免疫原としてマウスを免疫し、免疫マウスから
の脾細胞を用い細胞融合法で作成されるハイブリドーマ
クローンから得られる。精製ヒトプロＭＭＰ−１は、ヒ
ト正常皮膚線維芽細胞ＣＣＤ−４１ＳＫ（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ． ＣＲＬ１５０５）を１０％ＦＣＳ含有最小必須Ｅ
ａｇｌｅ培地中で培養し、必要に応じインターロイキン
１αで細胞刺激して得られた細胞培養上清から、限外ろ
過（東洋濾紙ＵＰ−７６）による濃縮、ヘパリンセファ
ロース ＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、セファクリル−Ｓ−２０
０（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）、グリーンＡ アクチゲル−ＡＬＤカラム（Ｓｔｅ
ｒｏｇｅｎｅ）などによりクロマトグラフィーにかけ精
製した。得られた抗ヒトＭＭＰ−１モノクローナル抗体
のうち、少なくとも活性型ＭＭＰ−１を認識する抗体を
使用することができる。抗ヒトＭＭＰ−１モノクローナ
ル抗体は、特開平６−３００７５７号及びＣｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１９，１−１４，１９９３記載の
モノクローナル抗体のうち、クローン７８−１２Ｇ８
（微工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３１１５）からの抗
体を選んだ。この抗体は潜在型及び活性型ＭＭＰ−１を
認識し、ＥＤＴＡなどのキレート剤によってはその免疫
反応性の変化が認められないという性質をもっている。
【００４５】抗ヒトＭＭＰ−２モノクローナル抗体は、
ＣＣＤ−４１ＳＫ細胞をヒトプロＭＭＰ−１の場合と同
様にして処理し、得られた細胞培養上清からゼラチンア
ガロース、抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧ結合セファロース、
抗フィブロネクチンＩｇＧ結合セファロースなどにより
クロマトグラフィーにかけ精製されるヒトプロＭＭＰ−
２を免疫原としてマウスを免疫し、免疫マウスからの脾
細胞を用い細胞融合法で作成されるハイブリドーマクロ
ーンから得られる。得られた抗ヒトＭＭＰ−２モノクロ
ーナル抗体のうち、少なくとも活性型ＭＭＰ−２を認識
する抗体を使用することができる。抗ヒトＭＭＰ−２モ
ノクローナル抗体は、特開平６−２１３８８８号及びＦ
ｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．
Ａｃｔａ，２２１，９１−１０３，１９９３に記載のモ
ノクローナル抗体のうち、親和性の強いクローン７５−
７Ｆ７（微工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３５）か
らの抗体を使用した。この抗体は、ＭＭＰ−２のカルボ
キシル末端領域を認識し、潜在型及び活性型ＭＭＰ−２
を認識する抗体である。
ＣＣＤ−４１ＳＫ細胞をヒトプロＭＭＰ−１の場合と同
様にして処理し、得られた細胞培養上清からゼラチンア
ガロース、抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧ結合セファロース、
抗フィブロネクチンＩｇＧ結合セファロースなどにより
クロマトグラフィーにかけ精製されるヒトプロＭＭＰ−
２を免疫原としてマウスを免疫し、免疫マウスからの脾
細胞を用い細胞融合法で作成されるハイブリドーマクロ
ーンから得られる。得られた抗ヒトＭＭＰ−２モノクロ
ーナル抗体のうち、少なくとも活性型ＭＭＰ−２を認識
する抗体を使用することができる。抗ヒトＭＭＰ−２モ
ノクローナル抗体は、特開平６−２１３８８８号及びＦ
ｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．
Ａｃｔａ，２２１，９１−１０３，１９９３に記載のモ
ノクローナル抗体のうち、親和性の強いクローン７５−
７Ｆ７（微工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３５）か
らの抗体を使用した。この抗体は、ＭＭＰ−２のカルボ
キシル末端領域を認識し、潜在型及び活性型ＭＭＰ−２
を認識する抗体である。
【００４６】抗ヒトＭＭＰ−７モノクローナル抗体は、
ヒト直腸癌細胞由来ＣａＲ−１細胞の培養液から、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１４２４５−１４２５
５，１９８６及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，
２１７１２−２１７１９，１９９２に記載のＯｋａｄａ
ｅｔ ａｌ．の方法に従い精製したヒトＭＭＰ−７
を、さらにＤＥＡＥ−セルロースカラム、Ｇｒｅｅｎ
Ａ Ｄｙｅｍａｔｒｉｘｇｅｌ（Ａｍｉｃｏｎ製）カラ
ム、亜鉛キレートセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
製）カラム、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＩＢＦ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｃｓ製）カラムなどで処理し、得られたヒ
トプロＭＭＰ−７を抗原として用いてＢＡＬＢ／ｃ雌マ
ウスを免疫し、こうして免疫されたマウスから採取した
脾臓細胞を８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ２
（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）と細胞融合させ、ハイブリド
ーマを選択し、クローニングして得られる。抗ヒトＭＭ
Ｐ−７モノクローナル抗体のうち、クローン１２５−２
０Ｈ１１（生工研受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４７３
５）は、活性型ＭＭＰ−７を認識する抗体である。
ヒト直腸癌細胞由来ＣａＲ−１細胞の培養液から、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１４２４５−１４２５
５，１９８６及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，
２１７１２−２１７１９，１９９２に記載のＯｋａｄａ
ｅｔ ａｌ．の方法に従い精製したヒトＭＭＰ−７
を、さらにＤＥＡＥ−セルロースカラム、Ｇｒｅｅｎ
Ａ Ｄｙｅｍａｔｒｉｘｇｅｌ（Ａｍｉｃｏｎ製）カラ
ム、亜鉛キレートセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
製）カラム、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＩＢＦ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｃｓ製）カラムなどで処理し、得られたヒ
トプロＭＭＰ−７を抗原として用いてＢＡＬＢ／ｃ雌マ
ウスを免疫し、こうして免疫されたマウスから採取した
脾臓細胞を８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ２
（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）と細胞融合させ、ハイブリド
ーマを選択し、クローニングして得られる。抗ヒトＭＭ
Ｐ−７モノクローナル抗体のうち、クローン１２５−２
０Ｈ１１（生工研受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４７３
５）は、活性型ＭＭＰ−７を認識する抗体である。
【００４７】抗ヒトＭＭＰ−９モノクローナル抗体は、
ヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０細胞）を培養し、必
要に応じｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ
−αで細胞刺激して得られた細胞培養上清から、限外ろ
過、ゼラチンアガロースカラム、抗ＴＩＭＰ−１モノク
ローナル抗体結合セファロース４Ｂ、抗フィブロネクチ
ン抗体結合セファロース４Ｂなどによりクロマトグラフ
ィーにかけ精製して得られたヒトプロＭＭＰ−９を免疫
原としてマウスを免疫し、免疫マウスからの脾細胞を用
い細胞融合法で作成されるハイブリドーマクローンから
得られる。得られた抗ヒトＭＭＰ−９モノクローナル抗
体のうち、少なくとも活性型ＭＭＰ−９を認識する抗体
を使用することができる。抗ヒトＭＭＰ−９モノクロー
ナル抗体は、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２３１，７９−８８，１９９
４に記載のモノクローナル抗体のうち、親和性の強いク
ローン７３−１８Ｂ３（微工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１３６９５）からの抗体を用いることにした。この抗体
は、ＭＭＰ−９の中央領域を認識し、潜在型及び活性型
ＭＭＰ−９を認識する抗体である。同様にしてＭＭＰ−
３、−８、−１０、−１１、−１２、−１３及び−１４
に対するそれぞれのモノクローナル抗体を調製し、適切
なクローンを選択して使用できる。
ヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０細胞）を培養し、必
要に応じｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ
−αで細胞刺激して得られた細胞培養上清から、限外ろ
過、ゼラチンアガロースカラム、抗ＴＩＭＰ−１モノク
ローナル抗体結合セファロース４Ｂ、抗フィブロネクチ
ン抗体結合セファロース４Ｂなどによりクロマトグラフ
ィーにかけ精製して得られたヒトプロＭＭＰ−９を免疫
原としてマウスを免疫し、免疫マウスからの脾細胞を用
い細胞融合法で作成されるハイブリドーマクローンから
得られる。得られた抗ヒトＭＭＰ−９モノクローナル抗
体のうち、少なくとも活性型ＭＭＰ−９を認識する抗体
を使用することができる。抗ヒトＭＭＰ−９モノクロー
ナル抗体は、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２３１，７９−８８，１９９
４に記載のモノクローナル抗体のうち、親和性の強いク
ローン７３−１８Ｂ３（微工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１３６９５）からの抗体を用いることにした。この抗体
は、ＭＭＰ−９の中央領域を認識し、潜在型及び活性型
ＭＭＰ−９を認識する抗体である。同様にしてＭＭＰ−
３、−８、−１０、−１１、−１２、−１３及び−１４
に対するそれぞれのモノクローナル抗体を調製し、適切
なクローンを選択して使用できる。
【００４８】実施例４ 活性型ＭＭＰｓの調製 活性型ＭＭＰ−１は、ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＣＤ−４
１ＳＫ）培養上清より精製した潜在型ＭＭＰ−１を０．
１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム含有５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（緩衝液Ａ）に
溶解し、終濃度が１ｍＭになるようにアミノフェニルマ
ーキュリックアセテート（ＡＰＭＡ）を加え、３７℃、
２時間インキュベーションした（Ｊ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１９，１
−１４，１９９３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲ
ル、２−メルカプトエタノール存在下）によりヒト潜在
型ＭＭＰ−１は完全に活性型ＭＭＰ−１へ活性化された
ことを確認した。
１ＳＫ）培養上清より精製した潜在型ＭＭＰ−１を０．
１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム含有５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（緩衝液Ａ）に
溶解し、終濃度が１ｍＭになるようにアミノフェニルマ
ーキュリックアセテート（ＡＰＭＡ）を加え、３７℃、
２時間インキュベーションした（Ｊ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１９，１
−１４，１９９３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲ
ル、２−メルカプトエタノール存在下）によりヒト潜在
型ＭＭＰ−１は完全に活性型ＭＭＰ−１へ活性化された
ことを確認した。
【００４９】活性型ＭＭＰ−２は、ＣＣＤ−４１ＳＫ培
養上清から精製した潜在型ＭＭＰ−２を上記緩衝液Ａに
溶解し、１ｍＭ ＡＰＭＡで３７℃、３０分間インキュ
ベーションすることにより得た（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２
１，９１−１０３，１９９３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上潜
在型ＭＭＰ−２が活性型ＭＭＰ−２に活性化されたこと
を確認した。活性型ＭＭＰ−７は、実施例３に記載のヒ
トプロＭＭＰ−７の調製の際、亜鉛キレートセファロー
ス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）カラムでの処理において１
ｍＭＣａＣｌ2 ，０．０５％ Ｂｒｉｊ３５，０．０２
％ ＮａＮ3 含有２５ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．５）に溶解したＮａＣｌの濃度勾配により溶
出すると、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有同緩衝液で溶出さ
れ得られた。
養上清から精製した潜在型ＭＭＰ−２を上記緩衝液Ａに
溶解し、１ｍＭ ＡＰＭＡで３７℃、３０分間インキュ
ベーションすることにより得た（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２
１，９１−１０３，１９９３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上潜
在型ＭＭＰ−２が活性型ＭＭＰ−２に活性化されたこと
を確認した。活性型ＭＭＰ−７は、実施例３に記載のヒ
トプロＭＭＰ−７の調製の際、亜鉛キレートセファロー
ス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）カラムでの処理において１
ｍＭＣａＣｌ2 ，０．０５％ Ｂｒｉｊ３５，０．０２
％ ＮａＮ3 含有２５ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．５）に溶解したＮａＣｌの濃度勾配により溶
出すると、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有同緩衝液で溶出さ
れ得られた。
【００５０】活性型ＭＭＰ−９は、ヒト線維肉腫細胞Ｈ
Ｔ１０８０培養上清から精製した潜在型ＭＭＰ−９を緩
衝液Ａに溶解し、１ｍＭ ＡＰＭＡで３７℃、２４時間
インキュベーションすることにより得た（Ｙ．Ｏｋａｄ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
７，２１７１２−２１７１９，１９９３）。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上潜在型ＭＭＰ−９が活性型ＭＭＰ−９に活性化
されたことを確認した。ＭＭＰ−３（Ｙ．Ｏｋａｄａ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５４，７３１
−７４１，１９８８）、ＭＭＰ−８（Ｖ．Ｋｎａｕｐｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−
Ｓｅｙｌｅｒ．，３７１，２９５−３０４，１９９
０）、ＭＭＰ−１０（Ａ．Ｊ．Ｐａｒｋ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１５８４−
１５９０，１９９１）、ＭＭＰ−１１（Ｄ．Ｐｅｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５
８４９−２５８５５，１９９４）、ＭＭＰ−１２（Ｓ．
Ｄ．Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２６８，２３８２４−２３８２９，１９９
３）、ＭＭＰ−１３（Ｊ．Ｍ．Ｐ．Ｆｒｅｉｊｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１６７
６６−１６７７３，１９９４）、ＭＭＰ−１４（特願平
６−３３１３０５号）についても各活性型ＭＭＰを調製
して、同様にして使用できる。
Ｔ１０８０培養上清から精製した潜在型ＭＭＰ−９を緩
衝液Ａに溶解し、１ｍＭ ＡＰＭＡで３７℃、２４時間
インキュベーションすることにより得た（Ｙ．Ｏｋａｄ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
７，２１７１２−２１７１９，１９９３）。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上潜在型ＭＭＰ−９が活性型ＭＭＰ−９に活性化
されたことを確認した。ＭＭＰ−３（Ｙ．Ｏｋａｄａ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５４，７３１
−７４１，１９８８）、ＭＭＰ−８（Ｖ．Ｋｎａｕｐｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−
Ｓｅｙｌｅｒ．，３７１，２９５−３０４，１９９
０）、ＭＭＰ−１０（Ａ．Ｊ．Ｐａｒｋ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１５８４−
１５９０，１９９１）、ＭＭＰ−１１（Ｄ．Ｐｅｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５
８４９−２５８５５，１９９４）、ＭＭＰ−１２（Ｓ．
Ｄ．Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２６８，２３８２４−２３８２９，１９９
３）、ＭＭＰ−１３（Ｊ．Ｍ．Ｐ．Ｆｒｅｉｊｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１６７
６６−１６７７３，１９９４）、ＭＭＰ−１４（特願平
６−３３１３０５号）についても各活性型ＭＭＰを調製
して、同様にして使用できる。
【００５１】実施例５ 活性型ＭＭＰｓの定量法 （ａ）モノクローナル抗体結合担体の調製法 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ４，２０９−３２７，１
９８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．の方法
に従って、マウス抗ヒトＭＭＰｓ ＩｇＧ（クローンＮ
ｏ．７８−１２Ｇ８、７５−７Ｆ７あるいは７３−１８
Ｂ３）を各々０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶
解し、１００μｇ／ｍｌの濃度に調製した。そのモノク
ローナル抗体溶液を９６穴マイクロプレートにウエル当
り１００μｌずつ加え、４℃、２４時間静置した。次に
モノクローナル抗体溶液を除去し、各々０．１Ｍ塩化ナ
トリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２
回洗浄後、１％ ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１
０ｍＭ塩化カルシウム含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４、緩衝液Ｂ）に浸漬し、４℃で保存した。
９８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．の方法
に従って、マウス抗ヒトＭＭＰｓ ＩｇＧ（クローンＮ
ｏ．７８−１２Ｇ８、７５−７Ｆ７あるいは７３−１８
Ｂ３）を各々０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶
解し、１００μｇ／ｍｌの濃度に調製した。そのモノク
ローナル抗体溶液を９６穴マイクロプレートにウエル当
り１００μｌずつ加え、４℃、２４時間静置した。次に
モノクローナル抗体溶液を除去し、各々０．１Ｍ塩化ナ
トリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２
回洗浄後、１％ ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１
０ｍＭ塩化カルシウム含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４、緩衝液Ｂ）に浸漬し、４℃で保存した。
【００５２】（ｂ）活性型ＭＭＰｓの定量法 ＭＭＰｓのうちＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９を除くすべて
のＭＭＰｓはその潜在型がＴＩＭＰｓと結合せず、遊離
の活性型のみがＴＩＭＰｓと結合するという共通の性質
を有するためそれらはすべて同一原理で定量される。従
って実施例として活性型ＭＭＰ−１の定量法を代表例と
して記載した。また、ＭＭＰ−２あるいはＭＭＰ−９に
ついては潜在型でも各々ＴＩＭＰ−２あるいはＴＩＭＰ
−１が結合するため、その潜在型との分別を行うために
標識物を直接付与したＴＩＭＰ−１あるいは標識物を間
接的に付与したＴＩＭＰ−２を使用した定量法を記載し
た。
のＭＭＰｓはその潜在型がＴＩＭＰｓと結合せず、遊離
の活性型のみがＴＩＭＰｓと結合するという共通の性質
を有するためそれらはすべて同一原理で定量される。従
って実施例として活性型ＭＭＰ−１の定量法を代表例と
して記載した。また、ＭＭＰ−２あるいはＭＭＰ−９に
ついては潜在型でも各々ＴＩＭＰ−２あるいはＴＩＭＰ
−１が結合するため、その潜在型との分別を行うために
標識物を直接付与したＴＩＭＰ−１あるいは標識物を間
接的に付与したＴＩＭＰ−２を使用した定量法を記載し
た。
【００５３】１）活性型ＭＭＰ−１の定量法 実施例４に記載した活性型ＭＭＰ−１を標準とし、既知
濃度の活性型ＭＭＰ−１あるいは遊離の活性型ＭＭＰ−
１を含む検体を９６穴ビニルプレート（Ｆａｌｃｏｎ
製）に各々２０μｌ加えた。次に実施例２（ａ）項で調
製したｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ複合体を５μｇ／ｍｌと
なるように緩衝液Ｂで希釈し、あるいは実施例２（ｂ）
項で調製したｒＴＩＭＰ−２−抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧ
−ＨＲＰ複合体を１８μｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ｂ
で希釈し、上記ビニルプレートに各々１００μｌずつ加
え混合した。この混合液を前記（ａ）項で調製した抗Ｍ
ＭＰ−１抗体（クローンＮｏ．７８−１２Ｇ８）結合プ
レートに１００μｌ加え、室温で２時間反応させ、生理
食塩液で３回洗浄した。次に０．０２％過酸化水素含有
０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．９）に溶解
した２ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンをウエル当
り１００μｌ加え、室温で２０分間反応後、２Ｎ硫酸１
００μｌを添加し、反応を停止させた。この反応混合液
の４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ492 ）をマイクロプレ
ートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東ソー）を用いて測定
し、検量線を作成した（図１）。ｒＴＩＭＰ−１−ＨＲ
Ｐ複合体を用いた定量系の感度は、標準０ｎｇ／ｍｌ値
＋２Ｓ．Ｄ．から５ｎｇ／ｍｌ（８４ｐｇ／アッセイ）
で、活性型ＭＭＰ−１標準液２０〜６４０ｎｇ／ｍｌ
（０．３３〜１０．７ｎｇ／アッセイ）の範囲で直線性
が認められた。ｒＴＩＭＰ−２−ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体
を用いた定量法の感度は、１．３ｎｇ／ｍｌ（２２ｐｇ
／アッセイ）で、活性型ＭＭＰ−１標準液４〜３３０ｎ
ｇ／ｍｌ（６７〜５５００ｐｇ／アッセイ）の範囲で直
線性が認められた。なお、ｒＴＩＭＰ−２−ＨＲＰ複合
体を用いた定量法でも、ｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ複合体
を用いた定量法とほぼ同じ様な結果が得られた。
濃度の活性型ＭＭＰ−１あるいは遊離の活性型ＭＭＰ−
１を含む検体を９６穴ビニルプレート（Ｆａｌｃｏｎ
製）に各々２０μｌ加えた。次に実施例２（ａ）項で調
製したｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ複合体を５μｇ／ｍｌと
なるように緩衝液Ｂで希釈し、あるいは実施例２（ｂ）
項で調製したｒＴＩＭＰ−２−抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧ
−ＨＲＰ複合体を１８μｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ｂ
で希釈し、上記ビニルプレートに各々１００μｌずつ加
え混合した。この混合液を前記（ａ）項で調製した抗Ｍ
ＭＰ−１抗体（クローンＮｏ．７８−１２Ｇ８）結合プ
レートに１００μｌ加え、室温で２時間反応させ、生理
食塩液で３回洗浄した。次に０．０２％過酸化水素含有
０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．９）に溶解
した２ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンをウエル当
り１００μｌ加え、室温で２０分間反応後、２Ｎ硫酸１
００μｌを添加し、反応を停止させた。この反応混合液
の４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ492 ）をマイクロプレ
ートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東ソー）を用いて測定
し、検量線を作成した（図１）。ｒＴＩＭＰ−１−ＨＲ
Ｐ複合体を用いた定量系の感度は、標準０ｎｇ／ｍｌ値
＋２Ｓ．Ｄ．から５ｎｇ／ｍｌ（８４ｐｇ／アッセイ）
で、活性型ＭＭＰ−１標準液２０〜６４０ｎｇ／ｍｌ
（０．３３〜１０．７ｎｇ／アッセイ）の範囲で直線性
が認められた。ｒＴＩＭＰ−２−ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体
を用いた定量法の感度は、１．３ｎｇ／ｍｌ（２２ｐｇ
／アッセイ）で、活性型ＭＭＰ−１標準液４〜３３０ｎ
ｇ／ｍｌ（６７〜５５００ｐｇ／アッセイ）の範囲で直
線性が認められた。なお、ｒＴＩＭＰ−２−ＨＲＰ複合
体を用いた定量法でも、ｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ複合体
を用いた定量法とほぼ同じ様な結果が得られた。
【００５４】２）活性型ＭＭＰ−２の定量法 実施例４に記載した活性型ＭＭＰ−２を標準とし、既知
濃度の活性型ＭＭＰ−２あるいは遊離の活性型ＭＭＰ−
２を含む検体を９６穴ビニルプレートに各々２０μｌ加
えた。次に実施例２（ａ）項で調製したｒＴＩＭＰ−１
−ＨＲＰ複合体を５μｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ｂで
希釈し、上記ビニルプレートに各々１００μｌずつ加え
混合した。この混合液を前記（ａ）項で調製したマウス
抗ＭＭＰ−２抗体（クローンＮｏ．７５−７Ｆ７）結合
プレートに加え、以下の操作は上記１）と同様に行っ
た。検量線を図２に示した。この定量法の感度は標準０
ｎｇ／ｍｌ値＋２Ｓ．Ｄ．から３４ｎｇ／ｍｌ（０．５
７ｎｇ／アッセイ）であり、直線性は３４〜９３０ｎｇ
／ｍｌ（０．５７〜１５．５ｎｇ／アッセイ）の範囲で
認められた。
濃度の活性型ＭＭＰ−２あるいは遊離の活性型ＭＭＰ−
２を含む検体を９６穴ビニルプレートに各々２０μｌ加
えた。次に実施例２（ａ）項で調製したｒＴＩＭＰ−１
−ＨＲＰ複合体を５μｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ｂで
希釈し、上記ビニルプレートに各々１００μｌずつ加え
混合した。この混合液を前記（ａ）項で調製したマウス
抗ＭＭＰ−２抗体（クローンＮｏ．７５−７Ｆ７）結合
プレートに加え、以下の操作は上記１）と同様に行っ
た。検量線を図２に示した。この定量法の感度は標準０
ｎｇ／ｍｌ値＋２Ｓ．Ｄ．から３４ｎｇ／ｍｌ（０．５
７ｎｇ／アッセイ）であり、直線性は３４〜９３０ｎｇ
／ｍｌ（０．５７〜１５．５ｎｇ／アッセイ）の範囲で
認められた。
【００５５】３）活性型ＭＭＰ−９の定量法 実施例４に記載した活性型ＭＭＰ−９を標準とし、既知
濃度の活性型ＭＭＰ−９あるいは遊離の活性型ＭＭＰ−
９を含む検体を９６穴ビニルプレートに各々２０μｌ加
えた。次に実施例２（ｂ）項で調製したｒＴＩＭＰ−２
−ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体を１８μｇ／ｍｌとなるように
緩衝液Ｂで希釈し、上記ビニルプレートに各々１００μ
ｌずつ加え混合した。この混合液を前記（ａ）項で調製
したマウス抗ヒトＭＭＰ−９抗体（クローンＮｏ．７３
−１８Ｂ３）結合プレート１００μｌに加え、以下の操
作は上記１）と同様に行った。検量線を図３に示した。
この測定系の感度は標準０ｎｇ／ｍｌ値＋２Ｓ．Ｄ．か
ら５ｎｇ／ｍｌ（８４ｐｇ／アッセイ）であり、直線性
は１０〜３２０ｎｇ／ｍｌ（０．１７〜５．３ｎｇ／ア
ッセイ）の範囲で認められた。同様にしてＭＭＰ−３、
−７、−８、−１０、−１１、−１２、−１３及び−１
４ついてもそれぞれの活性型ＭＭＰを分別定量する。
濃度の活性型ＭＭＰ−９あるいは遊離の活性型ＭＭＰ−
９を含む検体を９６穴ビニルプレートに各々２０μｌ加
えた。次に実施例２（ｂ）項で調製したｒＴＩＭＰ−２
−ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体を１８μｇ／ｍｌとなるように
緩衝液Ｂで希釈し、上記ビニルプレートに各々１００μ
ｌずつ加え混合した。この混合液を前記（ａ）項で調製
したマウス抗ヒトＭＭＰ−９抗体（クローンＮｏ．７３
−１８Ｂ３）結合プレート１００μｌに加え、以下の操
作は上記１）と同様に行った。検量線を図３に示した。
この測定系の感度は標準０ｎｇ／ｍｌ値＋２Ｓ．Ｄ．か
ら５ｎｇ／ｍｌ（８４ｐｇ／アッセイ）であり、直線性
は１０〜３２０ｎｇ／ｍｌ（０．１７〜５．３ｎｇ／ア
ッセイ）の範囲で認められた。同様にしてＭＭＰ−３、
−７、−８、−１０、−１１、−１２、−１３及び−１
４ついてもそれぞれの活性型ＭＭＰを分別定量する。
【００５６】実施例６ ヒト関節液中及びヒト血清中活
性型ＭＭＰｓの定量 検体として組織破壊の進行している慢性関節リウマチ
（ＲＡ）及びコントロールとしての変形性関節症（Ｏ
Ａ）患者の関節液、及びヒト血清を用い、ＲＡ患者血清
でレベルの上昇が認められているＭＭＰ−２（Ｎ．Ｆｕ
ｊｉｍｏｔｏ ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃ
ｔａ，２２１，９１−１０３，１９９３）を実施例４
（ｂ）項２）に記載の方法でｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ及
び抗ＭＭＰ−２抗体を用いて遊離の活性型ＭＭＰ−２を
測定した。ＯＡ患者関節液及びヒト血清中の遊離の活性
型ＭＭＰ−２濃度は、すべてこの定量法の感度以下であ
った。一方、組織破壊の進行しているＲＡ患者関節液中
の遊離の活性型ＭＭＰ−２濃度は、一部感度以下であっ
たが、ＯＡ患者関節液及びヒト血清中の遊離の活性型Ｍ
ＭＰ−２濃度よりも著しく高かった（図４）。ＯＡ患者
関節液及びヒト血清中で活性型ＭＭＰ−２は検出されな
かったが、これら検体中には遊離状態のＴＩＭＰｓが存
在することが知られており、遊離状態の活性型ＭＭＰｓ
が存在しないことと一致する。例として活性型ＭＭＰ−
２定量法の臨床応用例を示したが、その他にも組織破
壊、炎症あるいは癌転移などの疾患をもつ患者からの細
胞、組織ホモジネート、関節液、血液あるいは尿などに
おいて、本定量法により遊離状態の活性型ＭＭＰｓの分
別定量が可能となる。
性型ＭＭＰｓの定量 検体として組織破壊の進行している慢性関節リウマチ
（ＲＡ）及びコントロールとしての変形性関節症（Ｏ
Ａ）患者の関節液、及びヒト血清を用い、ＲＡ患者血清
でレベルの上昇が認められているＭＭＰ−２（Ｎ．Ｆｕ
ｊｉｍｏｔｏ ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃ
ｔａ，２２１，９１−１０３，１９９３）を実施例４
（ｂ）項２）に記載の方法でｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ及
び抗ＭＭＰ−２抗体を用いて遊離の活性型ＭＭＰ−２を
測定した。ＯＡ患者関節液及びヒト血清中の遊離の活性
型ＭＭＰ−２濃度は、すべてこの定量法の感度以下であ
った。一方、組織破壊の進行しているＲＡ患者関節液中
の遊離の活性型ＭＭＰ−２濃度は、一部感度以下であっ
たが、ＯＡ患者関節液及びヒト血清中の遊離の活性型Ｍ
ＭＰ−２濃度よりも著しく高かった（図４）。ＯＡ患者
関節液及びヒト血清中で活性型ＭＭＰ−２は検出されな
かったが、これら検体中には遊離状態のＴＩＭＰｓが存
在することが知られており、遊離状態の活性型ＭＭＰｓ
が存在しないことと一致する。例として活性型ＭＭＰ−
２定量法の臨床応用例を示したが、その他にも組織破
壊、炎症あるいは癌転移などの疾患をもつ患者からの細
胞、組織ホモジネート、関節液、血液あるいは尿などに
おいて、本定量法により遊離状態の活性型ＭＭＰｓの分
別定量が可能となる。
【００５７】
【発明の効果】本発明では、各ＭＭＰを特異的に認識す
ることができるモノクローナル抗体と各ＴＩＭＰを用い
ることにより遊離の各活性型ＭＭＰの免疫学的測定を達
成できる。特に被検試料中の活性型ＭＭＰを認識するモ
ノクローナル抗体と各ＴＩＭＰとを用いることにより、
遊離の各活性型ＭＭＰを測定することができ、その結果
活性型ＭＭＰを感度ならびに精度良く、また迅速に定量
し得る。そしてこうしてＭＭＰの免疫学的測定を達成で
きることにより、慢性関節リウマチなどのような炎症性
疾患、癌、腫瘍性疾患においても重要な働きをしている
と考えられる各活性型ＭＭＰを精度良く且つ迅速に分別
定量できるので、これら炎症反応の診断の道を開き、さ
らには慢性関節リウマチなどのような炎症性疾患、腫瘍
性疾患、転移性癌などの診断剤として有用である。
ることができるモノクローナル抗体と各ＴＩＭＰを用い
ることにより遊離の各活性型ＭＭＰの免疫学的測定を達
成できる。特に被検試料中の活性型ＭＭＰを認識するモ
ノクローナル抗体と各ＴＩＭＰとを用いることにより、
遊離の各活性型ＭＭＰを測定することができ、その結果
活性型ＭＭＰを感度ならびに精度良く、また迅速に定量
し得る。そしてこうしてＭＭＰの免疫学的測定を達成で
きることにより、慢性関節リウマチなどのような炎症性
疾患、癌、腫瘍性疾患においても重要な働きをしている
と考えられる各活性型ＭＭＰを精度良く且つ迅速に分別
定量できるので、これら炎症反応の診断の道を開き、さ
らには慢性関節リウマチなどのような炎症性疾患、腫瘍
性疾患、転移性癌などの診断剤として有用である。
【図１】活性型ＭＭＰ−１の標準曲線を示す図である。
【図２】活性型ＭＭＰ−２の標準曲線を示す図である。
【図３】活性型ＭＭＰ−９の標準曲線を示す図である。
【図４】ＲＡ患者、ＯＡ患者関節液あるいはヒト血清中
の遊離の活性型ＭＭＰ−２量を示す図である。
の遊離の活性型ＭＭＰ−２量を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年４月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【背景技術】細胞外マトリックスは、コラーゲン、プロ
テオグリカン、エラスチン、フィブロネクチン及びラミ
ニンなどの接着性糖タンパク質から構成されている（Ｍ
ａｒｔｉｎｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４８，６５６−６７７，１９
８３）。これらマトリックス成分の分解にはマトリック
スメタロプロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）が重要な役割を果
たしていることは周知のことである。知られているＭＭ
Ｐの種類とそのナンバーリングは以下のようになってい
る。間質型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、７２キロダル
トン（ｋＤａ）ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）、ストロム
ライシン−１ （ＭＭＰ−３）、ＰＵＭＰ−１ （ＭＭ
Ｐ−７）、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ−８）、９２ｋ
Ｄａゼラチナーゼ（ＭＭＰ−９）、ストロムライシン−
２（ＭＭＰ−１０）、ストロムライシン−３（ＭＭＰ−
１１）、マクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＰ−
１２）、コラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）及び膜型Ｍ
ＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）である（Ｈ．Ｂｉｒｋｅｄａｌ−
Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ．Ｍ
ｅｄ．，４，１９７−２５０，１９９３；Ｓ．Ｄ．Ｓｈ
ａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６８，２３８２４−２３８２９，１９９３；
Ｊ．Ｍ．Ｐ．Ｆｒｅｊｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１６７６６−１６７７３，１
９９４；Ｈ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，
３７０，６１−６５，１９９４）。
テオグリカン、エラスチン、フィブロネクチン及びラミ
ニンなどの接着性糖タンパク質から構成されている（Ｍ
ａｒｔｉｎｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４８，６５６−６７７，１９
８３）。これらマトリックス成分の分解にはマトリック
スメタロプロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）が重要な役割を果
たしていることは周知のことである。知られているＭＭ
Ｐの種類とそのナンバーリングは以下のようになってい
る。間質型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、７２キロダル
トン（ｋＤａ）ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）、ストロム
ライシン−１ （ＭＭＰ−３）、ＰＵＭＰ−１ （ＭＭ
Ｐ−７）、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ−８）、９２ｋ
Ｄａゼラチナーゼ（ＭＭＰ−９）、ストロムライシン−
２（ＭＭＰ−１０）、ストロムライシン−３（ＭＭＰ−
１１）、マクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＰ−
１２）、コラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）及び膜型Ｍ
ＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）である（Ｈ．Ｂｉｒｋｅｄａｌ−
Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ．Ｍ
ｅｄ．，４，１９７−２５０，１９９３；Ｓ．Ｄ．Ｓｈ
ａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６８，２３８２４−２３８２９，１９９３；
Ｊ．Ｍ．Ｐ．Ｆｒｅｊｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１６７６６−１６７７３，１
９９４；Ｈ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，
３７０，６１−６５，１９９４）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】
【課題の解決】本発明の目的は、簡単な操作及び試薬を
用い、感度並びに精度良く、また迅速にそれぞれの活性
型ＭＭＰｓ量を分別して定量し得る方法を提供すること
にある。こうした方法に用いる試薬キットを提供するこ
とも本発明の目的の一つである。本発明者らは、活性型
ＭＭＰｓに結合し、その活性を抑制するインヒビター、
例えばＴＩＭＰｓ、α２−マクログロブリン、ペプチド
インヒビター及び合成化合物などのうち、ＴＩＭＰｓが
すべてのＭＭＰｓの活性型に特異的に結合することに着
目し、各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とＴＩＭＰｓと
の組合せにより簡便な遊離の活性型ＭＭＰｓの分別定量
法を提供できるのではないかと考えて、鋭意研究の結
果、各ＭＭＰに特異的に結合する抗体と、ＴＩＭＰｓあ
るいはＴＩＭＰｓと各ＴＩＭＰに特異的に結合する抗体
との複合物を組合せて使用する遊離の活性型ＭＭＰｓの
分別定量法を確立した。さらにＴＩＭＰｓを標識付与用
として用いる場合、ＴＩＭＰｓの活性型ＭＭＰｓに対す
る結合能を損することなく直接または間接的に標識物を
付与することに成功し、この標識物を付与したＴＩＭＰ
ｓと各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とを組合せること
により、簡便な遊離の活性型ＭＭＰｓの分別定量法を確
立した。特に直接標識物を付与したＴＩＭＰ−１と各Ｍ
ＭＰに特異的に結合する抗体とを組み合わせて用いる場
合、遊離の活性型ＭＭＰ−１、−２、−３、−７、−
８、−１０、−１１、−１２及び−１３並びにＭＴ−Ｍ
ＭＰを定量することができ、直接標識物を付与したＴＩ
ＭＰ−２と各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とを組み合
わせて用いる場合、遊離の活性型ＭＭＰ−１、−３、−
７、−８、−９、−１０、−１１、−１２及び−１３並
びにＭＴ−ＭＭＰを定量することができる。さらに固相
用にＴＩＭＰ−１あるいはＴＩＭＰ−２を用いる場合も
上記と同様各々の遊離の活性型ＭＭＰｓを定量すること
ができる。
用い、感度並びに精度良く、また迅速にそれぞれの活性
型ＭＭＰｓ量を分別して定量し得る方法を提供すること
にある。こうした方法に用いる試薬キットを提供するこ
とも本発明の目的の一つである。本発明者らは、活性型
ＭＭＰｓに結合し、その活性を抑制するインヒビター、
例えばＴＩＭＰｓ、α２−マクログロブリン、ペプチド
インヒビター及び合成化合物などのうち、ＴＩＭＰｓが
すべてのＭＭＰｓの活性型に特異的に結合することに着
目し、各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とＴＩＭＰｓと
の組合せにより簡便な遊離の活性型ＭＭＰｓの分別定量
法を提供できるのではないかと考えて、鋭意研究の結
果、各ＭＭＰに特異的に結合する抗体と、ＴＩＭＰｓあ
るいはＴＩＭＰｓと各ＴＩＭＰに特異的に結合する抗体
との複合物を組合せて使用する遊離の活性型ＭＭＰｓの
分別定量法を確立した。さらにＴＩＭＰｓを標識付与用
として用いる場合、ＴＩＭＰｓの活性型ＭＭＰｓに対す
る結合能を損することなく直接または間接的に標識物を
付与することに成功し、この標識物を付与したＴＩＭＰ
ｓと各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とを組合せること
により、簡便な遊離の活性型ＭＭＰｓの分別定量法を確
立した。特に直接標識物を付与したＴＩＭＰ−１と各Ｍ
ＭＰに特異的に結合する抗体とを組み合わせて用いる場
合、遊離の活性型ＭＭＰ−１、−２、−３、−７、−
８、−１０、−１１、−１２及び−１３並びにＭＴ−Ｍ
ＭＰを定量することができ、直接標識物を付与したＴＩ
ＭＰ−２と各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とを組み合
わせて用いる場合、遊離の活性型ＭＭＰ−１、−３、−
７、−８、−９、−１０、−１１、−１２及び−１３並
びにＭＴ−ＭＭＰを定量することができる。さらに固相
用にＴＩＭＰ−１あるいはＴＩＭＰ−２を用いる場合も
上記と同様各々の遊離の活性型ＭＭＰｓを定量すること
ができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】またさらに各ＭＭＰに特異的に結合する抗
体と各ＴＩＭＰとを組み合わせて用いる場合、標識物を
付与した抗ＴＩＭＰ抗体を用いて間接的に標識物を付与
した各ＴＩＭＰを用いることにより、すべての遊離の活
性型ＭＭＰｓ、すなわちＭＭＰ−１、−２、−３、−
７、−８、−９、−１０、−１１、−１２及び−１３並
びにＭＴ−ＭＭＰを定量することができる。本発明は、
ＴＩＭＰｓから成る群から選ばれたものと各ＭＭＰに対
するモノクローナル抗体から成る群から選ばれたものと
を組合わせて用い、その組合わせ成分の一方を直接ある
いは間接に検知可能な標識物を付与した成分とし、他の
組合わせ成分を固相化した成分として用い、被検試料中
の遊離の活性型ＭＭＰｓを分別定量する方法及びその方
法に用いる試薬を提供することにある。こうして典型的
には本発明の目的は、上記の標識物を付与したＴＩＭＰ
ｓ（各ＴＩＭＰに対する標識物を付与した各モノクロー
ナル抗体で間接的に標識物を付与したＴＩＭＰｓを含
む）あるいは各ＭＭＰに対するモノクローナル抗体及び
固相担体用として各ＭＭＰに対するモノクローナル抗体
あるいはＴＩＭＰｓを用い、被検試料中の遊離の活性型
ＭＭＰｓを分別定量する優れた方法及びその為の試薬キ
ットを提供することにある。本発明はこうした遊離の活
性型ＭＭＰｓを分別定量することのできる試薬キットの
うちの各試薬をすべてその実施態様のうちに含むと理解
される。さらに本発明の目的は、上記定量法を用いて遊
離の活性型ＭＭＰｓを分別定量することにより、組織破
壊や癌転移などの病態をモニターし得る方法並びに試薬
あるいは診断剤を提供することにある。したがって、医
学的生理学的分野における上記試薬の各種利用、組織破
壊や癌転移、組織の修復の程度の判断、あるいは細胞増
殖促進などの生理的作用の指標として上記試薬を使用す
ることはすべて本発明のその実施態様のうちに含むと理
解される。
体と各ＴＩＭＰとを組み合わせて用いる場合、標識物を
付与した抗ＴＩＭＰ抗体を用いて間接的に標識物を付与
した各ＴＩＭＰを用いることにより、すべての遊離の活
性型ＭＭＰｓ、すなわちＭＭＰ−１、−２、−３、−
７、−８、−９、−１０、−１１、−１２及び−１３並
びにＭＴ−ＭＭＰを定量することができる。本発明は、
ＴＩＭＰｓから成る群から選ばれたものと各ＭＭＰに対
するモノクローナル抗体から成る群から選ばれたものと
を組合わせて用い、その組合わせ成分の一方を直接ある
いは間接に検知可能な標識物を付与した成分とし、他の
組合わせ成分を固相化した成分として用い、被検試料中
の遊離の活性型ＭＭＰｓを分別定量する方法及びその方
法に用いる試薬を提供することにある。こうして典型的
には本発明の目的は、上記の標識物を付与したＴＩＭＰ
ｓ（各ＴＩＭＰに対する標識物を付与した各モノクロー
ナル抗体で間接的に標識物を付与したＴＩＭＰｓを含
む）あるいは各ＭＭＰに対するモノクローナル抗体及び
固相担体用として各ＭＭＰに対するモノクローナル抗体
あるいはＴＩＭＰｓを用い、被検試料中の遊離の活性型
ＭＭＰｓを分別定量する優れた方法及びその為の試薬キ
ットを提供することにある。本発明はこうした遊離の活
性型ＭＭＰｓを分別定量することのできる試薬キットの
うちの各試薬をすべてその実施態様のうちに含むと理解
される。さらに本発明の目的は、上記定量法を用いて遊
離の活性型ＭＭＰｓを分別定量することにより、組織破
壊や癌転移などの病態をモニターし得る方法並びに試薬
あるいは診断剤を提供することにある。したがって、医
学的生理学的分野における上記試薬の各種利用、組織破
壊や癌転移、組織の修復の程度の判断、あるいは細胞増
殖促進などの生理的作用の指標として上記試薬を使用す
ることはすべて本発明のその実施態様のうちに含むと理
解される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】１．免疫原性抗原の調製 抗原としては、例えばＫｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｏｌｌａｇｅｎＲｅｌ． Ｒｅｓ．，７，３４１−３５
０，１９８７及びＫｏｄａｍａ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２７，１０３−１０
８，１９９０に記載の方法により調製したＴＩＭＰ−
１、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９３に記載
の方法により調製したＴＩＭＰ−２、特開平５−１９９
８６８号に記載の方法に従い調製したリコンビナントＴ
ＩＭＰ−１（ｒＴＩＭＰ−１）、Ａｏｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ，２６，２
８１−２９０，１９９５に記載の方法に従い調製したリ
コンビナントＴＩＭＰ−２（ｒＴＩＭＰ−２）などを用
いることができる。ここでは、ＭＭＰｓ活性を阻害する
ＴＩＭＰｓであればどのＴＩＭＰｓでも使用できる。
ｏｌｌａｇｅｎＲｅｌ． Ｒｅｓ．，７，３４１−３５
０，１９８７及びＫｏｄａｍａ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２７，１０３−１０
８，１９９０に記載の方法により調製したＴＩＭＰ−
１、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９３に記載
の方法により調製したＴＩＭＰ−２、特開平５−１９９
８６８号に記載の方法に従い調製したリコンビナントＴ
ＩＭＰ−１（ｒＴＩＭＰ−１）、Ａｏｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ，２６，２
８１−２９０，１９９５に記載の方法に従い調製したリ
コンビナントＴＩＭＰ−２（ｒＴＩＭＰ−２）などを用
いることができる。ここでは、ＭＭＰｓ活性を阻害する
ＴＩＭＰｓであればどのＴＩＭＰｓでも使用できる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】また抗原としては、例えばＺｈａｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１９，
１−１４，１９９３に記載の方法に従い調製したＭＭＰ
−１、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ， ２２１，９１−１０３，１９９３
に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−２、Ｏｋａｄａｅ
ｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５４，７３１−
７４１，１９８８に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−
３、Ｋｎａｕｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ．，３７１，２９５−３
０４，１９９０に記載の方法により調製したＭＭＰ−
８、Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６７，２１７１２−２１７１９，１９９２に記
載の方法に従い調製したＭＭＰ−９、Ｐａｒｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１５８４
−１５９０，１９９１に記載の方法に従い調製したリコ
ンビナントＭＭＰ−１０、Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８４９−２５８５
５，１９９４に記載の方法に従い調製したリコンビナン
トＭＭＰ−１１、Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．，２６８，２３８２４−２３８２
９，１９９３に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−１２
及びリコンビナントＭＭＰ−１２、Ｆｒｅｉｊｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１６７
６６−１６７７３，１９９４に記載の方法に従い調製し
たリコンビナントＭＭＰ−１３、特願平６−３３１３０
５号に記載の方法に従い調製したＭＴ−ＭＭＰなどで、
それらの文献やそこで引用する文献に記載の方法に従い
調製したＭＭＰｓ、さらには遺伝子組み換え等によって
得られたＭＭＰｓなどを用いることができる。
ｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１９，
１−１４，１９９３に記載の方法に従い調製したＭＭＰ
−１、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ， ２２１，９１−１０３，１９９３
に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−２、Ｏｋａｄａｅ
ｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５４，７３１−
７４１，１９８８に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−
３、Ｋｎａｕｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ．，３７１，２９５−３
０４，１９９０に記載の方法により調製したＭＭＰ−
８、Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６７，２１７１２−２１７１９，１９９２に記
載の方法に従い調製したＭＭＰ−９、Ｐａｒｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１５８４
−１５９０，１９９１に記載の方法に従い調製したリコ
ンビナントＭＭＰ−１０、Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８４９−２５８５
５，１９９４に記載の方法に従い調製したリコンビナン
トＭＭＰ−１１、Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．，２６８，２３８２４−２３８２
９，１９９３に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−１２
及びリコンビナントＭＭＰ−１２、Ｆｒｅｉｊｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１６７
６６−１６７７３，１９９４に記載の方法に従い調製し
たリコンビナントＭＭＰ−１３、特願平６−３３１３０
５号に記載の方法に従い調製したＭＴ−ＭＭＰなどで、
それらの文献やそこで引用する文献に記載の方法に従い
調製したＭＭＰｓ、さらには遺伝子組み換え等によって
得られたＭＭＰｓなどを用いることができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】ここでは、潜在型や活性型のものが好まし
く使用できる。こうした抗原は、各種原料、例えば培養
細胞、培養組織など、形質転換体細胞などの抗原産生材
料から従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法
などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限
外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速
液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ること
ができる。好ましくは、ポリアクリルアミド電気泳動、
モノクローナル抗体などの抗原を特異的に認識する抗体
あるいはインヒビターを固定化したアフィニティー・ク
ロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理できる。特
に好ましくはゼラチン−アガロース・アフィニティー・
クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・クロマト
グラフィーなどが挙げられる。
く使用できる。こうした抗原は、各種原料、例えば培養
細胞、培養組織など、形質転換体細胞などの抗原産生材
料から従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法
などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限
外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速
液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ること
ができる。好ましくは、ポリアクリルアミド電気泳動、
モノクローナル抗体などの抗原を特異的に認識する抗体
あるいはインヒビターを固定化したアフィニティー・ク
ロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理できる。特
に好ましくはゼラチン−アガロース・アフィニティー・
クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・クロマト
グラフィーなどが挙げられる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細
胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、脾細胞
懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を
得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうし
て得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に従い得られ
たミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培
地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細
胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリ
コールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当
該分野で知られたものを用いることができ、この様なも
のとしては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ
Ｊａｐａｎ）などが挙げられる。好ましくは、例えば３
０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ
加えることができ、分子量が１，０００〜８，０００の
ポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分
子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコー
ルがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチ
レングリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるよ
うにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチル
スルホキシドなどを少量加え、融合を促進することもで
きる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ
細胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが
挙げられるが、より好ましくは４：１〜７：１とするこ
とができる。融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応処
理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心な
どにより細胞を分離した後選択用培地に移す。
胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、脾細胞
懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を
得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうし
て得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に従い得られ
たミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培
地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細
胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリ
コールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当
該分野で知られたものを用いることができ、この様なも
のとしては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ
Ｊａｐａｎ）などが挙げられる。好ましくは、例えば３
０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ
加えることができ、分子量が１，０００〜８，０００の
ポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分
子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコー
ルがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチ
レングリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるよ
うにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチル
スルホキシドなどを少量加え、融合を促進することもで
きる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ
細胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが
挙げられるが、より好ましくは４：１〜７：１とするこ
とができる。融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応処
理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心な
どにより細胞を分離した後選択用培地に移す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】こうして得られたモノクローナル抗体は、
市販のアイソタイプ特異的抗マウスＩｇ抗体、例えばア
イソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体などを用いて
その抗体構成鎖の重鎖及び軽鎖のタイプについて調べる
ことができる。モノクローナル抗体は、また特開平６−
３００７５７号及びＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ
（Ｊ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２１９，１−１４，
１９９３）記載の方法で調製されたもの、例えば該文献
記載のクローン７８−１２Ｇ８（微工研受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３１１５）からのモノクローナル抗体、特開
平６−２１３８８８号及びＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ
ａ（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏｅｔ ａｌ．，２２１，９１
−１０３，１９９３）記載の方法で調製されたもの、例
えば該文献記載のクローン７５−７Ｆ７（微工研受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３５）からのモノクローナル抗
体、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏ
ｔｏ ｅｔ ａｌ．，２３１，７９−８８，１９９４）
記載の方法で調製されたもの、例えば該文献記載のクロ
ーン７３−１８Ｂ３（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
３６９５）からのモノクローナル抗体などであることが
できる。この各ＭＭＰに対し特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体は、各ＭＭＰの潜在型及び活性型を認識する
ものが好ましいものとして挙げられる。
市販のアイソタイプ特異的抗マウスＩｇ抗体、例えばア
イソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体などを用いて
その抗体構成鎖の重鎖及び軽鎖のタイプについて調べる
ことができる。モノクローナル抗体は、また特開平６−
３００７５７号及びＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ
（Ｊ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２１９，１−１４，
１９９３）記載の方法で調製されたもの、例えば該文献
記載のクローン７８−１２Ｇ８（微工研受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３１１５）からのモノクローナル抗体、特開
平６−２１３８８８号及びＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ
ａ（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏｅｔ ａｌ．，２２１，９１
−１０３，１９９３）記載の方法で調製されたもの、例
えば該文献記載のクローン７５−７Ｆ７（微工研受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３５）からのモノクローナル抗
体、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏ
ｔｏ ｅｔ ａｌ．，２３１，７９−８８，１９９４）
記載の方法で調製されたもの、例えば該文献記載のクロ
ーン７３−１８Ｂ３（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
３６９５）からのモノクローナル抗体などであることが
できる。この各ＭＭＰに対し特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体は、各ＭＭＰの潜在型及び活性型を認識する
ものが好ましいものとして挙げられる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】さらに本発明では、各ＭＭＰに対し特異的
に結合するモノクローナル抗体と、ＴＩＭＰｓに特異的
に結合する抗体とＴＩＭＰｓとの複合体を用いて、検体
試料中の遊離の各活性型ＭＭＰを免疫学的に分別して定
量する方法も提供される。特にＴＩＭＰ−１を特異的に
認識するモノクローナル抗体あるいはＴＩＭＰ−２を特
異的に認識するモノクローナル抗体とＴＩＭＰｓとの複
合体を標識試薬として用い、各ＭＭＰに対し特異的に結
合するモノクローナル抗体を固相化試薬として用いて検
体試料中の遊離の各活性型ＭＭＰを免疫学的に分別して
定量する方法が好ましく提供される。糖が結合している
ＭＭＰｓは、糖鎖などにより分子量にバラツキを生じた
り、研究者により報告される測定分子量も異なる。した
がって本発明では実質的に遊離のＭＭＰの活性型を測定
するものであればとくにその分子量は限定されるもので
ない。ＭＭＰｓは、大きく分けてプロペプチド（ｐｒｏ
ｐｅｐｔｉｄｅ）、触媒活性ドメイン（ｃａｔａｌｙｔ
ｉｃ ｄｏｍａｉｎ）、ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅ
ｇｉｏｎ）及びペキシン様ドメイン（ｐｅｘｉｎ−ｌｉ
ｋｅ ｄｏｍａｉｎ）の４つの領域に分けられ、プロペ
プチド領域をアミノ末端領域、ペキシン様ドメイン領域
をカルボキシル末端領域とされ、その間の触媒活性ドメ
イン及びヒンジ領域を中央領域とされるのが一般的であ
る。
に結合するモノクローナル抗体と、ＴＩＭＰｓに特異的
に結合する抗体とＴＩＭＰｓとの複合体を用いて、検体
試料中の遊離の各活性型ＭＭＰを免疫学的に分別して定
量する方法も提供される。特にＴＩＭＰ−１を特異的に
認識するモノクローナル抗体あるいはＴＩＭＰ−２を特
異的に認識するモノクローナル抗体とＴＩＭＰｓとの複
合体を標識試薬として用い、各ＭＭＰに対し特異的に結
合するモノクローナル抗体を固相化試薬として用いて検
体試料中の遊離の各活性型ＭＭＰを免疫学的に分別して
定量する方法が好ましく提供される。糖が結合している
ＭＭＰｓは、糖鎖などにより分子量にバラツキを生じた
り、研究者により報告される測定分子量も異なる。した
がって本発明では実質的に遊離のＭＭＰの活性型を測定
するものであればとくにその分子量は限定されるもので
ない。ＭＭＰｓは、大きく分けてプロペプチド（ｐｒｏ
ｐｅｐｔｉｄｅ）、触媒活性ドメイン（ｃａｔａｌｙｔ
ｉｃ ｄｏｍａｉｎ）、ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅ
ｇｉｏｎ）及びペキシン様ドメイン（ｐｅｘｉｎ−ｌｉ
ｋｅ ｄｏｍａｉｎ）の４つの領域に分けられ、プロペ
プチド領域をアミノ末端領域、ペキシン様ドメイン領域
をカルボキシル末端領域とされ、その間の触媒活性ドメ
イン及びヒンジ領域を中央領域とされるのが一般的であ
る。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】またリコンビナントＴＩＭＰ−２（ｒＴＩ
ＭＰ−２）は、ヒトＧｉｎ−１細胞などから得られた全
ＲＮＡ画分よりオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムを用
いてポリＡ＋ｍＲＮＡ画分を分離し、これを鋳型、オリ
ゴｄＴ（１５〜１８個）をプライマーにしてｃＤＮＡを
逆転写酵素を用いて調製し、Ｂｏｏｎｅ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８７，２８００−２８０４，１９９０などで知られ
たＴＩＭＰ−２ｃＤＮＡの配列を参考に作成したプライ
マーＴ２Ｆ７；ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣ
ＣＧＣＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＣＴ及びプライマーＴ２Ｒ
５；ＴＴＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＧＡＴ
ＣＣＴＣＧＡＴＡＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣを用
いてＰＣＲ法によりＴＩＭＰ−２遺伝子を増幅し、得ら
れたＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＧなどのベクターに組
込み、ＣＨＯ細胞などで発現させて得ることができる。
ｒＴＩＭＰ−２は、Ａｏｋｉら（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ
Ｔｉｓｓｕｅ，２６，２８１−２９０，１９９５）の
方法に従い調製した。抗ＴＩＭＰ−２モノクローナル抗
体結合セファロース ４Ｂカラムのクロマトグラフィー
にかけて処理し、必要に応じ限外ろ過、ゲルろ過などで
処理し、精製ｒＴＩＭＰ−２を調製した。調製されたｒ
ＴＩＭＰ−２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％均一ゲル、
還元条件）で約２４ｋＤａの単一のバンドとして認めら
れ、胎盤から調製された天然型ＴＩＭＰ−２と同じ分子
量の位置に認められた。エピトープの異なる抗ヒトＴＩ
ＭＰ−２モノクローナル抗体（特開平５−２４４９８５
号公報）によるウエスタンブロッティングを行った結
果、約２４ｋＤａの位置に単一のバンドとして認められ
たものであった。ＣＣＤ−４１ＳＫ細胞由来ＭＭＰ−１
に対する阻害活性は、ＩＣ５０が約１．１×１０−９Ｍ
であった。またＮ末端及びＣ末端構造解析の結果、得ら
れたｒＴＩＭＰ−２は、天然型ＴＩＭＰ−２と同一の物
質であることが示唆された。ここでは、ＭＭＰｓ活性を
阻害するＴＩＭＰｓであればどのようなＴＩＭＰｓでも
使用できるが、人為的に作成したｒＴＩＭＰｓを使用し
た。
ＭＰ−２）は、ヒトＧｉｎ−１細胞などから得られた全
ＲＮＡ画分よりオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムを用
いてポリＡ＋ｍＲＮＡ画分を分離し、これを鋳型、オリ
ゴｄＴ（１５〜１８個）をプライマーにしてｃＤＮＡを
逆転写酵素を用いて調製し、Ｂｏｏｎｅ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８７，２８００−２８０４，１９９０などで知られ
たＴＩＭＰ−２ｃＤＮＡの配列を参考に作成したプライ
マーＴ２Ｆ７；ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣ
ＣＧＣＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＣＴ及びプライマーＴ２Ｒ
５；ＴＴＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＧＡＴ
ＣＣＴＣＧＡＴＡＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣを用
いてＰＣＲ法によりＴＩＭＰ−２遺伝子を増幅し、得ら
れたＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＧなどのベクターに組
込み、ＣＨＯ細胞などで発現させて得ることができる。
ｒＴＩＭＰ−２は、Ａｏｋｉら（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ
Ｔｉｓｓｕｅ，２６，２８１−２９０，１９９５）の
方法に従い調製した。抗ＴＩＭＰ−２モノクローナル抗
体結合セファロース ４Ｂカラムのクロマトグラフィー
にかけて処理し、必要に応じ限外ろ過、ゲルろ過などで
処理し、精製ｒＴＩＭＰ−２を調製した。調製されたｒ
ＴＩＭＰ−２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％均一ゲル、
還元条件）で約２４ｋＤａの単一のバンドとして認めら
れ、胎盤から調製された天然型ＴＩＭＰ−２と同じ分子
量の位置に認められた。エピトープの異なる抗ヒトＴＩ
ＭＰ−２モノクローナル抗体（特開平５−２４４９８５
号公報）によるウエスタンブロッティングを行った結
果、約２４ｋＤａの位置に単一のバンドとして認められ
たものであった。ＣＣＤ−４１ＳＫ細胞由来ＭＭＰ−１
に対する阻害活性は、ＩＣ５０が約１．１×１０−９Ｍ
であった。またＮ末端及びＣ末端構造解析の結果、得ら
れたｒＴＩＭＰ−２は、天然型ＴＩＭＰ−２と同一の物
質であることが示唆された。ここでは、ＭＭＰｓ活性を
阻害するＴＩＭＰｓであればどのようなＴＩＭＰｓでも
使用できるが、人為的に作成したｒＴＩＭＰｓを使用し
た。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】こうしてＴＩＭＰ−２のカルボキシル末端
領域のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を特開
平５−２４４９８５号の記載に従い調製し、得られた抗
体のうち、特異性が高く且つ親和性の強いマウス抗ＴＩ
ＭＰ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ１１、微工研受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６９０）を選択し、それを用
い前記（ａ）項記載にしたがってＨＲＰを標識した。こ
のＩｇＧ−ＨＲＰ（１００μｇ）溶液にｒＴＩＭＰ−２
２０μｇを加え、１０℃、３時間静置反応させた。こ
の混合液にさらに最終濃度４％となるようにホルムアル
デヒドを加え（固定反応）、室温で２時間反応させた。
使用した抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ
１１）はＴＩＭＰ−２のカルボキシル末端領域を認識す
る抗体で、潜在型ＭＭＰ−２によりＴＩＭＰ−２−抗Ｔ
ＩＭＰ−２ ＩｇＧの結合が解離されることがわかって
いる（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９
３）。
領域のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を特開
平５−２４４９８５号の記載に従い調製し、得られた抗
体のうち、特異性が高く且つ親和性の強いマウス抗ＴＩ
ＭＰ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ１１、微工研受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６９０）を選択し、それを用
い前記（ａ）項記載にしたがってＨＲＰを標識した。こ
のＩｇＧ−ＨＲＰ（１００μｇ）溶液にｒＴＩＭＰ−２
２０μｇを加え、１０℃、３時間静置反応させた。こ
の混合液にさらに最終濃度４％となるようにホルムアル
デヒドを加え（固定反応）、室温で２時間反応させた。
使用した抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ
１１）はＴＩＭＰ−２のカルボキシル末端領域を認識す
る抗体で、潜在型ＭＭＰ−２によりＴＩＭＰ−２−抗Ｔ
ＩＭＰ−２ ＩｇＧの結合が解離されることがわかって
いる（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９
３）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４７】抗ヒトＭＭＰ−９モノクローナル抗体は、
ヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０細胞）を培養し、必
要に応じｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ
−αで細胞剌激して得られた細胞培養上清から、限外ろ
過、ゼラチンアガロースカラム、抗ＴＩＭＰ−１モノク
ローナル抗体結合セファロース４Ｂ、抗フィブロネクチ
ン抗体結合セファロース４Ｂなどによりクロマトグラフ
ィーにかけ精製して得られたヒトプロＭＭＰ−９を免疫
原としてマウスを免疫し、免疫マウスからの脾細胞を用
い細胞融合法で作成されるハイブリドーマクローンから
得られる。得られた抗ヒトＭＭＰ−９モノクローナル抗
体のうち、少なくとも活性型ＭＭＰ−９を認識する抗体
を使用することができる。抗ヒトＭＭＰ−９モノクロー
ナル抗体は、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２３１，７９−８８，１９９
４に記載のモノクローナル抗体のうち、親和性の強いク
ローン７３−１８Ｂ３（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１３６９５）からの抗体を用いることにした。この抗体
は、ＭＭＰ−９の中央領域を認識し、潜在型及び活性型
ＭＭＰ−９を認識する抗体である。同様にしてＭＭＰ−
３、−８、−１０、−１１、−１２及び−１３並びにＭ
Ｔ−ＭＭＰに対するそれぞれのモノクローナル抗体を調
製し、適切なクローンを選択して使用できる。
ヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０細胞）を培養し、必
要に応じｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ
−αで細胞剌激して得られた細胞培養上清から、限外ろ
過、ゼラチンアガロースカラム、抗ＴＩＭＰ−１モノク
ローナル抗体結合セファロース４Ｂ、抗フィブロネクチ
ン抗体結合セファロース４Ｂなどによりクロマトグラフ
ィーにかけ精製して得られたヒトプロＭＭＰ−９を免疫
原としてマウスを免疫し、免疫マウスからの脾細胞を用
い細胞融合法で作成されるハイブリドーマクローンから
得られる。得られた抗ヒトＭＭＰ−９モノクローナル抗
体のうち、少なくとも活性型ＭＭＰ−９を認識する抗体
を使用することができる。抗ヒトＭＭＰ−９モノクロー
ナル抗体は、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２３１，７９−８８，１９９
４に記載のモノクローナル抗体のうち、親和性の強いク
ローン７３−１８Ｂ３（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１３６９５）からの抗体を用いることにした。この抗体
は、ＭＭＰ−９の中央領域を認識し、潜在型及び活性型
ＭＭＰ−９を認識する抗体である。同様にしてＭＭＰ−
３、−８、−１０、−１１、−１２及び−１３並びにＭ
Ｔ−ＭＭＰに対するそれぞれのモノクローナル抗体を調
製し、適切なクローンを選択して使用できる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５０】活性型ＭＭＰ−９は、ヒト線維肉腫細胞Ｈ
Ｔ１０８０培養上清から精製した潜在型ＭＭＰ−９を緩
衝液Ａに溶解し、１ｍＭ ＡＰＭＡで３７℃、２４時間
インキュベーションすることにより得た（Ｙ．Ｏｋａｄ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
７，２１７１２−２１７１９，１９９３）。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上潜在型ＭＭＰ−９が活性型ＭＭＰ−９に活性化
されたことを確認した。ＭＭＰ−３（Ｙ．Ｏｋａｄａ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５４，７３１
−７４１，１９８８）、ＭＭＰ−８（Ｖ．Ｋｎａｕｐｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−
Ｓｅｙｌｅｒ．，３７１，２９５−３０４，１９９
０）、ＭＭＰ−１０（Ａ．Ｊ．Ｐａｒｋ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１５８４−
１５９０，１９９１）、ＭＭＰ−１１ （Ｄ．Ｐｅｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２
５８４９−２５８５５，１９９４）、ＭＭＰ−１２
（Ｓ．Ｄ．Ｓｈａｐ１ｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２３８２４−２３８２９，１
９９３）、ＭＭＰ−１３（Ｊ．Ｍ．Ｐ．Ｆｒｅｉｊｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１
６７６６−１６７７３，１９９４）、ＭＴ−ＭＭＰ（特
願平６−３３１３０５号）についても各活性型ＭＭＰを
調製して、同様にして使用できる。
Ｔ１０８０培養上清から精製した潜在型ＭＭＰ−９を緩
衝液Ａに溶解し、１ｍＭ ＡＰＭＡで３７℃、２４時間
インキュベーションすることにより得た（Ｙ．Ｏｋａｄ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
７，２１７１２−２１７１９，１９９３）。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上潜在型ＭＭＰ−９が活性型ＭＭＰ−９に活性化
されたことを確認した。ＭＭＰ−３（Ｙ．Ｏｋａｄａ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５４，７３１
−７４１，１９８８）、ＭＭＰ−８（Ｖ．Ｋｎａｕｐｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−
Ｓｅｙｌｅｒ．，３７１，２９５−３０４，１９９
０）、ＭＭＰ−１０（Ａ．Ｊ．Ｐａｒｋ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１５８４−
１５９０，１９９１）、ＭＭＰ−１１ （Ｄ．Ｐｅｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２
５８４９−２５８５５，１９９４）、ＭＭＰ−１２
（Ｓ．Ｄ．Ｓｈａｐ１ｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２３８２４−２３８２９，１
９９３）、ＭＭＰ−１３（Ｊ．Ｍ．Ｐ．Ｆｒｅｉｊｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１
６７６６−１６７７３，１９９４）、ＭＴ−ＭＭＰ（特
願平６−３３１３０５号）についても各活性型ＭＭＰを
調製して、同様にして使用できる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５５】３）活性型ＭＭＰ−９の定量法 実施例４に記載した活性型ＭＭＰ−９を標準とし、既知
濃度の活性型ＭＭＰ−９あるいは遊離の活性型ＭＭＰ−
９を含む検体を９６穴ビニルプレートに各々２０μｌ加
えた。次に実施例２（ｂ）項で調製したｒＴＩＭＰ−２
−ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体を１８μｇ／ｍｌとなるように
緩衝液Ｂで希釈し、上記ビニルプレートに各々１００μ
ｌずつ加え混合した。この混合液を前記（ａ）項で調製
したマウス抗ヒトＭＭＰ−９抗体（クローンＮｏ．７３
−１８Ｂ３）結合プレート１００μｌに加え、以下の操
作は上記１）と同様に行った。検量線を図３に示した。
この測定系の感度は標準０ｎｇ／ｍｌ値＋２Ｓ．Ｄ．か
ら５ｎｇ／ｍｌ （８４ｐｇ／アッセイ）であり、直線
性は１０〜３２０ｎｇ／ｍｌ （０．１７〜５．３ｎｇ
／アッセイ）の範囲で認められた。同様にしてＭＭＰ−
３、−７、−８、−１０、−１１、−１２及び−１３並
びにＭＴ−ＭＭＰについてもそれぞれの活性型ＭＭＰを
分別定量する。
濃度の活性型ＭＭＰ−９あるいは遊離の活性型ＭＭＰ−
９を含む検体を９６穴ビニルプレートに各々２０μｌ加
えた。次に実施例２（ｂ）項で調製したｒＴＩＭＰ−２
−ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体を１８μｇ／ｍｌとなるように
緩衝液Ｂで希釈し、上記ビニルプレートに各々１００μ
ｌずつ加え混合した。この混合液を前記（ａ）項で調製
したマウス抗ヒトＭＭＰ−９抗体（クローンＮｏ．７３
−１８Ｂ３）結合プレート１００μｌに加え、以下の操
作は上記１）と同様に行った。検量線を図３に示した。
この測定系の感度は標準０ｎｇ／ｍｌ値＋２Ｓ．Ｄ．か
ら５ｎｇ／ｍｌ （８４ｐｇ／アッセイ）であり、直線
性は１０〜３２０ｎｇ／ｍｌ （０．１７〜５．３ｎｇ
／アッセイ）の範囲で認められた。同様にしてＭＭＰ−
３、−７、−８、−１０、−１１、−１２及び−１３並
びにＭＴ−ＭＭＰについてもそれぞれの活性型ＭＭＰを
分別定量する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５６】実施例６ ヒト関節液中及びヒト血清中活
性型ＭＭＰｓの定量 検体として組織破壊の進行している慢性関節リウマチ
（ＲＡ）及びコントロールとしての変形性関節症（Ｏ
Ａ）患者の関節液、及びヒト血清を用い、ＲＡ患者血清
でレベルの上昇が認められているＭＭＰ−２（Ｎ．Ｆｕ
ｊｉｍｏｔｏ ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃ
ｔａ，２２１，９１−１０３，１９９３）を実施例５
（ｂ）項２）に記載の方法でｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ及
び抗ＭＭＰ−２抗体を用いて遊離の活性型ＭＭＰ−２を
測定した。ＯＡ患者関節液及びヒト血清中の遊離の活性
型ＭＭＰ−２濃度は、すべてこの定量法の感度以下であ
った。一方、組織破壊の進行しているＲＡ患者関節液中
の遊離の活性型ＭＭＰ−２濃度は、一部感度以下であっ
たが、ＯＡ患者関節液及びヒト血清中の遊離の活性型Ｍ
ＭＰ−２濃度よりも著しく高かった（図４）。ＯＡ患者
関節液及びヒト血清中で活性型ＭＭＰ−２は検出されな
かったが、これら検体中には遊離状態のＴＩＭＰｓが存
在することが知られており、遊離状態の活性型ＭＭＰｓ
が存在しないことと一致する。例として活性型ＭＭＰ−
２定量法の臨床応用例を示したが、その他にも組織破
壊、炎症あるいは癌転移などの疾患をもつ患者からの細
胞、組織ホモジネート、関節液、血液あるいは尿などに
おいて、本定量法により遊離状態の活性型ＭＭＰｓの分
別定量が可能となる。
性型ＭＭＰｓの定量 検体として組織破壊の進行している慢性関節リウマチ
（ＲＡ）及びコントロールとしての変形性関節症（Ｏ
Ａ）患者の関節液、及びヒト血清を用い、ＲＡ患者血清
でレベルの上昇が認められているＭＭＰ−２（Ｎ．Ｆｕ
ｊｉｍｏｔｏ ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃ
ｔａ，２２１，９１−１０３，１９９３）を実施例５
（ｂ）項２）に記載の方法でｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ及
び抗ＭＭＰ−２抗体を用いて遊離の活性型ＭＭＰ−２を
測定した。ＯＡ患者関節液及びヒト血清中の遊離の活性
型ＭＭＰ−２濃度は、すべてこの定量法の感度以下であ
った。一方、組織破壊の進行しているＲＡ患者関節液中
の遊離の活性型ＭＭＰ−２濃度は、一部感度以下であっ
たが、ＯＡ患者関節液及びヒト血清中の遊離の活性型Ｍ
ＭＰ−２濃度よりも著しく高かった（図４）。ＯＡ患者
関節液及びヒト血清中で活性型ＭＭＰ−２は検出されな
かったが、これら検体中には遊離状態のＴＩＭＰｓが存
在することが知られており、遊離状態の活性型ＭＭＰｓ
が存在しないことと一致する。例として活性型ＭＭＰ−
２定量法の臨床応用例を示したが、その他にも組織破
壊、炎症あるいは癌転移などの疾患をもつ患者からの細
胞、組織ホモジネート、関節液、血液あるいは尿などに
おいて、本定量法により遊離状態の活性型ＭＭＰｓの分
別定量が可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 東海 秀明 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内 (72)発明者 品川 朗 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内 (72)発明者 吉田 真一 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内 (72)発明者 岩田 和士 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内
Claims (19)
- 【請求項１】 マトリックスメタロプロテアーゼに対し
特異的に結合するモノクローナル抗体及びマトリックス
メタロプロテアーゼのインヒビターを組み合わせて用い
ることを特徴とする遊離の活性型マトリックスメタロプ
ロテアーゼ類の分別定量法。 - 【請求項２】 固相担体結合用としてマトリックスメタ
ロプロテアーゼに対し特異的に結合するモノクローナル
抗体あるいはマトリックスメタロプロテアーゼのインヒ
ビターを、標識物付与用として各々マトリックスメタロ
プロテアーゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗
体あるいはマトリックスメタロプロテアーゼのインヒビ
ターを用い且つ、固相担体結合物及び標識物付与物のい
ずれか一方がマトリックスメタロプロテアーゼに対し特
異的に結合するモノクローナル抗体で、他方がマトリッ
クスメタロプロテアーゼのインヒビターであり、それら
をそれぞれ組み合わせて用いることを特徴とする請求項
１記載の定量法。 - 【請求項３】 マトリックスメタロプロテアーゼのイン
ヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタロ
プロテアーゼ−１あるいはティシュ インヒビター オ
ブ メタロプロテアーゼ−２を用いることを特徴とする
請求項１又は２記載の定量法。 - 【請求項４】 マトリックスメタロプロテアーゼに対し
特異的に結合するモノクローナル抗体として各々マトリ
ックスメタロプロテアーゼ分子中の少なくとも中央領域
またはカルボキシル末端領域を認識する抗体を用いるこ
とを特徴とする請求項１又は２記載の定量法。 - 【請求項５】 モノクローナル抗体、ティシュ インヒ
ビター オブ メタロプロテアーゼ−１及びティシュ
インヒビター オブ メタロプロテアーゼ−２から成る
群から選ばれたものに標識物を直接付与したものを用い
て検知可能な標識とすることを特徴とした請求項２〜４
記載のいずれか一記載の定量法。 - 【請求項６】 標識物を付与したマトリックスメタロプ
ロテアーゼのインヒビターに特異的に結合する抗体を用
いてマトリックスメタロプロテアーゼのインヒビターを
標識することを標識手段として含むことを特徴とする請
求項２〜４のいずれか一記載の定量法。 - 【請求項７】 標識物を付与したマトリックスメタロプ
ロテアーゼのインヒビターに特異的に結合する抗体を用
いてマトリックスメタロプロテアーゼのインヒビターを
標識した後、架橋剤を用い免疫複合体が解離しないよう
に固定操作を行うことを特徴とする請求項６記載の定量
法。 - 【請求項８】 架橋剤としてホルムアルデヒドを用いる
ことを特徴とする請求項７記載の定量法。 - 【請求項９】 マトリックスメタロプロテアーゼのイン
ヒビターに特異的に結合するモノクローナル抗体とし
て、そのインヒビターの少なくともカルボキシル末端領
域を認識するモノクローナル抗体を用いることを特徴と
する請求項６〜８記載のいずれか一記載の定量法。 - 【請求項１０】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ
ンヒビターに特異的に結合する抗体として、ティシュ
インヒビター オブ メタロプロテアーゼ−１あるいは
ティシュ インヒビター オブ メタロプロテアーゼ−
２に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする請
求項６〜９記載のいずれか一記載の定量法。 - 【請求項１１】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ
ンヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタ
ロプロテアーゼ−１を、各マトリックスメタロプロテア
ーゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体として
各マトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域また
はカルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊離の
活性型マトリックスメタロプロテアーゼを測定すること
を特徴とする請求項１、請求項２及び請求項５〜１０記
載のいずれか一記載の定量法。 - 【請求項１２】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ
ンヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタ
ロプロテアーゼ−１を、各マトリックスメタロプロテア
ーゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体として
各マトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域また
はカルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊離の
活性型マトリックスメタロプロテアーゼ−１、−２、−
３、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１
３及び−１４から成る群から選ばれたものを測定するこ
とを特徴とする請求項１１記載の定量法。 - 【請求項１３】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ
ンヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタ
ロプロテアーゼ−１を、各マトリックスメタロプロテア
ーゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体として
各ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域
またはカルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊
離のヒト活性型マトリックスメタロプロテアーゼ−１、
−２、−３、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１
２、−１３及び−１４から成る群から選ばれたものを測
定することを特徴とする請求項１１又は１２記載の定量
法。 - 【請求項１４】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ
ンヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタ
ロプロテアーゼ−２を、各マトリックスメタロプロテア
ーゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体として
各マトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域また
はカルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊離の
活性型マトリックスメタロプロテアーゼを測定すること
を特徴とする請求項１、請求項２及び請求項５〜１０記
載のいずれか一記載の定量法。 - 【請求項１５】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ
ンヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタ
ロプロテアーゼ−２を、各マトリックスメタロプロテア
ーゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体として
各マトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域また
はカルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊離の
活性型マトリックスメタロプロテアーゼ−１、−２、−
３、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１
３及び−１４から成る群から選ばれたものを測定するこ
とを特徴とする請求項１４記載の定量法。 - 【請求項１６】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ
ンヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタ
ロプロテアーゼ−２を、各マトリックスメタロプロテア
ーゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体として
各ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域
またはカルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊
離のヒト活性型マトリックスメタロプロテアーゼ−１、
−２、−３、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１
２、−１３及び−１４から成る群から選ばれたものを測
定することを特徴とする請求項１４又は１５記載の定量
法。 - 【請求項１７】 マトリックスメタロプロテアーゼに対
し特異的に結合するモノクローナル抗体とマトリックス
メタロプロテアーゼのインヒビターとを用いることを特
徴とする遊離の活性型マトリックスメタロプロテアーゼ
類の分別定量用試薬。 - 【請求項１８】 試薬が、検知可能な標識の付されたマ
トリックスメタロプロテアーゼのインヒビターを含むこ
とを特徴とする請求項１７記載の試薬。 - 【請求項１９】 試薬が、マトリックスメタロプロテア
ーゼのインヒビターに対し特異的に結合し且つ検知可能
な標識を持つモノクローナル抗体とマトリックスメタロ
プロテアーゼのインヒビターとを結合したものを含むこ
とを特徴とする請求項１７記載の試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7053794A JP2864219B2 (ja) | 1995-02-20 | 1995-02-20 | 遊離の活性型マトリックスメタロプロテアーゼ類の分別定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7053794A JP2864219B2 (ja) | 1995-02-20 | 1995-02-20 | 遊離の活性型マトリックスメタロプロテアーゼ類の分別定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08226918A true JPH08226918A (ja) | 1996-09-03 |
| JP2864219B2 JP2864219B2 (ja) | 1999-03-03 |
Family
ID=12952732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7053794A Expired - Fee Related JP2864219B2 (ja) | 1995-02-20 | 1995-02-20 | 遊離の活性型マトリックスメタロプロテアーゼ類の分別定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2864219B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002041000A1 (fr) * | 2000-11-20 | 2002-05-23 | Daiichi Fine Chemical Co., Ltd. | Immunoessai pour metalloprotease a matrice liee a la membrane |
| JP2002541481A (ja) * | 1999-04-09 | 2002-12-03 | リグズホスピタレット | 癌マーカーとしての１型マトリクスメタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ｔｉｍｐ−１） |
| US6756197B1 (en) * | 1999-03-25 | 2004-06-29 | Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin | Collagenase 3 as a prognostic marker for rheumatoid arthritis |
| US7041787B2 (en) | 2000-12-29 | 2006-05-09 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Design and use of advanced zinc chelating peptides to regulate matrix metalloproteinases |
| CN114252609A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-29 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒及其检测方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2016068226A1 (ja) * | 2014-10-30 | 2017-09-14 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 関節リウマチマーカー |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04183397A (ja) * | 1990-11-16 | 1992-06-30 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト７２ｋＤａゼラチナーゼに対するモノクローナル抗体およびその利用 |
| JPH04504418A (ja) * | 1989-03-21 | 1992-08-06 | アメリカ合衆国 | マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤ペプチド |
| JPH0534353A (ja) * | 1991-07-26 | 1993-02-09 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト９２ｋＤａゼラチナーゼの免疫学的定量法 |
| JPH05244985A (ja) * | 1992-01-17 | 1993-09-24 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | 抗ヒトｔｉｍｐ−２モノクローナル抗体の製法およびその利用 |
| JPH06213888A (ja) * | 1992-12-24 | 1994-08-05 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼの免疫学的定量法 |
| JPH06300757A (ja) * | 1993-04-12 | 1994-10-28 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト間質型コラゲナーゼと阻害剤との複合体の免疫学的定量法および臨床診断への応用 |
-
1995
- 1995-02-20 JP JP7053794A patent/JP2864219B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04504418A (ja) * | 1989-03-21 | 1992-08-06 | アメリカ合衆国 | マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤ペプチド |
| JPH04183397A (ja) * | 1990-11-16 | 1992-06-30 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト７２ｋＤａゼラチナーゼに対するモノクローナル抗体およびその利用 |
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| JPH05244985A (ja) * | 1992-01-17 | 1993-09-24 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | 抗ヒトｔｉｍｐ−２モノクローナル抗体の製法およびその利用 |
| JPH06213888A (ja) * | 1992-12-24 | 1994-08-05 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼの免疫学的定量法 |
| JPH06300757A (ja) * | 1993-04-12 | 1994-10-28 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト間質型コラゲナーゼと阻害剤との複合体の免疫学的定量法および臨床診断への応用 |
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| US7807379B2 (en) | 1999-04-09 | 2010-10-05 | Rigshospitalet | Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases type-1 (TIMP-1) as a cancer marker |
| WO2002041000A1 (fr) * | 2000-11-20 | 2002-05-23 | Daiichi Fine Chemical Co., Ltd. | Immunoessai pour metalloprotease a matrice liee a la membrane |
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| CN114252609A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-29 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒及其检测方法 |
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