JPH0666799A

JPH0666799A - 抗原の測定方法

Info

Publication number: JPH0666799A
Application number: JP23632792A
Authority: JP
Inventors: Mariko Miura; 真理子三浦; Masaharu Matsuzaki; 正晴松崎; Toshiyuki Teruuchi; 敏之照内
Original assignee: S R L KK; Srl KK
Current assignee: S R L KK; Srl KK
Priority date: 1992-08-13
Filing date: 1992-08-13
Publication date: 1994-03-11

Abstract

(57)【要約】【構成】測定すべき抗原に対する抗体を固相化し、精
製ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて該固相のブロ
ッキングを行った後、測定すべき抗原を含む被検試料を
反応させ、測定すべき抗原に対する第２抗体を反応させ
た後、増感剤の存在下で前記第２抗体に直接もしくは間
接的に結合したアルカリフォスファターゼの活性を測定
する。【効果】バックグラウンドを低く抑えつつサンドイッ
チＥＩＡ法の感度を飛躍的に向上させることが可能とな
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗原の高感度測定方法に
関し、より詳しくは精製ブロッキング剤と増感剤とを組
合せることにより、内因性酵素によるバックグラウンド
値（測定ノイズ）等を大幅に低下させ、測定感度を著し
く向上させた抗原の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原（「抗体と特異的に結合する物質」
をいう）の測定方法としては種々の方法が知られている
が、測定対象によっては、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）で
高感度測定ができない場合があった。例えば、抗原の一
種であるサイトカイン(cytokine)やアレルギー反応の調
節に関与するタンパク質性因子のＥＩＡ測定方法におい
ては、ヒト血液中（ないし血清中）のレベルをモニター
できる程度の検出限界（例えば、０．０１〜１ｐｇ／ｍ
Ｌ）を有する高感度な測定方法は未だ確立されていな
い。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
血液中の抗原のレベルをモニター可能な感度を有する抗
原のＥＩＡ測定方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、従来からブロッキング剤として多用されていたウ
シ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」という）を精密に
精製することが、増感剤の存在下にアルカリフォスファ
ターゼ活性を測定する際のバックグラウンドを大巾に下
げ、抗原の高感度測定を可能とすることを見出した。

【０００５】本発明の抗原の測定方法は、上記知見に基
くものであり、より詳しくは、測定すべき抗原に対する
抗体を固相化し、精製ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
用いて該固相のブロッキングを行った後、測定すべき抗
原を含む被検試料を反応させ、測定すべき抗原に対する
第２抗体を反応させた後、増感剤の存在下で前記第２抗
体に直接もしくは間接的に結合したアルカリフォスファ
ターゼの活性を測定することを特徴とするものである。
以下、必要に応じて図面を参照しつつ本発明を詳細に説
明する。

【０００６】（固相）後述する抗体の固定化（主に物理
吸着による）が可能なものであれば、その材質又は形状
は特に制限されないが、多数の被検試料（検体）を同時
に測定可能な点からは、複数のウエル（穴）を有するマ
イクロプレート（例えば、９６ウエル−マイクロプレー
ト）を用いることが好ましい。酵素活性を発光反応又は
ケイ光反応を用いて測定する場合には、隣り合うウエル
からの光の干渉防止の点からは、上記マイクロプレート
は不透明なものであることが好ましい。

【０００７】（抗原）本発明において測定可能な抗原は
特に制限されないが、本発明は、特に従来、酵素免疫測
定法（ＥＩＡ）ではヒト血中におけるレベルの測定が困
難であったような抗原（調節因子、ホルモン、神経伝達
物質等）、より具体的には、例えばサイトカイン（イン
ターロイキン等）、イムノグロブリン結合因子（ＩｇＥ
結合因子等）、成長ホルモン放出因子、調節因子等の測
定に好ましく適用できる

【０００８】（精製ＢＳＡ）本発明においては、ＢＳＡ
（ウシ血清アルブミン）は精製したものを用いることが
必要である、精製の程度は、後述するようなバック・グ
ラウンドのレベルが達成される程度であることが好まし
い。精製ＢＳＡは、必要に応じ、緩衝液等で希釈して用
いることができる。

【０００９】本発明においては、上記したような精製Ｂ
ＳＡは、例えば、市販の結晶性ＢＳＡ（純度９５〜９８
％程度）をＤＥＡＥセルロースカラムおよびブルーセフ
ァロースカラムを用いて精製することにより得ることが
できる。

【００１０】（被検試料）測定すべき抗原を含有すると
考えられる血清、血漿、気管支・肺胞洗浄液、培養上清
等が用いられる。必要に応じて、被検試料は、緩衝液等
で希釈（例えば５〜１００倍程度に希釈）して用いても
よい。

【００１１】（固相化抗体）固相化すべき抗体として
は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のい
ずれも使用可能であるが、例えばサイトカインであるイ
ンターロイキン−４（ＩＬ−４）、可溶性ＩｇＥ結合因
子等を測定する場合には、特異性、純度等の点から、固
相化すべき抗体としてモノクローナル抗体を用いること
が好ましい。

【００１２】（第２抗体）固相化した抗体とともに、抗
原をはさむ（サンドイッチ）べき第２抗体としては、ポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも
使用可能である。本発明においてポリクローナル抗体を
用いる場合は、必要に応じて、抗原を固相化したアフィ
ニティゲルカラムを用いるアフィニティ・クロマトグラ
フィーにより精製して用いることが、特異性の改良とバ
ックグラウンド抑制の点から好ましい。固相化した抗体
と第２抗体とが異種の動物種に由来する場合（マウスＩ
ｇＧ−ウサギＩｇＧ等）は、特に固相化抗体と同じ動物
種のＩｇＧ（イムノグロブリンＧ）でネガティブアフィ
ニティ精製しておくことが好ましい。

【００１３】この第２抗体としては、アルカリフォスフ
ァターゼを直接標識した第２抗体を用いてもよいが、該
第２抗体および／又は酵素の有効利用の点からは、抗原
に第２抗体を反応させた後に、間接的に該第２抗体を酵
素で標識することが好ましい。このような、酵素標識方
法としては、酵素標識した抗体又はＦａｂ′フラグメン
トであって、第２抗体に特異的に結合する抗体又はＦａ
ｂ′フラグメント（例えば、第２抗体がウサギ由来の抗
体である場合は、抗ウサギイムノグロブリン抗体）を用
い、抗原−抗体反応を利用して第２抗体を標識する方
法、その他の特異的結合反応（例えばアビジン−ビオチ
ン反応）を利用して第２抗体を標識する方法（例えば、
ビオチン化第２抗体に、アビジン化酵素を特異的に結合
させる）が利用可能である。

【００１４】なお、酵素と抗体を１ステップグルタルア
ルデヒド法で架橋標識してアルカリフォスファターゼ標
識物を得る場合、通常、生成した酵素標識物は、酵素１
分子と抗体１分子との標識物のみならず種々の架橋され
た標識物をも含んでいる。このような場合、特異性を増
しバックグラウンドを低下させるためには、ゲル濾過等
により、酵素同士の複合物や酵素が過剰に標識された複
合物を除いておくことが好ましい。

【００１５】（基質）本発明において利用可能な基質
は、アルカリフォスファターゼ活性の定量が可能である
限り、特に制限されないが、感度を向上させる点から
は、発光反応および／又はケイ光反応を利用することが
好ましい。発光反応あるいはケイ光反応を利用して酵素
活性を測定する場合、基質としては、ジオキセタン誘導
体を用いることが好ましい。上記ジオキセタン誘導体と
しては、下記一般式（化１）に示すものが好ましく用い
られる。

【００１６】

【化１】

【００１７】（式中、Ａｄはスピロ結合を通してジオキ
セタンへ結合しているアダマンチリデン基を示し、Ｒは
低級アルキル基を示し、Ａｒは芳香族基を示す）。前記
式（化１）に示すようなジオキセタン誘導体は、例えば
ヨーロッパ特許公開公報２５４０５１号、ＰＣＴ公開公
報ＷＯ８８００６９５号、ないしTetrahedron Lett.,
２８，１１５５−１１５８（１９８７）に記載の方法と
同様にして製造することができる。

【００１８】前記一般式（化１）中のＲとしては、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の低級アルキ
ル基を、Ａｒとしては、フェニレン基、ナフチル基、ア
ントラニル基等の芳香族基を例示することができる。
尚、前記一般式（化１）で表されるジオキセタン誘導体
の陽イオンとしてはナトリウム、カリウム等のアルカリ
金属、アンモニウム、Ｎ (Ｒ²)₄ ⁺（式中、Ｒ²は、メ
チル、エチル等のアルキル基、ベンジル等のアラルキル
基を表わす。）で表される四級アンモニウムを例示する
ことができる。

【００１９】（増感剤）本発明においては、増感剤とし
て、アルカリフォスファターゼと基質との反応に基づく
発光ないしケイ光を増進する物質が広く使用可能である
が、特に、ポリアルキル４級アミン、および／又はケイ
光剤が好ましく用いられる。

【００２０】ポリアルキル４級アミンとしては、例え
ば、ポリジアリ−ルジメチルアンモニウムクロライド、
ポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウム
クロライド）〕（以下ＢＤＭＱと記す）等が好ましく
使用される。更に、ケイ光剤としては、例えば、フルオ
レセイン誘導体、ローダミン誘導体等が好ましく使用で
きる。

【００２１】（測定方法）本発明の抗原測定方法の概要
は、以下の通りである。まず固相（例えば、９６ウエル
−マイクロタイタープレート；発光用）に抗体を固定化
する。この固相化は、例えば、測定すべき抗原に対する
抗体（好ましくは濃度２〜２０μｇ／μＬ程度）を緩衝
液（炭酸緩衝液等）とともに、固相上に好ましくは５０
〜２００μＬ／ウエルづつ分注し、例えば４℃で一晩放
置することにより行えばよい。

【００２２】次に、上記固相のブロッキングを行う。本
発明においては、このブロッキングに精製ＢＳＡを用い
る。精製ＢＳＡ（好ましくは濃度０．５〜３％程度、更
には１〜２％程度）を緩衝液（例えばリン酸緩衝液；Ｐ
ＢＳ）とともに各ウエルに５０〜２５０μＬ程度（更に
は１００〜２００μＬ程度）分注し、例えば室温（２５
℃）で３０分〜３時間程度（更には１〜２時間程度）放
置して固相のブロッキングを行うことができる。このよ
うなブロッキングにより、アルカリフォスファターゼの
活性測定におけるバックグラウンドを顕著に低下させる
ことができる。

【００２３】必要に応じて、洗浄用緩衝液（例えば０．
０５％程度のTween ２０含有ＰＢＳ（−））で洗浄した
後、一次反応、すなわち固相化した抗体と、被検試料中
の抗原との反応を行なう、被検試料（血清、血漿、培養
上清等）は、必要に応じて希釈用緩衝液（例えば１％Ｂ
ＳＡ、０．０５％Tween ２０含有のＰＢＳ（−））で５
〜２００倍程度（更には５〜２０倍程度）に希釈して５
０〜２００μＬ／ウエル（更には１００〜１５０μＬ／
ウエル）程度分注する。反応は、例えば室温で１時間〜
１晩程度行えばよい。

【００２４】必要に応じて上記と同様に洗浄を行った
後、二次反応、すなわち第２抗体と抗原との反応を行
う。必要に応じてアフィニティ・クロマトグラフィー等
により精製した第２抗体（好ましくは濃度１〜２０μｇ
／ｍＬ程度）を緩衝液とともに５０〜２００μＬ／ウエ
ル程度分注して、例えば室温で１〜４時間程度反応させ
る。ここで用いた第２抗体が酵素標識されていない場合
には、更にアルカリフォスファターゼ標識物質（Ｆａ
ｂ′フラグメント、アビジン等）を上記第２抗体に反応
させる（三次反応）。この場合は、アルカリフォスファ
ターゼ標識物質を、緩衝液で好ましくは１〜１０万倍程
度に希釈して５０〜２００μＬ／ウエル程度加え、例え
ば室温で１〜３時間程度反応させればよい。

【００２５】必要に応じて洗浄を行った後、アルカリフ
ォスファターゼに反応する基質（例えばジオキセタン誘
導体たるＡＭＰＰＤ；３−（２′−スピロアダマンタ
ン）−４−メトキシ−４−（３′−フォスフォリロキ
シ）−フェニル−１，２−ジオキセタン）を、好ましく
は濃度０．１〜０．５ｍＭ程度をアルカリ条件下（例え
ば１ｍＭＭｇＣｌ₂含有Tris緩衝液ｐＨ９．５、０．
１Ｍジエタノールアミン溶液ｐＨ９．８等）に加える。
本発明においては、この際に、好ましくは１０〜２０倍
程度に希釈した増感剤（ＢＤＭＱ等）を共存させる。こ
のような（基質＋増感剤）は、好ましくは５０〜２００
μＬ／ウエル程度分注した後、例えば室温で１０〜８０
分程度（更には２０〜６０分程度）反応させればよい
（四次反応）

【００２６】上述した反応によって発生する発光ないし
ケイ光は発光測定機（例えば、マイクロプレートルミノ
メーター）等を用いて、相対発光強度（ＲＬＵ）として
測定すればよい。

【００２７】（ＢＳＡ等の精製の程度）本発明において
用いるＢＳＡの精製の程度（ＢＳＡの他に、第２抗体等
をも精製した場合には、これらを総合した精製の程度）
は、以下のようにして測定することが可能である。

【００２８】まず、測定に用いるマイクロプレート（固
相）上にアルカリフォスファターゼに対する基質溶液
（基質＋発光強度測定に用いる緩衝液）のみを分注し、
その発光強度（基質の自然分解ないし非酵素的分解によ
る発光強度）を測定し、これを「発光強度Ａ」とする。

【００２９】一方、測定すべき抗原を加えない以外は上
記した各操作を同様に実施し、その発光強度（ブランク
の発光強度）を測定し、これを「発光強度Ｂ」とする。
本発明においては、上記した（発光強度Ｂ）／（発光強
度Ａ）の比が２０以下であることが好ましく、１０以下
（更には５以下）であることが特に好ましい。以下、製
造例、実施例により本発明を更に具体的に説明する。

【００３０】製造例１（精製ＢＳＡの製造）ウシ血漿をエタノール分画して得
たフラクションＮｏ．５をセファデックス(Sephadex)Ｇ
１５０カラムを用いて（移動相：０．０５Ｍ酢酸緩衝
液）ゲルろ過し、これを次に活性炭処理した。より具体
的には０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）に分散させた
０．３％ノーリット(Norit) ＳＸ−３をＢＳＡ１００ｍ
ｇに対して２ｍＬ用いて、Voltex（振とう器）で１０分
間処理した。

【００３１】次いで３０００ｒｐｍで２０分間遠心し、
その上清を更に１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心して
上清を採取した。この上清を透析チューブ中に入れ、
０．０５ＭTris−Ｈｃｌ（ｐＨ８．３）で４℃、１６時
間透析を行った。

【００３２】透析後のＢＳＡ溶液を、０．０５Ｍ Tris
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）で平衡化したＤＥＡＥセルロー
スカラム（２×５０ｃｍ）に通し、このカラムに吸着し
た成分を溶出させた。溶出液としては０．０５ＭTris−
Ｈｃｌ緩衝液に、０．５Ｍ〜２ＭのＮａＣｌを加えたも
のを用いた。溶出液を透析チューブ中に入れ、０．１Ｍ
ＰＢ（Phosphate buffer、ｐＨ７．０）中で４℃、１６
時間透析した。

【００３３】上記で得られたＢＳＡ溶液をブルーセファ
ロースカラム（ファルマシア社製、２×３０ｃｍ）に通
し、吸着成分をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）ｐＨ９．０で溶
出させた後透析チューブに入れ、炭酸緩衝液（ｐＨ９．
０）中で４℃、１６時間透析して、精製ＢＳＡを得た。

【００３４】実施例１（インターロイキン−４（ＩＬ−４）の測定）固相たる
９６穴マイクロタイタープレート（発光用）に、固相化
抗体たる抗ヒトＩＬ−４・モノクローナル抗体(Genzyme
社製又は自家製）の炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）溶液（５
μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウエルづつ分注し、４℃で
１晩放置して、抗ＩＬ−４抗体を固相化した。

【００３５】次に、製造例１で得た精製ＢＳＡ（ウシ血
清アルブミン）の２％溶液（炭酸緩衝液中）を２００μ
Ｌ／ウエルづつ分注し、室温（約２５℃）で２時間放置
して固相のブロッキングを行った。

【００３６】洗浄緩衝液（０．０５％Tween ２０含有Ｐ
ＢＳ）で３回固相を洗浄した後、抗原を加えて一次反応
を行った。ここでは、抗原として、検量線作成のための
標準サンプル（スタンダード）たるリコンビナントヒ
トＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ社、Amersham社、又は自家製）を希
釈緩衝液（１％精製ＢＳＡ、０．０５％Tween ２０含有
ＰＢＳ）で５０，１０，２，１，０．５，０．２５，
０．１２，０．０６，０．０３および０ｐｇ／ｍＬの濃
度となるようにして（５０ｐｇ／ｍＬから１０ポイン
ト）、１００μＬ／ウエルづつ分注した。分注後、室温
で１晩放置して反応させた。

【００３７】洗浄緩衝液で３回洗浄した後、アフィニテ
ィクロマトグラフィーにより精製した第２抗体たる抗ヒ
トＩＬ−４ポリクローナル抗体（ウサギＩｇＧ：Genzym
e 社製又は自家製）を３μｇ／ｍＬ濃度で１００μＬ／
ウエルづつ分注し、室温で３時間反応させた（二次反
応）。

【００３８】次に、アルカリフォスファターゼ標識−Ｆ
ａｂ′抗ウサギＩｇＧ抗体（TAGO社製抗体をゲルクロマ
トグラフィーによりリクロマトしたもの）をTris−Ｎａ
Ｃｌ緩衝液で２．５万倍に希釈したものを１００μＬ／
ウエルづつ分注し、室温で１時間反応させた（三次反
応）

【００３９】洗浄緩衝液で４回洗浄した後、０．２ｍＭ
のＡＭＰＰＤ溶液（１ｍＭＭｇＣｌ₂含有Tris緩衝
液、ｐＨ９．５中）又は、０．１Ｍジエタノールアミン
溶液ｐＨ９．５〜１０中）を１００μＬ／ウエル加えて
室温で２０〜６０分放置して四次反応を行った。このＡ
ＭＰＰＤ溶液には、２０倍に希釈した増感剤（ＢＤＭＱ
＋フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；
商品名Emerald 、トロピックス社製）を共存させた。

【００４０】上記反応に基づく発光強度は、マイクロプ
レートルミノメーター（ダイナテック社製）を用いて測
定した。測定結果を図１（実線）に示す。上述したよう
にスタンダードとしてリコンビナントＩＬ−４を用いた
本実施例の測定系の検出範囲は０．０３−５０．０ｐｇ
／ｍＬであり、検出限界は０．０２ｐｇ／ｍＬであっ
た。

【００４１】気管支喘息患者（１８名）と健常者（５０
名）の血清中のＩＬ−４を本実施例の測定系により測定
した。この時は抗原を含む被検試料として、上記血清を
希釈緩衝液で５〜１１倍に希釈して用いた他は、上記と
同様にして行った。

【００４２】気管支喘息患者の血中ＩＬ−４は０．３−
４５ｐｇ／ｍＬとなり、また健常者の血中ＩＬ−４は
０．１〜２ｐｇ／ｍＬとなった。すなわち、本実施例の
測定系により血清中のＩＬ−４の測定が可能であること
が判明した。

【００４３】参考例１実施例１で用いたと同様のマイクロプレート上に、濃度
０．２ｍＭのＡＭＰＰＤの緩衝液（０．０５Ｍ Tris-HC
l（ｐＨ９．５）＋１ｍＭＭｇＣｌ₂）溶液１００μＬ
を分注し、室温で１時間放置後、マイクロプレートルミ
ノメーターで発光強度（基質たるＡＭＰＰＤの自然分解
による発光強度）を測定したところ０．１３ＲＬＵであ
った（発光強度Ａ）。

【００４４】一方、上記測定対象たる抗原を加えなかっ
た以外は実施例１と同様の操作を繰り返し、発光強度を
マイクロプレートルミノメーターで測定したところ０．
４８ＲＬＵであった（発光強度Ｂ）。したがって、発光
強度の比は、（発光強度Ｂ）／（発光強度Ａ）＝３．７
であった。

【００４５】比較例１市販のＩＬ−４測定キットIntertest −４（米国Genzym
e 社製）のキット（比色法）を、そのまま用いて、上記
実施例１と同様の標準サンプル中のＩＬ−４を測定した
（４９０ｍｍの吸光度（ＯＤ値））。結果を図１（点
線）に示す。図１に示すように、この従来法における検
出限界は約４５ｐｇ／ｍＬであった。

【００４６】比較例２市販のＩＬ−４測定キットIntertest ４(Genzyme社製）
の試薬を一部用いて、発光法によるＩＬ−４測定を行っ
た。すなわち、標準サンプルを上記キット添付の固相化
したマウスαヒトＩＬ−４モノクローナル抗体に加え室
温で２時間反応させた。次いで、キット添付のウサギα
ヒトＩＬ−４ポリクローナル抗体を分注して室温で２時
間反応させ、次にキット添付のビオチン化・ヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ抗体と室温で４５分間反応させた後、ストレプ
トアビジン化西洋ワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）に
代えて、Tris-HCl緩衝液で１０万倍に希釈したストレプ
トアビジン化アルカリフォスファターゼ（ＴＡＧＯ社
製）１００μＬ／ウエルを加え、室温で１時間反応させ
た。

【００４７】アルカリフォスファターゼの活性は０．１
ｍＭのＡＭＰＰＤおよび×１／２０希釈のEmerald を含
有するジエタノールアミン緩衝液１００μＬ／ウエルを
加え、実施例１と同様に相対発光強度を測定した。結果
を図２（実線）に示す。

【００４８】上記図２には、比較のため、上記した比較
例１のデータをも点線で示してある。なお、このキット
（Intertest ４）においては、上記したようにストレプ
トアビジン化西洋ワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）を
用いて、室温で４５分間反応させた後、基質としてＯＰ
Ｄ（ｏ−フェニレンジアミン）を用いて、４９０μｍの
吸光度（ＯＤ）を測定している。結果を図２に示す。

【００４９】図２に示したように、市販のキットにおい
て、比色法に代えてアルカリフォスファターゼＡＭＰＰ
Ｄ／増感剤の発光系を用いたのみでは、バックグラウン
ドが高く、検出限界は、いずれも１０．０ｐｇ／ｍＬで
あった。

【００５０】実施例２（可溶性ＩｇＥ結合因子（ｓＣＤ２３）の測定）固相た
る９６穴マイクロタイタ−プレート（発光用）に、抗体
たる抗ＣＤ２３・モノクローナル抗体（Ｃ２５、コスモ
・バイオ社製）の炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）溶液（１０
μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウエルづつ分注し、４℃で
１晩放置して、抗体を固相化した。次に、製造例１で得
た精製ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の１％溶液（ＰＢ
Ｓ中）を１００μＬ／ウエルづつ分注し、室温（約２５
℃）で２時間放置して固相のブロッキングを行った。

【００５１】洗浄緩衝液（０．０５％Tween ２０含有Ｐ
ＢＳ（−））で３回固相を洗浄した後、抗原を加えて一
次反応を行った。ここでは、抗原として検量線作成のた
めの標準サンプル（スタンダード）たるヒトｓＣＤ２３
（自家製）を希釈緩衝液（１％精製ＢＳＡ、０．０５％
Tween ２０含有Tris−ＮａＣｌ）で所定の濃度となるよ
うにして（５００Ｕ／ｍＬから１２ポイント）、１００
μＬ／ウエルづつ分注した。分注後、室温で１晩放置し
て反応させた。

【００５２】洗浄緩衝液で３回洗浄した後、第２抗体た
るビチオン化抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体（Ｂ
６、コールター社製）を２μｇ／ｍＬ濃度で１００μＬ
／ウエルづつ分注し、室温で３時間反応させた（二次反
応）、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、アビジン化アルカ
リフォスファターゼ（ＴＡＧＯ社）を上記希釈緩衝液で
１０万倍に希釈したものを１００μＬ／ウエルづつ分注
し、室温で１時間反応させた（三次反応）。

【００５３】次いで０．２ｍＭのＡＭＰＰＤ溶液（１ｍ
ＭＭｇＣｌ₂含有Tris緩衝液、ｐＨ９．５中又は、０．
１Ｍジエタノールアミン溶液ｐＨ９．８中）を１００μ
Ｌ／ウエル加えて室温で２０〜６０分放置して四次反応
を行った。このＡＭＰＰＤ溶液には、２０倍に希釈した
増感剤（ＢＤＭＱ＋フルオレセイン・イソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）；商品名Emerald 、トロピックス社製）
を共存させた。

【００５４】上記反応に基づく発光強度は、マイクロプ
レートルミノメーター（ダイナテック社製）を用い、相
対発光強度（ＲＬＵ）として測定した。測定結果を図３
に示す。上述したようにスタンダードとしてｓＣＤ２３
を用いた本実施例の測定系の検出範囲は５００〜０．７
８Ｕ／ｍＬであり、検出限界は０．５Ｕ／ｍＬであっ
た。

【００５５】気管支喘息患者（１８名）と健常者（９０
名）の血清中のｓＣＤ２３を本実施例の測定系により測
定した。この時は抗原を含む被検試料として、上記血清
を希釈緩衝液で１０倍に希釈して用いた他は上記と同様
にして行った。

【００５６】気管支喘息患者のｓＣＤ２３は５００Ｕ／
ｍＬ以上となり、また健常者の血中ｓＣＤ２３は７０〜
４５０Ｕ／ｍＬであった。比較のために、増感剤(Emera
ld) を入れない発光系を用いた他は上記と同様にしてス
タンダードの測定を行った結果を図３（ＣＬ）に示す。

【００５７】上記図３には、ケイ光法（ＦＬ）を用いて
測定したデータをも併せて示している。より具体的に
は、上記（実施例２）で使用したストレプトアビジン化
アルカリフォスファターゼに代えてアビジン化β−ガラ
クトシダーゼ（ＴＡＧＯ社）を上記希釈緩衝液で２．５
万倍に希釈したものを１００μＬ／ウエルづつ分注し、
室温で１時間反応させた。

【００５８】次いで、０．１ｍＭ４ＭＵ−Ｇａｌ（４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、シグ
マ社製）溶液（１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ₂、０．１％ＮａＮ₃を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ７．０）を１００ μＬ／ウエル加えて室温
で一定時間（２０分）反応させた後、１．０Ｍグリシン
−ＮａＯＨ溶液（ｐＨ１０）を５０μＬ／ウエルづつ加
え、酵素反応を停止させた。

【００５９】上記反応に基づく蛍光強度は、マイクロフ
ルオロリーダー（ダイナテック社製、励起波長３６０ｎ
ｍ，蛍光波長４５０ｎｍ）を用い、相対蛍光強度（ＲＦ
Ｕ）として測定した。

【００６０】実施例３（成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）Ｍｗ．４５４４の測
定）固相たる９６穴マイクロタイタ−プレート（発光
用）に、抗体たる抗ヒトＧＲＦ抗体（ウサギ、自家製）
の炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）溶液（５μｇ／ｍＬ）を１
００μＬ／ウエルづつ分注し、４℃で１晩放置して、抗
体を固相化した。

【００６１】次に、製造例１で得た精製ＢＳＡ（ウシ血
清アルブミン）の２％溶液（Tris-HCl緩衝液中）を２０
０μＬ／ウエルづつ分注し、室温（約２５℃）で２時間
放置して固相のブロッキングを行った。

【００６２】洗浄緩衝液（０．０５％Tween ２０含有Ｐ
ＢＳ（−））で３回固相を洗浄した後、抗原を加えて一
次反応を行った。ここでは、抗原として検量線作成のた
めの標準サンプル（スタンダード）として標準ヒトＧＲ
Ｆ（ペプチド研）を希釈緩衝液（１％精製ＢＳＡ、０．
０５％Tween ２０含有Tris NaCl緩衝液）で所定の濃度
となるようにして（２５０ｐｇ／ｍＬから８ポイン
ト）、１００μＬ／ウエルづつ分注した。分注後、室温
で１晩放置して反応させた。

【００６３】洗浄緩衝液で３回洗浄した後、第２抗体た
るビチオン化抗ヒトＧＲＦ抗体（ウサギＩｇＧ：自家
製）を１５μｇ／ｍＬ濃度で１００μＬ／ウエルづつ分
注し、室温で３時間反応させた（二次反応）。次に、ス
トレプトアビジン化アルカリフォスファターゼ（ＴＡＧ
Ｏ社）を上記希釈緩衝液で１０万倍に希釈したものを１
００μＬ／ウエルづつ分注し、室温で１時間反応させた
（三次反応）。

【００６４】洗浄緩衝液で４回洗浄した後、０．２ｍＭ
のＡＭＰＰＤ溶液（Tris緩衝液、ｐＨ９．５中又は、
０．１Ｍジエタノールアミン溶液ｐＨ９．８中）を１０
０μＬ／ウエル加えて室温で２０〜６０分放置して四次
反応を行った。このＡＭＰＰＤ溶液には、２０倍に希釈
した増感剤（ＢＤＭＱ＋フルオレセイン・イソチオシア
ネート（ＦＩＴＣ）；商品名Emerald 、トロピックス社
製）を共存させた。

【００６５】上記反応に基づく発光強度は、マイクロプ
レートルミノメーター（ダイナテック社製）を用いて測
定した。測定結果を図４（実線）に示す。上述したよう
にスタンダードとして標準ＧＲＦを用いた本実施例の測
定系の検出範囲は２５０〜０．４ｐｇ／ｍＬであり、検
出限界は０．２ｐｇ／ｍＬであった。

【００６６】一方、比較のため、上記と同様のスタンダ
ードを従来の比色法で測定した結果をも図４（点線）に
示す。

【００６７】参考のため、患者血清（６例）を、本発明
の測定法および従来法で測定したデータ（Ｓ１〜Ｓ６）
の比較を、図４に示した。小人症の下垂体性と被床下部
性の障害の鑑別・治療にＧＲＦ静注試験は有用であり、
同時に血中ＧＲＦ濃度の測定は、鑑別、治療に際しての
血中動態の把握に不可欠である。しかしながら、従来、
分子量４０００〜５０００程度の小ペプタイドは、サン
ドイッチＥＩＡ法では高感度な測定系を確立することが
むずかしいとされ、ＲＩＡ（放射線免疫測定法）測定が
多く用いられてきた。本実施例によれば、ｎｏｎ−ＲＩ
ＡでサンドイッチＥＩＡを行ない、上述したように高感
度な系を確立することが可能となった。

【００６８】

【発明の効果】上述したように本発明によれば、バック
グラウンドを低く抑えつつサンドイッチＥＩＡ法の感度
を飛躍的に向上させることが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定法によるヒトＩＬ−４の測定の検
量線（実線）および従来法の検量線（点線）を示すグラ
フである。

【図２】精製ＢＳＡを用いない系における発光法および
従来の比色法によるＩＬ−４測定の検量線を示すグラフ
である。

【図３】本発明の発光法（増感剤使用）、増感剤を用い
ない系における発光法、ケイ光法および従来の比色法に
よるｓＣＤ２３測定の検量線を示すグラフである。

【図４】本発明の測定法によるＧＲＦ測定の検量線（実
線）および従来の比色法の検量線（点線）を示すグラフ
である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】測定すべき抗原に対する抗体を固相化
し、精製ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて該固相
のブロッキングを行った後、測定すべき抗原を含む被検
試料を反応させ、測定すべき抗原に対する第２抗体を反
応させた後、増感剤の存在下で前記第２抗体に直接もし
くは間接的に結合したアルカリフォスファターゼの活性
を測定することを特徴とする抗原の測定方法。
【請求項２】上記アルカリフォスファターゼの活性を
ジオキセタン誘導体を基質として用いて測定する請求項
１記載の抗原の測定方法。
【請求項３】測定すべき抗原に第２抗体を反応させた
後に、該第２抗体を酵素標識する請求項１又は２に記載
の抗原の測定方法。
【請求項４】前記増感剤がポリアルキル４級アミンか
らなる請求項１、２又は３に記載の抗原の測定方法。
【請求項５】前記第２抗体及び／又はアルカリフォス
ファターゼ結合物を精製した後用いる請求項１、２、３
又は４に記載の抗原の測定方法。