CN114252609A - 一种基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及试剂盒技术领域，尤其涉及一种基质金属蛋白酶‑9的检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒的组分包括：磁珠微球试剂M和酶标试剂R，所述磁珠微球试剂M包括包被有第一基质金属蛋白酶‑9单克隆抗体的磁珠微球，所述酶标试剂R包括标记有第二基质金属蛋白酶‑9单克隆抗体的酶液。包被有基质金属蛋白酶‑9单克隆抗体的磁珠微球试剂M与标记有基质金属蛋白酶‑9单克隆抗体的酶标试剂R反应，使试剂盒的检测线性范围宽，为20pg/mL～40000pg/mL，精密度好，达到重复性≤5％，日间精密度≤8％，且稳定性好。
Description
技术领域
本申请涉及试剂盒技术领域，尤其涉及一种基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
基质金属蛋白酶(MMPs)是一类活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶，其主要的生理作用是降解细胞外基质。现已发现26种MMPs(MMP-1～26)，称为MMP家族，MMPs几乎能降解细胞外基质的所有成分，如胶原、明胶、黏性蛋白、纤维黏连蛋白、蛋白多糖等，参与人体许多生理和病理过程。在MMPs中MMP-9属于基质金属蛋白酶超家族成员中明胶酶的一种，是人体内最重要的蛋白酶之一。
MMP-9的蛋白组成从N端到C端主要包括信号肽序列、前肽序列、催化域(包含锌离子结合位点)、纤维粘连蛋白样功能域(可结合明胶)和V型胶原样功能域(提供多种低聚糖结合位点)。V型胶原样功能域为MMP-9所特有，借此与MMP-2(即明胶酶A)相区别，而前肽序列在MMP-9的酶原活化中有重要作用。MMP-9是降解IV型胶原的最主要成员之一，其底物包括变性的I型胶原(凝胶)、天然IV、V、VII、X和XI型胶原、纤维蛋白原、层粘连蛋白及多功能蛋白聚糖等。
目前，市场上对基质金属蛋白酶-9的定量分析方法有：酶联免疫吸附法和乳胶凝集法。这两种方法存在检测时间长、线性范围窄、精密度差的缺点。市场上亟需一种更优的方法进行基质金属蛋白酶-9的检测。
发明内容
本申请提供了基质金属蛋白酶9的检测试剂盒及其检测方法，以解决现有基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒的检测线性范围窄的技术问题。
第一方面，本申请提供了一种基质金属蛋白酶9的检测试剂盒，所述试剂盒的组分包括：磁珠微球试剂M和酶标试剂R，所述磁珠微球试剂M包括包被有第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的磁珠微球，所述酶标试剂R的组分包括标记有第二基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的酶液。
可选的，所述磁珠微球试剂M的制备方法包括：
将初始磁珠微球用磁珠微球活化缓冲液进行清洗并重悬后，进行第一活化，得到活化磁珠微球溶液；
将所述活化磁珠微球溶液的上清液去除，并加入磁珠微球包被缓冲液，以使所述活化磁珠微球溶液稳定，得到包被磁珠微球液；
将所述第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体和磁珠微球包被缓冲液混合，以稳定和保护抗体，得到基质金属蛋白酶-9抗体混合液；
将所述基质金属蛋白酶单克隆抗体混合液与所述包被磁珠微球液混匀，得到基质金属蛋白酶单克隆抗体微球液；将所述基质金属蛋白酶单克隆抗体微球液进行第一封闭后，进行第一保存，得到磁珠试剂M。
可选的，所述混匀的温度为25～30℃，所述混匀的时间为24h。
可选的，所述酶标试剂R的制备方法包括：
将第一酶进行第二活化，并加入交联剂，得到活化酶液；
将所述活化酶液用酶标记缓冲液缓冲进行透析，得到透析酶液；
将所述透析酶液与所述第二基质金属蛋白酶-9单克隆抗体混合，以实现酶-抗体标记，后进行第二封闭、纯化和第二保存，得到酶标试剂R。
可选的，所述第一酶包括碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
可选的，所述第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体包括鼠抗人单克隆抗体、兔抗人单克隆抗体和羊多抗人单克隆抗体中任意一种。
可选的，所述初始磁珠微球包括羧基磁珠微球、氨基磁珠微球、甲苯磺酸基磁珠微球和羟基磁珠微球中至少一种。
可选的，所述磁珠微球的粒径为0.6～5.0μm。
可选的，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品含有基质金属蛋白酶-9。
第二方面，本申请提供了第一方面所述的基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒的检测方法，所述方法包括以下步骤：
将待测样本、磁珠微球试剂M和酶标试剂R混合，孵育并去除杂质，得到混合溶液；
将所述混合溶液用仪器进行检测，得到所述待测样本中基质金属蛋白酶-9的浓度。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的试剂盒，基于磁微粒化学发光免疫分析法，用试剂盒中磁珠微球试剂M和酶标试剂R检测待测样本，磁珠微球试剂M中包被有基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的磁珠微球、酶标试剂R中标记有基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的酶液和待测样本中的抗原反应，抗原即基质金属蛋白酶-9，抗原抗体发生特异性结合，因酶的作用产生光信号，通过仪器增强终反应信号，产生光信号在103-108之间，相比其他检测平台，大大提高了检测试剂的线性范围，从而提高了敏感性和精密度，使试剂盒的检测线性范围宽，为20pg/mL～40000pg/mL。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的一种磁珠微球试剂M的制备方法的流程示意图；
图2为本申请实施例提供的一种酶标试剂R的制备方法的流程示意图；
图3为本申请对比例的线性范围图；
图4为本申请实施例1的线性范围图；
图5为本申请实施例2的线性范围图；
图6为本申请实施例3的线性范围图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
第一方面，本申请提供了一种基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒，所述试剂盒的组分包括：磁珠微球试剂M和酶标试剂R，所述磁珠微球试剂M包括包被有第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的磁珠微球，所述酶标试剂R的组分包括标记有第二基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的酶液。
在本申请一个实施例中，用试剂盒中磁珠微球试剂M和酶标试剂R混合，其中，包被有基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的磁珠微球、标记有基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的酶标试剂R和待测样本混合发生反应，使试剂盒的准确度高，偏差不超过±10％，同时热稳定性好，可以达到37℃热破7天、42℃运输3天，偏差在-10％～10％之间。
本申请实施例中，第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体和第二基质金属蛋白酶-9单克隆抗体具有不同的抗原识别位点，如具有相同的抗原识别位点，去识别同一个位点，会形成竞争关系，导致检测效率低下，检测结果不准确。
本申请实施例的方法，线性范围宽在于化学发光的反应阶段和检测阶段。反应阶段：标记有抗体的磁珠试剂和标记有抗体的酶与样本(含抗原)混合，发生特异性结合，可以经过磁分离除去游离的未结合的抗原抗体。检测阶段：反应阶段结束后，加入底物和酶结合发出光信号，光信号经过仪器的光电倍增管信号放大，然后检测光信号值，由标准曲线反算出待测物浓度。产生光信号在103-108之间，相比其他检测平台，大大提高了检测试剂的线性范围。
在一些实施方式中，所述磁珠微球试剂M的制备方法，如图1所示，所述方法包括以下步骤：
S11.将初始磁珠微球用磁珠微球活化缓冲液进行清洗并重悬，后进行第一活化，得到活化磁珠微球溶液；
S12.将所述活化磁珠微球溶液的上清液去除，并加入磁珠微球包被缓冲液，以使所述活化磁珠微球溶液稳定，得到包被磁珠微球液；
S13.将所述第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体和磁珠微球包被缓冲液混合，以稳定和保护抗体，得到基质金属蛋白酶-9抗体混合液；
S14.将所述基质金属蛋白酶单克隆抗体混合液与所述包被磁珠微球液混匀，得到基质金属蛋白酶单克隆抗体微球液；将所述基质金属蛋白酶单克隆抗体微球液进行第封闭，后进行第一保存，得到磁珠试剂M。
在一些实施方式中，所述混匀的温度为25～30℃，所述混匀的时间为2-4h。
本申请实施例中，控制混匀的温度为25～30℃的积极效果是反应的效率能够达到最高。高于30℃会对生物性原料(比如抗体、酶)造成不可逆的破坏，从而破坏原料，低于25℃反应效率会降低，降低了效率。
在一些实施方式中，所述酶标试剂R的制备方法，如图2所示，包括以下步骤：
S21.将第一酶进行第二活化，并加入交联剂，得到活化酶液；
S22.将所述活化酶液用酶标记缓冲液缓冲后进行透析，得到透析酶液；
S23.将所述透析酶液与所述第二基质金属蛋白酶-9单克隆抗体混合，以实现酶-抗体标记，后进行第二封闭、纯化和第二保存，得到酶标试剂R。
具体地，交联剂可以为戊二醛浓度，优选的质量浓度为0.5％～2％，交联剂还可以为高碘酸钠、N，N′-(1，4-亚苯基)双马来酰亚胺、N-γ-马来酰亚胺基丁酰-氧琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯等其中的一种。
具体地，透析的方法包括用透析袋进行透析，(透析袋的孔径为100KDa)透析的条件包括，4℃透析24小时，每隔8小时换液1次。
在一些实施方式中，所述酶标试剂R包括碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
在一些实施方式中，所述第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体包括鼠抗人单克隆抗体、兔抗人单克隆抗体和羊多抗人单克隆抗体中任意一种。
本申请实施例中，鼠抗人单克隆抗体、兔抗人单克隆抗体和羊多抗人单克隆抗体均可以达到检测的效果。，所述第二基质金属蛋白酶-9单克隆抗体包括鼠抗人单克隆抗体、兔抗人单克隆抗体和羊多抗人单克隆抗体中任意一种。
在一些实施方式中，所述初始磁珠微球包括羧基磁珠微球、氨基磁珠微球、甲苯磺酸基磁珠微球和羟基磁珠微球中至少一种。
本申请实施例中，羧基磁珠微球、氨基磁珠微球、甲苯磺酸基磁珠微球和羟基磁珠微球均可以达到检测的效果。
在一些实施方式中，所述磁珠微球的粒径为0.6～5.0μm。
本申请实施例中，控制磁珠微球的粒径为0.6～5.0μm的积极效果具有更优的灵敏度和更宽的线性。粒径大于5.0um：试剂容易发生聚沉，不利于试剂的长期保存；粒径小于0.6um：进行抗体标记时容易产生空间位阻，影响抗原抗体的特异性结合。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品含有基质金属蛋白酶-9。
本申请实施例中，校准品定标后，再测质控品观察其浓度是否在标注浓度范围内，若在则可以进行下一步测试，若不在则换新试剂与配套校准品与质控品，重复上述步骤，保证检测蛋白的精度和准度。
第二方面，本申请提供了第一方面所述的基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒的检测方法，所述方法包括以下步骤：
将待测样本、磁珠微球试剂M和酶标试剂R混合，孵育并去除杂质，得到混合溶液；
将所述混合溶液用仪器进行检测，得到所述待测样本中基质金属蛋白酶-9的浓度。
具体地，仪器可以为全自动化学发光免疫分析仪、半自动化学发光免疫分析仪等化学发光免疫分析仪。去除杂质可以理解为去除待测样本中未结合的抗体和游离的基质金属蛋白酶-9；待测样本中含有基质金属蛋白酶-9才可以检测出基质金属蛋白酶-9的浓度。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本发明的方法进行详细说明。
实施例1
本实施例提供了一种基于化学发光免疫分析法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的检测试剂盒，包含磁珠微球试剂M、酶标记试剂R和校准品；所述磁珠微球试剂M包括包被有第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的磁珠微球，所述酶标试剂R的组分包括标记有第二基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的酶液。
1、磁珠微球试剂M的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S11.将初始磁珠微球用磁珠微球活化缓冲液进行清洗并重悬后，进行第一活化，得到活化磁珠微球溶液；
S12.将所述活化磁珠微球溶液的上清液去除，并加入磁珠微球包被缓冲液，以使所述活化磁珠微球溶液稳定，得到包被磁珠微球液；
S13.将所述第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体和磁珠微球包被缓冲液混合，以稳定和保护抗体，得到基质金属蛋白酶-9抗体混合液；
S14.将所述基质金属蛋白酶单克隆抗体混合液与所述包被磁珠微球液混匀，得到基质金属蛋白酶单克隆抗体微球液；将所述基质金属蛋白酶单克隆抗体微球液进行第一封闭，后进行第一保存，得到磁珠试剂M。
(1)磁珠微球清洗：取磁珠微球MS160/Carboxyl(购自JSR公司，粒径为1.5μm的羧基磁珠微球，浓度10％)1mL，置于磁分离架上2min后除去上清液，加入10mL磁珠微球活化缓冲液(浓度50mmoL/L，pH5.5)混匀重悬，重复以上步骤3次，最后加入10mL磁珠微球活化液重悬备用；
(2)磁珠微球活化：在(1)中清洗好的10mL磁珠微球中加入0.25mL 10mg/mLNHS和0.25ml 10mg/mL磁珠微球活化剂，旋涡混匀，然后置于30℃条件下混匀30min；
(3)磁珠微球清洗：磁珠活化结束后，将活化好的磁珠液置于磁力架上2min，除去上清液，加入10mL的磁珠微球包被缓冲液(浓度50mmol/L，pH7.0)混匀重悬，重复以上步骤3次，最后加入5mL磁珠微球包被缓冲液重悬备用；
(4)磁珠微球包被：取0.2mg鼠抗人单MMP-9克隆抗体4A3(购自Biotechne公司)加入到5mL磁珠微球包被缓冲液(浓度50mmol/L，pH7.0)中，旋涡混匀，然后加入到(3)中的磁珠微球液中，旋涡混匀，置于30℃条件下混匀3小时；
(4)磁珠微球封闭：磁珠包被结束后，加入0.5mL的磁珠微球封闭液(甘氨酸浓度为0.8％，BSA浓度1.5％)，旋涡混匀，然后置于30℃条件下混匀30min；
(6)磁珠微球保存：磁珠封闭结束后，将磁珠液置于磁力架上静置2min，除去上清液，加入10mL磁珠微球保存液(三羟基氨基甲烷(Tris)缓冲液，摩尔浓度100mmol/L，pH7.0；无游离脂肪牛血清白蛋白，浓度0.5％；曲拉通100，浓度为0.1％；BND-10，浓度为0.05％)，混匀重悬，重复以上步骤3次后，加入10mL磁珠微球保存液重悬并于2℃～8℃保存。
2、所述酶标试剂R的制备方法，如图2所示，包括以下步骤：
S21.将第一酶进行第二活化，并加入交联剂，得到活化酶液；
S22.将所述活化酶液用酶标记缓冲液缓冲后进行透析，得到透析酶液；
S23.将所述透析酶液与所述第二基质金属蛋白酶-9单克隆抗体混合，以实现酶-抗体标记，后进行第二封闭、纯化和第二保存，得到酶标试剂R。
具体包括：(1)酶活化：取1000μg碱性磷酸酶P5931(购自Merck公司)加入到2000μL酶标记缓冲液中(PBS缓冲液优选浓度20mmol/L；pH值优选7.0)，再加入1000μL的酶交联剂1(戊二醛浓度优选1％)，旋涡混匀，置于25℃条件下避光混匀1h；
(2)酶透析：将活化好的酶液用酶标记缓冲液(PBS缓冲液优选浓度20mmol/L；pH值优选7.0)进行透析(透析袋孔径100KDa)，4℃透析24小时，每隔8小时换液1次；
(3)酶-抗体标记：步骤(2)完成后，在透析好的酶液中加入0.2mg的鼠抗人MMP-9单克隆抗体4H3(购自Biotechne公司)。旋涡混匀，置于4℃条件下避光混匀18h；
(4)酶封闭：步骤(3)完成后，在酶液中加入500ul的酶封闭剂(BSA浓度优选3％)，置于4℃条件下避光混匀1h；
(5)酶纯化：酶封闭完成后，用超滤管(购自Millipore，4mL，100KDa)对酶液进行纯化浓缩，使酶液最终体积为450uL～550uL；
(6)酶液保存：用酶保存液(磷酸盐缓冲液，50mmol/L，pH7.4，牛血清白蛋白浓度0.5％；甘油浓度为5％，防腐剂为Proclin300，浓度为0.25％)将纯化后的酶液稀释至1mL，置于-18℃～-25℃条件下保存。
3、校准品制备：
(1)校准品稀释液配制：缓冲液三羟基氨基甲烷(Tris)缓冲液，摩尔浓度50mmoL/L，pH7.4，稳定剂为胎牛血清，浓度0.2％，表面活性剂为乙二醇，浓度为0.05％，防腐剂为BND-10，浓度为0.1％。
(2)将重组人基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白购自(Biotechne公司)用水复溶后，按照梯度稀释6个浓度，分别为0pg/mL、30pg/mL、160pg/mL、800pg/mL、4000pg/mL、40000pg/mL，置于2℃～8℃保存。
实验时用的溶液配制方法如下：
(1)磁珠微球活化缓冲液：2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液、硼酸缓冲液，摩尔浓度10mmoL/L～200mmoL/L，pH4.0～7.0，优选20mmoL/L～100mmol/L，pH5.5～6.5。
(2)磁珠微球包被缓冲液：2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液、硼酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES缓冲液)、磷酸盐缓冲液等，摩尔浓度10mmoL/L～200mmoL/L，pH4.0～7.0，优选硼酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES缓冲液)，摩尔浓度20mmoL/L～100mmol/L，pH6.0～7.5。
(3)磁珠微球封闭液：甘氨酸(Gly)与牛血清白蛋白(BSA)混合液，其中甘氨酸浓度为0.5％～2％，优选0.75％～1.25％；牛血清白蛋白(BSA)溶液浓度为1％～5％，优选1.5％～3％。
(4)磁珠微球保存液：包含缓冲液、稳定剂、表面活剂剂、防腐剂。缓冲液为Good’s缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液等，摩尔浓度为20mmoL/L～200mmol/L，pH为6.0～8.5，优选Good’s缓冲液中的三羟基氨基甲烷(Tris)缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选摩尔浓度30mmoL/L～100mmol/L，优选pH7.0～8.0。稳定剂为牛血清白蛋白、动物血清、酪蛋白、植物蛋白、氨基酸等，浓度为0.05％～5％，优选无游离脂肪牛血清白蛋白、胎牛血清、酪蛋白等，浓度优选0.1％～1％。表面活性剂为曲拉通、吐温、乙二醇、丙三醇、山梨醇、十二烷基三甲基氯化铵等，浓度为0.01％～2％，优选曲拉通100、吐温20、乙二醇，浓度为0.05％～0.1％。防腐剂为Proclin300、Krovin600、四环素、硫酸庆大霉素、BND-10等，浓度为0.01％～2％，优选Proclin300、BND-10，浓度为0.05％～0.5％。
(5)酶标记缓冲液：5mmoL/L～50mmol/LPBS缓冲液，优选浓度10mmoL/L～25mmol/L；pH值为6.0～7.5，优选6.8～7.2。
(6)酶标记封闭剂：1％～5％牛血清白蛋白(BSA)，优选2％～3％。
(7)酶保存液：包含缓冲液、蛋白保护剂、甘油、防腐剂。其中缓冲液为Good’s缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液等，摩尔浓度为10mmoL/L～100mmol/L，pH为6.0～8.5，优选Good’s缓冲液中的三羟基氨基甲烷(Tris)缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选摩尔浓度20mmoL/L～50mmol/L，优选pH6.8～7.8。蛋白保护剂为牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、氨基酸，浓度为0.2％～2％，优选牛血清白蛋白、氨基酸中的精氨酸、丝氨酸，浓度0.3％～0.8％；甘油浓度为1％～10％，优选3％～5％，防腐剂为Proclin300、Krovin600、四环素、硫酸庆大霉素、BND-10等，浓度为0.01％～2％，优选Proclin300、BND-10，浓度为0.05％～0.5％。
(8)磁珠微球活化剂：按照20mg/ml的浓度称量配制EDC和NHS活化剂，先称好备用，待实验室现配现用，以防止活化剂失活。
(9)酶标记交联剂：0.1％～5％戊二醛，优选0.5％～2％。
(10)校准品稀释液：包含缓冲液、稳定剂、表面活剂剂、防腐剂溶液。缓冲液为Good’s缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液，摩尔浓度为20mmoL/L～200mmol/L，pH为6.0～8.5，优选Good’s缓冲液中的三羟基氨基甲烷(Tris)缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选摩尔浓度50mmoL/L～150mmol/L，优选pH7.4～8.2。稳定剂为牛血清白蛋白、动物血清、酪蛋白、植物蛋白、氨基酸等，浓度为0.05％～5％，优选马血清、胎牛血清、酪蛋白等，浓度优选0.1％～2％。表面活性剂为曲拉通、吐温、乙二醇、丙三醇、山梨醇、十二烷基三甲基氯化铵等，浓度为0.01％～2％，优选乙二醇、丙三醇，浓度为0.05％～0.1％。防腐剂为Proclin300、Krovin600、四环素、硫酸庆大霉素、BND-10等，浓度为0.01％～2％，优选Proclin300、BND-10，浓度为0.05％～0.5％。
实验时，试剂M的包被抗体可以是MMP-9(克隆号：4A3)(购自Biotechne公司，鼠抗人单克隆抗体)，试剂R的标记抗体可以是MMP-9(克隆号：4H3)(购自Biotechne公司，鼠抗人单克隆抗体)。基质金属蛋白酶9(MMP-9)抗原可以是重组人基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白(购自Biotechne公司，Recombinant Human MMP-9 Protein)。
实施例2
与实施例1的不同之处在于：将磁珠包被时，即S13中，基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的用量增加至0.3mg；
实施例3
与实施例1的不同之处在于：将磁珠包被时，即S13中，基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的用量增加至0.4mg；
实施例4
与实施例l的不同之处在于：将磁珠保存液中，曲拉通浓度提升至0.2％；
实施例5
与实施例1的不同之处在于：将磁珠保存液中，曲拉通浓度提升至0.3％；
实施例6
与实施例1的不同之处在于：将酶保存液中的牛血清白蛋白更换为酪蛋白，浓度为0.5％；
实施例7
与实施例1的不同之处在于：将酶保存液中的牛血清白蛋白更换为精氨酸，浓度为0.5％；
实施例8
与实施例1的不同之处在于：将校准品稀释液中的胎牛血清更换为马血清，浓度为0.2％；
实施例9
与实施例1的不同之处在于：将校准品稀释液中的胎牛血清更换为酪蛋白，浓度为0.2％。
对比例
按照发明专利《一种同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统及其制备方法和应用》(CN110824164A)制备试剂盒基质金属蛋白酶-9和2检测试剂。
实验检测
线性范围的检测方法：取高低值样本各一支，高值样本约40000pg/mL，低值样本20pg/mL。用商用试剂盒(MMP-9ELISA Kit，购自Biotechne)检测的样本浓度，将高低值样本混合梯度稀释成6个点，然后用制备好的试剂M和试剂R测试梯度样品，每个浓度样品测试3次，测试结果以浓度表示。要求测试结果信号值和浓度值相关性R≥0.9900。评估试剂：对比试剂、实施例1、实施例2和实施例3。检测结果如表1-表4所示和图3-图6所示。
表1对比例线性范围检测结果。
表2实施例1线性范围检测结果。
表3实施例2线性范围检测结果。
表4实施例3线性范围检测结果。
根据对比例、实施例1-3的检测结果，和图3-图6可知，专利CN110824164A中的试剂盒线性范围较窄(约为20-500pg/mL)；同时在本发明专利中，将磁珠包被时，即S13中，基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的用量从0.2mg增加至0.3mg；从随着抗体用量的增加，试剂检测的样品的相关性越好，说明试剂的线性越好。实施例3，在测试样本20pg/mL～40000pg/mL范围内，相关性R＝0.9995，说明试剂盒线性范围能达到20pg/mL～40000pg/mL，且远远宽与比对试剂的线性范围。其中，图3-图6横坐标的单位为pg/mL。重复性的检测方法：用试剂盒检测高中低值临床样本，每个样本重复测试10次，计算测试CV。评估试剂：对比例、实施例1、实施例4和实施例5。检测结果如表5。
表5对比例、实施例1/4/5重复性检测结果。
由表5可知，对比例测试低中高值样本重复性为12.0％～14.1％，实施例1测试低中高值样品重复性为6.4％～7.0％，实施例4测试低中高值样品重复性为4.3％～4.8％，实施例5测试低中高值样品重复性为1.6％～3.6％，说明对比例重复性较实施例差，同时实施例1/4/5结果随着曲拉通100量的增加，试剂检测的重复性越好。
日间精密度的检测方法：用试剂盒测试低中高值3个样品，分别在两台设备上进行测试，每个样品连续测试5天，每台设备每天每个样品测试4次，每个样品共40个测试结果，统计数据结果得出精密度结果。检测结果如表6-表8。
表6对比例、实施例1/4/5日间精密度(低值样品)检测结果。
表7对比例、实施例1/4/5日间精密度(中值样品)检测结果。
表8对比例、实施例1/4/5日间精密度(高值样品)检测结果。
由表5-表8可知，对比例测试低中高值样品日间精密度为7.93％～10.37％，实施例1测试低中高值样品日间精密度为5.7％～9.6％，实施例4测试低中高值样品日间精密度为4.0％～4.9％，实施例5测试低中高值样品日间精密度为2.1％～2.9％，说明对比例日间精密度比实施例差，同时实施例1/4/5结果说明随着曲拉通100量的增加，试剂检测的精密度越高。
试剂稳定性的检测方法：将制备好的试剂等分分成3分，分别置于4℃静置7天、37℃热破7天、42℃模拟运输(300转/分钟)3天。然后在相同条件下，用实施例1、实施例6和实施例7制备的试剂测试3个校准品和3个临床样本，观察37℃和42℃条件下测试浓度结果的变化率，变化率在±10％说明试剂热稳定性较好。检测结果如表9-表11所示。
表9对比例试剂稳定性检测结果。
表10实施例1试剂稳定性检测结果。
表11实施例6试剂稳定性检测结果。
表12实施例7试剂稳定性检测结果。
由表9-表12可知，对比例的试剂37℃热破7天后测试校准品和样本的变化率为-21.7％～-19.6％，42℃模拟运输3天后测试校准品和样本的变化率为-20.7％～-18.6％，实施例1的试剂37℃热破7天后测试校准品和样本的变化率为-15.4％～-14.1％，42℃模拟运输3天后测试校准品和样本的变化率为-15.3％～-12.9％，实施例6的试剂37℃热破7天后测试校准品和样本的变化率为-6.1％～-4.3％，42℃模拟运输3天后测试校准品和样本的变化率为-6.0％～-3.0％，实施例7的试剂37℃热破7天后测试校准品和样本的变化率为1.6％～4.4％，42℃模拟运输3天后测试校准品和样本的变化率为0.0％～6.4％。对比例试剂37℃热稳定性和42℃热稳定性较差，同时实施例6和实施例7中试剂的稳定剂分别为酪蛋白和精氨酸，添加该两种物质后，试剂的热稳定性均较优。
校准品稳定性的检测方法：将制备好的校准品等分分成3分，分别置于4℃静置7天、37℃热破7天、42℃模拟运输(300转/分钟)3天。然后在相同条件下，用实施例1、实施例8和实施例9制备的试剂测试5个有浓度校准品点，观察37℃和42℃条件下测试浓度结果的变化率，变化率在上10％说明校准品热稳定性较好。检测结果如表13-表16所示。
表13对比例校准品稳定性检测结果。
表14实施例1校准品稳定性检测结果。
表15实施例8校准品稳定性检测结果。
表16实施例9校准品稳定性检测结果。
由表13-表16可知，对比例1的校准品37℃热破7天后测试校准品的变化率为-22.0％～-17.5％，42℃模拟运输3天后测试校准品变化率为-23.0％～-18.7％，实施例1的校准品37℃热破7天后测试校准品的变化率为-15.0％～-13.0％，42℃模拟运输3天后测试校准品变化率为-14.2％～-11.7％，实施例8的校准品37℃热破7天后测试各校准品的变化率为-6.0％～-4.3％，42℃模拟运输3天后测试校准品变化率为-5.3％～-3.2％，实施例9的校准品37℃热破7天后测试校准品的变化率为1.0％～4.8％，42℃模拟运输3天后测试校准品的变化率为1.1％～4.3％。对比例校准品稳定性较差，实施例8和实施例9中校准品稳定剂分别为马血清和酪蛋白，添加该两种稳定剂后，校准品的热稳定性均较优。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：磁珠微球试剂M和酶标试剂R，所述磁珠微球试剂M包括包被有第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的磁珠微球，所述酶标试剂R的组分包括标记有第二基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的酶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠微球试剂M的制备方法包括：
将初始磁珠微球用磁珠微球活化缓冲液进行清洗并重悬后，进行第一活化，得到活化磁珠微球溶液；
将所述活化磁珠微球溶液的上清液去除，并加入磁珠微球包被缓冲液，以使所述活化磁珠微球溶液稳定，得到包被磁珠微球液；
将所述第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体和磁珠微球包被缓冲液混合，以稳定和保护抗体，得到基质金属蛋白酶-9抗体混合液；
将所述基质金属蛋白酶单克隆抗体混合液与所述包被磁珠微球液混匀，得到基质金属蛋白酶单克隆抗体微球液；
将所述基质金属蛋白酶单克隆抗体微球液进行第一封闭，进行第一保存，得到磁珠试剂M。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述混匀的温度为25～30℃，所述混匀的时间为2-4h。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标试剂R的制备方法包括：
将第一酶进行第二活化，并加入交联剂，得到活化酶液；
将所述活化酶液用酶标记缓冲液缓冲液进行透析，得到透析酶液；
将所述透析酶液与所述第二基质金属蛋白酶-9单克隆抗体混合，以实现酶-抗体标记，后进行第二封闭、纯化和第二保存，得到酶标试剂R。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一酶包括碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
6.据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体包括鼠抗人单克隆抗体、兔抗人单克隆抗体和羊多抗人单克隆抗体中任意一种。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述初始磁珠微球包括羧基磁珠微球、氨基磁珠微球、甲苯磺酸基磁珠微球和羟基磁珠微球中至少一种。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠微球的粒径为0.6～5.0μm。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品含有基质金属蛋白酶-9。
10.一种如权利要求1-9任意一项所述的基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将待测样本、磁珠微球试剂M和酶标试剂R混合，后孵育并去除杂质，得到混合溶液；
将所述混合溶液用仪器进行检测，得到所述待测样本中基质金属蛋白酶-9的浓度。
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