JPS60100600A - 担体と結合したフイブリンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は７イブリンーまたはフイブリノゲンー分解生成
物で被覆された表面の調製法に関する。

本発明はさらにフィブリンに対する親和性を有する蛋白
質のかかる被覆された表面を用いる検出および測定法に
関するっ蛋白分解酵素もこの方法で測定されうる。

表面をある種の抗原または抗体で被覆することは抗体ま
たは抗原の免疫学的測定にとって知られているっしかし
ながらフィブリンでは表面は恐らくまだ被覆されていな
い。

フィブリンはフイブリノゲンからフィブリノペプチドＡ
およびＢの蛋白分Ｍ的分解により生成する。生成する可
溶性のフイ／リン単量体分子は集合しそしてフィブリン
沖１作体を形成し。

これは第■因子を作用させると共有で交叉結合した重合
体として存在する。プラスミノゲン。

プラスミン、プラスミノゲン賦活剤、フィブロネクチン
、α２−アンチプラスミン、α２−アンチプラスミン−
プラスミン複合体またはプラスミノゲンーストレプトキ
ナーゼのような一連の蛋白質はフィブリンに対し高い親
和性を有する。

その上、フィブリンはプラスミンのような酵素に対し基
質としてそして′組織プラスミノゲン賦活剤または１本
鎖ウロキナーゼのようなプラスミノゲン賦活剤に対し効
果器として作用する。

従来法において知られた方法てｔまフィブリンと相互作
用するかかる蛋白質の親和性ならびに活性の同時かつ速
かな測定ができない。

それゆえかかる方法を開発するという課題があった。

驚くべきことに、フィブリンで被わ′１さｈた表面がフ
ィブリンと相互作用しうる蛋白質の同時の、速かなそし
て感度の良い親和性ならびに活性の測定に適当であるこ
とが見出された。

それゆえ本発明はフィブリン−またＣまフイブリノゲン
ー分解生成物を用いる担体の被覆法に関する。

本発明はまた標識されたフィブリン−またはフイプリノ
ゲ／−分解生成物で被覆された担体の調製法にも関する
。

被覆するには、場合により標識されていてもよいフイブ
リノゲンが使用でき、これは次釦凝同される。

標識剤は被覆剤に吸着さｉＬるか、その中に包含される
かまたは共有または共有でなくそれに結合されうる。

被覆剤に吸着されるかまたは共有または共有でなくそれ
に結合される８Ｉ識ならびにフィブリン網中に包含され
る標識が好ましい。放射性核種、酵素１色素、酵素基質
および抑制剤が標識として特に好ましい。

被覆される和体表血としてＶよ例えはボリスチ“　し／
、ポリウレタン、シリコーン、アセチルセルロース、Ｐ
ＶＣ，ラテックス、けいそう土、ガラスならびにまた物
理的または化学的に活性化された水不溶性表面例えばδ
−照射されたポリスチレンおよびアミノプロピルガラス
が適当テある。

好ましい調製法は、担体例えばポリスチレン小管の表面
を５０〜ｏ、ｏｏｏ１ｍ９／−の蛋白質を含有するフイ
ブリノゲン溶液と保温しそして場合により洗滌し、存在
するフイブリノゲンを凝固させそして表面を洗滌しそし
て場合により乾燥させることにある。表面に存在するフ
ィブリン分子を場合により標識で処理してもよい。

別の調製法は担体例えばポリスチレン小管を５０〜０．
０００１Ｆｎｇ／−の蛋白質溶液と共に、標識されたフ
イブリノゲンおよびフィブリソゲン００〜１比混合物と
接触させ、該混合物を保温しそして場合により洗滌し、
フイブリノゲンを第Ｘ■因子の存在下または非存在下に
凝固させそして表面を洗いそして場合により乾燥させる
ことにるる。

さらに別の調製法は担体例乏、ばポリスチレン小管を５
０〜５　ｍ９　／　ｔｔｔのフイブリノゲンを含有する
溶液と共にフイプリノゲン」・・よび標識例えば酵素、
酵素基η、抑制剤１旨」色素の混合物と接触させそして
該混合物を作溝し、存在するフイブリノゲンを第Ｘ１ｌ
ｌ因子の存（１日下または非存在下にんｔ固させそして
表面を洗澹・しそして場合により乾燥させることにある
。

別の調製法は担体例えばポリスチレン小管をフィブリン
−丑たけフィブリノ）ｒ゛ノン−解生成物の溶液と、捷
たは場合により（１，１〜５０μｍ１／、ｎｔのＥｌ白
質を含有する溶液と共にフィブリン分解生成物と標識さ
れたフィブリン−またはフイフリノゲンー分ＩＷ生成物
００〜１力る割合の混合物と接触させ、該混合物を保〃
、１１、シフ、洗滌しそして場合により乾燥させること
にあるっ 好ましい態様においては１００ＷＬｔ当り０．５〜５Ｉ
好ましくは”／１００ｍ／のフィブリノゲンを含有する
溶液０．０４　ｍｌを好ましくは０，２ＮＩＨのトロン
ビンを有する小管中好オしくは２〔］℃〜３７℃、好ま
しくけ３７℃で一夜凝固させそして乾燥させそして小管
を好甘しくけ洗滌しそして次に乾燥する。

特例好ましい態様においてｕ　１ｏｏ−当り０．５〜５
ｇ好捷しくけ２．９／１００＋＋＋１！のフイブリノゲ
ンおよび色素例えは０．０２　ｇ／　ｍ、ｌのブルーテ
キストランを含有する溶液を小管中でトロンヒンを用い
好寸［７くけ２０〜６７℃で凝固させ、好゛牛しくは６
７℃で一夜乾燥し、好捷しくけ水洗しそして次に乾燥す
る。

他の特に奸才しい調製法においてにｒ、フィブリン、フ
イブリノゲン分解生成物またはフィブリン分解生成物で
被町された表向を次に過沃素酸塩処理はルオキシダーゼ
と反応させ、洗滌しそして場合により乾燥させる。場合
により被覆された表面ばペルオキシダーゼで標識された
フイプリノゲン抗体で処理さ）１うる。

本発明はさらにフィブリン士たけフィブリン分解生成物
に対する親和性を・１１ζる蛋白質を検出および測定す
るに当り、水不溶性担体をフィブリン−捷たけフィブリ
ノゲンー分解生成物の溶液、フイブリノゲン溶液または
フィブリノゲンの場合はさらに凝固剤を加えＣナニフイ
ブリノゲン溶液と接触させそして顔面合物を保温し。

それにより被覆された担体がＴｉｔられ、場合により洗
Δ１ヤし、被覆された担体を測シ〆すべき蛋白質の溶液
と合しそしてその蛋白ｊｔＪを測定することを特徴とす
る方法に関する。

フィブリンに対する親和性に一有する蛋白質。

のみならずフィブリンを崩解させうる蛋白分解酵素の測
定または検出が好ましい。これらの蛋白質の被覆に及ぼ
す作用により既知反応条件下にフィブリン分解生成物ま
たは標識されたフィブリン分解生成物または包含された
標識の放出が追跡されうる。

被覆された表面に結合した蛋白ηロ、免疫学的に１例え
ばペルオキシダーゼで標識された抗体で検出まだは測定
でき、その場合ペルオキシダーゼの酵素活性が測定され
る。

プラスミノケ゛ン、プラスミン２プラスミン−抑制剤複
合物、プラスミノゲン賦活剤、フィブロネクチン捷たは
α２−アンチプラスミン抑制剤の測定が特に好ましい。

好ましい態様においては１例えば好捷しくにフィブリン
で被覆した小管中におけるプラスミノゲン賦活剤を含崩
する溶液０゜１　ｍｌ舌・例えば１ｇ／１００−のアル
ブミンを含有するｐＨ７，５の５０ミリモル／ｌの燐酸
塩緩衝液中で好ましくは１ＣＴＡ／ｍｌを含有するゾラ
スミノゲン溶液０．１ｍｌの存在下に例えば０．５〜５
時１ｉ１３７℃で保温する。プラスミノケン賦活剤に、
Ｉン・イブリンに結合し、このものがその比活性を強め
る。この酵素の作用の下にプラスミノケンＱ」プラスミ
ンに変換される。生成したプラスミン０［フィブリンを
分解してフィブリン分解生成物となす。放出されたばゾ
チドはトリえば萄萄球菌凝集試験のようなフィブリン分
解生成物にとつ、）て感度の良い試験を用いて検出され
る。他のｔｌ、ｒ−４シい態様においてはプラスミノゲ
ン、プラスミンまたはα２−アンチプラスミンの測定に
対し類似の方法で操作する。

それゆえ本発明はさらにフィブリンに対する親和性を有
する蛋白質の検出にｚｌするフィブリンで被覆された担
体の使用ならＯにかかる蛋白質の活性測定にも関するっ フィブリンで被覆されだ担体を例えばｘｆｎ液。

血漿、血清または組織液体中に存在するようなフィブリ
ンと結合する蛋白質またはヲ゛ロテイナーゼの検出に使
用するのが特に好ましい。

かかる被覆された担体をフィブリンと結合するプラスミ
ノケン賦活剤とフィブリンと結合しないプラスミノケン
賦活剤との間の判）３１Ｊにイ史用することが特に好ま
しい。

好ましい態様においてはフィブリンで被覆された表面を
場合によりアプロチニンのようなヲ゛ラスミン抑制剤を
添加してプラスミノケン賦活剤を含有する溶液と例えば
１〜６０分、Ｇ）′！Ｆｔ、＜は５〜１５分、２０〜３
７℃で保温する。次ｅ′Ｃフィブリンを含有する表面を
洗浄する。フイブ１ノンに結合された蛋白質は耐１記の
ようにし、てＩ１１定する。

さらにフィブリンで被覆された表面はフィブリンと結合
する物質の除去にも使用されうる。

本発明を下記の実施例により６（−１明する。

実施例　１ 牛フイブリノゲンを蒸留水中針溶解させた。

プラスミノケン不含の２ｇ／ｌ［１０−の牛フイブリノ
ゲン溶液０．０４−をボリスブし・ン小管に加えた。次
にトロンビン溶液（１０旧Ｈ／ｆｆ＋７り　０．０２＋
ａ／を加えそしてこの溶液を５０〜１００秒間振盪する
ことによりホモジナイズした。凝固したのちフィブリン
を含有する小管を保汎１室中６７℃で一夜乾燥した。得
られたフィブリンで被覆された小管を洗液中に何らフィ
ブリンまたはフィブリン分解生成物が検出され得り一く
なる壕で水洗した。次に洗滌した小管を保渦宇中６７℃
で一夜乾燥した。

実施例　２ 実ｊｆ＋ｉ例１と同様に操作するが、フイプリノゲン溶
液は２０■／−のブルーデキストラン２０００を含有（
また。小管を過剰の色素が完全に除去される捷で洗滌し
た。

実施例　６ 実施例１と同様に操作するが、フィブリンで被覆された
小管をはルオキシダー七で標識されたアンチフイブリノ
ゲンー免疫グロブリン溶液０、０５　、ｄと光線を辿断
して２時間保温し２次に洗浄しそして乾燥した。

実施例　４ 得られたフィブリン被覆された小管を＋ｔ＋ＩＩ織プラ
スミノゲン賦活剤の測定に使用した。組織プラスミノケ
ン不含剤を含有する溶液を１．９／１ｏ。

ｖｎｌのヒトアルブミンを含有するｐｆ（７，５の５０
ミリモル／ｌの燐酸塩緩衝液を用い幾何学的級数で希釈
した。

試験混合物は賦活剤含有希釈物０．　ｊ　ｍｌおよび１
Ｑ　ＣＴＡ／ｉを含有するゾラスミノケ゛ン溶液０，１
−から成るっこの試料をフィブリンで被覆された小管中
３７℃で１〜５時間保温した。規則的な間隔で試料０．
０３−を採取しそして葡萄球菌懸濁液０．０３−と混合
した。凝集が覗察された。緩衝液０．２　ｍ、ｌのもの
、緩衝液０．１　ＩＩ／！およびプラスミノゲン０．１
　ｍｌのものおよび緩衝液０．１−および賦活剤０．１
　ｍｌのものからなる３種類の対照が用いられた。フィ
ブリン小管中４時間保温したのちですべての対照は陰性
であった。すなわち葡萄球菌懸濁液添加後食くとも１０
分１では何ら凝４↓４が観察され得なかった。１ｌｌｉ
萄球菌の添加２分以内に凝集が起った場合反応は陽性と
認められた。

下記の表により本発明に、しる方法の感度が引き出され
うる。

１閤００゛ 巨 実施例　５ 実施例１におけると同様に１．で測定した。この方法は
フィブリンを結合する蛋白質と結合しない蛋白質とを区
別するそのｎＦｉ力について試験した。クロキナ−上（
尿から取得）（１）および糾紗、プラスミノゲン賦活剤
（２）ｄ実施例４におけると同様にして賦形きした。

さらに、ウロキナーゼ試ネＩ（３）および組織プラスミ
ノゲン賦活剤（４）をフィブリン小管中６７℃で１０分
間保温し１次に緩衝液で３回洗いそして終りに緩衝液０
．１　ｍｌおよびノ′ラスミノゲン（１０ＣＴＡ、　／
ｍｌ）　０．１　ｖｎｌと実Ｎｌｉ　（シ１１４におけ
ると同様にして保温しそして試験１．、　ｌｒ、いその
結果を下記に示す。

１　陽性 Ｚ　ＩｖＩＳ件 ３　陽性 ４　陽性 実施例　６ 実施例２記載と同様のフィブリン小管を組織プラスミノ
ゲン賦活剤と一緒に実施例４の記載と同様の方法で作泥
した。反応は分光光度計により追跡した。

光学濃度の時間および賦活剤Ｂに依存する増大が観察さ
れた。

実施例　７ 実施例６の記載と同様のフィブリン小管を組織プラスミ
ノゲン賦活剤と一緒に実ｆＡ　ｆ９１１４におけると同
様にして保温した。フィブリンの分解程度は遊離された
ペルオキシダーゼを官有する断片全測定することにより
測定された。ペルオキシダーゼの測定は既知方法に従い
実施された。

その結果を以下に示す。

ＴＰＡ（単　位）　対　照

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）担体の表面にフィブリンを被覆することＫより担体
   と結合したフィブリンを調製するに当り、担体をフィブ
   リノゲン溶液および凝固剤とまたはフィブリン−゛また
   はフィブリノゲンー分解生成物の溶液と接触させ、該混
   合物を保温し、洗滌しそして場合により乾燥することを
   特徴とする方法。 ２）フイブリノゲンまたはフィブリン−またはフイブリ
   ノケ゛ンー分解生成物を標識づけることをｅ＃徴とする
   前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）担体をフイブリノゲン溶液および凝固剤とまたはフ
   ィブリン−またはフ・ｆブリノゲンー分解生成物と接触
   させた後に標識剤で処理することを特徴とする特許 項記載の方法。 ４）フィブリンまたは７イブリン分解生成物に対する親
   和性を有する蛋白質を検出および測定するに当り．前記
   特許請求の範囲第１項記載の方法に従い被覆された担体
   をその蛋白質の溶液と一緒にしそしてその蛋白質を測定
   することを特徴とする方法。 ５）担体がポリスチレンからなることを特徴とする前記
   特許請求の範囲第１項記載の方法。