JPH08248029A - 複合化被検物質誘導体を用いた競合イムノアッセイ - Google Patents
複合化被検物質誘導体を用いた競合イムノアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 被検出物質を被検出物質誘導体の存在下にお
ける競合イムノアッセイにより検出する方法と、この方
法実施のために使用するキットの提供。 【解決手段】 この方法は、(ａ) 被検物質誘導体と被
検物質および被検物質誘導体に特異的な第一受容体分子
と被検物質とを含有するサンプルのインキュベーション
工程、ただしインキュベーション混合物にはさらに被検
物質誘導体または被検物質誘導体および被検物質に特異
的に結合する第二受容体分子を含有する；(ｂ) 被検物
質誘導体に結合していない第一受容体分子の分離工程；
または(ｂ′) 第一受容体分子に結合していない被検物
質誘導体の分離工程；ならびに(ｃ) 被検物質誘導体に
結合している第一受容体分子または第一受容体分子に結
合している被検物質誘導体の検出工程を実施することか
らなる。
ける競合イムノアッセイにより検出する方法と、この方
法実施のために使用するキットの提供。 【解決手段】 この方法は、(ａ) 被検物質誘導体と被
検物質および被検物質誘導体に特異的な第一受容体分子
と被検物質とを含有するサンプルのインキュベーション
工程、ただしインキュベーション混合物にはさらに被検
物質誘導体または被検物質誘導体および被検物質に特異
的に結合する第二受容体分子を含有する；(ｂ) 被検物
質誘導体に結合していない第一受容体分子の分離工程；
または(ｂ′) 第一受容体分子に結合していない被検物
質誘導体の分離工程；ならびに(ｃ) 被検物質誘導体に
結合している第一受容体分子または第一受容体分子に結
合している被検物質誘導体の検出工程を実施することか
らなる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、被検物質を被検物
質誘導体の存在下における競合イムノアッセイにより検
出する方法、およびこの検出方法を実施するためのキッ
トに関する。
質誘導体の存在下における競合イムノアッセイにより検
出する方法、およびこの検出方法を実施するためのキッ
トに関する。
【０００２】
【従来技術】免疫学的検出方法はインビトロ診断におい
てきわめて重要になってきた。この理由は、それらが高
度に特異的できわめて感度が高いことにある。さらに、
これらのアッセイは操作が簡単なことが特徴的である。
これらの検出方法は検出すべき被検物質とその結合パー
トナー間の免疫学的相互作用に基づくものである。
てきわめて重要になってきた。この理由は、それらが高
度に特異的できわめて感度が高いことにある。さらに、
これらのアッセイは操作が簡単なことが特徴的である。
これらの検出方法は検出すべき被検物質とその結合パー
トナー間の免疫学的相互作用に基づくものである。
【０００３】サンドイッチアッセイの場合、被検物質は
２つの異なる抗体でサンドイッチのように結合される。
２つの抗体の一方は標識（マーカー）をもち、それによ
りその濃度を測定することができる。小さな被検物質の
場合には、２つの異なる抗体が同時にその被検物質に結
合できないという立体的理由から、サンドイッチ法は除
外される。この場合、一般に、競合アッセイが用いられ
る。これらのアッセイでは、被検物質および被検物質の
合成誘導体が抗体の結合部位で競合する。被検物質誘導
体（古典的競合法）または抗体のいずれかが通常、標識
される。
２つの異なる抗体でサンドイッチのように結合される。
２つの抗体の一方は標識（マーカー）をもち、それによ
りその濃度を測定することができる。小さな被検物質の
場合には、２つの異なる抗体が同時にその被検物質に結
合できないという立体的理由から、サンドイッチ法は除
外される。この場合、一般に、競合アッセイが用いられ
る。これらのアッセイでは、被検物質および被検物質の
合成誘導体が抗体の結合部位で競合する。被検物質誘導
体（古典的競合法）または抗体のいずれかが通常、標識
される。
【０００４】古典的競合法においては、抗体が固相に結
合される場合が多く、一方、標識抗体を使用する方法で
は、被検物質誘導体が固定化される（固相抗原法、たと
えばＳＰＡＬＴ＝固相抗原ルミネセンス法）。
合される場合が多く、一方、標識抗体を使用する方法で
は、被検物質誘導体が固定化される（固相抗原法、たと
えばＳＰＡＬＴ＝固相抗原ルミネセンス法）。
【０００５】競合アッセイ法においては、標識抗体を用
いる方法が被検物質の遊離有効部分の測定にとくに重要
視されるようになってきた。この場合「遊離有効部分」
とはこれらの被検物質が、たとえば血清中で起こるよう
に、リガンドとしてそれらの天然の受容体に結合してい
ないことを意味する。このタイプの方法はたとえば、遊
離トリヨードサイロニン（ＦＴ３）および遊離サイロキ
シン（ＦＴ４）の測定において重要性が増大してきた。
サンプル中に存在する結合蛋白質（たとえば血清蛋白
質）の濃度とは独立に被検物質の比率を測定可能にする
ためには、被検物質誘導体は、抗体とは依然として相互
作用できるが結合蛋白質とはまったくまたは有意ではな
い程度しか相互作用しないように、固相への結合によっ
てその性質を変化させなければならない。このタイプの
方法は一工程アッセイとして、たとえばEP-A-0 103 605
に記載されている。
いる方法が被検物質の遊離有効部分の測定にとくに重要
視されるようになってきた。この場合「遊離有効部分」
とはこれらの被検物質が、たとえば血清中で起こるよう
に、リガンドとしてそれらの天然の受容体に結合してい
ないことを意味する。このタイプの方法はたとえば、遊
離トリヨードサイロニン（ＦＴ３）および遊離サイロキ
シン（ＦＴ４）の測定において重要性が増大してきた。
サンプル中に存在する結合蛋白質（たとえば血清蛋白
質）の濃度とは独立に被検物質の比率を測定可能にする
ためには、被検物質誘導体は、抗体とは依然として相互
作用できるが結合蛋白質とはまったくまたは有意ではな
い程度しか相互作用しないように、固相への結合によっ
てその性質を変化させなければならない。このタイプの
方法は一工程アッセイとして、たとえばEP-A-0 103 605
に記載されている。
【０００６】標識抗体を用いるこの方法はとくに、ほと
んどの場合抗体の標識化が問題とならないことから、ト
レーサーの調製が容易という利点がある。したがって、
上述のような望ましい結合挙動を示す被検物質トレーサ
ーが利用可能であれば、古典的競合法は依然として好ま
しいものである（EP-A-0 026 103）。
んどの場合抗体の標識化が問題とならないことから、ト
レーサーの調製が容易という利点がある。したがって、
上述のような望ましい結合挙動を示す被検物質トレーサ
ーが利用可能であれば、古典的競合法は依然として好ま
しいものである（EP-A-0 026 103）。
【０００７】上述の方法を実施する場合、抗体に対して
適当な親和性を有する被検物質誘導体の選択が問題とな
ることが多い。これらは、意味のあるアッセイ結果を得
るためには、抗体に対する被検物質誘導体の親和性が、
抗体に対する被検物質の親和性とある比率の範囲内にな
ければならないことにより生じる（EP-A-0 254 929、EP
-A-0 324 540、EP-A-0 303 284参照）。たとえば、抗体
に対する被検物質誘導体の親和性が高すぎると、アッセ
イ混合物における反応平衡が抗体−被検物質誘導体複合
体の方向にシフトしすぎてアッセイ機能の低下を招くこ
とになる。この不利益を解消するためには、被検物質と
抗体のプレインキュベーションを行うことができる（EP
-A-0 182 385参照）。他方、被検物質誘導体の親和性が
低すぎる場合には、最初に被検物質誘導体と抗体のプレ
インキュベーションを行うのが有用になる。しかしなが
ら、いずれの場合も、アッセイを２工程で実施する必要
があるという欠点がある。この欠点を回避する可能性と
しては、抗体に対する適当な親和性を生じるように被検
物質誘導体を化学的に修飾することが考えられる。しか
しながら、この種の方法もまた労力を要し、小さな被検
物質誘導体では困難を伴うかまたはまったく実施不可能
な場合が多いと思われる。
適当な親和性を有する被検物質誘導体の選択が問題とな
ることが多い。これらは、意味のあるアッセイ結果を得
るためには、抗体に対する被検物質誘導体の親和性が、
抗体に対する被検物質の親和性とある比率の範囲内にな
ければならないことにより生じる（EP-A-0 254 929、EP
-A-0 324 540、EP-A-0 303 284参照）。たとえば、抗体
に対する被検物質誘導体の親和性が高すぎると、アッセ
イ混合物における反応平衡が抗体−被検物質誘導体複合
体の方向にシフトしすぎてアッセイ機能の低下を招くこ
とになる。この不利益を解消するためには、被検物質と
抗体のプレインキュベーションを行うことができる（EP
-A-0 182 385参照）。他方、被検物質誘導体の親和性が
低すぎる場合には、最初に被検物質誘導体と抗体のプレ
インキュベーションを行うのが有用になる。しかしなが
ら、いずれの場合も、アッセイを２工程で実施する必要
があるという欠点がある。この欠点を回避する可能性と
しては、抗体に対する適当な親和性を生じるように被検
物質誘導体を化学的に修飾することが考えられる。しか
しながら、この種の方法もまた労力を要し、小さな被検
物質誘導体では困難を伴うかまたはまったく実施不可能
な場合が多いと思われる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明はしたがって、
上述の欠点を克服した競合イムノアッセイにおける被検
物質の検出方法を提供することを目的とするものであ
る。この目的は請求の範囲の項に記載の態様によって達
成される。
上述の欠点を克服した競合イムノアッセイにおける被検
物質の検出方法を提供することを目的とするものであ
る。この目的は請求の範囲の項に記載の態様によって達
成される。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明はしたがって、以
下の工程、 (ａ) 被検物質誘導体と、被検物質および被検物質誘導
体に特異的な第一受容体分子と被検物質とを含有するサ
ンプルのインキュベーション工程、ただしインキュベー
ション混合物にはさらに被検物質誘導体または被検物質
誘導体および被検物質に特異的に結合する第二受容体分
子を含有する； (ｂ) 被検物質誘導体に結合していない第一受容体分子
の分離；または(ｂ′) 第一受容体分子に結合していな
い被検物質誘導体の分離工程；ならびに (ｃ) 被検物質誘導体に結合している第一受容体分子ま
たは第一受容体分子に結合している被検物質誘導体の検
出工程を実施することからなる競合イムノアッセイによ
り被検物質を検出する方法に関する。
下の工程、 (ａ) 被検物質誘導体と、被検物質および被検物質誘導
体に特異的な第一受容体分子と被検物質とを含有するサ
ンプルのインキュベーション工程、ただしインキュベー
ション混合物にはさらに被検物質誘導体または被検物質
誘導体および被検物質に特異的に結合する第二受容体分
子を含有する； (ｂ) 被検物質誘導体に結合していない第一受容体分子
の分離；または(ｂ′) 第一受容体分子に結合していな
い被検物質誘導体の分離工程；ならびに (ｃ) 被検物質誘導体に結合している第一受容体分子ま
たは第一受容体分子に結合している被検物質誘導体の検
出工程を実施することからなる競合イムノアッセイによ
り被検物質を検出する方法に関する。
【００１０】上述の工程（ｂ）は被検物質誘導体が固相
に結合している場合に実施される。一方、工程（ｂ′）
は第一受容体分子が固相に結合している場合に行われ
る。
に結合している場合に実施される。一方、工程（ｂ′）
は第一受容体分子が固相に結合している場合に行われ
る。
【００１１】本発明の意味の範囲内での「被検物質」の
語は、サンプル好ましくは生物学的サンプル中に存在
し、受容体分子によって結合可能な任意の分子を意味す
る。
語は、サンプル好ましくは生物学的サンプル中に存在
し、受容体分子によって結合可能な任意の分子を意味す
る。
【００１２】「被検物質誘導体」の語は、被検物質に対
する受容体分子と交差反応する物質を意味する。
する受容体分子と交差反応する物質を意味する。
【００１３】「受容体分子」の語は、他分子たとえば被
検物質の特異的結合部位を有する任意の分子を意味す
る。受容体分子の例には、ホルモン受容体または抗体が
ある。受容体分子は、天然、組換え、合成または半合成
起源のいずれのものであってもよい。
検物質の特異的結合部位を有する任意の分子を意味す
る。受容体分子の例には、ホルモン受容体または抗体が
ある。受容体分子は、天然、組換え、合成または半合成
起源のいずれのものであってもよい。
【００１４】被検物質誘導体に特異的な第二受容体分子
は、被検物質と交差反応可能であるが、交差反応させて
はならない。それは通常、第一受容体分子とは異なる。
さらに、それに標識をもたせることも可能であるが、そ
の標識は、第一受容体分子が標識されている場合には第
一受容体分子の標識とは異なる。
は、被検物質と交差反応可能であるが、交差反応させて
はならない。それは通常、第一受容体分子とは異なる。
さらに、それに標識をもたせることも可能であるが、そ
の標識は、第一受容体分子が標識されている場合には第
一受容体分子の標識とは異なる。
【００１５】本発明の方法を使用すれば、サンプル中の
被検物質は容易に、定性的および定量的に検出すること
ができる。この結果は、被検物質誘導体がそれに特異的
な第二受容体分子によって遮蔽され、したがって被検物
質誘導体に対する第一受容体分子の親和性が低下するこ
とによって達成される。これにより、インキュベーショ
ン混合物中における反応平衡は、被検物質−被検物質特
異的第一受容体分子の方向にシフトすることになる。異
なる被検物質誘導体特異的分子の使用により、被検物質
誘導体または被検物質誘導体と被検物質誘導体特異的第
二受容体分子複合体の、被検物質特異的第一受容体分子
に対する相対的な反応性は、簡単な様式で変化させるこ
とができる。それによって、アッセイを至適化するため
の更なる自由度が利用可能になる。
被検物質は容易に、定性的および定量的に検出すること
ができる。この結果は、被検物質誘導体がそれに特異的
な第二受容体分子によって遮蔽され、したがって被検物
質誘導体に対する第一受容体分子の親和性が低下するこ
とによって達成される。これにより、インキュベーショ
ン混合物中における反応平衡は、被検物質−被検物質特
異的第一受容体分子の方向にシフトすることになる。異
なる被検物質誘導体特異的分子の使用により、被検物質
誘導体または被検物質誘導体と被検物質誘導体特異的第
二受容体分子複合体の、被検物質特異的第一受容体分子
に対する相対的な反応性は、簡単な様式で変化させるこ
とができる。それによって、アッセイを至適化するため
の更なる自由度が利用可能になる。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明の方法を実施するため、ど
のような材料が固相として使用可能であり、どのような
条件が使用可能であるかは、本技術分野の熟練者にはよ
く知られている。この種の材料および条件としては、た
とえばHarlow & Lane、“Antibodies，A Laboratory Ma
nual"，CSH-Press，Cold Spring Harbor，1988に記載さ
れているような通常のタイプが好ましい。さらに、適当
な緩衝液を用いた洗浄工程を、上述の各工程間で行う必
要があることは本技術分野の熟練者には既知の通りであ
る。この場合も、たとえば前出のHarlow & Laneの著書
が指針として有用である。さらに、本発明の方法中に言
及されるそれぞれの工程における時間や温度をどのよう
に選択するかも、本技術分野の熟練者には既知の通りで
ある。好ましくは、温度は室温（通常、約２２℃）から
３７℃の間である。インキュベーションにとくに好まし
い温度は３７℃である。被検物質誘導体に結合している
第一受容体分子または第一受容体分子に結合している被
検物質誘導体の検出も、通常の方法たとえば標識被検物
質誘導体または標識第一受容体分子により発射されるシ
グナルの測定によって行われる。被検物質誘導体も第一
受容体分子も標識されない場合には、検出はたとえば第
一受容体分子に特異的な第二の標識抗体または抗体フラ
グメントを用いて実施することができる。
のような材料が固相として使用可能であり、どのような
条件が使用可能であるかは、本技術分野の熟練者にはよ
く知られている。この種の材料および条件としては、た
とえばHarlow & Lane、“Antibodies，A Laboratory Ma
nual"，CSH-Press，Cold Spring Harbor，1988に記載さ
れているような通常のタイプが好ましい。さらに、適当
な緩衝液を用いた洗浄工程を、上述の各工程間で行う必
要があることは本技術分野の熟練者には既知の通りであ
る。この場合も、たとえば前出のHarlow & Laneの著書
が指針として有用である。さらに、本発明の方法中に言
及されるそれぞれの工程における時間や温度をどのよう
に選択するかも、本技術分野の熟練者には既知の通りで
ある。好ましくは、温度は室温（通常、約２２℃）から
３７℃の間である。インキュベーションにとくに好まし
い温度は３７℃である。被検物質誘導体に結合している
第一受容体分子または第一受容体分子に結合している被
検物質誘導体の検出も、通常の方法たとえば標識被検物
質誘導体または標識第一受容体分子により発射されるシ
グナルの測定によって行われる。被検物質誘導体も第一
受容体分子も標識されない場合には、検出はたとえば第
一受容体分子に特異的な第二の標識抗体または抗体フラ
グメントを用いて実施することができる。
【００１７】本発明の方法の好ましい実施態様において
は、被検物質誘導体は、サンプルおよび第一受容体分子
とのインキュベーション前に第二受容体分子とインキュ
ベートされる。
は、被検物質誘導体は、サンプルおよび第一受容体分子
とのインキュベーション前に第二受容体分子とインキュ
ベートされる。
【００１８】この最初のインキュベーション工程によ
り、被検物質誘導体はすでに遮蔽されてインキュベーシ
ョン混合物中に導入されることになる。これにはさら
に、被検物質誘導体を完全にまたはほぼ完全に遮蔽する
のに、より少量の被検物質特異的第二受容体分子しか必
要としないという利点がある。両受容体分子が同時に被
検物質誘導体とインキュベートされる場合には、これら
は被検物質誘導体上の有効な結合部位で競合する。この
場合には、アッセイの実施のためにより多量の第二受容
体分子が使用されなければならないことになる。
り、被検物質誘導体はすでに遮蔽されてインキュベーシ
ョン混合物中に導入されることになる。これにはさら
に、被検物質誘導体を完全にまたはほぼ完全に遮蔽する
のに、より少量の被検物質特異的第二受容体分子しか必
要としないという利点がある。両受容体分子が同時に被
検物質誘導体とインキュベートされる場合には、これら
は被検物質誘導体上の有効な結合部位で競合する。この
場合には、アッセイの実施のためにより多量の第二受容
体分子が使用されなければならないことになる。
【００１９】本発明方法のさらに他の好ましい実施態様
においては、第一受容体分子は標識されている。この実
施態様においては、第一受容体分子の標識が被検物質の
検出に利用されることになる。
においては、第一受容体分子は標識されている。この実
施態様においては、第一受容体分子の標識が被検物質の
検出に利用されることになる。
【００２０】本発明方法のさらに他の好ましい実施態様
においては、被検物質誘導体が標識されている。
においては、被検物質誘導体が標識されている。
【００２１】受容体分子または被検物質誘導体の標識は
様々なタイプの標識とすることができる。本発明にとく
に好ましい標識は、放射性、化学ルミネセンス、生物ル
ミネセンス、蛍光、リン光もしくはエレクトロルミネセ
ンス標識、酵素、ビオチンまたは吸光可能な基である。
様々なタイプの標識とすることができる。本発明にとく
に好ましい標識は、放射性、化学ルミネセンス、生物ル
ミネセンス、蛍光、リン光もしくはエレクトロルミネセ
ンス標識、酵素、ビオチンまたは吸光可能な基である。
【００２２】本発明の方法のさらに他の好ましい実施態
様においては、被検物質誘導体は固相に結合される。こ
の実施態様においては、被検物質誘導体は標識しないこ
とが好ましい。本発明の方法に使用できる固相の例には
マイクロタイタープレート、好ましくはポリスチレン製
のもの、ポリマービーズ、試験管または膜がある。
様においては、被検物質誘導体は固相に結合される。こ
の実施態様においては、被検物質誘導体は標識しないこ
とが好ましい。本発明の方法に使用できる固相の例には
マイクロタイタープレート、好ましくはポリスチレン製
のもの、ポリマービーズ、試験管または膜がある。
【００２３】本発明の方法のさらに他の好ましい実施態
様においては、被検物質誘導体は固相への結合ののちに
第二受容体分子とインキュベートされる。この実施態様
ではとくに、最初に被検物質誘導体でコートされた固
相、たとえばマイクロタイタープレートを調製しておけ
ば、本発明の分析法による使用まで通常の条件下で長期
間の保存も可能であるという利点を有する。
様においては、被検物質誘導体は固相への結合ののちに
第二受容体分子とインキュベートされる。この実施態様
ではとくに、最初に被検物質誘導体でコートされた固
相、たとえばマイクロタイタープレートを調製しておけ
ば、本発明の分析法による使用まで通常の条件下で長期
間の保存も可能であるという利点を有する。
【００２４】本発明の方法のさらに他の好ましい実施態
様においては、第一受容体分子が固相に結合される。
様においては、第一受容体分子が固相に結合される。
【００２５】本発明の方法のさらに他の好ましい実施態
様においては、被検物質誘導体は、第一受容体分子を固
相へ結合させたのちに、第二受容体分子とインキュベー
トされる。
様においては、被検物質誘導体は、第一受容体分子を固
相へ結合させたのちに、第二受容体分子とインキュベー
トされる。
【００２６】この実施態様でもとくに、固相が、第一受
容体分子の結合後、本発明の分析法による使用まで適当
な条件下に長期間保存できるという利点がある。
容体分子の結合後、本発明の分析法による使用まで適当
な条件下に長期間保存できるという利点がある。
【００２７】第一および第二受容体分子が標識を除いて
同一である実施態様はさらに好ましい例である。
同一である実施態様はさらに好ましい例である。
【００２８】第一および第二受容体分子が異なる実施態
様はさらに他の好ましい例である。通常は、本発明のア
ッセイには、２つの異なる抗体が用いられることにな
る。
様はさらに他の好ましい例である。通常は、本発明のア
ッセイには、２つの異なる抗体が用いられることにな
る。
【００２９】さらに他の好ましい実施態様においては、
第一および／または第二受容体分子は抗体または抗体フ
ラグメントである。
第一および／または第二受容体分子は抗体または抗体フ
ラグメントである。
【００３０】この場合に用いられる抗体はポリクローナ
ル、モノクローナル、キメラまたは合成的に製造された
抗体とすることができる。この種類の抗体の調製は従来
技術において既知であり、またたとえば前出のHarlow &
Laneに記載されている。抗体フラグメントについても
同様に従来技術において知られている。本発明の意味の
範囲内においては、それらは被検物質誘導体または被検
物質に特異的に結合できればよく、またそれらが第一受
容体分子として用いられるときは、適当な標識を提供で
きることも必要である。抗体フラグメントの例にはＦ
ｖ、ＦａｂまたはＦ(ａｂ)2フラグメントがある。
ル、モノクローナル、キメラまたは合成的に製造された
抗体とすることができる。この種類の抗体の調製は従来
技術において既知であり、またたとえば前出のHarlow &
Laneに記載されている。抗体フラグメントについても
同様に従来技術において知られている。本発明の意味の
範囲内においては、それらは被検物質誘導体または被検
物質に特異的に結合できればよく、またそれらが第一受
容体分子として用いられるときは、適当な標識を提供で
きることも必要である。抗体フラグメントの例にはＦ
ｖ、ＦａｂまたはＦ(ａｂ)2フラグメントがある。
【００３１】本発明の方法のさらに他の好ましい実施態
様においては、被検物質はリガンドである。本発明にお
いては、「リガンド」とは、この分子に結合する天然の
受容体が存在する任意の分子を意味する語として理解さ
れる。好ましくは、リガンドは天然に存在する分子であ
り、この分子はとくに好ましくは体液中たとえば血清中
に存在する。
様においては、被検物質はリガンドである。本発明にお
いては、「リガンド」とは、この分子に結合する天然の
受容体が存在する任意の分子を意味する語として理解さ
れる。好ましくは、リガンドは天然に存在する分子であ
り、この分子はとくに好ましくは体液中たとえば血清中
に存在する。
【００３２】本発明による方法のとくに好ましい実施態
様においては、リガンドは、サイロキシン、トリヨード
サイロニン、またはステロイドたとえばエストラジオー
ルである。
様においては、リガンドは、サイロキシン、トリヨード
サイロニン、またはステロイドたとえばエストラジオー
ルである。
【００３３】本発明の方法の他の好ましい実施態様にお
いて、被検物質の第一受容体とのプレインキュベーショ
ンは、工程（ａ）の前に行われる。この実施態様によれ
ば、遊離被検物質、とくにリガンドの実質的な量の結合
が達成され、これがついで、本発明よるアッセイ系にお
けるこのリガンドの定量的検出に有利な効果を与えるこ
とになる。
いて、被検物質の第一受容体とのプレインキュベーショ
ンは、工程（ａ）の前に行われる。この実施態様によれ
ば、遊離被検物質、とくにリガンドの実質的な量の結合
が達成され、これがついで、本発明よるアッセイ系にお
けるこのリガンドの定量的検出に有利な効果を与えるこ
とになる。
【００３４】このプレインキュベーション工程は好まし
くは５〜３０分間行われる。
くは５〜３０分間行われる。
【００３５】本発明はさらに、少なくとも(ａ) 被検物
質誘導体；および／または(ｂ) 標識被検物質誘導体；
ならびに(ｃ) 被検物質および被検物質誘導体に特異的
な第一受容体分子；および／または(ｄ) 被検物質およ
び被検物質誘導体に特異的な標識された第一受容体分
子；および(ｅ) 被検物質誘導体または被検物質誘導体
および被検物質に特異的に結合する第二受容体分子を含
有するキットに関する。
質誘導体；および／または(ｂ) 標識被検物質誘導体；
ならびに(ｃ) 被検物質および被検物質誘導体に特異的
な第一受容体分子；および／または(ｄ) 被検物質およ
び被検物質誘導体に特異的な標識された第一受容体分
子；および(ｅ) 被検物質誘導体または被検物質誘導体
および被検物質に特異的に結合する第二受容体分子を含
有するキットに関する。
【００３６】本技術分野の熟練者によれば、本発明のキ
ットにさらに他の慣用の成分、たとえば適当な緩衝液を
補足することが可能であろう。
ットにさらに他の慣用の成分、たとえば適当な緩衝液を
補足することが可能であろう。
【００３７】本発明は最後に、本発明よる方法を実施す
るための、本発明のキットの使用に関する。
るための、本発明のキットの使用に関する。
【００３８】
【実施例】以下の実施例は本発明を例示するものであ
る。 例１ BeriLux（登録商標）Ｔ３（Behringwerke AG，Marbur
g）−コートチューブ（タンパク質−Ｔ３接合体でコー
トされているチューブ）に０.５mlの抗−Ｔ３抗体溶液
［非標識BeriLux（登録商標）Ｔ３トレーサー抗体１μ
ｇ／mlインキュベーション緩衝液］を添加する。３７℃
で２時間インキュベートしたのち溶液を除去し、チュー
ブを１mlの洗浄緩衝液で１回洗浄する。この方法で前処
置したチューブを、標識抗−Ｔ３抗体をトレーサーとし
て用いるＦＴ３アッセイにおける固相として使用する。
得られるシグナルダイナミックスは非処置のチューブの
場合よりも高い（図１）。
る。 例１ BeriLux（登録商標）Ｔ３（Behringwerke AG，Marbur
g）−コートチューブ（タンパク質−Ｔ３接合体でコー
トされているチューブ）に０.５mlの抗−Ｔ３抗体溶液
［非標識BeriLux（登録商標）Ｔ３トレーサー抗体１μ
ｇ／mlインキュベーション緩衝液］を添加する。３７℃
で２時間インキュベートしたのち溶液を除去し、チュー
ブを１mlの洗浄緩衝液で１回洗浄する。この方法で前処
置したチューブを、標識抗−Ｔ３抗体をトレーサーとし
て用いるＦＴ３アッセイにおける固相として使用する。
得られるシグナルダイナミックスは非処置のチューブの
場合よりも高い（図１）。
【００３９】インキュベーション緩衝液：１リットル中
に１ｇのウシＩｇＧ、８ｇのＮａＣｌおよび１ｇのナト
リウムアジドを含有する０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.
４
に１ｇのウシＩｇＧ、８ｇのＮａＣｌおよび１ｇのナト
リウムアジドを含有する０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.
４
【００４０】トレーサー：１リットル中に１ｇのウシＩ
ｇＧ、８ｇのＮａＣｌおよび１ｇのナトリウムアジドを
含有する０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.４、１ml中、３
０ngのBeriLux（登録商標）Ｔ３トレーサー抗体［BeriL
ux（登録商標）Ｔ３−Tracer antibodies＝MA13-3D8-3
8、製造業者：Immunogen International Ltd., United
Kingdom］
ｇＧ、８ｇのＮａＣｌおよび１ｇのナトリウムアジドを
含有する０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.４、１ml中、３
０ngのBeriLux（登録商標）Ｔ３トレーサー抗体［BeriL
ux（登録商標）Ｔ３−Tracer antibodies＝MA13-3D8-3
8、製造業者：Immunogen International Ltd., United
Kingdom］
【００４１】洗浄緩衝液：１リットル中に８ｇのＮａＣ
ｌ含有する０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.４
ｌ含有する０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.４
【００４２】アッセイ条件：サンプル（標準または血
清）１００mlおよびトレーサー２００μlを室温で６０
分間振盪する。各回１mlの洗浄緩衝液で４回洗浄後、シ
グナル活性を、BeriLux（登録商標）分析装置で測定す
る。
清）１００mlおよびトレーサー２００μlを室温で６０
分間振盪する。各回１mlの洗浄緩衝液で４回洗浄後、シ
グナル活性を、BeriLux（登録商標）分析装置で測定す
る。
【００４３】例２ ＩｇＧ−エストラジオール接合体でコートした１mgの磁
性粒子を１μｇの抗−エストラジオール抗体 (Medix-Bi
oteck, Cat. No. MBE 0107, Lot-no. M-16607)／mlイン
キュベーション緩衝液を含有する溶液８mlと接触させ
る。３７℃で１時間インキュベートしたのち、磁性粒子
を洗浄し、エストラジオールＳＰＡＬＴアッセイにおい
て固相として使用する。用いられるトレーサーは、Beri
Lux（登録商標）標識で標識された抗−エストラジオー
ル抗体 (BiosPacific, Clone No. A54010014 P）であ
る。この方法で処理された磁性粒子で得られる標準曲線
は、後処理されていない固相を用いて同一条件下で得ら
れるよりも高いシグナルダイナミックスを有する（図
２）。
性粒子を１μｇの抗−エストラジオール抗体 (Medix-Bi
oteck, Cat. No. MBE 0107, Lot-no. M-16607)／mlイン
キュベーション緩衝液を含有する溶液８mlと接触させ
る。３７℃で１時間インキュベートしたのち、磁性粒子
を洗浄し、エストラジオールＳＰＡＬＴアッセイにおい
て固相として使用する。用いられるトレーサーは、Beri
Lux（登録商標）標識で標識された抗−エストラジオー
ル抗体 (BiosPacific, Clone No. A54010014 P）であ
る。この方法で処理された磁性粒子で得られる標準曲線
は、後処理されていない固相を用いて同一条件下で得ら
れるよりも高いシグナルダイナミックスを有する（図
２）。
【００４４】インキュベーション緩衝液：１リットル中
に８.７ｇのＮａＣｌ、１ｇのウシＩｇＧ、１ｇのナト
リウムアジドを含有する０.１Ｍ Tris／塩酸塩リン酸緩
衝液、ｐＨ８.０
に８.７ｇのＮａＣｌ、１ｇのウシＩｇＧ、１ｇのナト
リウムアジドを含有する０.１Ｍ Tris／塩酸塩リン酸緩
衝液、ｐＨ８.０
【００４５】トレーサー：１リットル中に５.９ｇのＮ
ａＣｌ、１ｇのウシＩｇＧ、１ｇのナトリウムアジド、
１５mgのダナゾールおよび１５mgのハイドロコーチゾン
を含有する０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６.３、１ml中、
１０ngの抗−エストラジオール抗体（BiosPacific）
ａＣｌ、１ｇのウシＩｇＧ、１ｇのナトリウムアジド、
１５mgのダナゾールおよび１５mgのハイドロコーチゾン
を含有する０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６.３、１ml中、
１０ngの抗−エストラジオール抗体（BiosPacific）
【００４６】洗浄緩衝液：１リットル中に８ｇのＮａＣ
ｌ含有する０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.４
ｌ含有する０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.４
【００４７】アッセイ条件：磁性粒子懸濁液２０μl
（コートされた磁性粒子２５μg）＋サンプル（標準ま
たは血清）１００μlとトレーサー２００μlを３７℃で
３０分間インキュベートする。各回０.５mlの洗浄緩衝
液で３回洗浄したのち、シグナル活性をBeriLux（登録
商標）分析装置で測定する。
（コートされた磁性粒子２５μg）＋サンプル（標準ま
たは血清）１００μlとトレーサー２００μlを３７℃で
３０分間インキュベートする。各回０.５mlの洗浄緩衝
液で３回洗浄したのち、シグナル活性をBeriLux（登録
商標）分析装置で測定する。
【図１】ＳＰＡＬＴ法によるＦＴ３ルミネセンスイムノ
アッセイを示す。使用された固相はタンパク質Ｔ３接合
体（＝被検物質誘導体）でコートされたチューブである
（上の曲線）。被検物質誘導体を抗−Ｔ３抗体で遮蔽す
ることにより、高いシグナルダイナミックスを有する標
準曲線が得られる(下の曲線）。
アッセイを示す。使用された固相はタンパク質Ｔ３接合
体（＝被検物質誘導体）でコートされたチューブである
（上の曲線）。被検物質誘導体を抗−Ｔ３抗体で遮蔽す
ることにより、高いシグナルダイナミックスを有する標
準曲線が得られる(下の曲線）。
【図２】エストラジオール定量測定のＳＰＡＬＴアッセ
イを示す。使用された固相はタンパク質エストラジオー
ル接合体（＝被検物質誘導体）でコートされたチューブ
（上の曲線）。被検物質誘導体を抗エストラジオール抗
体で遮蔽することにより、高いシグナルダイナミックス
の標準曲線が得られる（下の曲線）。
イを示す。使用された固相はタンパク質エストラジオー
ル接合体（＝被検物質誘導体）でコートされたチューブ
（上の曲線）。被検物質誘導体を抗エストラジオール抗
体で遮蔽することにより、高いシグナルダイナミックス
の標準曲線が得られる（下の曲線）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハインツ−ユルゲン・スクルツイプチク ドイツ連邦共和国デー−63263ツエペリー ンハイム．フオルストハウスヴエーク11 (72)発明者 ペーター・モルツ ドイツ連邦共和国デー−55118マインツ. カイザー−ヴイルヘルム−リング44 (72)発明者 ラインハルト・ケスマルカー ドイツ連邦共和国デー−35041マルブルク. ヘーエンヴエーク２エー
Claims (17)
- 【請求項１】 以下の工程、 (ａ) 被検物質誘導体と、被検物質および被検物質誘導
体に特異的な第一受容体分子と被検物質とを含有するサ
ンプルのインキュベーション工程、ただしインキュベー
ション混合物にはさらに被検物質誘導体または被検物質
誘導体および被検物質に特異的に結合する第二受容体分
子を含有する； (ｂ) 被検物質誘導体に結合していない第一受容体分子
の分離工程；または(ｂ′) 第一受容体分子に結合して
いない被検物質誘導体の分離工程；ならびに (ｃ) 被検物質誘導体に結合している第一受容体分子ま
たは第一受容体分子に結合している被検物質誘導体の検
出工程を実施することからなる競合イムノアッセイによ
る被検物質の検出方法。 - 【請求項２】 被検物質誘導体は、サンプルおよび第一
受容体分子とのインキュベーションの前に第二受容体分
子とインキュベートする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 第一受容体分子は標識されている請求項
１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 被検物質誘導体は標識されている請求項
１または２に記載の方法。 - 【請求項５】 標識は、放射性、化学ルミネセンス、生
物ルミネセンス、蛍光、リン光もしくはエレクトロルミ
ネセンス標識、酵素、ビオチン、または吸光可能な基で
ある請求項３または４に記載の方法。 - 【請求項６】 被検物質誘導体は固相に結合されている
請求項１〜３および５の一つに記載の方法。 - 【請求項７】 被検物質誘導体は固相に結合したのち、
第二受容体分子とインキュベートする請求項１〜３、５
および６の一つに記載の方法。 - 【請求項８】 第一受容体分子は固相に結合されている
請求項１、２、４および５の一つに記載の方法。 - 【請求項９】 被検物質誘導体は、第一受容体分子を固
相に結合したのち第二受容体分子とインキュベートする
請求項１、２、４、５および８の一つに記載の方法。 - 【請求項１０】 第一および第二受容体分子は標識を除
いて同一である請求項１〜９の一つに記載の方法。 - 【請求項１１】 第一および第二受容体分子は互いに異
なる請求項１〜９の一つに記載の方法。 - 【請求項１２】 第一および／または第二受容体分子は
抗体または抗体フラグメントである請求項１〜１１の一
つに記載の方法。 - 【請求項１３】 被検物質はリガンドである請求項１〜
１２の一つに記載の方法。 - 【請求項１４】 リガンドはサイロキシン、トリヨード
サイロニンまたはステロイドである請求項１３に記載の
方法。 - 【請求項１５】 被検物質の第一受容体分子とのプレイ
ンキュベーションは工程（ａ）の前に行われる請求項１
〜１４の一つに記載の方法。 - 【請求項１６】 少なくとも、(ａ) 被検物質誘導体；
および／または(ｂ) 標識された被検物質誘導体；なら
びに(ｃ) 被検物質および被検物質誘導体に特異的な第
一受容体分子；および／または(ｄ) 被検物質および被
検物質誘導体に特異的な標識された第一受容体分子；お
よび(ｅ) 被検物質誘導体または被検物質誘導体および
被検物質に特異的に結合する第二受容体分子を含有する
キット。 - 【請求項１７】 請求項１〜１５の一つに記載の方法を
実施するための、請求項１６に記載のキットの使用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19504198A DE19504198A1 (de) | 1995-02-09 | 1995-02-09 | Kompetitiver Immuntest unter Verwendung komplexierter Analytderivate |
| DE19504198:4 | 1995-02-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP3502497B2 JP3502497B2 (ja) | 2004-03-02 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02219496A Expired - Fee Related JP3502497B2 (ja) | 1995-02-09 | 1996-02-08 | 複合化被検物質誘導体を用いた競合イムノアッセイ |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0726464B1 (ja) |
| JP (1) | JP3502497B2 (ja) |
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| AU (1) | AU4440096A (ja) |
| CA (1) | CA2169121C (ja) |
| DE (2) | DE19504198A1 (ja) |
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| US7662555B2 (en) * | 2003-12-24 | 2010-02-16 | Shinichiro Isobe | Method for detecting biomolecule, labeling dye used therefore, and labeling kit |
| US8084215B2 (en) * | 2008-04-29 | 2011-12-27 | Psychemedics Corporation | Non-proteolytic method for the determination of analytes in keratinized structures |
| HUE028235T2 (en) * | 2008-04-29 | 2016-12-28 | Psychemedics Corp | Solid phase multi-analyte test |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0103605B1 (en) | 1982-03-19 | 1990-12-05 | EKINS, Roger Philip | Method for free ligand assays |
| EP0089806B1 (en) * | 1982-03-22 | 1989-06-28 | AMERSHAM INTERNATIONAL plc | Assay for the free portion of substances in biological fluids |
| GB8317124D0 (en) * | 1983-06-23 | 1983-07-27 | Ekins R P | Free ligand assay |
| DE3442817A1 (de) | 1984-11-23 | 1986-05-28 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagenz zur quantitativen bestimmung von freiem thyroxin in plasma, serum oder vollblut |
| DE3624464A1 (de) | 1986-07-19 | 1988-01-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis eines analyten sowie hierfuer geeignetes mittel |
| DE3727238A1 (de) * | 1987-08-14 | 1989-02-23 | Henning Berlin Gmbh | Immunologisches bestimmungsverfahren zur bestimmung von hapteneigenschaften aufweisenden freien substanzen |
| GB8800419D0 (en) * | 1988-01-08 | 1988-02-10 | Amersham Int Plc | Method for measuring free fraction of ligands in biological fluids |
| DE3929119A1 (de) * | 1989-09-01 | 1991-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis von analyten |
| US5164299A (en) * | 1990-03-20 | 1992-11-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Use of a mixture of conjugated and unconjugated solid phase binding reagent to enhance the performance of assays |
| US5143852A (en) * | 1990-09-14 | 1992-09-01 | Biosite Diagnostics, Inc. | Antibodies to ligand analogues and their utility in ligand-receptor assays |
| IE920778A1 (en) * | 1991-03-12 | 1992-09-23 | Du Pont | Method for specific binding assays using a releasable ligand |
| WO1993003367A1 (en) * | 1991-07-29 | 1993-02-18 | Serex, Inc. | Differential binding affinities and dissociation assays based thereon |
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