CN113391076A - 一种25-羟基维生素d的免疫检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种25‑羟基维生素D的免疫检测方法及其应用，包括使用抗25‑羟基维生素D的3号位抗体和抗25‑羟基维生素D的22号位抗体进行配对，分别用于捕获以及检测25‑羟基维生素D‑大分子蛋白的偶联物，形成双抗体夹心复合物，其中包括侧向层析平台、酶联免疫吸附平台(ELISA)、化学发光平台、微流控平台、免疫比浊平台。本发明所述的一种25‑羟基维生素D的免疫检测方法及其应用，涉及免疫检测方法领域，本发明有益效果是：降低项目开发难度，节省开发成本，提高开发效率，可以与样品中的25‑羟基维生素D结合，从而提高了试剂性能，有效竞争抗体量远多于现有技术的方法，从而可以兼顾灵敏度和反应性，并且线性范围也可以得到增加。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测方法领域，特别涉及一种25-羟基维生素D的免疫检测方法及其应用。
背景技术
维生素D是一种脂溶性维生素，在人体内出现的主要形式是维生素D2(麦角钙化醇)(图1)和维生素D3(图2)(胆钙化醇)。食物源和自身合成的维生素D2和维生素D3在25-羟化酶作用下分别转化为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，总称25-羟基维生素D。25羟基维生素D作为维生素D的活性代谢物，常被检测用于体现人体维生素D的代谢水平，在儿童和老年代谢疾病、绝经期妇女疾病、重症患者体征监测方面有重要临床意义。目前25-羟基维生素D的测定方法主要有胶体金层析法，荧光层析法，酶联免疫法、液相色谱-质谱检测法以及化学发光法等，其中免疫检测方法主要是胶体金层析法，荧光层析法，酶联免疫法和化学发光法等。然而25羟基维生素D分子量小，仅为420Da左右，在免疫检测过程中小分子的免疫原性差，常与大分子蛋白偶联以增加免疫原性，如牛血清白蛋白。半抗原通常都是小分子物质，由于半抗原分子量小因此在免疫类的诊断试剂中与抗原抗体等大分子的包被和标记工艺区别比较大，因此对相关产品的开发影响较大，例如层析法的产品半抗原不能直接固定于硝酸纤维素膜上、半抗原偶联标记物的难度比较高等。
现有技术常常用化学方法把半抗原偶联到大分子蛋白(如BSA)上，再作为IVD试剂原料来使用，例如将VD-BSA固定于NC膜上，但存在检测灵敏度低、线性范围窄，样本基质效应等问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种25-羟基维生素D的免疫检测方法及其应用，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种生物样品中25-羟基维生素D的免疫检测方法，包括
S1、使用抗25-羟基维生素D的3号位抗体和抗25-羟基维生素D的22号位抗体进行配对，分别用于捕获以及检测25-羟基维生素D-大分子蛋白的偶联物，形成双抗体夹心复合物，其中包括侧向层析平台、酶联免疫吸附平台(ELISA)、化学发光平台、微流控平台、免疫比浊平台，还包括25-羟基维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，所述方法使用抗25-羟基维生素D的3号位(C3)抗体和抗25-羟基维生素D的22号位(C22)抗体至少各一种，形成夹心法；
S2、捕获和检测抗体都是抗25-羟基维生素D的抗体；抗25-羟基维生素D的3号位(C3)抗体可用于捕获或者检测，同时搭配抗25-羟基维生素D的22号位(C22)抗体用于检测或者捕获，抗体是指可识别25-羟基维生素D2以及25-羟基维生素D3的杂交瘤或者重组单抗、多抗、抗体的Fab片段等有效片段，以及抗体及其有效片段嵌合、聚合等方式形成的蛋白；
S3、再通过生物样品中的25-羟基维生素D的竞争，形成一定的测值-浓度相关曲线，进而达到检测生物样品中25-羟基维生素D的目的；所述抗25-羟基维生素D的22号位(C22)抗体是指，抗体的特异性表位是针对25-羟基维生素D的C22位置和大分子蛋白偶联后的结构，并且抗体对未偶联的25-羟基维生素D也可以结合的免疫球蛋白及其衍生物。
优选的，所述抗25-羟基维生素D的3号位(C3)抗体是指，抗体的特异性表位是针对25-羟基维生素D的C3位置和大分子蛋白偶联后的结构，并且抗体对未偶联的25-羟基维生素D也可以结合的免疫球蛋白及其衍生物。
优选的，所述3号位(C3)抗体或者22号位(C22)抗体可用的包被固相支持物为磁珠、酶联免疫吸附板、硝酸纤维素膜、胶乳、芯片等可通过理化方法将抗体固相化的材料。
优选的，所述3号位(C3)抗体或者22号位(C22)抗体可用的标记物为辣根过氧化物酶、吖啶酯、碱性磷酸酶、荧光素、荧光微球、稀土离子、半导体纳米微晶粒、胶体金等。
优选的，所述3号位(C3)抗体或者22号位(C22)抗体也可以通过间接标记的方式偶联到以上所列标记物，包括不限于使用生物素-亲和素系统、1,3-二硝基苯(DNP)-抗1,3-二硝基苯(DNP)抗体系统等，例如3号位(C3)抗体偶联生物素，辣根过氧化物酶标记亲和素，然后将二者通过一定比例结合形成3号位抗体-生物素-亲和素-辣根过氧化物酶的复合物。
优选的，所述双抗体夹心法的抗原为25-羟基维生素D-大分子蛋白的偶联物及其衍生物，偶联物上同时具有22号位(C22)抗体和3号位(C3)抗体的结合位点，其中，大分子蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、鸡卵白蛋白(OVA)、γ球蛋白及其衍生物等；25-羟基维生素D与大分子蛋白常用的连接方法有碳化二亚胺法、马来酰亚胺法、戊二醛法等，25-羟基维生素D与大分子蛋白的连接可通过使用化学接头发生，化学接头可以由25-羟基维生素D及其衍生物形成的烷基、芳基、烷氧基、酰胺、磺酰胺、或羧基或肽基团组成，其与大分子蛋白及其衍生物的化学接头反应形成相应的偶联物，优选的，通过蛋白的氨基基团和25-羟基维生素D的衍生物的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)的化学反应实现，而25-羟基维生素D的衍生物的衍生活性基团长度取决于使用的活化试剂种类。
优选的，所述25-羟基维生素D-大分子蛋白的偶联物及其衍生物，可通过多种方式合成，包括不限于：a)通过大分子蛋白与25-羟基维生素D C3位置偶联，然后再与25-羟基维生素D C22位置偶联形成；b)通过大分子蛋白与25-羟基维生素D C22位置偶联，然后再与25-羟基维生素D C3位置偶联形成；优选的，使用方法a，大分子蛋白与25-羟基维生素D C3位置通过常规方法偶联后，将25-羟基维生素D C22位置衍生物活化后再继续偶联形成，其中，大分子蛋白与25-羟基维生素D C3位置的偶联方法可以是本领域常用的方法，25-羟基维生素D C22位置衍生物可以是本领域常用的试剂。
优选的，所述免疫检测方法采用的试剂，检测的生物样品指血清、血清或全血，试剂内容包括上述提到的包被固相支持物试剂组分、标记物试剂组分、夹心法抗原试剂组分，还包括对样品进行处理的释放试剂组分，目的是将样品中的25-羟基维生素D分子从维生素D-结合蛋白复合物中释放出来，然后样品中游离的25-羟基维生素D分子与夹心法抗原试剂组分竞争结合22号位(C22)抗体或3号位(C3)抗体，形成一定的测值-浓度相关曲线，进而达到检测生物样品中25-羟基维生素D的目的。
优选的，所述偶联物所用的25-羟基维生素D为半抗原，结构简单，与大分子蛋白偶联后可能由于空间位阻等原因，并且由于市场上商业化的抗25-羟基维生素D抗体的多样性，可能存在随机的3号位抗体和22号位抗体无法搭配的情况，需要使用合适的25-羟基维生素D与大分子偶联物进行配对筛选。
优选的，所述免疫检测方法试剂，检测生物样品如全血、血清、血浆中的25-羟基维生素D，其中样本中的25-羟基维生素D的存在方式包括游离的、以及与结合蛋白结合的复合物等形式存在，因此试剂组分可能还包括将复合物中的25-羟基维生素D解离的释放试剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
双抗体夹心的方法学，使用常规的抗体包被和标记工艺即可完成产品的开发和生产，不需要针对25-羟基维生素D-大分子蛋白的偶联物进行包被或者标记工艺的调整，降低项目开发难度，节省开发成本，提高开发效率；
捕获和检测抗体都是抗25-羟基维生素D的抗体，在形成夹心法的过程，都可以与样品中的25-羟基维生素D结合，从而提高了试剂性能；
理论上，现有技术将25-羟基维生素D-大分子蛋白偶联物作为捕获或者检测原料，当配对的抗体用量较高才能达到较好的反应度，但会导致游离的25-羟基维生素D灵敏度差，反之为了提高试剂灵敏度，必须严格控制配对的抗体，从而限制了试剂的反应度。而双抗体夹心竞争法的应用，捕获抗体和检测抗体都能与样品中的25-羟基维生素D进行竞争，并且竞争的结果都会影响双抗体夹心复合物的形成，因此总的有效竞争抗体量远多于现有技术的方法，从而可以兼顾灵敏度和反应性，并且线性范围也可以得到增加。
附图说明
图1为未偶联的25-羟基维生素D2分子；
图2为未偶联的25-羟基维生素D3分子；
图3为一般的25-羟基维生素D分子22号位(C22)偶联大分子蛋白示意图；
图4为25-羟基维生素D分子22号位(C22)偶联大分子蛋白的偶联物结构优选一示意图；
图5为25-羟基维生素D分子22号位(C22)偶联大分子蛋白的偶联物结构优选二示意图；
图6为一般的25-羟基维生素D分子3号位(C3)偶联大分子蛋白一示意图；
图7为一般的25-羟基维生素D分子3号位(C3)偶联大分子蛋白二示意图；
图8为同时具有两种抗体结合位点的25-羟基维生素D分子3号位(C3)-大分子蛋白-25-羟基维生素D分子22号位(C22)的偶联物及其衍生物的示意图；
图9为25-羟基维生素D分子22号位衍生物示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
如图1-9所示的一种25-羟基维生素D的免疫检测方法及其应用，包括
S1、使用抗25-羟基维生素D的3号位抗体和抗25-羟基维生素D的22号位抗体进行配对，分别用于捕获以及检测25-羟基维生素D-大分子蛋白的偶联物，形成双抗体夹心复合物，其中包括侧向层析平台、酶联免疫吸附平台(ELISA)、化学发光平台、微流控平台、免疫比浊平台，还包括25-羟基维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，所述方法使用抗25-羟基维生素D的3号位(C3)抗体和抗25-羟基维生素D的22号位(C22)抗体至少各一种，形成夹心法；
S2、捕获和检测抗体都是抗25-羟基维生素D的抗体；抗25-羟基维生素D的3号位(C3)抗体可用于捕获或者检测，同时搭配抗25-羟基维生素D的22号位(C22)抗体用于检测或者捕获，抗体是指可识别25-羟基维生素D2以及25-羟基维生素D3的杂交瘤或者重组单抗、多抗、抗体的Fab片段等有效片段，以及抗体及其有效片段嵌合、聚合等方式形成的蛋白；
S3、再通过生物样品中的25-羟基维生素D的竞争，形成一定的测值-浓度相关曲线，进而达到检测生物样品中25-羟基维生素D的目的；所述抗25-羟基维生素D的22号位(C22)抗体是指，抗体的特异性表位是针对25-羟基维生素D的C22位置和大分子蛋白偶联后的结构，并且抗体对未偶联的25-羟基维生素D也可以结合的免疫球蛋白及其衍生物。
优选的，所述抗25-羟基维生素D的3号位(C3)抗体是指，抗体的特异性表位是针对25-羟基维生素D的C3位置和大分子蛋白偶联后的结构，并且抗体对未偶联的25-羟基维生素D也可以结合的免疫球蛋白及其衍生物。
优选的，所述3号位(C3)抗体或者22号位(C22)抗体可用的包被固相支持物为磁珠、酶联免疫吸附板、硝酸纤维素膜、胶乳、芯片等可通过理化方法将抗体固相化的材料。
优选的，所述3号位(C3)抗体或者22号位(C22)抗体可用的标记物为辣根过氧化物酶、吖啶酯、碱性磷酸酶、荧光素、荧光微球、稀土离子、半导体纳米微晶粒、胶体金等。
优选的，所述3号位(C3)抗体或者22号位(C22)抗体也可以通过间接标记的方式偶联到以上所列标记物，包括不限于使用生物素-亲和素系统、1,3-二硝基苯(DNP)-抗1,3-二硝基苯(DNP)抗体系统等，例如3号位(C3)抗体偶联生物素，辣根过氧化物酶标记亲和素，然后将二者通过一定比例结合形成3号位抗体-生物素-亲和素-辣根过氧化物酶的复合物。
优选的，所述双抗体夹心法的抗原为25-羟基维生素D-大分子蛋白的偶联物及其衍生物，偶联物上同时具有22号位(C22)抗体和3号位(C3)抗体的结合位点，其中，大分子蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、鸡卵白蛋白(OVA)、γ球蛋白及其衍生物等；25-羟基维生素D与大分子蛋白常用的连接方法有碳化二亚胺法、马来酰亚胺法、戊二醛法等，25-羟基维生素D与大分子蛋白的连接可通过使用化学接头发生，化学接头可以由25-羟基维生素D及其衍生物形成的烷基、芳基、烷氧基、酰胺、磺酰胺、或羧基或肽基团组成，其与大分子蛋白及其衍生物的化学接头反应形成相应的偶联物，优选的，通过蛋白的氨基基团和25-羟基维生素D的衍生物的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)的化学反应实现，而25-羟基维生素D的衍生物的衍生活性基团长度取决于使用的活化试剂种类。
优选的，所述25-羟基维生素D-大分子蛋白的偶联物及其衍生物，可通过多种方式合成，包括不限于：a)通过大分子蛋白与25-羟基维生素D C3位置偶联，然后再与25-羟基维生素D C22位置偶联形成；b)通过大分子蛋白与25-羟基维生素D C22位置偶联，然后再与25-羟基维生素D C3位置偶联形成；优选的，使用方法a，大分子蛋白与25-羟基维生素D C3位置通过常规方法偶联后，将25-羟基维生素D C22位置衍生物活化后再继续偶联形成，其中，大分子蛋白与25-羟基维生素D C3位置的偶联方法可以是本领域常用的方法，25-羟基维生素D C22位置衍生物可以是本领域常用的试剂。
优选的，所述免疫检测方法采用的试剂，检测的生物样品指血清、血清或全血，试剂内容包括上述提到的包被固相支持物试剂组分、标记物试剂组分、夹心法抗原试剂组分，还包括对样品进行处理的释放试剂组分，目的是将样品中的25-羟基维生素D分子从维生素D-结合蛋白复合物中释放出来，然后样品中游离的25-羟基维生素D分子与夹心法抗原试剂组分竞争结合22号位(C22)抗体或3号位(C3)抗体，形成一定的测值-浓度相关曲线，进而达到检测生物样品中25-羟基维生素D的目的。
优选的，所述偶联物所用的25-羟基维生素D为半抗原，结构简单，与大分子蛋白偶联后可能由于空间位阻等原因，并且由于市场上商业化的抗25-羟基维生素D抗体的多样性，可能存在随机的3号位抗体和22号位抗体无法搭配的情况，需要使用合适的25-羟基维生素D与大分子偶联物进行配对筛选。
优选的，所述免疫检测方法试剂，检测生物样品如全血、血清、血浆中的25-羟基维生素D，其中样本中的25-羟基维生素D的存在方式包括游离的、以及与结合蛋白结合的复合物等形式存在，因此试剂组分可能还包括将复合物中的25-羟基维生素D解离的释放试剂。
实施例：
实施例1：
具备两种结合位点的25-羟基维生素D与大分子蛋白偶联物的制备；
1.将25-羟基维生素D3(购于Toronto Research Chemicals)与大分子蛋白(牛血清白蛋白，购于Thermo)的C3号位偶联物的制备；
将1mg 25-羟基维生素D3溶解于溶解于有机溶剂(DMSO)中，加入10mg丁二酸酐，在合适的惰性气体保护下，室温避光反应12小时，将混合物加入到20ml乙酸乙酯中，然后依次用超纯水、合适浓度的盐酸、超纯水洗涤，过滤后真空干燥得到1mg 25-羟基维生素D3 C3-半琥珀酸酯，溶于1ml二氯甲烷中，加入0.2mg NHS和0.4mg EDC，室温避光搅拌12小时，过滤真空干燥后得到25-羟基维生素D3 C3-半琥珀酸酯的活化酯，溶于0.5ml有机溶剂(DMSO)后备用；
2.将上述25-羟基维生素D3 C3-半琥珀酸酯的活化酯，与大分子蛋白(牛血清白蛋白)(溶于pH7.4的10mM PBS中)按摩尔比2-8：1的比例混合，室温避光快速搅拌15分钟后，用透析袋透析4h至PBS缓冲液中，得到25-羟基维生素D3 C3-大分子蛋白(牛血清白蛋白)偶联物，离心取上清备用；
3.将1mg 25-羟基维生素D衍生物(图7中X＝4)、2mg丁二酸酐和0.1μL三乙胺溶解于有机溶剂(DMSO)中，在合适的惰性气体保护下，室温避光反应12小时，再加入0.2mg NHS和0.4mg EDC，室温避光搅拌12小时，按摩尔比10-20:1的比例，将合适体积的溶液缓慢滴加到步骤2的25-羟基维生素D3 C3-大分子蛋白(牛血清白蛋白)偶联物中，室温避光快速搅拌15分钟后，用透析袋透析4h至PBS缓冲液中，得到具备两种结合位点的25-羟基维生素D与大分子蛋白偶联物。
实施例2：
ELISA间接法验证具备两种结合位点的25-羟基维生素D与大分子蛋白偶联物的活性；
1.用包被液(50mM/L碳酸盐缓冲液pH9.6)将上述偶联物稀释至0.2-1μg/mL后加入96孔酶标板(购自厦门金灿华)，100μL/孔，4℃反应过夜，用洗涤液(PBST)洗板3次；每孔加入200μL封闭液(1％牛血清白蛋白的10mM/L pH7.4磷酸盐缓冲液)，37℃孵育0.5小时，用洗涤液洗板3次，晾干；
2.加入合适浓度的抗25-羟基维生素D抗体(抗体来自多家IVD原料公司)(用封闭液稀释)100μL/孔，37℃孵育0.5小时，用洗涤液洗板3次；
3.加入对应种属的合适浓度的酶标二抗(购自Thermo，酶标二抗用封闭液稀释，)100μL/孔，37℃孵育0.5小时，用洗涤液洗板5次；加入底物A、B溶液各50μL/孔，37℃避光反应10分钟，再加入终止液50μL/孔，用酶标仪读取450nm/630nm的吸光度值；
4.结果如下：
结果显示：实施例1制备的偶联物对市售多个品牌的抗维生素D抗体都有包被活性，且对两种不同表位的抗体都能较好的检出。
实施例3：
荧光侧向层析免疫检测方法学筛选25羟基维生素D检测试剂盒的抗体配对原料；
使用常规方法准备以下组分：
1、荧光素标记抗25-羟基维生素D的3号位(C3)抗体以及抗25-羟基维生素D的22号位(C22)抗体，并制备对应的偶联物结合垫；选择以下方法示例：以0.02mol/LPBS(pH7.4)调整抗体浓度到10mg/ml；取相当于蛋白量1/50的FITC(购自Sigma公司)，溶解于相当蛋白溶液1/10体积的0.2mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)中；在搅拌条件下将FITC快速加入抗体中，搅拌反应1h。标记完成后透析纯化得到带荧光素标记的抗体，分装冻干，-20℃保存备用。
2、在硝酸纤维素膜(NC膜)上包被抗25-羟基维生素D的22号位(C22)抗体以及抗25-羟基维生素D的3号位(C3)抗体，制备层析膜；抗体采购来自全球多家IVD原料公司，选择以下方法示例：使用硝酸纤维素膜(Millipore135)，检测T线上包被抗25-羟基维生素D的上述抗体，包被浓度0.2mg/mL～2mg/mL，按1μL/cm制备，质控C线上包被对应的抗抗体(二抗)，包被浓度为0.2mg/mL～2.0mg/mL(应用时将C线的浓度调整到合适的检测范围内)，使用划膜仪(上海金标生物科技公司)制备检测T线以及质控C线，检测T线与质控C线间距0.8-1.2cm；将制备好的层析膜在室温下真空干燥2小时，密封避光防潮保存。
3、使用合适浓度的实施例1制备的25-羟基维生素D与大分子蛋白偶联物的制备样品垫；选择以下方法示例：将空白样本垫(Ahlstrom8964)剪成3-5mm宽的长条，将实施例1制备的偶联物用稀释液稀释到合适的浓度，然后按每试纸条10μL～40μL的量均匀地加在样本垫上，均匀浸透后在37℃烘干2小时，防潮避光保存备用。所述稀释液为含有蔗糖、Tween-20和PEG2000的硼酸盐溶液，稀释液中硼酸盐的浓度为1mM～10mM，每100mL稀释液中含有0.3g～5g蔗糖，0.05mL～2mL Tween-20和0.2g～2g PEG2000。
4、组装试纸条，测试没有添加任何样品(血清、血浆、全血、质控品等)的空白释放试剂组分(购自Diasource)；
5、测试条件如下：
备注：“—”表示不进行搭配测试；①～⑧的序号表示对应配对条件
测试T线的荧光值与C线的荧光值的比值，结果如下：
结果显示：有相当一部分的抗体搭配方式不能成功应用于本发明，但在少数的搭配方式上，仍然显示有较好的结果，这可能与抗原抗体结合空间位阻、25-羟基维生素D与大分子蛋白偶联物的两种结合位点分布情况以及抗体的结合位点相关。
因此应用本发明的关键是筛选合适的抗体配对，以下实施例省略阐述抗体配对筛选过程。
实施例4：
一种荧光侧向层析免疫检测方法检测25-羟基维生素D试剂的应用；
1.实验组：使用常规方法制备上述实施例3中的关键组分，组装试纸条；
关键组分包括：荧光素标记的抗25-羟基维生素D的22号位(C22)抗体(HeavyBio)制备的合适浓度的偶联物结合垫、包被抗25-羟基维生素D的3号位(C3)抗体(FAPON)的合适浓度的层析膜、选择合适浓度的25-羟基维生素D与大分子蛋白偶联物制备的样品垫。
2.对照组：南京岚煜生物25-羟基维生素D检测试剂盒(干式荧光免疫层析法)，该试剂结合垫的组分是标记荧光微球的25-羟基维生素D单克隆抗体，T线上包被的是25-羟基维生素D-BSA的偶联物。
3.临床样本检测结果：
实验组使用合适浓度的偶联物结合垫和合适浓度客抗体包被的层析膜，测试不同浓度的临床样本(由上述释放试剂组分处理)，计算C线的荧光值与T线的荧光值的比值，
结果如下：
| 临床样本浓度(ng/mL) | 对照组C/T | 实验组C/T |
| 6.42 | 1.32 | 0.41 |
| 8.51 | 1.39 | 0.53 |
| 11.87 | 1.52 | 0.63 |
| 19.56 | 1.8 | 1.18 |
| 28.89 | 2.18 | 1.42 |
| 55.37 | 3.24 | 2.21 |
| 71.76 | 4.62 | 3.07 |
| 92.74 | 6.82 | 4.45 |
| 138.08 | 7.10 | 6.52 |
| 188.71 | 6.98 | 10.63 |
结果显示，实验组的C/T值，对低值的临床样本检出更灵敏，最低检出限更高，而对高值样本的区分度更好，检出上限更高，线性范围更宽。
4.用浓度为20.00ng/mL和60.00ng/mL的25-羟基维生素D标准品，使用上述试剂重复检测3次，计算偏差观察准确度。
结果显示，按本发明制备的荧光层析试剂偏差在±10％以内，准确度合格。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种生物样品中25-羟基维生素D的免疫检测方法，其特征在于：包括
S1、使用抗25-羟基维生素D的3号位抗体和抗25-羟基维生素D的22号位抗体进行配对，分别用于捕获以及检测25-羟基维生素D-大分子蛋白的偶联物，形成双抗体夹心复合物，其中包括侧向层析平台、酶联免疫吸附平台(ELISA)、化学发光平台、微流控平台、免疫比浊平台，还包括25-羟基维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，所述方法使用抗25-羟基维生素D的3号位(C3)抗体和抗25-羟基维生素D的22号位(C22)抗体至少各一种，形成夹心法；
S2、捕获和检测抗体都是抗25-羟基维生素D的抗体；抗25-羟基维生素D的3号位(C3)抗体可用于捕获或者检测，同时搭配抗25-羟基维生素D的22号位(C22)抗体用于检测或者捕获，抗体是指可识别25-羟基维生素D2以及25-羟基维生素D3的杂交瘤或者重组单抗、多抗、抗体的Fab片段等有效片段，以及抗体及其有效片段嵌合、聚合等方式形成的蛋白；
S3、再通过生物样品中的25-羟基维生素D的竞争，形成一定的测值-浓度相关曲线，进而达到检测生物样品中25-羟基维生素D的目的；所述抗25-羟基维生素D的22号位(C22)抗体是指，抗体的特异性表位是针对25-羟基维生素D的C22位置和大分子蛋白偶联后的结构，并且抗体对未偶联的25-羟基维生素D也可以结合的免疫球蛋白及其衍生物。
2.根据权利要求1所述一种生物样品中25-羟基维生素D的免疫检测方法，其特征在于：所述抗25-羟基维生素D的3号位(C3)抗体是指，抗体的特异性表位是针对25-羟基维生素D的C3位置和大分子蛋白偶联后的结构，并且抗体对未偶联的25-羟基维生素D也可以结合的免疫球蛋白及其衍生物。
3.根据权利要求1所述一种生物样品中25-羟基维生素D的免疫检测方法，其特征在于：所述3号位(C3)抗体或者22号位(C22)抗体可用的包被固相支持物为磁珠、酶联免疫吸附板、硝酸纤维素膜、胶乳、芯片等可通过理化方法将抗体固相化的材料。
4.根据权利要求1所述一种生物样品中25-羟基维生素D的免疫检测方法，其特征在于：所述3号位(C3)抗体或者22号位(C22)抗体可用的标记物为辣根过氧化物酶、吖啶酯、碱性磷酸酶、荧光素、荧光微球、稀土离子、半导体纳米微晶粒、胶体金等。
5.根据权利要求1所述一种生物样品中25-羟基维生素D的免疫检测方法，其特征在于：所述3号位(C3)抗体或者22号位(C22)抗体也可以通过间接标记的方式偶联到以上所列标记物，包括不限于使用生物素-亲和素系统、1,3-二硝基苯(DNP)-抗1,3-二硝基苯(DNP)抗体系统等，例如3号位(C3)抗体偶联生物素，辣根过氧化物酶标记亲和素，然后将二者通过一定比例结合形成3号位抗体-生物素-亲和素-辣根过氧化物酶的复合物。
6.根据权利要求1所述一种生物样品中25-羟基维生素D的免疫检测方法，其特征在于：所述双抗体夹心法的抗原为25-羟基维生素D-大分子蛋白的偶联物及其衍生物，偶联物上同时具有22号位(C22)抗体和3号位(C3)抗体的结合位点，其中，大分子蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、鸡卵白蛋白(OVA)、γ球蛋白及其衍生物等；25-羟基维生素D与大分子蛋白常用的连接方法有碳化二亚胺法、马来酰亚胺法、戊二醛法等，25-羟基维生素D与大分子蛋白的连接可通过使用化学接头发生，化学接头可以由25-羟基维生素D及其衍生物形成的烷基、芳基、烷氧基、酰胺、磺酰胺、或羧基或肽基团组成，其与大分子蛋白及其衍生物的化学接头反应形成相应的偶联物，优选的，通过蛋白的氨基基团和25-羟基维生素D的衍生物的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)的化学反应实现，而25-羟基维生素D的衍生物的衍生活性基团长度取决于使用的活化试剂种类。
7.根据权利要求6所述一种生物样品中25-羟基维生素D的免疫检测方法，其特征在于：所述25-羟基维生素D-大分子蛋白的偶联物及其衍生物，可通过多种方式合成，包括不限于：a)通过大分子蛋白与25-羟基维生素D C3位置偶联，然后再与25-羟基维生素D C22位置偶联形成；b)通过大分子蛋白与25-羟基维生素D C22位置偶联，然后再与25-羟基维生素DC3位置偶联形成；优选的，使用方法a，大分子蛋白与25-羟基维生素D C3位置通过常规方法偶联后，将25-羟基维生素D C22位置衍生物活化后再继续偶联形成，其中，大分子蛋白与25-羟基维生素D C3位置的偶联方法可以是本领域常用的方法，25-羟基维生素D C22位置衍生物可以是本领域常用的试剂。
8.根据权利要求1所述一种生物样品中25-羟基维生素D的免疫检测方法，其特征在于：所述免疫检测方法采用的试剂，检测的生物样品指血清、血清或全血，试剂内容包括上述提到的包被固相支持物试剂组分、标记物试剂组分、夹心法抗原试剂组分，还包括对样品进行处理的释放试剂组分，目的是将样品中的25-羟基维生素D分子从维生素D-结合蛋白复合物中释放出来，然后样品中游离的25-羟基维生素D分子与夹心法抗原试剂组分竞争结合22号位(C22)抗体或3号位(C3)抗体，形成一定的测值-浓度相关曲线，进而达到检测生物样品中25-羟基维生素D的目的。
9.根据权利要求6所述一种生物样品中25-羟基维生素D的免疫检测方法，其特征在于：所述偶联物所用的25-羟基维生素D为半抗原，结构简单，与大分子蛋白偶联后可能由于空间位阻等原因，并且由于市场上商业化的抗25-羟基维生素D抗体的多样性，可能存在随机的3号位抗体和22号位抗体无法搭配的情况，需要使用合适的25-羟基维生素D与大分子偶联物进行配对筛选。
10.根据权利要求1所述一种生物样品中25-羟基维生素D的免疫检测方法的应用，其特征在于：所述免疫检测方法试剂，检测生物样品如全血、血清、血浆中的25-羟基维生素D，其中样本中的25-羟基维生素D的存在方式包括游离的、以及与结合蛋白结合的复合物等形式存在，因此试剂组分可能还包括将复合物中的25-羟基维生素D解离的释放试剂。
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