JPS62156560A - 配位子／非配位子検定を実行するための方法及びキツト - Google Patents
配位子／非配位子検定を実行するための方法及びキツトInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
（産業上の利用分野）
本発明は、細ｊ胞又は細胞片の試料（標本）から抽出さ
れる配位子（リガント）の検定（アッセイ）に関し、特
に、（１）試料からの配位子〜の抽出と、このために少
なくとも２つの非配位子−（アンチリカント）との配位
子−の反応とを同時に実行して検出可能な反応生成物を
形成″４″ること、及び（２）反応生成物を検出するこ
とにｊ；る検定に関１−るものである。更に、本発明は
そのような検定を実行するＪＴ法、及びそのような方法
を実施″４−るための成分を持つキットに関するもので
ある。 （背１１．技術） 液体試料中の、特定の物質の存在及び濃度を検定するた
めの技術は当業者によって知られている。そのような技
術は、例えば放射性標識免疫検定（旧酊ｒａｄｉｏｉｍ
ｍｕｎｏａｓＳａｙｓ） 、酵素免疫検定（］（１八；
へｎ７ｙｍｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）、酵素結合
免疫検定（１：１．ＩｓΔ：Ｃｒ＋ｚｙｍｃ−１ｉｎｋ
ｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ） 、及び関連する蛋
白″ｊ１結合力法（ｐｒｏｌ、ａｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ
ｍｃｌ、ｔ＋ｏｄｏｌｏｇｉｃｓ）がある。これらの技
術のずぺては特定のレセプタを分類するために化合物の
結合を含む。従って、配位子／非配位子−検定（リガン
ド／アンチ−リカシトアッセイ）の 般的なカブコリ、
即ち検定で生しる相ノア、作用の特別なタイプ、又は反
応に関′チー・）−る成分の特別なタイプに制限されな
いカブコリに分類される。］）−へての配位子／非配位
子−検定は次の２つの＋’＋ｆ提に基づくものである６
（＋）ｉ対の物質（配位子−／非配位７’−）は〃いに
強い特定の親和力を持つ。即ち、１対の物質は、互いに
結合する傾向かあるが、他の物質に対してほとんど、又
は全く結合しない。 （２）その方法は、−・度、錯体
が形成されると、相ｔ７−作用で結合する配位′ｆ／非
配位子・の検出を５丁能とするように開発され得る。 ここで、配位Ｔ−は検出される物質として定義され、非
配位−ｒ−は配位ｔの存在を探るために使用される物質
として定義される。配位子／非配位子検定において、追
加的な修正される配位子は非配位子の結合部位に対して
、検出すべき物質として対抗するものとして使用される
。この場合において配位子又は非配位子のいずれか一方
の固定化は反応生成物の検出を容易にする。 配位子／非配位子の反応は、反応生成物を識別するため
に種々の標識（ラベル）を用いる、種々の方法で検出さ
れる。現在、最も庁通に用いられる標識は、酵素、蛍光
色素及び放射性化合物である。 配位子／非配位子の検定方法は抗体又は抗原、即ち試料
内の配位子の存在又は不在を検出するための酵素免疫検
定（［：Ｉ八）に適用される。近年、ＩＥ［八及びＩ：
ＬＩＳへの使用は、生物学的活性物質の検出及び計叶の
ためにますますＪ要になっている。典型的な１４Ｌｌｓ
八法では、抗原は特定の抗体との抗原の捕捉によって直
接又は間接に検出され、また、適切な条件下で、」、（
質による反応で触媒作用する酵素標識抗体（ｃｎｚｙｍ
ｃ−１ａｂｅｌｅｄ ａｎＬｉｂｏｄｉｃｓ）の使用に
よって結合した抗原か検出される。酵素の活性は、 一
般に着色された反応生成物の外観によって検出される。 いくつかの酵素はアルカリフォスファターセ、ホースラ
ディッシュベルオキシターセ及びグルコースオキシダー
ゼを含み、抗原又は抗体と結合される。ホースラディッ
シュベルオキシターゼ（１１旧’；ｈｏｒｓｅｒａｄｉ
ｓｈ ｐｃｒｏｘｉｄａｓｃ）は共通に使用される。 いくつかの基質は１１旧）に使用できる。視覚的検出に
おいて、基質は過酸化水素及び色原体（ｃｈｒｏｍｏｇ
ｃｎｉｃ ｍａＬｃｒｉａｌ） 、例えばオルトフェニ
レンジアミン（（］−ｐｈｃｎｙｌｃｎｃｄｉａｍｉｎ
ｃ）又はデトラメチルベンシジン（１，ｃＬｒａｍｃＬ
ｈｙｌｂｃｎｚｉｄｉｎｃ）のような酸化により色を表
わすものを含む。 蛍光免疫検定技術（目へ；ｆｌｕｏｒｃｓｃｃｎ１．
ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）では抗原は蛍光色素標識抗体
（ｒ Ｉｕｏｒｏｃｈｒｏｍｃ −１ａｂｃｌｃｄ ａ
ｎｌ、１ｂｏｄｉｃｓ）で直接又は間接的に識別される
。蛍光色素は、励起される放射（例えば紫外線光）を吸
収し、かつ光（例えば可視光）を放射１ｊ−る染料であ
る。最も一般的に使用される蛍光色素はフルオレセイン
イソチオシアネート及びテトラメチルイソチオシアネー
トである。 生物学的試料における分析の配位Ｔ−／非配位子反応に
よる検出な標識化合物を採用する方法の使用を通して達
成される。種々の旧式技術、例えば配位子の直接又は間
接のｄｌ１１定は当業者によって知られている。 配位子／非配位子検定は匡薬の分野、例えば伝染病の診
断に適用される。病医学的因子（ｅｔｉｏｌｏ−ｇｉｃ
ａｌ ａｇｃｎＬ）の正確な同一が確立された後だＧ−
ｊ、伝染病の正確な診断及び治療か可能である。微生物
の場合では、微生物の同定、及び微生物のグループの同
定のために使用される、種又はグループの特定の抗原、
即ち配位子は、例えば全細胞、細ｊθ壁又は細胞片から
抽出される。そのような配位子−の検出のための検定か
簡！ｎで迅速であることが望ましい。 グループＡ連２ｒ１球閑の抗原、即ち多糖類は配位子／
非配位子−検定の使用によって有利に検定され得る。ヘ
ータ溶血性の（ｂｅＬａ−ｈｏｍｏｌｙＬｉｃ）、病原
性のグループＡ連鎖球菌は、人間のに部呼吸管及び皮膚
の伝染病と関連する最も一般的な細菌の媒介物（ａｇｅ
ｎＬ）である。最も高い発生はｒ供に典Ｊｌ、Ｉｔ、的
に発見される。抗生療法は選択の治療である。左記の治
療がされない場合には、グループＡ連２０球菌伝染病は
リューマチ熱のようなより深刻な合併症を導く（ウォン
ナーマーカー（Ｗａｎｎａｍａｋｃｒ） 、 ｌ 。 Ｉ）＝［レビューズオブインタ、ディス、 （ｌｌｃ
ｖｉｃｗｓ ｏｒｌｎｌ、、Ｄｉｓ、） 」、 １
：９６７−９７：Ｉ、 １９７９：カタンサロ（ｆ：
ａｌａｎｚａｒｏ） 、ト、、１１他： ［アメ−、シ
ー、メツ１−（Ａｍｃｒ、Ｊ、Ｍｃｄ、）Ｊ、１７：７
４！ｌ−７５６，１９５４）。人間の病気の病因学的因
ｒとしてのグループＡ連鎖球］＾１の頻度か高いので、
筒中−で迅速な診断の方法か要求されている。培Ａ （
ｃｕ ｌ Ｌｕｒｅ）から分離したグループＡ連３ｎ球
菌の同定に使用される現在の方法はバシトラシンサセプ
ティビイリティ（ｂａｃｉＬｒａｃｉｎｓｕｓｃｃｐＬ
ｉｂｉｌｉＬｙ）及びラテックススライド膠着（ＩａＬ
ｃｘ ５ｌｉｄｅ ａＨｌｕＬｉｎａＬｉｏｎ）を含む
。確証的な方法は、免疫蛍光法、沈降素試験及び凝析（
ｃｏａａｇｇｌｕＬｉｎａＬｉｏｎ）を含む（カブラン
（ｋａｐ ｌ ａｎ） 。 Ｌ、に、他［シェ、タリン、マイクロ、 （，１，Ｃ
ｌ１ｎ。 Ｍｉｃｒｏ、） Ｊ 、 １４（６）：６７８−６８０
，１９８１； ロス（ｆｌｏｓｓ） 。 ）） 、 Ｗ 、他「ジェ、タリン、バドル （Ｊ、Ｇ
ｌｉ口。 ＰａＬｈｏｌ、）」、 ３３：６９１−６９：１．１９
８０： カミング（Ｃｕｍｍｉｎｇ） 、Ｃ，Ｇ、他［
シェ、メッド、マイクロ。 （，１，Ｍｃｄ、Ｍｉｃｒｏ ） Ｊ １３： ４５９
−４６１．１９８０：ファクラム（１’ａｃｋｌａｍ）
Ｊｌ、１１．他「エエム、ジェ、タリン、バト 、
（八ｍ、Ｊ、ｃＩｉｎ、Ｐａｔ、ｈ、） Ｊ 、
５：６０８−６１０．１９８２； ＆びエトワー
ド（ｌＥｄｗａｒｄｓ） 、 Ｅ 、八、他［ジエ、タ
リン。 マイクロ、（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏ、）］、 ！５
（３）：４８１−４８３゜（１９８２）。 連鎖球菌の細胞壁から特定グループの多糖類の抽出は酸
を含む抽出試薬で達成される。その技術は、抗原の存在
を検出するために免疫学的な検定り順を実行する而に、
酸が抽出されるグループＡ連鎖球菌の抗原の中和を教え
る。中和のステップはそのような検定を実行するために
かかる時間を増加させる。酸が抽出されるグループＡ連
鎖球菌の抗原の検定は従来技術のものより簡ｒ１ｔで迅
速なため有利である。 史に、細１胞又は細胞片から抽出される配位子の検定「
、順であって、試料からの配位子の抽出と、このために
少なくとも２つの非配位子−との配位トの反応とを同時
に実行して検出可能な反応生成物を形成することかでき
るものは有利である。 （発明の概要） 本発明は、細胞又は細胞片の試料から抽出される配位子
゛を検出するための方法、及びそのような方法を実施す
るための成分を持つキットをｌｊ−える。本発明に基づ
く方法は試料からの配位子−の抽出と、そのために少な
くとも２つの非配位子との配位子−の反応とを同時に行
うため、比較釣部ｍで迅速である。従って、本発明は、
細１ｎ又は細ｊｎ片の試料から抽出される配位子の検定
を実行するための方法において、（ａ）試料からの配位
子−の抽出と、このために少なくとも２つの非配位子と
の配位子の反応とを同時に実行して検出可能な反応生成
物を形成するステップ、及び（ｂ）反応生成物を検出す
るステップを其備するものを提供する。 好ましい実施態様では本発明は、少なくとも１つの非配
位子か固体の支持体に固定される、同相の配位子／非配
位子−の検定を提供する。 また、本発明は、酸か抽出されるグループＡ連鎖球菌の
抗原の検定を実行するための免疫検定方法において、（
Ｊ］）細ｊ旧又は細胞片の試料からグループＡ連鎖球菌
の抗原の酸又は酵素抽出と、このために第１及び第２の
抗体との抗原の反応とを同時に実行して検出可能な反応
生成物を形成するステップ、及び（２）反応生成物を検
出するステップを具備′４−るものを提供する。 史に、本発明は、細胞又は細胞片の試料から抽出される
配位子゛の検定を実行するためのキットにおいて、前記
検定は、（ａ）試料からの配位子の抽出と、このために
少なくとも２つの非配位子との配位子の反応とを同時に
実行して検出可能な反応生成物を形成１−るステップ、
及び（ｂ）反応生成物を検出するステップを具備し、前
記キットは配位子に対する抽出試薬を含む１又は複数の
溶液と、このために少なくとも２つの非配位子とを具備
し、１つの非配位子＝は検出可能な標識を持つものであ
るようなキットを提供する。 好ましい実施態様では本発明は、免疫検定を実行するた
めのキットにおいて、 （１）抗原のための抽出試薬を含む少なくとも１つの溶
液、 （２）抗原のための固定される第１の抗体、（：１）酵
素と共役する抗原のための第２の抗体、（４）酵素のＪ
、ξ質、 （５）色原体、 とを具備するものである。 （実施例） 本発明にＪ、ＩＩ、ついて、細胞又は細ｊθ片から抽出
される配位子−の検定のための方法はＩｙ−えられる。 その方法は（＋）試料から配位子＝の抽出と、複数の非
配位との配位子の反応とを同時に実行して検出可能な反
応生成物を形成するステップ、及び（２）反応生成物を
検出するステップを持つ。 本発明のある実施例の方法では、更に検出ステップの前
に洗浄ステップを持つ。他の実施例では試料はマトリク
スに吸収又は吸着される。 本発明に」＾づ〈方法は固相の配位子／非配位を検定に
通ずる。従って、本発明は、更に細胞又は細胞片の試料
から抽出される配位子の検定を実行するための方法を提
供し、その方法は次の（１）〜（４）のステップを具備
する。（１）配位子を含む試料をマトリクスに吸収又は
吸着させるステップ。 （２）試料の吸収又は吸着の１１η又は後で、配位子に
対する第１の非配位子を含む固定物質でコートされるか
又は該物質をもつ容器の中に、マトリクスを置くステッ
プ。（３）次の（ｉ） （ｉｉ）のステップによって
、配位子の抽出と、このために少なくとも２つの非配位
子との配位子の反応とを同時に実行して、検出可能な反
応生成物を形成するステップ。（１）検出５丁能な１１
ｔの反応生成物を形成するために１・分な少なくとも一
部の配位子−を抽出するための晴の１又はそれ以１−の
抽出試薬を容器の中に加えると共に、配位子に対して、
検出可能な標識を持つ第２の非配位子を含む溶液を容器
に加えるステップ。（ｉ ｉ） 試料からの配位子″
の抽出と反応生成物の形成とを許容するｒめ定められた
時間に管の内容物を培養（ｉｎｃｕｂａＬｉＢ） ”ｌ
−るステップ。 （４）反応生成物を検１１）するステップ。 本発明のある実施例では、抽出試薬は加えられ、マトリ
クスに吸収される。第２の非配位子の溶液は容器の底に
加えられ、配位子は試料から抽出されたとき第２の非配
位子の溶液の中に拡散し、第１及び第２の非配位子−に
よって捕捉される。他の実施例では、抽出試薬と第２の
非配位子−は連続的に又は同時に加えられる。 本発明に基づく方法は配位子−／非配位子検定に適する
けれども、むしろ抗原／抗体検定の方か好ましい。 本発明は細胞又は細胞片の試料から抽出され得る配置１
７子に適用される。適例となるクラスの配位子は、例え
ば炭水化物、蛋白質、ペプチド、ヌクレオチド、及び混
合分子、例えばペプチド、炭水化物を含む。グループＡ
連鎖球１￥１抗原は炭水化物抗原の例である。配位子／
非配位子の反応生成物が適切な器共によるか又は視覚に
よるかによって検出がｕＪ能であるように配位子か十分
ある限り、抽出される配位子の量は広い範囲に亙って変
化させることかできる。 本発明のある実施例では、マトリクスは合成の又は自然
の吸収物質、例えばダクロン、レーヨン、綿、セルロー
スを含む。別の実施例では、マトリクスは、ポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリプロピレン又はカラス繊維のよ
うな合成の又は自然の吸着物質から成る。プラスチック
の棒で、ダクロン又はレーヨンのチップを持つスワブ（
綿棒）は、例えば喉から取られる生物学的試料に適して
いる。 抽出試薬は、配位子−又はその非配位子の分解なしで、
配位子−をうまく抽出するのに適した、いくつかの試薬
、例えば酸、塩基又は酵素であってもよい。１ｌｌｊ硝
酸は酸抽出に好ましく、ストレプトミセスアルバス（ａ
ｌｂｕｓ）酵素はクル・−ブＡ連鎖球菌抗原の酵素抽出
に好ましい。 抗体は斤通の技術によって準備される。例えば抗体は兎
の中に抗原を大わることによって生しさせる。 いくつかの適当な検出方法、例えば旧Ａ、 ｌ１ｌＡ。 １１．１ｓＡ、又は１・ＩＡは、抗Ｊｊａ ／抗体の反
応生成物を検出するために使用される。抗体は放射能、
酵素又は蛍光色素で識別される。現在、酵素は好ましい
標識である。抗体と共役する酵素は、本発明に基つく検
定に使用されるが、ペルオキシダーゼ（過酸化水素）は
酵素の好ましいクラスであり、特に、ホースラディッシ
ュベルオキシターセは好ましい。 本発明に基つく酵素免疫検定に使用する色原体は、酵素
及びその基？１の存在で色を変化させること又は作るこ
とが１１丁能であるような色原体てあってもよい。３．
３’ 、５．５’−テトラメチルベンジジン（’ｒＭＩ
ｌ）は、使用される酵素がホースラデイシュベルオキシ
ダーセであるとき、好ましい色原体である。 本発明は、特に次（＋） 、 （２）のステップによっ
て、グループＡ連鎖球菌の免疫検定に適１−る。 （１）試料からグループＡ連鎖球菌抗原の酸抽出と、検
出＋１７能な反応生成物を形成するために、少なくとも
２つ抗体との抗原の反応とを同時に実行１−るステップ
。 （２）反応生成物を検出するステップ。旧式、ｆｉ
ｌ＾ 又はＩ佳１ｓへのような適切な免疫検定は、グル
ープＡ連鎖球菌の抗原の検出に使用してもよいが、好ま
しい免疫検定は、第１の抗体が容器の表面に固定され、
第２の抗体が酵素と共役１−る測色学的Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ
へサンドイッチ免疫検定（ｃｏｌｏｒｉｍｃＬｒｉｃ
ｌ：１ＩｓＡ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａｙ）である。 そのような測色学的酵素免疫検定では、色の形成又は変
化が生じるとき、色又は色の変化が視見的に又は適切な
器共によって検出できるように、十分な抗原が抽出され
る。種計数技術（１３ｒｃｅｄ ｃｏｕｎｔ −ｒｉｎ
ｇＬｅｃｈｎｉｑｕｃ） （ラムブレイト（Ｕｒｎｌ＋
ｒｃｉｔ） 、 Ｗ、 Ｗ。 「現代微生物学（Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ＋
ｇｙ）４ （１９６２）Ｌ １１．フリーマンアントカ
ンパニー（Ｗ、Ｉｌ、 Ｆｒｃｃｍａｎ＆ （ｒｏ
、 ） ）によって定められるｌＯ″の細胞及びそれ以
トのグループＡ連鎖球菌抗原のニー七は、本発明に基つ
くグループＡ連鎖球菌抗原のＩＥＬＩＳ八によって有益
に検出されている。しかしながら、色が検出され得る限
り、その方法はどんな：１１のグループＡ連３１１球菌
抗原にも適している。 また、本発明は、細胞又は細ｊＲ片の試料から抽出され
る配位子−の検定を実行するためのキットを提供する。 その検定は（＋）試料からの配位子の抽出と、このため
に少なくとも２つの非配位子との配位子−の反応とを同
時に実行して検出可能な反応生成物を形成するステップ
、及び（２）反応生成物を検出するステップとを具備す
る。そのキットは、配位子の抽出試薬を含む１又は複数
の溶液と、配位子−どの検出可能な反応生成物を形成す
るための少なくとも２つ非配位子とを具備する。 実施例において、本発明は免疫検定を実行するためのキ
ットを提供１−る。キットは、抗原の抽出試薬を含む１
又は複数の溶液と、抽出される抗原のための第１の抗体
と、抗原のための第２の抗体とから成り、第１の抗体は
容器又は固体の支持体の表面に固定され、第２の抗体は
酵素と共役する。一実施例において、キットは、更に酵
素の基質及び色原体を含む。他の実施例において、キッ
トは、史に吸収性又は吸着性のマトリクスを含む。 また、本発明はそのようなキラ［・を使用する免疫検定
を実施するための方法を提供する。その方法は、次の（
１）〜（４）のステップから成る。（１）抗原を含む試
料をマトリクスに吸収又は吸着するステップ。 （２）
試料の吸収又は吸着の前又は後で、容−の中にマトリク
スを置くこと。この容器は抗原のための第１の抗体を含
む基質でコーティングされる。（３）次の（ｉ） 、
（ｉ ｉ） のステップによって、抗原の抽出と、こ
のために少なくとも２つの抗体との抗原の反応とも同時
に実行して検出可能な反応生成物を形成するステップ。 （ｉ）検出可能なｊｌｌの反応生成物を形成するために
少なくと６１−分な抗原の−・部を抽出するためのＢｉ
Ｉの１又は複数の抽出試薬を容器の中に加えると共に、
抗原のための第２の抗体を含む溶液を容器の中に入れる
ステップ。この溶液は検出可能な標識を持つ。 （ｉｉ） 試料からの抗原の抽出と、反応生成物の形
成とを許容する予め定められた時間に管の内容物を定温
放置（培り−４−るステップ。 （４）反応生成物を検
出すること。 次の例は本発明を史に説明するため提供される。 対↓ 酸抽出されるグループＡ車釦球菌元ｊ皇のための免疫検
定 以ドに述へる検定において、グループＡ連鎖球菌抗原は
、細胞の試料からの抽出と、そのために固定される抗体
による捕捉とが同時になされる。 この検定は、２つのポリクロナル抗原を用いる、固相、
２サイトの酵素結合免疫検定（１１，１ｓΔ）て、力か
固相で固定され、他方か溶液の中に加えられ、そしてホ
ースラディッシュベルオキシターセと共役する。ポリク
ロナル抗原は、当釆者によって知られた技術を用いて、
兎の中で育てらねて調製される。この検定は定性的又は
ｔ定性的「−順である。 この検定において、試料は喉から取られる。 データは重複して作成（ｒｕｎ）される。試料抗原を含
まないスワブ（綿棒）は負制御として作成され、約１０
″のバクテリアを谷々含も２つの試料のスワブは作成さ
れる。 １庚 １、試料はダクロンのスワブで採集される。このスワブ
は、グループＡ連鎖球菌抗原に対して第１のポリクロナ
ル抗体でコーディング（コート）された管の中に置かれ
る。 抜胚：兎の抗一連鎖球菌Ａ抗体（Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔ
、１−ｓＬｒｅｐ Ａ ａｎｔｉｂｏｄｙ）はＮ−ア
セチルグルコサミンアガロース（ａｇａｒｏｓｃ） （
米国シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃ：ｈｅｍｉｃａｌ
）製、セントルス）を用イテ親和的に清浄（ｐｕｒｉｆ
ｙ）される。 抗゛がコートされる管：ポリスチレン管（Ｎｕｎｃ）は
、−晩中、０．１％のアジドを持つ２５０μＵの１１
ＩＩ Ｓ中で重合した（０．００２％のグルタルアルデ
ヒド）抗一連鎖球菌（４μｇ／管）でコーティングくコ
ート）される。この管は、リン酸塩（ｐＨ７）で一度洗
浄され、−晩中、４％のｌｌ５Ａを持つ、ｐＨ７，４の
リン酸緩衝食島水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆＩｃｒ
ｃｄ ５ａｌｉｎｅ）で定温放置される。そして管は洗
浄され、使用のための準備ができる。 ２．１０５μＵの試：ｉＡはスワブに加えられ、次に１
０５μＵの試薬Ｂか加えられる。最後に、１０５μＵの
試薬Ｃは管の底に加えられる。これらの試薬は次のよう
に構成される。 試薬Ａ：硝酸ナトリウム溶液は蒸留水の中に１リットル
当り１３８グラムの硝酸ナトリウムを加えて作成される
。 基又１：酢酸溶液は１リツトルの蒸留水に対し７．１０
２ ミリリットルの氷酢酸を加えて作成される。 試薬Ｃ：１リツトルの蒸留水に対し、ヒストリス（ｂｉ
ｓＬｒｉｓ）をリットルツ１つ１０．４６クラム、共役
根（ｃｏｎ、ｉ ｕｇａ Ｌｃ）をリットル当り５００
ミリリツトル、トウィーン２０ （ＴＷＩミ］シＮ２０
） 、 ｐＨ６をリットル゛ｌＩ、すｌミリリットルを
加えて作成される。 左役水：兎の抗一連鎖球菌Ａ抗体は、ナカネ法（１１，
に、）ナカネ（Ｎａｋａｎｃ）、八、カワシ（Ｋａｗａ
ｓｉ）「ジュー１組織化学、細胞化学（Ｊ、ｌｌ１ｓ１
．ｏｃｔ＋ｃｍ。 ｆ：ｙｌ、ｏｃｈｅｍ、）」２２．１０８４（１９７４
）の修正を用いて、親和的に清浄され、ＩＩＩＩＰと共
役１−る。 ３．これらの試薬は約３分間、定７品放置（ｉｎｃｕｂ
ａｌ、）される。 ４、スワブか取り除かれ、７０マイクロリツトルの洗浄
液か加えられる。 洗浄液：洗浄液は、１リツトルの蒸留水に対し一塩Ｊ、
（性リン酸カリウムをリットル当り１４．０９グラム、
二塩基性リン酸カリウムをリットル当り６０．：１６グ
ラム、塩素酸ナトリウムをリットル当り８ 、 Ｉ Ｏ
ダラム、トリトン（’ｒ旧ＴＯＮ）Ｘ１００、ＱＳをリ
ットル当り９０ミリリツトル、ｐｌ＋７．Ｊを加えて構
成される。 ５゜管は水で満され、デカント（別の容器等へ移すこと
）される。この手順は４回水により繰り返される。 ６ 最後のデカントの後、管の外へ流れる水は、次のセ
ットの試薬の希釈を防ぐため、吸い取られる。 ７．１００マイクロリツトルの試薬り及び５０マイクロ
リツトルの試薬Ｅは管に加えられる。 試薬りは基質溶液であり、トライトロウス酢酸ナトリウ
ムをリットル当りＩ ：ｌ 、 ６１５グラム、過酸化
尿素（エリアペルオキシド）をリットル当り０．４７グ
ラム、１．０モルのクエン酸溶液、ｐ１１５を蒸留水に
すべて溶かして構成される。 試薬Ｅは色原体溶液であり、５００ミリリツトルのメタ
ノールを５００ミリリツトルのグリセロールに加え、史
にその１リツトルの溶液に１．２７グラム（７） ’ｒ
Ｍ１１を加える。ＴＭＩ）は３． ：Ｉ’ 、５．５’
（Ｄテトラメチルベンジジンである。 ８、管は３分間、定温放置される。 ９、光学的濃度（以Ｆ、０．Ｄ、と略称する）を決定す
るために、管は、０．５Ｎの硫酸溶液を１ミリリツトル
で満され、０．Ｄ、は４５０ナノメートルの解析で読み
出される。 管 虹し 制御１０．０４１ 制御２ ０．０４０ 試料１ ０．４６３ 試料２ ０．２２８ 負制御より大きな強さくインテンシテイ）の１１１色の
存在は、正の結果か考慮される。試料の０ 、 Ｄ 、
の変化はスワブにおける試薬の吸収の変化のために生じ
る。 形 Ａ、酸」ｕ」 グループＡ連鎖球菌抗原がいくつかの異なったｐＨの値
で抽出されることを除いて、ＩＦｆ記例油側述へたよう
に、免疫検定（イムノアッセイ）はグループＡ連鎖球菌
抗原の抽出に関して最適ｐｌ＋を決定するために実行さ
れる。この検定の結果を第１図に示す。 Ｂ一度堕上ネ煎荀澄 亜硝酸が抽出される連鎖球菌が試料として用いられるこ
と、及び検定がいくつかの異なったｐＨの値で導かれる
ことを除いて、ｍｌ記油側で述べたように、グループＡ
連鎖球菌抗原の免疫化学的結合に関して最適ｐｌ＋を決
定するための免疫検定は実行される。この検定の結果を
第１図に示す。 Ｃ９級−盟 前記例１の免疫検定に」、（づき、グループＡ連３ｎ球
菌抗原の抽出と免疫化学的結合を同時に実行するための
最′ＪｆｉｐＨは約ｐＨ４，’ｌで決定される。 皿ｌ グループ八゛
れる配位子（リガント）の検定（アッセイ）に関し、特
に、（１）試料からの配位子〜の抽出と、このために少
なくとも２つの非配位子−（アンチリカント）との配位
子−の反応とを同時に実行して検出可能な反応生成物を
形成″４″ること、及び（２）反応生成物を検出するこ
とにｊ；る検定に関１−るものである。更に、本発明は
そのような検定を実行するＪＴ法、及びそのような方法
を実施″４−るための成分を持つキットに関するもので
ある。 （背１１．技術） 液体試料中の、特定の物質の存在及び濃度を検定するた
めの技術は当業者によって知られている。そのような技
術は、例えば放射性標識免疫検定（旧酊ｒａｄｉｏｉｍ
ｍｕｎｏａｓＳａｙｓ） 、酵素免疫検定（］（１八；
へｎ７ｙｍｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）、酵素結合
免疫検定（１：１．ＩｓΔ：Ｃｒ＋ｚｙｍｃ−１ｉｎｋ
ｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ） 、及び関連する蛋
白″ｊ１結合力法（ｐｒｏｌ、ａｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ
ｍｃｌ、ｔ＋ｏｄｏｌｏｇｉｃｓ）がある。これらの技
術のずぺては特定のレセプタを分類するために化合物の
結合を含む。従って、配位子／非配位子−検定（リガン
ド／アンチ−リカシトアッセイ）の 般的なカブコリ、
即ち検定で生しる相ノア、作用の特別なタイプ、又は反
応に関′チー・）−る成分の特別なタイプに制限されな
いカブコリに分類される。］）−へての配位子／非配位
子−検定は次の２つの＋’＋ｆ提に基づくものである６
（＋）ｉ対の物質（配位子−／非配位７’−）は〃いに
強い特定の親和力を持つ。即ち、１対の物質は、互いに
結合する傾向かあるが、他の物質に対してほとんど、又
は全く結合しない。 （２）その方法は、−・度、錯体
が形成されると、相ｔ７−作用で結合する配位′ｆ／非
配位子・の検出を５丁能とするように開発され得る。 ここで、配位Ｔ−は検出される物質として定義され、非
配位−ｒ−は配位ｔの存在を探るために使用される物質
として定義される。配位子／非配位子検定において、追
加的な修正される配位子は非配位子の結合部位に対して
、検出すべき物質として対抗するものとして使用される
。この場合において配位子又は非配位子のいずれか一方
の固定化は反応生成物の検出を容易にする。 配位子／非配位子の反応は、反応生成物を識別するため
に種々の標識（ラベル）を用いる、種々の方法で検出さ
れる。現在、最も庁通に用いられる標識は、酵素、蛍光
色素及び放射性化合物である。 配位子／非配位子の検定方法は抗体又は抗原、即ち試料
内の配位子の存在又は不在を検出するための酵素免疫検
定（［：Ｉ八）に適用される。近年、ＩＥ［八及びＩ：
ＬＩＳへの使用は、生物学的活性物質の検出及び計叶の
ためにますますＪ要になっている。典型的な１４Ｌｌｓ
八法では、抗原は特定の抗体との抗原の捕捉によって直
接又は間接に検出され、また、適切な条件下で、」、（
質による反応で触媒作用する酵素標識抗体（ｃｎｚｙｍ
ｃ−１ａｂｅｌｅｄ ａｎＬｉｂｏｄｉｃｓ）の使用に
よって結合した抗原か検出される。酵素の活性は、 一
般に着色された反応生成物の外観によって検出される。 いくつかの酵素はアルカリフォスファターセ、ホースラ
ディッシュベルオキシターセ及びグルコースオキシダー
ゼを含み、抗原又は抗体と結合される。ホースラディッ
シュベルオキシターゼ（１１旧’；ｈｏｒｓｅｒａｄｉ
ｓｈ ｐｃｒｏｘｉｄａｓｃ）は共通に使用される。 いくつかの基質は１１旧）に使用できる。視覚的検出に
おいて、基質は過酸化水素及び色原体（ｃｈｒｏｍｏｇ
ｃｎｉｃ ｍａＬｃｒｉａｌ） 、例えばオルトフェニ
レンジアミン（（］−ｐｈｃｎｙｌｃｎｃｄｉａｍｉｎ
ｃ）又はデトラメチルベンシジン（１，ｃＬｒａｍｃＬ
ｈｙｌｂｃｎｚｉｄｉｎｃ）のような酸化により色を表
わすものを含む。 蛍光免疫検定技術（目へ；ｆｌｕｏｒｃｓｃｃｎ１．
ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）では抗原は蛍光色素標識抗体
（ｒ Ｉｕｏｒｏｃｈｒｏｍｃ −１ａｂｃｌｃｄ ａ
ｎｌ、１ｂｏｄｉｃｓ）で直接又は間接的に識別される
。蛍光色素は、励起される放射（例えば紫外線光）を吸
収し、かつ光（例えば可視光）を放射１ｊ−る染料であ
る。最も一般的に使用される蛍光色素はフルオレセイン
イソチオシアネート及びテトラメチルイソチオシアネー
トである。 生物学的試料における分析の配位Ｔ−／非配位子反応に
よる検出な標識化合物を採用する方法の使用を通して達
成される。種々の旧式技術、例えば配位子の直接又は間
接のｄｌ１１定は当業者によって知られている。 配位子／非配位子検定は匡薬の分野、例えば伝染病の診
断に適用される。病医学的因子（ｅｔｉｏｌｏ−ｇｉｃ
ａｌ ａｇｃｎＬ）の正確な同一が確立された後だＧ−
ｊ、伝染病の正確な診断及び治療か可能である。微生物
の場合では、微生物の同定、及び微生物のグループの同
定のために使用される、種又はグループの特定の抗原、
即ち配位子は、例えば全細胞、細ｊθ壁又は細胞片から
抽出される。そのような配位子−の検出のための検定か
簡！ｎで迅速であることが望ましい。 グループＡ連２ｒ１球閑の抗原、即ち多糖類は配位子／
非配位子−検定の使用によって有利に検定され得る。ヘ
ータ溶血性の（ｂｅＬａ−ｈｏｍｏｌｙＬｉｃ）、病原
性のグループＡ連鎖球菌は、人間のに部呼吸管及び皮膚
の伝染病と関連する最も一般的な細菌の媒介物（ａｇｅ
ｎＬ）である。最も高い発生はｒ供に典Ｊｌ、Ｉｔ、的
に発見される。抗生療法は選択の治療である。左記の治
療がされない場合には、グループＡ連２０球菌伝染病は
リューマチ熱のようなより深刻な合併症を導く（ウォン
ナーマーカー（Ｗａｎｎａｍａｋｃｒ） 、 ｌ 。 Ｉ）＝［レビューズオブインタ、ディス、 （ｌｌｃ
ｖｉｃｗｓ ｏｒｌｎｌ、、Ｄｉｓ、） 」、 １
：９６７−９７：Ｉ、 １９７９：カタンサロ（ｆ：
ａｌａｎｚａｒｏ） 、ト、、１１他： ［アメ−、シ
ー、メツ１−（Ａｍｃｒ、Ｊ、Ｍｃｄ、）Ｊ、１７：７
４！ｌ−７５６，１９５４）。人間の病気の病因学的因
ｒとしてのグループＡ連鎖球］＾１の頻度か高いので、
筒中−で迅速な診断の方法か要求されている。培Ａ （
ｃｕ ｌ Ｌｕｒｅ）から分離したグループＡ連３ｎ球
菌の同定に使用される現在の方法はバシトラシンサセプ
ティビイリティ（ｂａｃｉＬｒａｃｉｎｓｕｓｃｃｐＬ
ｉｂｉｌｉＬｙ）及びラテックススライド膠着（ＩａＬ
ｃｘ ５ｌｉｄｅ ａＨｌｕＬｉｎａＬｉｏｎ）を含む
。確証的な方法は、免疫蛍光法、沈降素試験及び凝析（
ｃｏａａｇｇｌｕＬｉｎａＬｉｏｎ）を含む（カブラン
（ｋａｐ ｌ ａｎ） 。 Ｌ、に、他［シェ、タリン、マイクロ、 （，１，Ｃ
ｌ１ｎ。 Ｍｉｃｒｏ、） Ｊ 、 １４（６）：６７８−６８０
，１９８１； ロス（ｆｌｏｓｓ） 。 ）） 、 Ｗ 、他「ジェ、タリン、バドル （Ｊ、Ｇ
ｌｉ口。 ＰａＬｈｏｌ、）」、 ３３：６９１−６９：１．１９
８０： カミング（Ｃｕｍｍｉｎｇ） 、Ｃ，Ｇ、他［
シェ、メッド、マイクロ。 （，１，Ｍｃｄ、Ｍｉｃｒｏ ） Ｊ １３： ４５９
−４６１．１９８０：ファクラム（１’ａｃｋｌａｍ）
Ｊｌ、１１．他「エエム、ジェ、タリン、バト 、
（八ｍ、Ｊ、ｃＩｉｎ、Ｐａｔ、ｈ、） Ｊ 、
５：６０８−６１０．１９８２； ＆びエトワー
ド（ｌＥｄｗａｒｄｓ） 、 Ｅ 、八、他［ジエ、タ
リン。 マイクロ、（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏ、）］、 ！５
（３）：４８１−４８３゜（１９８２）。 連鎖球菌の細胞壁から特定グループの多糖類の抽出は酸
を含む抽出試薬で達成される。その技術は、抗原の存在
を検出するために免疫学的な検定り順を実行する而に、
酸が抽出されるグループＡ連鎖球菌の抗原の中和を教え
る。中和のステップはそのような検定を実行するために
かかる時間を増加させる。酸が抽出されるグループＡ連
鎖球菌の抗原の検定は従来技術のものより簡ｒ１ｔで迅
速なため有利である。 史に、細１胞又は細胞片から抽出される配位子の検定「
、順であって、試料からの配位子の抽出と、このために
少なくとも２つの非配位子−との配位トの反応とを同時
に実行して検出可能な反応生成物を形成することかでき
るものは有利である。 （発明の概要） 本発明は、細胞又は細胞片の試料から抽出される配位子
゛を検出するための方法、及びそのような方法を実施す
るための成分を持つキットをｌｊ−える。本発明に基づ
く方法は試料からの配位子−の抽出と、そのために少な
くとも２つの非配位子との配位子−の反応とを同時に行
うため、比較釣部ｍで迅速である。従って、本発明は、
細１ｎ又は細ｊｎ片の試料から抽出される配位子の検定
を実行するための方法において、（ａ）試料からの配位
子−の抽出と、このために少なくとも２つの非配位子と
の配位子の反応とを同時に実行して検出可能な反応生成
物を形成するステップ、及び（ｂ）反応生成物を検出す
るステップを其備するものを提供する。 好ましい実施態様では本発明は、少なくとも１つの非配
位子か固体の支持体に固定される、同相の配位子／非配
位子−の検定を提供する。 また、本発明は、酸か抽出されるグループＡ連鎖球菌の
抗原の検定を実行するための免疫検定方法において、（
Ｊ］）細ｊ旧又は細胞片の試料からグループＡ連鎖球菌
の抗原の酸又は酵素抽出と、このために第１及び第２の
抗体との抗原の反応とを同時に実行して検出可能な反応
生成物を形成するステップ、及び（２）反応生成物を検
出するステップを具備′４−るものを提供する。 史に、本発明は、細胞又は細胞片の試料から抽出される
配位子゛の検定を実行するためのキットにおいて、前記
検定は、（ａ）試料からの配位子の抽出と、このために
少なくとも２つの非配位子との配位子の反応とを同時に
実行して検出可能な反応生成物を形成１−るステップ、
及び（ｂ）反応生成物を検出するステップを具備し、前
記キットは配位子に対する抽出試薬を含む１又は複数の
溶液と、このために少なくとも２つの非配位子とを具備
し、１つの非配位子＝は検出可能な標識を持つものであ
るようなキットを提供する。 好ましい実施態様では本発明は、免疫検定を実行するた
めのキットにおいて、 （１）抗原のための抽出試薬を含む少なくとも１つの溶
液、 （２）抗原のための固定される第１の抗体、（：１）酵
素と共役する抗原のための第２の抗体、（４）酵素のＪ
、ξ質、 （５）色原体、 とを具備するものである。 （実施例） 本発明にＪ、ＩＩ、ついて、細胞又は細ｊθ片から抽出
される配位子−の検定のための方法はＩｙ−えられる。 その方法は（＋）試料から配位子＝の抽出と、複数の非
配位との配位子の反応とを同時に実行して検出可能な反
応生成物を形成するステップ、及び（２）反応生成物を
検出するステップを持つ。 本発明のある実施例の方法では、更に検出ステップの前
に洗浄ステップを持つ。他の実施例では試料はマトリク
スに吸収又は吸着される。 本発明に」＾づ〈方法は固相の配位子／非配位を検定に
通ずる。従って、本発明は、更に細胞又は細胞片の試料
から抽出される配位子の検定を実行するための方法を提
供し、その方法は次の（１）〜（４）のステップを具備
する。（１）配位子を含む試料をマトリクスに吸収又は
吸着させるステップ。 （２）試料の吸収又は吸着の１１η又は後で、配位子に
対する第１の非配位子を含む固定物質でコートされるか
又は該物質をもつ容器の中に、マトリクスを置くステッ
プ。（３）次の（ｉ） （ｉｉ）のステップによって
、配位子の抽出と、このために少なくとも２つの非配位
子との配位子の反応とを同時に実行して、検出可能な反
応生成物を形成するステップ。（１）検出５丁能な１１
ｔの反応生成物を形成するために１・分な少なくとも一
部の配位子−を抽出するための晴の１又はそれ以１−の
抽出試薬を容器の中に加えると共に、配位子に対して、
検出可能な標識を持つ第２の非配位子を含む溶液を容器
に加えるステップ。（ｉ ｉ） 試料からの配位子″
の抽出と反応生成物の形成とを許容するｒめ定められた
時間に管の内容物を培養（ｉｎｃｕｂａＬｉＢ） ”ｌ
−るステップ。 （４）反応生成物を検１１）するステップ。 本発明のある実施例では、抽出試薬は加えられ、マトリ
クスに吸収される。第２の非配位子の溶液は容器の底に
加えられ、配位子は試料から抽出されたとき第２の非配
位子の溶液の中に拡散し、第１及び第２の非配位子−に
よって捕捉される。他の実施例では、抽出試薬と第２の
非配位子−は連続的に又は同時に加えられる。 本発明に基づく方法は配位子−／非配位子検定に適する
けれども、むしろ抗原／抗体検定の方か好ましい。 本発明は細胞又は細胞片の試料から抽出され得る配置１
７子に適用される。適例となるクラスの配位子は、例え
ば炭水化物、蛋白質、ペプチド、ヌクレオチド、及び混
合分子、例えばペプチド、炭水化物を含む。グループＡ
連鎖球１￥１抗原は炭水化物抗原の例である。配位子／
非配位子の反応生成物が適切な器共によるか又は視覚に
よるかによって検出がｕＪ能であるように配位子か十分
ある限り、抽出される配位子の量は広い範囲に亙って変
化させることかできる。 本発明のある実施例では、マトリクスは合成の又は自然
の吸収物質、例えばダクロン、レーヨン、綿、セルロー
スを含む。別の実施例では、マトリクスは、ポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリプロピレン又はカラス繊維のよ
うな合成の又は自然の吸着物質から成る。プラスチック
の棒で、ダクロン又はレーヨンのチップを持つスワブ（
綿棒）は、例えば喉から取られる生物学的試料に適して
いる。 抽出試薬は、配位子−又はその非配位子の分解なしで、
配位子−をうまく抽出するのに適した、いくつかの試薬
、例えば酸、塩基又は酵素であってもよい。１ｌｌｊ硝
酸は酸抽出に好ましく、ストレプトミセスアルバス（ａ
ｌｂｕｓ）酵素はクル・−ブＡ連鎖球菌抗原の酵素抽出
に好ましい。 抗体は斤通の技術によって準備される。例えば抗体は兎
の中に抗原を大わることによって生しさせる。 いくつかの適当な検出方法、例えば旧Ａ、 ｌ１ｌＡ。 １１．１ｓＡ、又は１・ＩＡは、抗Ｊｊａ ／抗体の反
応生成物を検出するために使用される。抗体は放射能、
酵素又は蛍光色素で識別される。現在、酵素は好ましい
標識である。抗体と共役する酵素は、本発明に基つく検
定に使用されるが、ペルオキシダーゼ（過酸化水素）は
酵素の好ましいクラスであり、特に、ホースラディッシ
ュベルオキシターセは好ましい。 本発明に基つく酵素免疫検定に使用する色原体は、酵素
及びその基？１の存在で色を変化させること又は作るこ
とが１１丁能であるような色原体てあってもよい。３．
３’ 、５．５’−テトラメチルベンジジン（’ｒＭＩ
ｌ）は、使用される酵素がホースラデイシュベルオキシ
ダーセであるとき、好ましい色原体である。 本発明は、特に次（＋） 、 （２）のステップによっ
て、グループＡ連鎖球菌の免疫検定に適１−る。 （１）試料からグループＡ連鎖球菌抗原の酸抽出と、検
出＋１７能な反応生成物を形成するために、少なくとも
２つ抗体との抗原の反応とを同時に実行１−るステップ
。 （２）反応生成物を検出するステップ。旧式、ｆｉ
ｌ＾ 又はＩ佳１ｓへのような適切な免疫検定は、グル
ープＡ連鎖球菌の抗原の検出に使用してもよいが、好ま
しい免疫検定は、第１の抗体が容器の表面に固定され、
第２の抗体が酵素と共役１−る測色学的Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ
へサンドイッチ免疫検定（ｃｏｌｏｒｉｍｃＬｒｉｃ
ｌ：１ＩｓＡ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａｙ）である。 そのような測色学的酵素免疫検定では、色の形成又は変
化が生じるとき、色又は色の変化が視見的に又は適切な
器共によって検出できるように、十分な抗原が抽出され
る。種計数技術（１３ｒｃｅｄ ｃｏｕｎｔ −ｒｉｎ
ｇＬｅｃｈｎｉｑｕｃ） （ラムブレイト（Ｕｒｎｌ＋
ｒｃｉｔ） 、 Ｗ、 Ｗ。 「現代微生物学（Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ＋
ｇｙ）４ （１９６２）Ｌ １１．フリーマンアントカ
ンパニー（Ｗ、Ｉｌ、 Ｆｒｃｃｍａｎ＆ （ｒｏ
、 ） ）によって定められるｌＯ″の細胞及びそれ以
トのグループＡ連鎖球菌抗原のニー七は、本発明に基つ
くグループＡ連鎖球菌抗原のＩＥＬＩＳ八によって有益
に検出されている。しかしながら、色が検出され得る限
り、その方法はどんな：１１のグループＡ連３１１球菌
抗原にも適している。 また、本発明は、細胞又は細ｊＲ片の試料から抽出され
る配位子−の検定を実行するためのキットを提供する。 その検定は（＋）試料からの配位子の抽出と、このため
に少なくとも２つの非配位子との配位子−の反応とを同
時に実行して検出可能な反応生成物を形成するステップ
、及び（２）反応生成物を検出するステップとを具備す
る。そのキットは、配位子の抽出試薬を含む１又は複数
の溶液と、配位子−どの検出可能な反応生成物を形成す
るための少なくとも２つ非配位子とを具備する。 実施例において、本発明は免疫検定を実行するためのキ
ットを提供１−る。キットは、抗原の抽出試薬を含む１
又は複数の溶液と、抽出される抗原のための第１の抗体
と、抗原のための第２の抗体とから成り、第１の抗体は
容器又は固体の支持体の表面に固定され、第２の抗体は
酵素と共役する。一実施例において、キットは、更に酵
素の基質及び色原体を含む。他の実施例において、キッ
トは、史に吸収性又は吸着性のマトリクスを含む。 また、本発明はそのようなキラ［・を使用する免疫検定
を実施するための方法を提供する。その方法は、次の（
１）〜（４）のステップから成る。（１）抗原を含む試
料をマトリクスに吸収又は吸着するステップ。 （２）
試料の吸収又は吸着の前又は後で、容−の中にマトリク
スを置くこと。この容器は抗原のための第１の抗体を含
む基質でコーティングされる。（３）次の（ｉ） 、
（ｉ ｉ） のステップによって、抗原の抽出と、こ
のために少なくとも２つの抗体との抗原の反応とも同時
に実行して検出可能な反応生成物を形成するステップ。 （ｉ）検出可能なｊｌｌの反応生成物を形成するために
少なくと６１−分な抗原の−・部を抽出するためのＢｉ
Ｉの１又は複数の抽出試薬を容器の中に加えると共に、
抗原のための第２の抗体を含む溶液を容器の中に入れる
ステップ。この溶液は検出可能な標識を持つ。 （ｉｉ） 試料からの抗原の抽出と、反応生成物の形
成とを許容する予め定められた時間に管の内容物を定温
放置（培り−４−るステップ。 （４）反応生成物を検
出すること。 次の例は本発明を史に説明するため提供される。 対↓ 酸抽出されるグループＡ車釦球菌元ｊ皇のための免疫検
定 以ドに述へる検定において、グループＡ連鎖球菌抗原は
、細胞の試料からの抽出と、そのために固定される抗体
による捕捉とが同時になされる。 この検定は、２つのポリクロナル抗原を用いる、固相、
２サイトの酵素結合免疫検定（１１，１ｓΔ）て、力か
固相で固定され、他方か溶液の中に加えられ、そしてホ
ースラディッシュベルオキシターセと共役する。ポリク
ロナル抗原は、当釆者によって知られた技術を用いて、
兎の中で育てらねて調製される。この検定は定性的又は
ｔ定性的「−順である。 この検定において、試料は喉から取られる。 データは重複して作成（ｒｕｎ）される。試料抗原を含
まないスワブ（綿棒）は負制御として作成され、約１０
″のバクテリアを谷々含も２つの試料のスワブは作成さ
れる。 １庚 １、試料はダクロンのスワブで採集される。このスワブ
は、グループＡ連鎖球菌抗原に対して第１のポリクロナ
ル抗体でコーディング（コート）された管の中に置かれ
る。 抜胚：兎の抗一連鎖球菌Ａ抗体（Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔ
、１−ｓＬｒｅｐ Ａ ａｎｔｉｂｏｄｙ）はＮ−ア
セチルグルコサミンアガロース（ａｇａｒｏｓｃ） （
米国シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃ：ｈｅｍｉｃａｌ
）製、セントルス）を用イテ親和的に清浄（ｐｕｒｉｆ
ｙ）される。 抗゛がコートされる管：ポリスチレン管（Ｎｕｎｃ）は
、−晩中、０．１％のアジドを持つ２５０μＵの１１
ＩＩ Ｓ中で重合した（０．００２％のグルタルアルデ
ヒド）抗一連鎖球菌（４μｇ／管）でコーティングくコ
ート）される。この管は、リン酸塩（ｐＨ７）で一度洗
浄され、−晩中、４％のｌｌ５Ａを持つ、ｐＨ７，４の
リン酸緩衝食島水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆＩｃｒ
ｃｄ ５ａｌｉｎｅ）で定温放置される。そして管は洗
浄され、使用のための準備ができる。 ２．１０５μＵの試：ｉＡはスワブに加えられ、次に１
０５μＵの試薬Ｂか加えられる。最後に、１０５μＵの
試薬Ｃは管の底に加えられる。これらの試薬は次のよう
に構成される。 試薬Ａ：硝酸ナトリウム溶液は蒸留水の中に１リットル
当り１３８グラムの硝酸ナトリウムを加えて作成される
。 基又１：酢酸溶液は１リツトルの蒸留水に対し７．１０
２ ミリリットルの氷酢酸を加えて作成される。 試薬Ｃ：１リツトルの蒸留水に対し、ヒストリス（ｂｉ
ｓＬｒｉｓ）をリットルツ１つ１０．４６クラム、共役
根（ｃｏｎ、ｉ ｕｇａ Ｌｃ）をリットル当り５００
ミリリツトル、トウィーン２０ （ＴＷＩミ］シＮ２０
） 、 ｐＨ６をリットル゛ｌＩ、すｌミリリットルを
加えて作成される。 左役水：兎の抗一連鎖球菌Ａ抗体は、ナカネ法（１１，
に、）ナカネ（Ｎａｋａｎｃ）、八、カワシ（Ｋａｗａ
ｓｉ）「ジュー１組織化学、細胞化学（Ｊ、ｌｌ１ｓ１
．ｏｃｔ＋ｃｍ。 ｆ：ｙｌ、ｏｃｈｅｍ、）」２２．１０８４（１９７４
）の修正を用いて、親和的に清浄され、ＩＩＩＩＰと共
役１−る。 ３．これらの試薬は約３分間、定７品放置（ｉｎｃｕｂ
ａｌ、）される。 ４、スワブか取り除かれ、７０マイクロリツトルの洗浄
液か加えられる。 洗浄液：洗浄液は、１リツトルの蒸留水に対し一塩Ｊ、
（性リン酸カリウムをリットル当り１４．０９グラム、
二塩基性リン酸カリウムをリットル当り６０．：１６グ
ラム、塩素酸ナトリウムをリットル当り８ 、 Ｉ Ｏ
ダラム、トリトン（’ｒ旧ＴＯＮ）Ｘ１００、ＱＳをリ
ットル当り９０ミリリツトル、ｐｌ＋７．Ｊを加えて構
成される。 ５゜管は水で満され、デカント（別の容器等へ移すこと
）される。この手順は４回水により繰り返される。 ６ 最後のデカントの後、管の外へ流れる水は、次のセ
ットの試薬の希釈を防ぐため、吸い取られる。 ７．１００マイクロリツトルの試薬り及び５０マイクロ
リツトルの試薬Ｅは管に加えられる。 試薬りは基質溶液であり、トライトロウス酢酸ナトリウ
ムをリットル当りＩ ：ｌ 、 ６１５グラム、過酸化
尿素（エリアペルオキシド）をリットル当り０．４７グ
ラム、１．０モルのクエン酸溶液、ｐ１１５を蒸留水に
すべて溶かして構成される。 試薬Ｅは色原体溶液であり、５００ミリリツトルのメタ
ノールを５００ミリリツトルのグリセロールに加え、史
にその１リツトルの溶液に１．２７グラム（７） ’ｒ
Ｍ１１を加える。ＴＭＩ）は３． ：Ｉ’ 、５．５’
（Ｄテトラメチルベンジジンである。 ８、管は３分間、定温放置される。 ９、光学的濃度（以Ｆ、０．Ｄ、と略称する）を決定す
るために、管は、０．５Ｎの硫酸溶液を１ミリリツトル
で満され、０．Ｄ、は４５０ナノメートルの解析で読み
出される。 管 虹し 制御１０．０４１ 制御２ ０．０４０ 試料１ ０．４６３ 試料２ ０．２２８ 負制御より大きな強さくインテンシテイ）の１１１色の
存在は、正の結果か考慮される。試料の０ 、 Ｄ 、
の変化はスワブにおける試薬の吸収の変化のために生じ
る。 形 Ａ、酸」ｕ」 グループＡ連鎖球菌抗原がいくつかの異なったｐＨの値
で抽出されることを除いて、ＩＦｆ記例油側述へたよう
に、免疫検定（イムノアッセイ）はグループＡ連鎖球菌
抗原の抽出に関して最適ｐｌ＋を決定するために実行さ
れる。この検定の結果を第１図に示す。 Ｂ一度堕上ネ煎荀澄 亜硝酸が抽出される連鎖球菌が試料として用いられるこ
と、及び検定がいくつかの異なったｐＨの値で導かれる
ことを除いて、ｍｌ記油側で述べたように、グループＡ
連鎖球菌抗原の免疫化学的結合に関して最適ｐｌ＋を決
定するための免疫検定は実行される。この検定の結果を
第１図に示す。 Ｃ９級−盟 前記例１の免疫検定に」、（づき、グループＡ連３ｎ球
菌抗原の抽出と免疫化学的結合を同時に実行するための
最′ＪｆｉｐＨは約ｐＨ４，’ｌで決定される。 皿ｌ グループ八゛
【（鎖球γ′ｉ、Ｆ、のイリん・。
以下に述べる検定は２つのポリクロナノＵ抗体を用いる
、定ｊｉｉ、的な同相、２サイトの酵素結合免疫検定（
＋］、ｌ５Ａ）であり、一方の抗体は同相で固定され、
他方の抗体は溶液に加えられ、ホースラディシュベルオ
キシダーゼと共役する。この検定は、１）η油側１で述
べたように、抗体、抗体がコートされる管、共役根、基
質、色原体及び洗浄溶液を用いて実行される。 １、連鎖球菌Ａのサスベンジジン（懸濁液）を含む試料
の１０乃至３０ミリリツトルの測定されるアリコート（
試料の一部）は、第１のポリクロナル抗体でコートされ
る管に加えられる。 ２．１０５マイクロリツトルの試薬Ａは管に加えられ、
次に１０５マイクロリツトルの試薬Ｂが加えられる。最
後に、１０５マイクロリツトルの試薬Ｃは管の底に加え
られる。 ３、これらの試薬は約３分間、定温放置される。 ４．７０マイクロリツトルの洗浄液が加えられる。 ５、管は水で満されデカントされる。この手順は４回水
で繰り返される。 ６、最後のデカントの後管の外へ流れる水は次のセット
の試薬の希釈を防ぐために吸い取られる。 ７．１０（ｌマイクロリットルの試薬り及び５０マイク
ロリツトルの試薬Ｅは管に加えられる。 ８、管は約２分間又はそれ以上、定温放置される。 ９、試料は重複して作成される。標準曲線（ｓｔ、ａｎ
ｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）はＯ，Ｄ、ｌニットによってｍ
ｌ当りのバクテリアの数を決定するために作成（ｒｕｎ
）される。標準連鎖球菌のサスペンシミマンは、標準的
なコロニー計数方法を用いて、ミリリットル当りのバク
テリアの数を決定することによってｊｉＩられる。標慴
すスベンジＥｌンのアリコート及び試料は、インキュベ
ーション（定温放置）時間を含む同一のＬ順に従って検
定される。 例】。 この検定は、ｌｔｆ記例油側述べたように、抗体、抗体
がコートされる管、共役根、基質、色原体を用いて実行
される。、ストレプトミセスアルバス酵素は、この検定
において、グループＡ連釦球菌抗Ｊｊ；ｊを抽出するた
めに使用される。 −Ｌ順 （＋＞ −−一晩中の肉汁培Ａ （ｂｒｏＬｈ ｃｕｌ
Ｌｕｒｃ）による連鎖球菌のグループＡ培養は、遠心分
離機にかけられ、６：ｌＯｎｍにおいてコレマンスペク
トル光度計（スペクトロフォトメータ）で測定したとき
の０．０３のり、Ｄ、まてリン酸緩衝食塩水で懸濁され
る。この懸濁液は、コロニー計数によって決定されたと
き、又はブリード法（口ｒｅａｄ ＭｃＬｈｏｄ）によ
るとき５ Ｘ １０７細胞／１ｎｆｌを示す。この懸濁
液の２０ミリリツトルは抗一連８１球菌Ａ抗体がコート
される管に加えられる。 ストレプトミセスアルバスを素：ストレブトミセスアル
バス酵素はＷ、Ｒ，マックステッド（Ｍａｘｔｃｄ）の
手順に従って作成される（「ザ ランセット（Ｔｈｅ
Ｉ、ａｎｃｃｊ）」Ｖｏｌ、２．（１９４８，８月！４
日） ｐＨ，２５５−２５６）。 （２） ０．１％のトウィーン（ＴＷＥＥＮ）２０を含
む５０μ２の共役根（ｃｏｎｊｕｇａＬｅ）が管に加え
られる。 （３） ３００μ２のストレプトミセスアルバス酵素が
管に加えられる。 （４）ステップ３の溶液は室温で２０分間、放置される
。 （５）管は給水栓の水（タップウォータ）で５回洗浄さ
れる。 （６） １００μ２の基質及び５０μ２の色原体は管に
加えられ、室温で５分間、保持される。 （７） １ ｍｌの０．５Ｎｔ１２ＳＯ＜が管に加
えられ、４５０ｎｍでスペクトル光度計により読み出さ
れる。 結果 ■んＩ四囲） 叫 ０ ０ 、０ ：Ｉ
２０ ０．０４０１ｘ
１０” Ｏ，：ｌ：１２１
ｘ Ｉｏ６ ０．：］５７１・１
・１相、２サイトの酵素結合同時免疫検定を用いた１−
述の例は、中、に本発明を使用した２つの例である。こ
れらの例で述べた実際の工程の変形は゛Ｐ１業者によっ
て容易になされる。従って、本発明は本実施例に限られ
るものではない。 （発明の効果） 以ト詳細に説明したように本発明によれば、筒中−かつ
迅速に配位子／非配位〆−の検定を実行することかでき
る。
、定ｊｉｉ、的な同相、２サイトの酵素結合免疫検定（
＋］、ｌ５Ａ）であり、一方の抗体は同相で固定され、
他方の抗体は溶液に加えられ、ホースラディシュベルオ
キシダーゼと共役する。この検定は、１）η油側１で述
べたように、抗体、抗体がコートされる管、共役根、基
質、色原体及び洗浄溶液を用いて実行される。 １、連鎖球菌Ａのサスベンジジン（懸濁液）を含む試料
の１０乃至３０ミリリツトルの測定されるアリコート（
試料の一部）は、第１のポリクロナル抗体でコートされ
る管に加えられる。 ２．１０５マイクロリツトルの試薬Ａは管に加えられ、
次に１０５マイクロリツトルの試薬Ｂが加えられる。最
後に、１０５マイクロリツトルの試薬Ｃは管の底に加え
られる。 ３、これらの試薬は約３分間、定温放置される。 ４．７０マイクロリツトルの洗浄液が加えられる。 ５、管は水で満されデカントされる。この手順は４回水
で繰り返される。 ６、最後のデカントの後管の外へ流れる水は次のセット
の試薬の希釈を防ぐために吸い取られる。 ７．１０（ｌマイクロリットルの試薬り及び５０マイク
ロリツトルの試薬Ｅは管に加えられる。 ８、管は約２分間又はそれ以上、定温放置される。 ９、試料は重複して作成される。標準曲線（ｓｔ、ａｎ
ｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）はＯ，Ｄ、ｌニットによってｍ
ｌ当りのバクテリアの数を決定するために作成（ｒｕｎ
）される。標準連鎖球菌のサスペンシミマンは、標準的
なコロニー計数方法を用いて、ミリリットル当りのバク
テリアの数を決定することによってｊｉＩられる。標慴
すスベンジＥｌンのアリコート及び試料は、インキュベ
ーション（定温放置）時間を含む同一のＬ順に従って検
定される。 例】。 この検定は、ｌｔｆ記例油側述べたように、抗体、抗体
がコートされる管、共役根、基質、色原体を用いて実行
される。、ストレプトミセスアルバス酵素は、この検定
において、グループＡ連釦球菌抗Ｊｊ；ｊを抽出するた
めに使用される。 −Ｌ順 （＋＞ −−一晩中の肉汁培Ａ （ｂｒｏＬｈ ｃｕｌ
Ｌｕｒｃ）による連鎖球菌のグループＡ培養は、遠心分
離機にかけられ、６：ｌＯｎｍにおいてコレマンスペク
トル光度計（スペクトロフォトメータ）で測定したとき
の０．０３のり、Ｄ、まてリン酸緩衝食塩水で懸濁され
る。この懸濁液は、コロニー計数によって決定されたと
き、又はブリード法（口ｒｅａｄ ＭｃＬｈｏｄ）によ
るとき５ Ｘ １０７細胞／１ｎｆｌを示す。この懸濁
液の２０ミリリツトルは抗一連８１球菌Ａ抗体がコート
される管に加えられる。 ストレプトミセスアルバスを素：ストレブトミセスアル
バス酵素はＷ、Ｒ，マックステッド（Ｍａｘｔｃｄ）の
手順に従って作成される（「ザ ランセット（Ｔｈｅ
Ｉ、ａｎｃｃｊ）」Ｖｏｌ、２．（１９４８，８月！４
日） ｐＨ，２５５−２５６）。 （２） ０．１％のトウィーン（ＴＷＥＥＮ）２０を含
む５０μ２の共役根（ｃｏｎｊｕｇａＬｅ）が管に加え
られる。 （３） ３００μ２のストレプトミセスアルバス酵素が
管に加えられる。 （４）ステップ３の溶液は室温で２０分間、放置される
。 （５）管は給水栓の水（タップウォータ）で５回洗浄さ
れる。 （６） １００μ２の基質及び５０μ２の色原体は管に
加えられ、室温で５分間、保持される。 （７） １ ｍｌの０．５Ｎｔ１２ＳＯ＜が管に加
えられ、４５０ｎｍでスペクトル光度計により読み出さ
れる。 結果 ■んＩ四囲） 叫 ０ ０ 、０ ：Ｉ
２０ ０．０４０１ｘ
１０” Ｏ，：ｌ：１２１
ｘ Ｉｏ６ ０．：］５７１・１
・１相、２サイトの酵素結合同時免疫検定を用いた１−
述の例は、中、に本発明を使用した２つの例である。こ
れらの例で述べた実際の工程の変形は゛Ｐ１業者によっ
て容易になされる。従って、本発明は本実施例に限られ
るものではない。 （発明の効果） 以ト詳細に説明したように本発明によれば、筒中−かつ
迅速に配位子／非配位〆−の検定を実行することかでき
る。
第１図はグループＡ連鎖球菌抗原の抽出と免疫化学的結
合の同時実行に関して最ＪｐＨを決定するための検定で
ｉｒｌられた結果を示すクラ７である。
合の同時実行に関して最ＪｐＨを決定するための検定で
ｉｒｌられた結果を示すクラ７である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）細胞又は細胞片の試料から抽出される配位子の検
定を実行するための方法において、 （ａ）試料からの配位子の抽出と、このために少なくと
も２つの非配位子との配位子の反応とを同時に実行して
検出可能な反応生成物を形成するステップ、 （ｂ）反応生成物を検出するステップ、 とを具備することを特徴とする検定を実行するための方
法。 （２）前記試料が、マトリクスに吸収又は吸着されるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の検定を実行
するための方法。 （３）前記マトリクスが、少なくとも１つの合成又は自
然の、吸収又は吸着分質であることを特徴とする特許請
求の範囲第２項記載の検定を実行するための方法。 （４）前記マトリクスが、ポリスチレン、ポリエチレン
、ポリプロピレン、ナイロン、ダクロン、レーヨン、綿
又はセルロースから成ることを特徴とする特許請求の範
囲第２項記載の検定を実行するための方法。 （５）前記抽出ステップが、検出可能な反応生成物の量
を形成するために十分な少なくとも配位子の一部を抽出
するための量の１又は複数の抽出試薬で試料を抽出する
ことを含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
の検定を実行するための方法。 （６）少なくとも１つの非配位子は固体の支持体に固定
されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の検
定を実行するための方法。 （７）第１の非配位子が固体の支持体に固定され、第２
の非配位子が検出可能な標識で識別されることを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載の検定を実行するための
方法。 （８）前記標識が、放射性標識、蛍光色素標識、又は酵
素標識を含むことを特徴とする特許請求の範囲第７項記
載の検定を実行するための方法。 （９）前記配位子は抗原を含み、前記第１及び第２の非
配位子は抗体を含み、前記検出可能な標識は酵素を含む
ことを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の検定を実
行するための方法。 （１０）前記酵素がペルオキシダーゼであることを特徴
とする特許請求の範囲第９項記載の検定を実行するため
の方法。 （１１）前記ペルオキシダーゼがホースラディッシュペ
ルオキシダーゼであることを特徴とする特許請求の範囲
第１０項記載の検定を実行するための方法。 （１２）前記反応生成物は酵素の基質及び色原体との酵
素の測色学的反応によって検出されることを特徴とする
特許請求の範囲第９項記載の検定を実行するための方法
。 （１３）前記色原体がテトラメチルベンジジンであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の検定を実
行するための方法。 （１４）前記細胞又は細胞片は微生物又は哺乳動物の細
胞又は細胞片を含むことを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の検定を実行するための方法。 （１５）前記配位子はグループＡ連鎖球菌の抗原を含み
、前記抽出試薬は亜硝酸又はストレプトミセスアルバス
酵素を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
の検定を実行するための方法。 （１６）細胞又は細胞片の試料から抽出される抗原の免
疫検定を実行するための方法において、（ａ）抗原を含
む試料をマトリクスに吸収又は吸着させるステップ、 （ｂ）試料の吸収又は吸着の前又は後で、抗原に関する
第１の抗体を含む固定物質でコートされるか又は該物質
をもつ容器の中に、マトリクスを配置するステップ、 （ｃ）（ｉ）検出可能な反応生成物を形成するために十
分な少なくとも抗原の一部を抽出する量の１又は複数の
抽出試薬を容器に加えると共に、抗原に関して、検出可
能な標識を持つ第２の抗体を含む溶液を容器に加えるこ
と、及び、（ｉｉ）試料からの抗原の抽出と検出可能な
反応生成物の形成とを許容する、予め定められた時間に
管の内容物を培養することによって、抗原の抽出と、少
なくとも２つの抗体との抗原の反応とを同時に実行して
、検出可能な反応生成物が形成されるステップ、 （ｄ）反応生成物を検出するステップ、 とを具備することを特徴とする免疫検定を実行するため
の方法。 （１７）前記マトリクスは少なくとも１つの、合成又は
自然の吸収又は吸着物質を含むことを特徴とする特許請
求の範囲第１６項記載の免疫検定を実行するための方法
。 （１８）前記マトリクスは、ポリスチレン、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ナイロン、ダクロン、綿又はセル
ロースを含むことを特徴とする特許請求の範囲第１７項
記載の免疫検定を実行するための方法。 （１９）前記細胞又は細胞片は微生物又は哺乳動物の細
胞又は細胞片を含むことを特徴とする特許請求の範囲第
１６項記載の免疫検定を実行するための方法。 （２０）前記抗原はグループＡ連鎖球菌の抗原を含み、
前記抽出試薬は亜硝酸又はストレプトミセスアルバス酵
素を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１６項記載
の免疫検定を実行するための方法。 （２１）前記検出可能な標識は放射性標識、蛍光色素標
識、又は酵素標識を含むことを特徴とする特許請求の範
囲第１６項記載の免疫検定を実行するための方法。 （２２）前記酵素がペルオキシダーゼであることを特徴
とする特許請求の範囲第２１項記載の免疫検定を実行す
るための方法。 （２３）前記ペルオキシダーゼがホースラディッシュペ
ルオキシダーゼであることを特徴とする特許請求の範囲
第２２項記載の免疫検定を実行するための方法。 （２４）前記検出ステップは、容器を洗浄すること、酵
素に対する基質及び色原体を容器に加えること、及び色
の変化又は色の形成を視覚的に又は適当な器具で検出す
ることを含むことを特徴とする特許請求の範囲第１６項
記載の免疫検定を実行するための方法。 （２５）前記基質が過酸化物であることを特徴とする特
許請求の範囲第２４項記載の免疫検定を実行するための
方法。 （２６）前記過酸化物が過酸化水素であることを特徴と
する特許請求の範囲第２５項記載の免疫検定を実行する
ための方法。 （２７）前記色原体がテトラメチルベンジジンであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第２４項記載の免疫検定
を実行するための方法。 （２８）前記抽出試薬はマトリクスに吸収され、前記第
２の抗体を含む溶液は容器の底に加えられ、容器の内容
物は、抗原がマトリクスから第２の抗体溶液の中に拡散
すると共に反応生成物を形成するように所定時間、定温
放置されることを特徴とする特許請求の範囲第１６項記
載の免疫検定を実行するための方法。 （２９）細胞又は細胞片の試料から抽出される配位子の
検定を実行するためのキットにおいて、前記検定は（ａ
）試料からの配位子の抽出と、このために少なくとも２
つの非配位子との配位子の反応とを同時に実行して検出
可能な反応生成物を形成するステップ、及び（ｂ）反応
生成物を検出するステップを含み、 前記キットは配位子のための抽出試薬を含む少なくとも
１つの溶液と、配位子を持つ検出可能な反応生成物の形
成を可能とする少なくとも２つの非配位子とを具備する
ことを特徴とする検定を実行するためのキット。 （３０）少なくとも１つの合成又は自然の吸収又は吸着
物質を含むマトリクスを具備することを特徴とする特許
請求の範囲第２９項記載の検定を実行するためのキット
。 （３１）前記マトリクスはポリスチレン、ポリエチレン
、ポリプロピレン、ナイロン、ダクロン、レーヨン、綿
又はセルロースを含むことを特徴とする特許請求の範囲
第３０項記載の検定を実行するためのキット。 （３１）前記マトリクスはプラスチックの棒で、ダクロ
ン又はレーヨンのチップを持つスワブを含むことを特徴
とする特許請求の範囲第３０項記載の検定を実行するた
めのキット。 （３３）第１の非配位子は固体の支持体に固定され、第
２の非配位子は検出可能な標識で識別されることを特徴
とする特許請求の範囲第２９項記載の検定を実行するた
めのキット。 （３４）前記検出可能な標識は放射性標識、蛍光色素標
識、又は酵素標識を含むことを特徴とする特許請求の範
囲第３３項記載の検定を実行するためのキット。 （３５）前記第１の非配位子は抗体を含み、第２の非配
位子は酵素と共役する抗体を含むことを特徴とする特許
請求の範囲第３３項記載の検定を実行するためのキット
。 （３６）前記酵素がペルオキシダーゼであることを特徴
とする特許請求の範囲第３５項記載の検定を実行するた
めのキット。 （３７）前記ペルオキシダーゼがホースラディッシュペ
ルオキシダーゼであることを特徴とする特許請求の範囲
第３６項記載の検定のためのキット。 （３８）酵素に対する基質及び色原体を具備することを
特徴とする特許請求の範囲第３５項記載の検定を実行す
るためのキット。 （３９）前記基質が過酸化物であることを特徴とする特
許請求の範囲第３８項記載の検定を実行するためのキッ
ト。 （４０）前記過酸化物が過酸化水素であることを特徴と
する特許請求の範囲第３９項記載の検定を実行するため
のキット。 （４１）前記色原体がテトラメチルベンジジンであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第３８項記載の検定を実
行するためのキット。 （４２）前記細胞又は細胞片は微生物又は哺乳動物の細
胞又は細胞片を含むことを特徴とする特許請求の範囲第
２９項記載の検定を実行するためのキット。 （４３）前記配位子はグループＡ連鎖球菌の抗原を含み
、前記抽出試薬は亜硝酸又はストレプトアルバス酵素を
含むことを特徴とする特許請求の範囲第２９項記載の検
定を実行するためのキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US779212 | 1985-09-23 | ||
| US06/779,212 US4794076A (en) | 1985-09-23 | 1985-09-23 | Simultaneous extraction of a ligand from a sample and capture by anti-ligands therefor in ligand/anti-ligand assays |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62156560A true JPS62156560A (ja) | 1987-07-11 |
Family
ID=25115681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61223971A Pending JPS62156560A (ja) | 1985-09-23 | 1986-09-24 | 配位子／非配位子検定を実行するための方法及びキツト |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4794076A (ja) |
| EP (1) | EP0217583B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62156560A (ja) |
| AT (1) | ATE65609T1 (ja) |
| AU (1) | AU6111086A (ja) |
| CA (1) | CA1285224C (ja) |
| DE (1) | DE3680437D1 (ja) |
| SE (1) | SE8604010L (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| DK70488D0 (da) * | 1988-02-11 | 1988-02-11 | Ancos Aps | Fremgangsmaade til paavisning af antistoffer i blod, samt membran og test-saet til anvendelse ved udoevelse af fremgangsmaaden |
| GB9414096D0 (en) * | 1994-07-13 | 1994-08-31 | Secr Defence | Labelled capture assay |
| US7549792B2 (en) * | 2006-10-06 | 2009-06-23 | Covidien Ag | Electronic thermometer with selectable modes |
| WO2016198835A1 (en) | 2015-06-08 | 2016-12-15 | Arquer Diagnostics Limited | Methods and kits |
| US11519916B2 (en) | 2015-06-08 | 2022-12-06 | Arquer Diagnostics Limited | Methods for analysing a urine sample |
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