JPH10502171A - 多相系におけるイムノアッセイの実施方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はイムノアッセイを多相系において実施する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 多相系におけるイムノアッセイの実施方法 本発明は、多相系においてイムノアッセイを行う方法に関する。 免疫学的検出方法は、インビトロ診断において極めて重要になってきている。 この理由は、それらが高度に特異的で、極めて高感度であることによる。さらに これらのアッセイは操作が容易である。この検出方法は、検出すべき被検物質と その１または２個以上の結合パートナーの間の免疫学的相互作用に基づくもので ある。 サンドイッチアッセイにおいては、被検物質はサンドイッチのように、２つの 異なる抗体によって結合される。２つの抗体の１つは、その濃度の測定を可能に する標識（マーカー）をもっている。 サンドイッチ法は小さな被検物質には適当ではない。たとえば、立体的理由に より２つの異なる抗体が同時に被検物質に結合できないからである。このような 環境下には、一般に競合アッセイが使用される。これらのアッセイにおいては、 被検物質と被検物質の合成誘導体が、たとえば抗体の結合部位で競合する。一般 に、被検物質の誘導体（通常の競合法）もしくは抗体（たとえば、SPALT：固相 抗原ルミネッセンス法）のいずれかが標識される。標識された成分はトレーサー と呼ばれる。 既知の競合法の欠点は、免疫測定アッセイにおける立場とは対照的に検出試薬 を過剰に使用することができず、したがって、検出すべき免疫複合体側に有利な 望ましい程度まで平衡位置を移動させることが不可能であるから、サンドイッチ アッセイの場合に比較して感度が劣ることである。 一般に、標識によって放射されるシグナルを測定する前に、過剰 の遊離トレーサー抗体(サンドイッチアッセイの場合およびSPALTを行う場合)ま たは非結合被検物質トレーサー(通常の競合法の場合)の分離が必要である。 「均一系アッセイ」として知られている方法では、遊離トレーサーと結合した トレーサーからのシグナルは互いに異なるので、この種の分離は必要がない。 不均一系アッセイには、被検物質の濃度に相関するシグナルを測定する前に、 通常は固相に結合している標識された免疫複合体を遊離の標識試薬から分離する ために１もしくは２回以上の分離工程が要求されるという欠点がある。この付加 的な工程は、アッセイが手作業で行われる場合には比較的労力を要し、その方法 に誤差を生じる可能性を増大させる。自動分析装置によって実施する場合でも、 この方法工程のために、一般にさらに付属装置を必要とするので、分離工程は不 利である。 この理由から、初期段階には「均一系アッセイ」が開発された。EMIT(酵素増 幅イムノアッセイ法；Biochem．Biophys．Res．Commun．47: 846，1972)の名称 で知られる均一系アッセイは、小分子たとえば薬物（たとえばステロイド）の検 出に有用であることがわかっている。改良されたEMITでは、標識として使用され る酵素の活性は、被検物質／酵素接合体が被検物質に対する抗体に結合すると低 下する。これは、抗体の存在下における酵素の活性中心に対する基質の親和性の 低下もしくは立体障害、または酵素のコンホーメーションの変化によることが明 らかである。 EMITの他の変法は、酵素に共有結合で結合する被検物質誘導体による酵素活性 の阻害に基づくものである。この場合は、被検物質に 向けられた抗体が酵素標識被検物質誘導体に結合したときに、その活性が回復す る。この方法のさらに他の変法が比較的大きな被検物質、たとえばIgG用に開発 されている（Anal．Biochem．102: 167，1990）。しかしながら、この方法を用 いて達成される感度はかなり低い。 FETIA(蛍光励起トランスファーイムノアッセイ；J．Biol．Chem．251: 4172， 1976)は、一方が抗体に連結し、他方が被検物質誘導体に連結する２つの蛍光分 子の間のエネルギーの移動に基づく方法である。この場合は、検出すべき被検物 質が標識抗体と標識被検物質誘導体の間の複合体の形成を妨害する。 ECIA（酵素チャネリング・イムノアッセイ；Anal．Biochem．1056: 223，1979 ; Appl．Biochem．Biotechnol．6: 53-64，1981）は、それぞれ異なる酵素をも つ抗体および被検物質トレーサーを使用する。第一の酵素反応の生成物が第二の 酵素反応の基質を構成する。２つの反応の総速度はこの共固定化によって著しく 増大する。 SLFIA(基質標識蛍光イムノアッセイ)においては、酵素基質で標識された被検 物質誘導体が抗-被検物質抗体の結合部位で被検物質と競合する。抗体への基質 標識被検物質誘導体の結合が基質の酵素との反応を妨害する（Burd J.F.，Feene y J.E.，Carrico R.J.，Bogulaski R.C.：Clin．Chem．23，1402，1977; Wong R .C.，Burd J.F.，Carrico R.J.，Buckler R.T.，Thoma J.，Bogulaski R.C.：Cl in．Chem．25，686，1979）。 蛍光化合物が溶液中で偏光によって励起されると、観察される発光も偏光され る。この偏光の程度は励起分子の移動度に依存する。蛍光トレーサーが抗体に結 合した場合の蛍光トレーサーの移動度の 低下が、蛍光偏光イムノアッセイにおいて、遊離および結合トレーサーの間の識 別に使用される。 蛍光保護イムノアッセイ（H.E．Ullman: Tokai J．Exp．Clin．Med.，４巻， 補遺，7-32頁，1979）は競合法に従って操作される均一系アッセイである。 慣用の競合アッセイでは、被検物質濃度が低い場合には、標識が抗−蛍光抗体 にもう接近できなくなり、その結果、もう消光が起こらなくなるまでトレーサー を結合するのに十分な抗−被検物質抗体が遊離状態で残存する。この立体的遮蔽 は抗−被検物質抗体を空間的需要の大きい成分とカップリングさせることにより さらに効果的にすることができる。 固相抗原法では、巨大な被検物質誘導体のトレーサー抗体への結合は、同様の 様式で、それが抗−蛍光抗体に同時に結合することを妨害する。 蛍光保護イムノアッセイの変法においては、抗−蛍光抗体への活性炭のカップ リングに基づく活性炭による光の非特異的な吸収が、消光効果（スカベンジング 効果）の増強に利用される。 その他の方法としては、たとえばALFPIA（抗原標識蛍光保護アッセイ；Clin． Chem．25: 1077，1979）またはSPA（シンチレーション近位アッセイ；米国特許 第4,568,649号；WO 90/11524号）がある。この方法では、シグナルはシンチレー ターに近接して結合する放射性トレーサーにより発生される。 本発明の基底にある目的は、既知の方法に比べてとくに感度、干渉による影響 の可能性がないこと、および操作の容易性に関して優れたイムノアッセイを実施 するための改良方法を提供することにあ った。 この目的は、新規な本方法において、現在の技術水準から既知のイムノアッセ イにおける慣用の成分、たとえば抗原、抗原誘導体または抗体とすることができ る受容体Ａ、選択された試験構造とは独立にたとえば標識抗体または標識抗原と することができるトレーサーに加えて、付加的成分として、標識に向けられ標識 との相互作用によってシグナルを発生するかあるいはシグナルを定性的および／ または定量的に変化させる受容体Ｂを用いることによって達成された。同時に、 受容体ＡおよびＢを１または２以上の相に適当に固定化することにより、トレー サーが受容体ＡおよびＢに同時に結合しないことを保証できる。これには、受容 体Ａに結合するトレーサーと受容体Ａに結合しないトレーサーが定性的および／ または定量的に異なるシグナルを誘発するので、両者を直接識別できるという利 点がある。その結果、現在の技術水準において既知のシステムと比較して、高い 感度、干渉による影響の可能性の低下、および改良された操作性を示す試験系の 確立が可能になる。 したがって、本発明は、検出すべき被検物質を含有するサンプルを受容体Ａお よびトレーサーに接触させる被検物質の測定方法において、被検物質は a) トレーサーと複合体を形成し、この複合体が標識によって検出できるもの である（イムノメトリーの原理）か、 b) 被検物質に向けられた受容体Ａへの結合でトレーサーと競合して、受容体 Ａとトレーサーの複合体の形成に拮抗するものである（競合法の原理）か、また は c) 被検物質と構造的に同一であるかもしくは構造的に類似する 受容体Ａと競合して、受容体Ａとトレーサーの複合体の形成に拮抗するもの（競 合法の原理）で、 さらに、 1) 標識と相互作用することによってシグナルを発生するかまたはシグナルを 定性的および／もしくは定量的に変化させる受容体Ｂを添加し、ついで 2) 標識によってもたらされるシグナルを測定することを特徴とし、 この場合、受容体ＡおよびＢは１または数個の相の上部または内部に適当に固 定化して、トレーサーは、受容体ＡおよびＢが同時に参加する結合中に入れない か、またはその結合に加わってもその程度はわずかで異なる被検物質濃度の検出 および識別は保証される、被検物質の測定方法に関する。 最も単純な場合、受容体Ｂは標識に対する抗体である。しかしながら、もちろ ん、標識が酵素である場合には受容体Ｂは酵素の基質または酵素の阻害剤とする こともできる。また、たとえば、標識はビオチン化酵素とし、受容体Ｂはビオチ ン残基に結合して酵素の触媒活性を阻害するアビジンまたはストレプトアビジン とすることもできる。常に重要なことは、標識と受容体Ｂがそれらの相互作用に よってシグナルの発生またはシグナルの変化を生じるという意味で「対」を形成 していることである。 当然、標識と受容体Ｂの位置を交換することもできる。たとえば、抗−被検物 質抗体はついで、SPALTアッセイの場合、そうでない方が通常のように標識によ って標識されるのではなく受容体Ｂに接合され、一方標識は、遊離の（すなわち 固相結合被検物質（誘導体） に結合していない）抗−被検物質抗体と受容体Ｂの接合体のみが標識に結合でき る位置に置かれてもよい。 本発明の範囲内において、トレーサーは最も一般的な形では標識された受容体 であると理解すべきである。この場合、標識は共有結合または非共有結合によっ て受容体に結合することができる。トレーサーはすべて、受容体および標識も同 様に、それらが有意義でありまた当業者に周知な様式で互いに組合わされる限り 現在の技術水準で既知のものが本発明によって使用できる。トレーサーの受容体 部分は単一の受容体であってもまた互いに共有結合または非共有結合によって順 次連結できる２以上の受容体から構成されていてもよい。 標識は、シグナルを放射できるか、または直接もしくは間接にシグナルを発生 できる化合物、たとえば発光原グループまたは酵素を意味するものと理解すべき である。 慣用の競合アッセイの場合には、被検物質特異的な免疫反応の平衡は、上述の 方法において、付加的な連結された免疫反応を用いて検出される免疫複合体の方 向にシフトさせることができる。最も単純な場合、これは、被検物質が抗体Ａの 結合部位から被検物質トレーサーを置換することによって達成され、このように して「抽出」された被検物質トレーサーは、付加的な免疫反応において抗体Ｂに より結合される。 抗体Ａは被検物質および被検物質トレーサーの両者に向けられているのに対し て、抗体Ｂは被検物質トレーサーとしか結合できない。その結果として、被検物 質トレーサーは、平衡反応「抗体Ａ／被検物質／被検物質トレーサー」に通常の 様式で参加することはできな い。 被検物質トレーサーのみに向けられている抗体Ｂのこの特異性によりならびに 適当に高濃度の抗体Ｂを選択することによって、平衡位置を最も有利になるよう に変えることができる。これにより、通常の競合免疫反応の感度に関する欠点が 低減される。トレーサーが抗体Ｂに結合した結果として標識によって放射される シグナルが変化する場合には、この場合のシグナルの変化は測定すべき被検物質 の濃度と相関することから、測定すべき成分を分離する必要はない。放射される シグナルの変化は、抗体Ｂへの結合によって直接誘発するか、または抗体Ｂへの 結合によりトレーサーをシグナル修飾環境に導入することによって誘発すること ができる。蛍光消光効果の場合には、これは、たとえば抗体Ｂを消光物質と接合 することにより達成できる。 サンドイッチアッセイの場合、形成されるサンドイッチ複合体（捕捉抗体Ａ、 被検物質およびトレーサー抗体から構成される）の数は被検物質の濃度に相関す る。したがって、サンドイッチ複合体中に結合しないトレーサーの残存量もまた 被検物質の濃度に相関する。遊離のトレーサーは抗体Ｂによって結合される。 本発明においては、２つの受容体ＡおよびＢの適当な固定化によって、トレー サーは受容体ＡおよびＢが同時に結合した安定な免疫複合体（たとえば抗体Ａ、 被検物質トレーサーおよび抗体Ｂからなるサンドイッチ複合体）中には入れない ことが保証する。これを達成するための一つの可能性には、受容体ＡとＢを異な る粒子にカップリングさせ、粒子のサイズおよび組成を、受容体ＡとＢが同時に 参加するトレーサーの結合がさらに困難になるかまたは妨害される ように選択する方法がある。また、受容体ＡとＢの両者を同じ固相に結合させて も、受容体ＡとＢが同時に関与する場合にはこのようなトレーサーへの結合がさ らに困難になるかまたは妨害されるような十分の距離を置いて結合させることも できる。 例として、選択が可能な一部の原理を図１に図解的に示す。 このような空間的配置の例は以下の通りである。 １．抗体Ａと抗体Ｂを異なるプラスチックビーズに結合させ、ビーズのサイズ または質量を十分大きく選択して、抗体Ａおよび抗体Ｂが共通に関与する結合に よって２つのビーズを安定に架橋することを不可能にするか、または立体障害に より抗体Ｂでコートされたビーズが抗体Ａによってコートされたビーズに十分結 合できないようにする配置。 ２．抗体Ａはプラスチックビーズに結合させ、抗体Ｂは反応チューブの内壁に 結合させる配置。 以下は、選択可能な不均一系アッセイの操作の例である。すなわち、予め被検 物質トレーサーで飽和させた固定化抗体Ａ（抗−被検物質抗体）でコーティング したプラスチックビーズを、抗体Ｂ（抗−標識抗体）でコーティングしたポリス チレンチューブに加える。被検物質を含むサンプルおよびインキュベーション緩 衝液を加えたのち、懸濁液をインキュベートし、ついでプラスチックビーズを除 去する。チューブ内に残ったシグナルを測定する。 ３．たとえば、OPUS（登録商標）システム(BDI，Westwood，MA，USA)において 使用されているような試験要素の異なるゲル相への抗体Ａおよび抗体Ｂの固定（ 図２参照）。 3a．OPUS試験モジュールを以下のように改変する。すなわち、 抗−蛍光標識抗体（Ｂ抗体）をアガロースの最上層に包埋し、中間層は通常のよ うに光学的フィルターとして用い、抗−被検物質抗体（抗体Ａ）および蛍光標識 被検物質トレーサーからなる免疫複合体は最下層に包埋する。 負荷されたサンプルからの被検物質は、免疫複合体からトレーサー分子を置換 し、トレーサーは最下層から拡散して最上層の抗−蛍光標識抗体によって結合さ れる。最下層の蛍光シグナルを測定する。これから、被検物質濃度の増大ととも に下降する標準曲線が得られる。 3b．OPUS試験モジュールを以下のように改変する。すなわち、抗−蛍光標識抗 体（Ｂ抗体）をアガロースの最下層に包埋し、中間層は通常のように光学的フィ ルターとして用い、抗−被検物質抗体（抗体Ａ）および蛍光標識被検物質トレー サーからなる免疫複合体は最上層に包埋する。 負荷されたサンプルからの被検物質は、免疫複合体からトレーサー分子を置換 し、トレーサーは最下層に拡散して抗−蛍光標識抗体によって結合される。最下 層の蛍光シグナルを測定する。これから、被検物質濃度の増大とともに上昇する 標準曲線が得られる。 ４．抗体Ａと抗体Ｂを膜繊維に結合させ、繊維上の抗体Ａと抗体Ｂの距離は２ つの抗体が同時にトレーサーとの結合に入れないことを保証する配置。 抗体Ｂへのトレーサーの結合がトレーサーによって放射されるシグナルに変化 をもたらす場合には、アッセイはついで、分離および／または洗浄工程が不要に なる様式で実施できる。この場合、シグナルの変化は測定すべき被検物質の濃度 と相関する。シグナルの 変化は、定性的なシグナル変化たとえば発光波長のシフトおよび／または定量的 シグナル変化たとえばシグナルの消光であってもよい。後者は、アクリジニウム アシルスルホンアミド標識の例を用いて図３に示す。 標識／抗−標識抗体対が酵素／酵素基質対で置換された場合には、シグナルの 変化に代えてシグナルを発生させることができる。 インキュベーション（工程）は様々な方式で実施できる。順序の選択は、不均 一系の操作の場合のように、通常の至適化作業の一部である。例としては以下の 方式がある。 １．抗体Ａ（固相に結合されている）と被検物質トレーサーからなる予め形成 された複合体を被検物質を含有するサンプルとインキュベートする。抗体Ｂ（同 様に固相に結合されている）はこのインキュベーションの最初から存在させるか またはある時間t₁を経過したのちにはじめて添加する。シグナルは時間t₂後に測 定する（図４の上の列参照）。 ２．被検物質誘導体（固相に結合されている）と標識された抗体Ａからなる予 め形成された複合体を(SPALTの原理)被検物質を含有するサンプルとインキュベ ートする。抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）はこのインキュベーションの 最初から存在させるかまたはある時間t₁を経過したのちにはじめて添加する。シ グナルは時間t₂後に測定する（図４の中央の列参照）。 ３．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質およびトレーサー抗体からな る予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサンドイッチ複合体を、被検 物質を含有するサンプルおよび抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）とともに インキュベートする。予 め形成された複合体を不安定化してトレーサーの置換を促進するために、修飾さ れた被検物質を予め形成されたサンドイッチ複合体中に被検物質に代えて使用す ることもできる(図４の下の列参照)。 ４．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質トレーサーおよび被検物質を 含有するサンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t₁を経過したのちに抗 体Ｂ（同様に固相に結合されている）を添加し、シグナルを時間t₂の経過後に測 定する（図５の上の列参照）。 ５．被検物質を含有するサンプルおよびトレーサー抗体を一緒にインキュベー トし、ある時間t₁を経過したのちに、抗体Ａ（固相に結合されている）と被検物 質の予め形成された複合体を添加する。時間t₂の経過後に、抗体Ｂ（同様に固相 に結合されている）を加え、時間t₃後にシグナルを測定する（図５の中央の列参 照）。 ６．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質含有サンプル、およびトレー サー抗体をインキュベートする。サンドイッチ複合体が形成されたならば、抗体 Ｂ（同様に固相に結合されている）を加える。その結果、サンドイッチ複合体中 に結合していないトレーサーの部分が抗体Ｂによって結合される（図５の下の列 参照）。 ７．抗体Ａ（固相に結合されている）と被検物質または被検物質誘導体の予め 形成された複合体を、被検物質含有サンプルおよび被検物質トレーサーとともに インキュベートする。抗体Ａによって結合されていないトレーサーの部分が抗体 Ｂにより結合される。 これに加えて、アッセイの操作はトレーサーと抗体Ｂの間の免疫反応にトレー サーと付加的な抗体B′の間の付加的免疫反応を連結することによって改変する ことができる。たとえば、固相に結合され ている抗体Ｂが、被検物質特異的免疫反応後または反応時に残存するトレーサー の遊離部分を結合する機能を有するとしても、このトレーサー部分のシグナルを 何らかの変化から保護するために、被検物質特異的結合に包含されるトレーサー のシグナルを固相には結合しない抗体B′を添加することによって選択的に改変 することができる。 この付加的インキュベーション工程は、たとえば、手作業で行われるアッセイ ではたとえば、抗体Ｂがその作用を発揮する時間をより正確に制御できること、 および／または、たとえば存在するもしくは添加できる抗体Ｂの量はその抗体が 固相に結合されていることにより限られる場合に、適当な高濃度の抗体B′によ ってシグナルにより迅速におよび／またはより明瞭に顕著な変化をもたらすこと により有利である。 関連する例の一部を以下に掲げる。 ８．抗体Ａ（固相に結合されている）と被検物質トレーサーからなる予め形成 された複合体を、被検物質含有サンプルとインキュベートする。抗体Ｂ（異なる 固相に結合されている）はこのインキュベーションの最初から存在させるかまた はある時間t₁を経過したのちにはじめて添加する。時間t₂後に、抗体B′を添加 し、適当な時間t₃後にシグナルを測定する。 ９．被検物質誘導体（固相に結合されている）および標識抗体Ａ(SPALTの原理 )からなる予め形成された複合体を被検物質含有サンプルとインキュベートする 。抗体Ｂ(同様に固相に結合されている)はこのインキュベーションの最初から存 在させるかまたはある時間t₁を経過したのちにはじめて添加する。時間t₂後に、 抗体B′を添加 し、さらに時間t₃の間インキュベートしたのちにシグナルを測定する（図６参照 ）。 10．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質およびトレーサー抗体からな る予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサンドイッチ複合体を被検物 質を含有するサンプルおよび抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）とインキュ ベートする。ついで抗体B′を添加し、シグナルを測定する。 11．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質トレーサーおよび被検物質を 含有するサンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t₁を経過したのちに抗 体Ｂ（同様に固相に結合されている）を添加し、時間t₂の経過後に抗体B′を添 加する。ついでシグナルを測定する。 12．被検物質を含有するサンプルおよびトレーサー抗体を一緒にインキュベー トし、ある時間t₁を経過したのちに、抗体Ａ（固相に結合されている）および被 検物質からなる予め形成された複合体を加える。時間t₂の経過後に、抗体Ｂ(同 様に固相に結合されている)を加え、時間t₃後に抗体B′を添加する。ついでシグ ナルを測定する。 13．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質を含有するサンプルおよびト レーサー抗体をインキュベートする。サンドイッチ複合体が形成されたならば、 抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）を加え、その結果サンドイッチ複合体中 に結合していないトレーサーの部分が抗体Ｂにより結合される。抗体B′を添加 すると、この抗体はサンドイッチ複合体中に含まれるトレーサーに結合する。 トレーサーの標識基が酵素である場合には、抗体Ｂは酵素基質で 置き換えることができる。この場合には、シグナルはトレーサーと酵素基質の間 の接触の結果として発生する。この場合も、発生するシグナルは測定すべき被検 物質の濃度に相関する。この例は以下の通りである。 14．抗体Ａ（固相に結合されている）および被検物質トレーサー（酵素で標識 された被検物質誘導体）からなる予め形成された複合体を、被検物質含有サンプ ルとインキュベートする。異なる固相に固定化されている酵素基質は、このイン キュベーションの最初から存在させるか、またはある時間t₁を経過したのちには じめて添加する。時間t₂後にシグナルを測定する。 15．被検物質誘導体（固相に結合されている）および酵素標識抗体Ａからなる (SPALTの原理)予め形成された複合体を被検物質含有サンプルとインキュベート する。異なる固相に結合されている酵素基質はこのインキュベーションの最初か ら存在させるかまたはある時間t₁を経過したのちにはじめて添加する。時間t₂後 にシグナルを測定する。 16．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質およびトレーサー抗体からな る予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサンドイッチ複合体を、被検 物質を含有するサンプルおよび酵素基質（同様に固相に結合されている）とイン キュベートする。 17．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質トレーサーおよび被検物質を 含有するサンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t₁を経過したのちに酵 素基質（同様に固相に結合されている）を添加し、時間t₂の経過後にシグナルを 測定する。 18．被検物質を含有するサンプルおよびトレーサー抗体を一緒に インキュベートし、ある時間t₁を経過したのちに、抗体Ａ（固相に結合されてい る）および被検物質からなる予め形成された複合体を加える。時間t₂の経過後に 酵素基質(同様に固相に結合されている)を加え、時間t₃後にシグナルを測定する 。 19．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質含有サンプル、およびトレー サー抗体をインキュベートする。サンドイッチ複合体が形成されたならば、酵素 基質Ｂ（同様に固相に結合されている）を加え、その結果として、サンドイッチ 複合体中に結合していないトレーサーの部分が酵素基質と反応できる。 20．抗体Ａ（固相に結合されている）および被検物質トレーサーからなる予め 形成された複合体を被検物質を含有するサンプルとともにインキュベートする。 酵素に向けられ、酵素活性を減弱または阻害する抗体Ｂ（同様に固相に結合され ている）はこのインキュベーションの最初から存在させるかまたはある時間t₁を 経過したのちにはじめて添加する。時間t₂後に酵素基質を加え、適当な時間t₃後 にシグナルを測定する。 21．被検物質誘導体（固相に結合されている）および標識抗体Ａ(SPALTの原理 )からなる予め形成された複合体を被検物質含有サンプルとインキュベートする 。酵素に向けられた抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）は、このインキュベ ーションの最初から存在させるかまたはある時間t₁を経過したのちにはじめて添 加する。時間t₂後に酵素基質を添加し、さらに時間t₃のインキュベーション後に シグナルを測定する。 22．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質およびトレーサー抗体からな る予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサ ンドイッチ複合体を被検物質含有サンプルおよび抗体Ｂ（酵素に向けられ、同様 に固相に結合されている）とインキュベートする。ついで酵素基質を加え、シグ ナルを測定する。 23．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質トレーサーおよび被検物質を 含有するサンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t₁を経過したのちに抗 体Ｂ（酵素に向けられ、同様に固相に結合されている）を添加し、時間t₂の経過 後に酵素基質を加える。ついでシグナルを測定する。 24．被検物質を含有するサンプルおよびトレーサー抗体を一緒にインキュベー トし、ある時間t₁を経過したのちに抗体Ａ（固相に結合されている）および被検 物質の予め形成された複合体を加える。時間t₂の経過後に、抗体Ｂ（酵素に向け られ、同様に固相に結合されている）を加え、時間t₃後に酵素基質を添加する。 ついでシグナルを測定する。 25．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質を含有するサンプル、および トレーサー抗体をインキュベートする。サンドイッチ複合体が形成されたならば 抗体Ｂ（酵素に向けられ、同様に固相に結合されている）を加えると、その結果 サンドイッチ複合体中に結合していないトレーサーの部分が抗体Ｂによって結合 される。酵素基質を添加することにより、サンドイッチ複合体中に包含されるト レーサーがシグナルを発生できる。 ここに挙げた例はすべて、もちろん、標識の位置と受容体Ｂの位置が交換され た変法で操作することができる。この例は以下の通りである。 26．抗体Ａ（固相に結合されている）および受容体Ｂに接合され た被検物質誘導体の予め形成された複合体を、被検物質含有サンプルとインキュ ベートする。標識（同様に固相に結合されている）はこのインキュベーションの 最初から存在させるか、またはある時間t₁を経過したのちにはじめて添加する。 時間t₂後にシグナルを測定する。 27．被検物質誘導体（固相に結合されている）および抗体Ｂに接合された抗体 Ａ（SPALTの原理）からなる予め形成された複合体を、被検物質を含有するサン プルとインキュベートする。標識（同様に固相に結合されている）はこのインキ ュベーションの最初から存在させるか、またはある時間t₁を経過したのちにはじ めて添加する。時間t₂後にシグナルを測定する。 28．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質、および抗体Ｂで標識された 抗−被検物質抗体の予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサンドイッ チ複合体を被検物質含有サンプルおよび標識（同様に固相に結合されている）と インキュベートする。 29．抗体Ａ（固相に結合されている）、抗体Ｂに接合された被検物質誘導体、 および被検物質含有サンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t₁を経過し たのちに、標識（同様に固相に結合されている）を添加し、時間t₂の経過後にシ グナルを測定する。 30．被検物質を含有するサンプル、および抗体Ｂと接合された抗−被検物質抗 体を一緒にインキュベートし、ある時間t₁を経過したのちに、抗体Ａ（固相に結 合されている）および被検物質の予め形成された複合体を加える。時間t₂の経過 後に、標識（同様に固相に結合されている）を加え、時間t₃後にシグナルを測定 する。 31．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質を含有するサン プル、および抗体Ｂと接合された抗-被検物質抗体をインキュベートする。サン ドイッチ複合体が形成されたならば、標識（同様に固相に結合されている）を加 えると、その結果サンドイッチ複合体中に結合していない抗体Ｂと接合された抗 −被検物質抗体の部分が標識を結合できる。 32．抗体Ａ（固相に結合されている）および酵素基質によって標識された被検 物質誘導体の予め形成された複合体を、被検物質含有サンプルとインキュベート する。異なる固相に固定化されている酵素はこのインキュベーションの最初から 存在させるか、またはある時間t₁を経過したのちにはじめて添加する。時間t₂後 にシグナルを測定する。 33．被検物質誘導体（固相に結合されている）および酵素基質で標識された抗 体Ａ(SPALTの原理)からなる予め形成された複合体を、被検物質を含有するサン プルとインキュベートする。異なる固相に結合している酵素は、このインキュベ ーションの最初から存在させるか、またはある時間t₁を経過したのちにはじめて 添加する。時間t₂後にシグナルを測定する。 34．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質、および酵素基質で標識され た抗−被検物質抗体からなる予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサ ンドイッチ複合体を被検物質含有サンプルおよび酵素（同様に固相に結合されて いる）とインキュベートする。 35．抗体Ａ（固相に結合されている）、酵素基質によって標識された被検物質 誘導体および被検物質含有サンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t₁を 経過したのちに、酵素（同様に固相に結 合されている）を添加し、時間t₂の経過後にシグナルを測定する。 36．被検物質を含有するサンプル、および酵素基質で標識されている抗−被検 物質抗体を一緒にインキュベートし、ある時間t₁を経過したのちに抗体Ａ（固相 に結合されている）および被検物質の予め形成された複合体を添加する。時間t₂ の経過後に、酵素（同様に固相に結合されている）を加え、時間t₃後にシグナル を測定する。 37．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質を含有するサンプル、および 酵素−基質で標識されている抗−被検物質抗体をインキュベートする。サンドイ ッチ複合体が形成されたならば、酵素（同様に固相に結合されている）を加える とその結果サンドイッチ複合体中に結合していない酵素−基質で標識されている 抗体の部分が酵素と反応可能になる。 38．抗体Ａ(固相に結合されている)と酵素-基質で標識されている被検物質誘 導体からなる予め形成された複合体を被検物質含有サンプルとインキュベートす る。酵素基質に向けられた抗体Ｂ（酵素基質の酵素的変換をそれへの結合により 阻害または防止する。抗体Ｂは同様に固相に結合されている）はこのインキュベ ーションの最初から存在させるかまたはある時間t₁の経過後にはじめて添加する 。時間t₂後に酵素を添加し、適当な時間t₃後にシグナルを測定する。 39．被検物質誘導体(固相に結合されている)および酵素-基質で標識された抗 体Ａ(SPALTの原理)からなる予め形成された複合体を、被検物質を含有するサン プルとインキュベートする。酵素基質に向けられた抗体Ｂ（異なる固相に結合さ れている）はこのインキュベーションの最初から存在させるか、またはある時間 t₁を経過したのちにはじめて添加する。時間t₂後に酵素を添加し、さらに時間t₃ の インキュベーション後にシグナルを測定する(図７参照)。 40．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質、および酵素基質で標識され ている抗−被検物質抗体の予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサン ドイッチ複合体を、被検物質含有サンプルおよび抗体Ｂ（酵素基質に向けられ、 同様に固相に結合されている）とインキュベートする。ついで酵素を添加し、シ グナルを測定する。 41．抗体Ａ（固相に結合されている）、酵素基質で標識されている被検物質誘 導体および被検物質含有サンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t₁を経 過したのち、抗体Ｂ（酵素基質に向けられ、同様に固相に結合されている）を加 え、時間t₂の経過後に酵素を添加する。ついでシグナルを測定する。 42．被検物質含有サンプルおよび酵素基質で標識されている抗−被検物質抗体 を一緒にインキュベートし、ある時間t₁を経過したのちに、抗体Ａ（固相に結合 されている）および被検物質の予め形成された複合体を加える。時間t₂の経過後 に抗体Ｂ（酵素基質に向けられ、同様に固相に結合されている）を添加し、時間 t₃後に酵素を加える。ついでシグナルを測定する。 43．抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質含有サンプル、および酵素基 質で標識されている抗−被検物質抗体をインキュベートする。サンドイッチ複合 体が形成されたならば、抗体Ｂ（酵素基質に向けられ、同様に固相に結合されて いる）を加える。その結果として、サンドイッチ複合体中に結合していない酵素 基質で標識されている抗体の部分が、抗体Ｂによって結合される。酵素を加える と、サンドイッチ複合体中に含まれるトレーサーがシグナルを発生 できる。 本発明をさらに以下の実施例によって記述する。実施例は本発明をさらに詳細 に説明することを意図するものであり、いかなる意味においても本発明を限定す るものではなく、本発明は請求の範囲によって決定される。 実施例 １ PSAの測定のためのルミネッセンスイムノアッセイ（LIA） 試薬の調製：固相Ａ ： Rhone-Poulenc(カタログ番号：EM1-100/40)の磁性粒子をモノクローナル抗−P SA抗体(BW 92-283/029; Behringwerke AG，Marburg)により、カルボジイミド法 ［G．Wendlbergerら，Synthese von Peptiden(ペプチドの合成)，２部，Methode n Org．Chem．(有機化学的方法)，Houben-Weyl，４版，1952，ＸＶ／２巻，1974 ］を用いてコートした。コーティング濃度は10％磁性粒子懸濁液１mlあたり抗体 ６mgとした。そのまま使用できる懸濁液は、保存緩衝液［50mM ２−シクロヘキ シルアミノエタンスルホン酸（CHES），0.5ｇ／l NaN₃，３ｇ／l ウシ血清アル ブミン，pH 8.0］中磁性粒子2.5mg／lの濃度とした。固相Ｂ ： 磁性粒子を、固相Ａの場合と同様に、アクリジニウムＮ−アシルスルホンアミ ド標識（EP-A-0 257 541およびEP-A-0 330 050）に対するモノクローナル抗体［ BW 90-9/04; Behringwerke AG; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Z ellkulturen GmbH（ドイツ微生物ならびに培養細胞保存機関），Braunschweig， Germany寄託番号DSM ACC 2184として寄託］によりコートした。トレーサー ： モノクローナル抗−PSA抗体（BW 92-284/03，Behringwerke AG）をアクリジニ ウムＮ−アシルスルホンアミド標識（EP-A-0 257 54，EP-A-0 330 050）により モル比１＋１で標識した。標識化は文献記載のNHS法で実施した(NHS＝Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミド反応性基；A．K．Campbell，Chemiluminescence: Princip les and Applications in Bioligy and Medicine，１版，VCH／Horwood，Weinhe im／Chichester，1988，439頁)。精製にはゲル透過クロマトグラフィー(Sephade x Ｇ25)を用いた。トレーサーは、トレーサー緩衝液（10mM酢酸ナトリウム，150 mM NaCl，２ｇ／ｌウシ血清アルブミン，0.1％ Mergal K9N，pH 5.0）中300ng／ mlの濃度で保存した。PSA 標準 ： PSA（前立腺特異的抗原、Behringwerke AG）を溶解した緩衝液は以下の組成： 50mM Tris、150mM NaCl、0.05％ NaN₃、0.01％ Tween 20，0.5ｇ／l ウシIgG，4 0ｇ／ｌウシ血清アルブミン、８mg／l Titriplex Ｖ、pH 7.6とした。標準濃度 は０、50、100、200および400ng／mlとした。予め形成された複合体 ： 抗−PSA抗体（固相Ａに結合している）およびPSAからなる予め形成された複合 体は以下のようにして形成された。１mlの固相Ａ懸濁液および１mlのPSA溶液［2 0mg／ml(１ｇ／ｌのウシIgGおよび0.5ｇ／ｌのナトリウムアジドを含有する10mM リン酸塩緩衝液，pH 7.3)］を37℃で30分インキュベートし、ついで粒子を１ml の緩衝液 で５分間洗浄し（磁性分離）、最終容量を１mlとした。 アッセイ操作： PSA含有サンプル10mlを10mlのトレーサーとともに室温で２分間インキュベー トした。ついで予め形成された複合体10mlを加え、さらに２分後に10mlの固相Ｂ を加えた。ついでサンプルをルミノメーター[BeriLux（登録商標）アナライザー ]中で測定した（測定時間１秒）。 結果は図８に示す。アッセイ操作は図8aに図解的に示す。 実施例 ２ PSAの測定のためのイムノルミノメトリーアッセイ（ILMA） 試薬の調製：固相Ａ ： ローナル抗−PSA抗体(BW 92-283/029; Behringwerke AG，Marburg)により、カル ボジイミド法［G．Wendlbergerら，Synthesevon Peptiden(ペプチドの合成)，II 部，Methoden Org．Chem．(有機化学的方法)，Houben-Weyl，４版，1952，ＸＶ ／２巻，1974］を使用してコートした。コーティング濃度は、10％磁性粒子懸濁 液１mlについて抗体６mgとした。そのまま使用できる懸濁液は、保存緩衝液［50 mM CHES，0.5ｇ／l NaN₃，３ｇ／l ウシ血清アルブミン，pH 8.0］中磁性粒子濃 度10mg／mlとした。固相Ｂ ： 磁性粒子を、固相Ａの場合と同様に、アクリジニウムＮ−アシルスルホンアミ ド標識（EP-A-0 257 541およびEP-A-0 330 050）に対するモノクローナル抗体［ BW 90-9/04; Behringwerke AG; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZe llkulturen GmbH(ドイツ微生物ならびに培養細胞保存機関)，Braunschweig,Germ anyに寄託番号DSM ACC 2184として寄託］によりコートした。そのまま使用でき る懸濁液は、保存緩衝液(50mM CHES，0.5ｇ／l NaN₃，３ｇ／l ウシ血清アルブ ミン，pH 8.0)中磁性粒子濃度2.5mg／mlとした。トレーサー ： モノクローナル抗−PSA抗体（BW 92-284/03，Behringwerke AG）をアクリジニ ウムＮ−アシルスルホンアミド標識(EP-A-0 257 54，EP-A-0 330 050)によって モル比１＋0.5で標識した。標識化は文献記載のNHS法で行った(NHS＝Ｎ−ヒドロ キシスクシンイミド反応基; A．K．Campbell，Chemiluminescence: Principles and Appli-cations in Bioligy and Medicine，１版，VCH／Horwood，Weinheim ／Chichester，1988，439頁)。精製にはゲル透過クロマトグラフィー(Sephadex Ｇ25)を使用した。トレーサーは、トレーサー緩衝液（10mM酢酸ナトリウム，150 mM NaCl，２ｇ／l ウシ血清アルブミン，0.1％ Mergal K9N，pH 5.0）中30mg／m lの濃度で保存した。PSA 標準 ： PSA（前立腺特異的抗原、Behringwerke AG）を溶解した緩衝液は以下の組成： 50mM Tris、150mM NaCl、0.05％ NaN₃、0.01％Tween 20、0.5ｇ／l ウシIgG、40ｇ／l ウシ血清アルブミン、８mg／l Titriplex Ｖ、 pH 7.6 とした。標準濃度は０、0.2、0.4、0.8、1.6、3.1、6.2および12.5mg／m lとした。 アッセイ操作： PSA含有サンプル10mlを10mlのトレーサーおよび10mlの固相Ａとともに37℃で2 0分間インキュベートした。ついで10mlの固相Ｂを加え、さらに15分後に、混合 物をルミノメーター［BeriLux(登録商標)アナライザー］中で１秒間測定した。 結果は図９に示す。アッセイ操作は図9aに図解的に示す。 実施例 ３ サイロキシンの測定のためのSPALTアッセイ 試薬の調製：固相Ａ ： BeriLux T3に使用されている蛋白質／T3接合体により、カルボジイミド法［G．W endlbergerら，Synthese von Peptiden(ペプチドの合成)，II部，Methoden Org ．Chem．(有機化学的方法)，Houben-Weyl，４版，1952，ＸＶ／２巻，1974］を 用いてコートした。コーティング濃度は10％磁性粒子懸濁液１mlあたり接合体0. 3mgとした。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液（50mM Tris／クエン酸緩衝 剤，0.5ｇ／l NaN₃，３ｇ／l ウシ血清アルブミン，pH 7.0）中2.5mg／mlとした 。固相Ｂ ： クリジニウムＮ−アシルスルホンアミド標識(EP-A-0 257 541 なら びにEP-A-0 330 050)に対するモノクローナル抗体[BW 90-9/04；Behringwerke A G; Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイツ微 生物および培養細胞保存機関），Braunschweig，Germanyに寄託番号DSM ACC 218 4として寄託]により、カルボジイミド法［G．Wendlbergerら，Synthese von Pep tiden(ペプチドの合成)，第II部，Methoden Org．Chem．(有機化学的方法)，Hou ben-Weyl，４版，1952，ＸＶ／２巻，1974］を用いてコートした。コーティング 濃度は、10％磁性粒子懸濁液１mlあたり抗体６mgとした。そのまま使用できる懸 濁液は、保存緩衝液(50mM CHES，0.5ｇ／l NaN₃，３ｇ／l ウシ血清アルブミン ，pH 8.0)中磁性粒子濃度2.5mg／mlとした。トレーサー ： モノクローナル抗−T4抗体(BW 86-49/7/1，Behringwerke AG)をアクリジニウ ム Ｎ−アシルスルホンアミド標識（EP-A-0 257 54，EP-A-0 330 050）によりモ ル比１＋５で標識した。標識化は、文献記載のNHS法で実施した(NHS＝Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミド反応性基；A.K．Campbell，Chemiluminescence: Principl es and Applications in Bioligy and Medicine，１版，VCH/Horwood，Weinheim ／Chichester，1988，439頁)。精製にはゲル透過クロマトグラフィー(Sephadex Ｇ25)を使用した。トレーサーは、トレーサー緩衝液(10mMクエン酸／リン酸緩衝 剤，２ｇ／l ポリエチレングリコール 6000，２ｇ／l Mowiol，pH 6.3)中40mg／ mlの濃度で保存した。T4 標準 ： T4標準用緩衝液は以下の組成とした。10mMリン酸塩，１ｇ／l ウ シIgG，0.5ｇ／l NaN₃，pH 7.3。標準濃度は０、0.1、0.5、１、５、10ならびに 50mg／mlとした。予め形成された複合体 ： 予め形成された複合体(固相Ａに結合されているトレーサー）は以下のように して調製された。６mlの固相Ａを３mlに濃縮した(固相を磁性分離し、緩衝液に 再懸濁する)。ついで0.2mlのトレーサーを加え、混合物を37℃で30分インキュベ ートした。粒子を10mMリン酸塩緩衝剤、１ｇ／l ウシIgG、0.5ｇ／l NaN₃、pH 7 .3（洗浄緩衝液）で５分間洗浄した。粒子は３mlの洗浄緩衝液中に保存した。 アッセイ操作： T4含有サンプル10mlを10mlの予め形成された複合体と室温で２分間インキュベ ートした。ついで10mlの固相Ｂを加え、さらに２分後に混合物をルミノメーター ［BeriLux(登録商標)アナライザー］中で１秒間測定した。 結果は図10に示す。アッセイ操作は図10ａに図解的に示す。 実施例 ４ サイロキシンの測定のためのLIA（保護／消光法） 試薬の調製：固相Ａ ： ノクローナル抗−T4抗体（BW 86-49/7/1，Behringwerke AG）によりカルボジイ ミド法を用いてコートした［G．Wendlbergerら，Synthese von Peptiden（ペプ チドの合成），II部，Methoden Org．Chem．(有機化学的方法)，Houben-Weyl， ４版，1952，ＸＶ／２巻，1974］。コーティング濃度は、10％磁性粒子懸濁液１ mlあたり抗体 1.2mgとした。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液[10.36ｇ／l CHES，0.5ｇ ／l NaN₃，１ｇ／l ウシIgG，pH 8.0]中2.5mg／mlとした。固相Ｂ ： リジニウムＮ−アシルスルホンアミド標識（EP-A-0 257 541およびEP-A-0 330 0 50）に対するモノクローナル抗体［保護抗体，BW 90-9/04; Behringwerke AG; D eutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(ドイツ微生物 および培養細胞保存機関)，Braunschweig，Germany に寄託番号 DSM ACC 2183と して寄託］によって、カルボジイミド法［G．Wendlbergerら，Synthese von Pep tiden（ペプチド合成），第II部，Methoden Org.Chem．(有機化学的方法)，Houb en-Weyl，４版，1952，ＸＶ／２巻，1974］を用いてコートした。コーティング 濃度、は10％磁性粒子懸濁液１mlあたり抗体６mgとした。そのまま使用できる懸 濁液は、保存緩衝液[10.36ｇ／l CHES，0.5ｇ／l ナトリウムアジド，３ｇ／lウ シ血清アルブミン，pH 8.0]中磁性粒子濃度2.5mg／mlとした。トレーサー ： BeriLux FT3に使用されているトレーサーを、トレーサー緩衝液（10mMリン酸 塩緩衝剤，１ｇ／l IgG，pH 7.3）中360ng／mlの濃度で保存した。消光抗体 ： 抗−標識抗体BW 90-8/04［Behringwerke AG; Deutsche Sammlung von Mikroor ganismen und Zellkulturen GmbH(ドイツ微生物ならびに培養細胞保存機関)，Br aunschweig，Germanyに寄託番号DSM ACC 2184 として寄託］を緩衝溶液(10mMリン酸塩，１ｇ／l IgG，0.5ｇ／l ナトリウ ムアジド，pH 7.3)中に0.1mg／mlの濃度で保存した。T4 標準 ： 血清メジウム中濃度０、18、40、85、175および340ng／mlのBeriLux（登録商 標）T4標準（Behringwerke AG）を用いた。予め形成された複合体 ： 予め形成された複合体（固相Ａに結合されているトレーサー）は以下のように して調製した。２mlの固相Ａに２mlのトレーサーを加え、混合物を37℃で30分イ ンキュベートした。粒子を10mMリン酸塩緩衝剤、１ｇ／l IgG、0.5ｇ／l ナトリ ウムアジド、pH 7.3で５分間洗浄し、２mlとした。ついでANS(８−アニリノナフ タレン−１−スルホン酸)２mgを加えた。 アッセイ操作： 10mlの予め形成された複合体およびT4含有サンプル10mlを15分間インキュベー トした。ついで10mlの固相Ｂおよび10mlの消光抗体を各場合10分間の間隔を置い て加え、懸濁液をルミノメーター[BeriLux（登録商標）アナライザー]中で１秒 間測定した。一定のインキュベーション温度37℃に保持した。 結果は図11に示す。アッセイ操作は図11ａに図解的に示す。 実施例 ５ サイロキシンの測定のためのLIA 試薬の調製：固相Ａ ： クローナル抗−T4抗体(BW 86-49/7/1，Behringwerke AG)によりカ ルボジイミド法を用いてコートした［G．Wendlbergerら，Synthese von Peptide n（ペプチドの合成），II部，Methoden Org.Chem．(有機化学的方法)，Houben-W eyl，４版，1952，ＸＶ／２巻，1974］。コーティング濃度は10％磁性粒子懸濁 液中、抗体1.25mg／mlとした。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液（10.36 ｇ／l CHES，0.5ｇ／l ナトリウムアジド，１ｇ／l ウシIgG，pH 8.0）中2.5mg ／mlとした。固相Ｂ ： BeriLux標識に対するモノクローナル抗体[消光抗体，BW 90-8/04; Behringwerke AG; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイツ 微生物および培養細胞保存機関），Braunschweig，Germanyに寄託番号DSM ACC 2 184として寄託]によって、カルボジイミド法[G．Wendlbergerら，Synthese von Peptiden(ペプチド合成)，第II部，Methoden Org．Chem.(有機化学的方法)，Hou ben-Weyl，４版，1952，ＸＶ／２巻，1974]を用いてコートした。コーティング 濃度は、10％磁性粒子懸濁液１mlあたり抗体６mgとした。そのまま使用できる懸 濁液は、保存緩衝液(10.36ｇ／l CHES，0.5ｇ／l ナトリウムアジド，３ｇ／l ウシ血清アルブミン，pH 8.0)中磁性粒子濃度2.5mg／mlとした。トレーサー ： BeriLux FT3に使用されているトレーサーを、トレーサー緩衝液（10mMリン酸 塩緩衝剤，１ｇ／l IgG，0.5ｇ／l NaN₃，pH 7.3）中360ng／mlの濃度で保存し た。T4 標準 ： 血清メジウム中濃度０、18、40、85、175および340ng／mlのBeriLux（登録商 標）T4標準（Behringwerke AG）を用いた。予め形成された複合体 ： 予め形成された複合体（固相Ａに結合されているトレーサー）は以下のように して調製した。２mlの固相Ａに２mlのトレーサーを加え、混合物を37℃で30分イ ンキュベートした。粒子を10mMリン酸塩緩衝液、１ｇ／l IgG、0.5ｇ／l ナトリ ウムアジド、pH 7.3で５回洗浄し、２mlとした。ついでANS(８−アニリノナフタ レン−１−スルホン酸)２mgを加えた。 アッセイ操作： 10μlの予め形成された複合体およびT4含有サンプル10μlを15分間インキュベ ートした。ついで10μlの固相Ｂを加えてさらに10分間インキュベートしたのち 、懸濁液をルミノメーター［BeriLux(登録商標)アナライザー］中で１秒間測定 した。一定のインキュベーション温度37℃に保持した。 結果は図12に示す。アッセイ操作は図12ａに図解的に示す。 実施例 ６ FT3の測定のためのLIA 試薬の調製：固相Ａ ： クローナル抗−T3抗体（BeriLux FT3 抗体）によりカルボジイミド法［G.Wendlb ergerら，Synthese von Peptiden(ペプチドの合成)，II部，Methoden Org．Chem ．(有機化学的方法)，Houben-Weyl，４版，1952，ＸＶ／２巻，1974］を用いて コートした。コーティング 濃度は10％磁性粒子懸濁液中、抗体0.25mg／mlとした。そのまま使用できる懸濁 液は保存緩衝液（10.36ｇ／l CHES，0.5ｇ／l ナトリウムアジド，１ｇ／l ウシ IgG，pH 8.0）中2.5mg／mlとした。固相Ｂ ： BeriLux標識に対するモノクローナル抗体[消光抗体，BW 90-8／04; Behringwerk e AG; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイ ツ微生物および培養細胞保存機関），Braunschweig，Germanyに寄託番号DSM ACC 2184として寄託]によって、カルボジイミド法[G．Wendlbergerら，Synthese vo n Peptiden(ペプチド合成)，第II部，Methoden Org．Chem．(有機化学的方法)， Houben-Weyl，４版，1952，ＸＶ／２巻，1974]を用いてコートした。コーティン グ濃度は10％磁性粒子懸濁液１mlあたり抗体６mgとした。そのまま使用できる懸 濁液は保存緩衝液（10.36ｇ／l CHES，0.5ｇ／l ナトリウムアジド，３ｇ／l ウ シ血清アルブミン，pH 8.0）中磁性粒子濃度2.5mg／mlとした。トレーサー ： トレーサー緩衝液（50mM Tris塩酸塩，150mM NaCl，0.5ｇ／l ナトリウムアジ ド，0.1ｇ／l Tween 20，40ｇ／l ウシ血清アルブミン，ならびに８mg／l Titri plex Ｖ，pH 7.6）中１ng／mlのハプテントレーサー（T3−アクチジントレーサ ー；図17参照）。FT3 標準 ： 血清メジウム中濃度０〜22pg／mlの濃度範囲のFT3標準を用いた。 アッセイ操作： 50μlのサンプルを10μlのトレーサーオよび10μlの固相Ａと一緒に15分間イ ンキュベートした。ついで10μlの固相Ｂを加え、混合物をさらに10分間インキ ュベートしたのち懸濁液をルミノメーター［BeriLux(登録商標)アナライザー］ 中で１秒間測定した。一定のインキュベーション温度37℃に保持した。 結果は図13に示す。アッセイ操作は図13ａに図解的に示す。 実施例 ７ PSAの測定のためのイムノルミノメトリーアッセイ（ILMA） 試薬の調製：固相Ａ ： ローナル抗−PSA抗体(BW 92-283／029; Behringwerke AG，Marburg)により、カ ルボジイミド法［G.Wendlbergerら，Synthesevon Peptiden(ペプチドの合成)，I I部，Methoden Org．Chem．(有機化学的方法)，Houben-Weyl，４版，1952，ＸＶ ／２巻，1974］を使用してコートした。コーティング濃度は、10％磁性粒子懸濁 液１mlについて抗体６mgとした。そのまま使用できる懸濁液は、保存緩衝液（50 mM CHES，0.5ｇ／l NaN₃，３ｇ／l ウシ血清アルブミン，pH 8.0）中磁性粒子濃 度10mg／mlとした。固相Ｂ ： 磁性粒子を固相Ａの場合と同様に、BeriLux標識に対するモノクローナル抗体 ［BW 90-8/04; Behringwerke AG; Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen undZ ellkulturen GmbH(ドイツ微生物ならびに培養細胞保存機関)，Braunschweig,Ger many に寄託番号 DSM ACC2184として寄託］によりコートした。そのまま使用で きる 懸濁液は、保存緩衝液（50mM CHES，0.5ｇ／l NaN₃，３ｇ／l ウシ血清アルブミ ン，pH 8.0）中磁性粒子濃度５mg／mlとした。トレーサー濃厚液 ： モノクローナル抗−PSA抗体（BW 92-284/03，Behringwerke AG）を BeriLux（ 登録商標）標識によりモル比１＋10で標識した。標識化は文献記載のNHS法で実 施した(NHS＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド反応基；A.K．Campbell，Chemilumi nescence: Principles and Applications in Bioligy and Medicine,１版，VCH ／Horwood，Weinheim／Chichester，1988，439頁)。精製はゲル透過クロマトグ ラフィー(Sephadex Ｇ25)で実施した。トレーサーはトレーサー緩衝液（10mM酢 酸ナトリウム，150mM NaCl，２ｇ／l ウシ血清アルブミンおよび0.1％Mergal K9 N，pH 5.0）中30μl／mlの濃度で保存した。トレーサー ： そのまま使用できるトレーサーの調製にはトレーサー濃厚液を0.1Ｍリン酸塩 緩衝液（0.15ｇ／l NaClおよび１ｇ／l ウシ血清アルブミン含有，pH 6.3）で1 ：200の割合に希釈した。PSA 標準 ： PSA（前立腺特異的抗原、Behringwerke AG）を溶解した緩衝液は以下の組成： 50mM Tris，150mM NaCl，0.05％ NaN₃，0.01％Tween 20，0.5ｇ／l ウシIgG，40 ｇ／l ウシ血清アルブミン，８mg／l Titriplex Ｖ，pH 7.6とした。標準濃度は ０、0.5、3.2、10.6、32，80および160ng／mlとした。 アッセイ操作： PSA含有サンプル10μlを10μlの固相Ａおよび20μlのトレーサー とともに37℃で15分間インキュベートした。ついで10μlの固相Ｂを加え、さら に15分後に、混合物をルミノメーター[BeriLux(登録商標)アナライザー]中で0.7 秒間測定した。発光試薬としては0.5％ H₂O₂および125mM NaOH含有20mM HNO₃を 使用した。 結果は図14に示す。アッセイ操作は図9aに図解的に示す。 実施例 ８ PSAの測定のためのイムノルミノメトリーアッセイ（ILMA） 試薬の調製：固相Ａ ： ローナル抗−PSA抗体(BW 92-283/029; Behringwerke AG，Marburg)により、カル ボジイミド法［G．Wendlbergerら，Synthese von Peptiden(ペプチドの合成)，I I部，Methoden Org．Chem．(有機化学的方法)，Houben-Weyl，４版，1952，ＸＶ ／２巻，1974］を用いてコートした。コーティング濃度は、10％磁性粒子懸濁液 中、抗体６mg／mlとした。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液（50mM CHES ，0.5ｇ／l NaN₃および３ｇ／l ウシ血清アルブミン，pH 8.0］中磁性粒子濃度1 0mg／mlとした。固相Ｂ ： 磁性粒子を固相Ａの場合と同様に、BeriLux標識に対するモノクローナル抗体 ［BW 90-8/04; Behringwerke AG; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(ドイツ微生物ならびに培養細胞保存機関)，Braunschweig,Ge rmany に寄託番号 DSM ACC 2184として寄託］によりコートした。そのまま使用 できる懸濁液は、保存緩衝液（50mM CHES，0.5ｇ／l NaN₃，３ｇ／l ウシ血清ア ルブ ミン，pH 8.0）中磁性粒子濃度５mg／mlとした。トレーサー濃厚液 ： モノクローナル抗−PSA抗体（BW 92-284/03，Behringwerke AG）をBeriLux(登 録商標)標識によりモル比１＋10で標識した。標識化は文献記載のNHS法で実施し た(NHS＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド反応基；A.K．Campbell，Chemiluminesc ence: Principles and Applications in Bioligy and Medicine，１版，VCH／Ho rwood，Weinheim／Chichester，1988，439頁)。精製はゲル透過クロマトグラフ ィー(Sephadex Ｇ25)で実施した。トレーサーはトレーサー緩衝液（10mM酢酸ナ トリウム，150mM NaCl，２ｇ／l ウシ血清アルブミンおよび0.1％ Mergal K9N， pH 5.0）中30μｇ／mlの濃度で保存した。トレーサー ： そのまま使用できるトレーサーの調製にはトレーサー濃厚液を0.1Ｍリン酸塩 緩衝液(0.15ｇ／l NaClおよび１ｇ／l ウシ血清アルブミン含有，pH 6.3)で１： 200の割合に希釈した。測定用緩衝液 ： 12.1ｇのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、8.8ｇの塩化ナトリウム、0 .1ｇのナトリウムアジドおよび10ｇのTween 20を990mlの脱イオン水に溶解し、 この溶液のpHを25％塩酸で8.0に調整した。 測定用緩衝液に適当な発光試薬を配合して使用することにより（アッセイ操作 の項参照）溶媒効果を減弱することができる。PSA 標準 ： PSA（前立腺特異的抗原，Behringwerke AG）を溶解した緩衝液は 以下の組成：50mM Tris、150mM NaCl、0.05％ NaN₃、0.01％ Tween 20、0.5ｇ／ l ウシIgG，40ｇ／l ウシ血清アルブミン，８mg／l Titriplex Ｖ、pH 7.6とし た。標準濃度は０、3.2、10.6、32、80および160ng／mlとした。 アッセイ操作： PSA含有サンプル10μlを10μlの固相Ａおよび20μlのトレーサーとともに37℃ で15分間インキュベートした。ついで10μlの固相Ｂ、さらに５分後に200μlの 測定用緩衝液を添加した。混合物を、ルミノメーター［BeriLux(登録商標)アナ ライザー］中 0.7秒間測定した。発光試薬として0.5％H₂O₂および125mM NaOH含 有20mM HNO₃を使用した。 結果は図15に示す。アッセイ操作は図9aに図解的に示す。 実施例 ９ T3の測定のためのLIA 試薬の調製：固相Ａ ： クローナル抗−T3抗体（BeriLux FT3 抗体）によりカルボジイミド法［G.Wendlb ergerら，Synthese von Peptiden(ペプチドの合成)，II部，Methoden Org．Chem ．(有機化学的方法)，Houben-Weyl，４版，1952，ＸＶ／２巻，1974］を用いて コートした。コーティング濃度は10％磁性粒子懸濁液中、抗体0.25mg／mlとした 。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液(10.36ｇ／l CHES，0.5ｇ／l ナトリ ウムアジド，３ｇ／l ウシ血清アルブミン，pH 8.0)中2.5mg／mlとした。固相Ｂ ： BeriLux標識に対するモノクローナル抗体［消光抗体，BW 90-8/04; Behringwerk e AG; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイ ツ微生物および培養細胞保存機関），Braunschweig，Germanyに寄託番号DSM ACC 2184 として寄託］によって、カルボジイミド法［G．Wendlbergerら，Synthese von Peptiden(ペプチド合成)，第II部，Methoden Org．Chem．(有機化学的方法 )，Houben-Weyl，４版，1952，ＸＶ／２巻，1974］を用いてコートした。コーテ ィング濃度は10％磁性粒子懸濁液１mlあたり抗体６mgとした。そのまま使用でき る懸濁液は保存緩衝液（10.36ｇ／l CHES，0.5ｇ／l ナトリウムアジド，３ｇ／ l ウシ血清アルブミン，pH 8.0）中磁性粒子濃度2.5mg／mlとした。 トレーサーの合成：工程１：ストレプトアビジン−T3接合体の調製 ： a) ３mgのストレプトアビジンを1.7mlの0.1Ｍ四ホウ酸塩緩衝液（10％ジオキ サン含有）pH8.0中に溶解する。28μlのGMBS溶液（ジオキサン中５mg／mlのγ− マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル）を加えた。混合物を室温におい て１時間反応させたのち、PD10／G25ｍカラムにより0.1Ｍリン酸緩衝液(５mM ED TA含有)中に再緩衝化した。得られた溶出液（「溶液１」）は容量２ml、ストレ プトアミジンの濃度0.9mg／mlである。 b) ７mgのトリヨードサイロニン(T3)を700mlのDMSOに溶解する。Ｎ−エチル モルホリン10μlおよびSAMSA(Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸)を80μlのD MSOに溶解して加える。30分後に１Ｍのヒ ドロキシルアミン水溶液100μlをピペットで添加する。得られた溶液（「溶液２ 」）は室温で15分間インキュベートする。 c) 1.76mlの溶液１および41.5μlの溶液２を混合し、室温に１時間放置した 。ついで、PD10／G25ｍカラムにより0.1Ｍリン酸カリウム緩衝液、pH 7.2（「溶 液２」）中で再緩衝化した。再緩衝化後、ストレプトアビジン−T3接合体の濃度 は0.6mg／mlである。工程２：ストレプトアビジン−T3接合体のBeriLux標識による標識 a) ビオチン基を有するBeriLux標識の合成 BeriLux標識（NHS−反応基を有する）200mg(0.26mmol)を最初にアセトニトリ ル30ml中に導入し、98mg（0.26mmol）のＮ−ビオチン−1,8−ジアミノ−3,6−ジ オキサオクタン（Boehringer Mannheim）および46μｌ（0.3mmol）のトリエチル アミンのアセトニトリル５ml中溶液を室温で滴下して加える。反応混合物を室温 で12時間攪拌すると、この間に反応混合物は緑色に変化する。混合物をろ過し溶 媒を真空中で留去する。残留物(400mg；緑色油状物)を逆相カラム上[静止相：Li chroPrep C-18（Merck）；移動相：アセトニトリル／水＝33：67＋0.1容量％ト リフルオロ酢酸〜アセトニトリル／水＝45：55＋0.1容量％トリフルオロ酢酸の 勾配]製造用中圧クロマトグラフィー(Buchiシステム)によって精製する。アセト ニトリルを真空中で留去し、凍結乾燥して水を除去すると、黄色の粉末170mgが 単離される。MS(FAB)：[C₄₇H₅₅N₆O₉S₂]⁺（計算値：911.347；分析値：911.350） [CF₃CO₂]^-（113）。 b) 182μlの溶液３(0.1mgのストレプトアビジン−T3接合体)、718μlの0.1Ｍ リン酸カリウム緩衝液、pH 7.2、14μlのアセトニトリルおよび86μlの標識溶液 ［アセトニトリル中BeriLux標識（ビオ チン基を含有する）10mg／ml］を一緒にピペットで取り、室温で30分インキュベ ートする。このトレーサーは PD10／G25ｍによりゲルクロマトグラフィーで精製 する。 トレーサー溶液の調製： トレーサー緩衝液中トレーサ−６ng／ml。 トレーサー緩衝液：0.2％ウシIgG、0.1％ Mergalおよび0.025％ANS含有100mM PBS、pH 6.3。T3 標準 ： 血清メジウム中濃度０〜7.5ng／mlの濃度範囲のT3標準を用いた。測定用緩衝液 ： 150mM NaCl、１％Tween 20および0.01％のナトリウムアジドを含有する100mM Tris緩衝液。 アッセイ操作： 50μlのサンプルを100μlのトレーサーオよび20μlの固相Ａと一緒に37℃で30 分間インキュベートした。ついで10μlの固相Ｂを加え、混合物を室温で10分間 インキュベートしたのち測定用緩衝液200μlをピペットで加える。懸濁液をルミ ノメーター［BeriLux(登録商標)アナライザー］中で１秒間測定した（発光試薬 ：R1＝0.5％過酸化水素含有20mM硝酸；R2＝125mM水酸化ナトリウム）。 結果は図16に示す。アッセイ操作は図13aに図解的に示す。 図３の説明： この図は BeriLux（登録商標）標識（アクリジニウムアシルスルホンアミド標 識）（抗−標識抗体を添加しない場合の活性＝100％）で標識されたトレーサー 抗体に対する３種の異なる抗−標識抗体の 消光効果を示す。 抗体BW 90-9/016はシグナル改変試薬から標識を保護するのにとくに適してい るが、BW 90-8/04はシグナル改変(この場合はシグナル消光)抗体として使用でき る。BW 89-191/019抗体かこれらの適用のいずれでも適性は劣っている。 BeriLux(登録商標)アナライザー中での測定時間は１秒である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．検出すべき被検物質を含有するサンプルを受容体Ａおよびトレーサーに接触 させる被検物質の測定方法において、被検物質は a) トレーサーと複合体を形成し、この複合体が標識によって検出できるも のである（イムノメトリーの原理）か、 b) 被検物質に向けられた受容体Ａへの結合でトレーサーと競合して、受容 体Ａとトレーサーの複合体の形成に拮抗するものである（競合法の原理）か、ま たは c) 被検物質と構造的に同一であるかもしくは構造的に類似する受容体Ａと 競合して、受容体Ａとトレーサーの複合体の形成に拮抗するもの（競合法の原理 ）で、 さらに、 1) 標識と相互作用することによってシグナルを発生するかまたはシグナル を定性的および／もしくは定量的に変化させる受容体Ｂを添加し、ついで 2) 標識によってもたらされるシグナルを測定することを特徴とし、 この場合、受容体ＡおよびＢは１または数個の相の上部または内部に適当に 固定化して、トレーサーは、受容体ＡおよびＢが同時に参加する結合中に入れな いか、またはその結合に加わってもその程度はわずかで異なる被検物質濃度の検 出および識別は保証される被検物質の測定方法。 ２．a)受容体Ａは被検物質に対する抗体であり、b)トレーサーは被検物質の誘導 体であって、受容体Ａおよび受容体Ｂの両者がこの被検物質の誘導体に向けられ ている競合原理による請求項１に記 載の方法。 ３．a)トレーサーは、被検物質および受容体Ａに向けられている受容体であり、 b)受容体Ａは被検物質と構造的に同一であるかまたは被検物質の誘導体である競 合原理による請求項１に記載の方法。 ４．a)受容体Ａ被検物質に向けられていて、b)トレーサーは被検物質に向けられ ている受容体であり、この受容体は被検物質の受容体Ａのエピトープではない他 のエピトープに向けられているかまたは被検物質が数個の同一のエピトープを有 する場合は受容体Ａが認識するエピトープの他のエピトープもしくは同じエピト ープを認識するイムノメトリーの原理による請求項１に記載の方法。 ５．受容体ＡおよびＢは異なる相に結合するかまたはその内部に存在する上記請 求項の１または２以上に記載の方法。 ６．受容体ＡおよびＢは同一の相に結合するかまたはその内部に存在する上記請 求項の１または２以上に記載の方法。 ７．少なくとも１つの相は固体の内部または外部表面である上記請求項の１また は２以上に記載の方法。 ８．固体は膜、小チューブまたはマイクロタイタープレートもしくはその部分で ある請求項７に記載の方法。 ９．少なくとも１つの相はプラスチック表面からなる上記請求項の１または２以 上に記載の方法。 10．少なくとも１つの相は１または２以上の金属含有および／または金属イオン 含有プラスチックビーズである上記請求項の１または２以上に記載の方法。 11．少なくとも１つの相は１または２以上の磁化可能なプラスチッ クビーズからなる上記請求項の１または２以上に記載の方法。 12．２つの相は異なるゲル相である請求項５に記載の方法。 13．標識はルミネッセンス、蛍光、リン光、化学ルミネッセンス、生物ルミネッ センスまたはエレクトロルミネッセンスである上記請求項の１または２以上に記 載の方法。 14．標識はアクリジニウムエステル、アクリジニウムアシルスルホンアミド、ル ミノール、イソルミノールもしくはこれらの物質の誘導体、ジオキセタン、ルシ フェリン、シュウ酸エステルもしくはシュウ酸アミドである請求項13に記載の方 法。 15．標識は酵素または修飾酵素である上記請求項の１または２以上に記載の方法 。 16．標識は酵素基質である上記請求項の１または２以上に記載の方法。 17．標識はトレーサーに直接結合している上記請求項の１または２以上に記載の 方法。 18．標識は、標識すべき成分に向けられている受容体により標識すべき成分に間 接的に結合させる上記請求項の１または２以上に記載の方法。 19．受容体Ｂは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント 、化学的に修飾された抗体または化学的に修飾された抗体フラグメントである上 記請求項の１または２以上に記載の方法。 20．受容体Ｂは、酵素インヒビター、アビジンまたはストレプトアビジンである 上記請求項の１または２以上に記載の方法。 21．標識はアクリジニウム化合物であり、受容体Ｂは二重ヘリック スDNA構造を有し、それは受容体によって結合された標識からの発光を防止する かまたはより困難にする機能をもつ上記請求項の１または２以上に記載の方法。 22．さらに受容体B′を加え、この受容体は標識に結合して、受容体Ｂによって もたらされるシグナルとは定量的および／または定量的に異なシグナル変化を与 える上記請求項の１または２以上に記載の方法。 23．受容体Ｂはいかなるシグナル変化も与えない請求項22に記載の方法。 24．受容体Ａ、サンプル、トレーサーおよび受容体Ｂをインキュベートしたのち 、標識によって誘発されるシグナルの測定時のサンプルの比率を低下させるため に液体を加えるか、または受容体Ａ、サンプルおよびトレーサーをインキュベー トしたのち、受容体Ｂは使用されたサンプルの容量より大きい液体容量中におい て添加される上記請求項の１または２以上に記載の方法。 25．各場合において、標識に代えて受容体Ｂが、受容体Ｂに代えて標識が使用さ れる上記請求項の１または２以上に記載の方法。 26．検出すべき被検物質を含有するサンプルを、トレーサーおよび受容体Ａの予 め形成された複合体と接触させる被検物質の測定方法において、被検物質は a) 被検物質に向けられた抗体Ａとの結合からトレーサーを置換するか、 b) 被検物質と構造的に同一であるかもしくは構造的に類似している受容体 Ａをトレーサーとの結合から置換し、 さらに、 1) トレーサーに結合する抗体Ｂを添加し、ついで 2) 適当な分離工程後に、受容体Ａとトレーサーまたは受容体Ｂとトレーサ ーからなる複合体によって誘発されるシグナルを測定することを特徴とし、 この場合、受容体ＡおよびＢは１または数個の相の上部または内部に適当に 固定化して、トレーサーは、受容体ＡおよびＢが同時に参加する結合中に入れな いかまたはその結合に加わってもその程度はわずかで、異なる被検物質濃度の検 出および識別は保証される被検物質の測定方法。