CN108362688A - 一种25羟基维生素d磁微粒化学发光检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，属于免疫分析领域。该试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、磁分离试剂；其中，所述R2试剂包括碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体；所述磁分离试剂包括异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物、抗异硫氰酸荧光素抗体标记的磁性微粒，所述异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物中的蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵蛋白和γ球蛋白中的一种。该试剂盒通过强碱试剂从结合蛋白中解离25羟基维生素D，然后在中和试剂作用下实现磁微粒化学发光检测，具有较高的灵敏度、特异性和较宽的检测范围，能够用来评价患者维生素D代谢状态，提示钙、骨代谢状态。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析领域，具体涉及一种25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒。
背景技术
25羟基维生素D作为维生素D的活性代谢物，常被检测用于体现人体维生素D的代谢水平，在儿童和老年代谢疾病、绝经期妇女疾病、重症患者体征监测方面有重要临床意义。由于25羟基维生素D为疏水分子，在体内常与结合蛋白结合存在，并且由于抗原-抗体反应和碱磷酶-底物发光反应需要在离子环境中进行，因此，如何获得游离的25羟基维生素D，并使其在离子环境中保持游离状态是免疫法检测的难点之一。另外，25羟基维生素D分子量小，仅为420Da左右，在免疫检测过程中小分子的免疫原性差，常与大分子蛋白偶联以增加免疫原性，如牛血清白蛋白。但是，如果保证在偶联大分子蛋白后，仍能使抗体识别小分子的抗体识别位点成为免疫法检测的另一个难点。此外，24羟基维生素D的临床检测范围通常在50ng/mL以下，对检测灵敏度、反应度要求高，是25羟基维生素D检测的第三个难点。
国内已申请专利的检测技术包括液相色谱-质谱检测(公开CN103308621A、CN105651901A、CN105527364A)、免疫层析(公开号CN104749385A)和板式免疫检测(公开号CN202522564U、CN202522564U)。使用液-质检测灵敏度和准确度高，但其缺点在于：1.样品需要进行前处理，使25羟基维生素D与结合蛋白解离；2.一次只能检测一个样本，检测通量低；3.液-质分析仪属精密分析仪器，仪器购买和使用成本高，对仪器操作、人员素质的要求较高；4.仪器状态和维护情况对检测结果影响极大，实验室间平行检测差异较大。而使用免疫层析和板式免疫法，成本较低，仪器成熟，但缺点是：1.点板操作复杂，对操作人员加样要求较高；2.耗时长；3.重复性和准确性差；4.受限于反应表面积，分析灵敏度低，无法精确定量低浓度样本。
因此，找到一种既能够降低操作难度、减少检测时间、控制检测成本，又能够提高检测灵敏度、准确度和重复性的检测方法是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，该试剂盒通过与全自动化学免疫发光仪联用，大大降低了操作难度和检测时间，控制了检测成本的同时，有效提高了25羟基维生素D检测的灵敏度、准确度和重复性。
基于上述目的，本发明提供的一种25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，该试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、磁分离试剂；其中，
所述R2试剂包括碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体；
所述磁分离试剂包括异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物、抗异硫氰酸荧光素抗体标记的磁性微粒，所述异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物中的蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵蛋白和γ球蛋白中的一种。
优选地，所述碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体浓度为0.5～2.0μg/mL，所述异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物的浓度为0.05～2.0μg/mL，所述抗异硫氰酸荧光素抗体标记的磁性微粒的浓度为0.5～2.0mg/mL。
优选地，所述R2试剂还包括牛血清白蛋白、动物血清、防腐剂和缓冲液；所述牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5～5.0％，所述动物血清选自羊血清、牛血清、马血清和鸡血清中的一种，所述防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.1～0.3％，所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为6.0～9.0。
优选地，所述磁分离试剂还包括缓冲液、牛血清白蛋白、动物血清和防腐剂；所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为6.0～9.0，所述牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5～5.0％，所述动物血清选自羊血清、牛血清、马血清和鸡血清中的一种，所述防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.1～0.3％。
优选地，所述R1试剂为摩尔浓度为0.2～0.5M的氢氧化钠。R1试剂可使血清中的蛋白变性，从而使结合态25羟基维生素D被释放为游离态，有利于被抗体识别检测。
优选地，所述R3试剂包括缓冲液、两性试剂和还原剂；所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为6.0～9.0；所述两性试剂选自DMSO、DMF、甲醇、乙醇和吐温80中的一种，所述两性试剂的质量百分比浓度为0.2～60％；所述还原剂选自DTT、β-巯基乙醇、TCEP和SDS中的一种，所述还原剂的质量百分比浓度为0.1～5.0％。R3试剂可以中和R1试剂导致的强碱性环境，同时保持25羟基维生素D在溶液中的解离状态，利于被R2试剂中碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体识别。
优选地，所述试剂盒还包括校准品液系列和质控品液系列，所述校准品液系列和质控品液系列分别包括25羟基维生素D抗原、牛血清白蛋白、动物血清、防腐剂和缓冲液；所述牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5～5.0％，所述动物血清选自羊血清、牛血清、马血清和鸡血清中的一种，所述防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.1～0.3％，所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为6.0～9.0；所述校准品液系列中25羟基维生素D抗原浓度分别为0.0ng/mL、15.0ng/mL、30.0ng/mL、50.0ng/mL、90.0ng/mL和150.0ng/mL；所述质控品液系列中25羟基维生素D抗原浓度分别为15.0ng/mL和40.0ng/mL。
优选地，所述R2试剂中碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体的制备方法如下：
(1)配制10～15mg/mL的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液；
(2)取25羟基维生素D单克隆抗体置于试管中，加入2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，混匀，室温放置20～60min，得活化的25羟基维生素D单克隆抗体；
(3)称取碱性磷酸钠置于试管中，碱性磷酸钠的质量为25羟基维生素D单克隆抗体质量的0.5～1.5倍；
(4)向装有碱性磷酸钠的试管中加入5～10mg/mL的Sulfo-SMCC溶液，混匀，室温放置10～30min，得活化的碱性磷酸钠；
(5)向装有活化的25羟基维生素D单克隆抗体的试管中加入1M的MgCl2溶液，然后加入活化的碱性磷酸钠，4℃放置12～20h；
(6)利用蛋白质纯化系统收集步骤(5)中制得的碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体。
优选地，所述磁分离试剂中异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物的制备方法如下：
(1)将25羟基维生素D衍生物采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析；
(2)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.2～1mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液；
(3)向步骤(1)处理后的25羟基维生素D衍生物中加入步骤(2)制备的异硫氰酸荧光素溶液，混匀，室温反应20h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得；其中，每毫克25羟基维生素D衍生物加入0.15mL的异硫氰酸荧光素溶液。
优选地，所述磁分离试剂中抗异硫氰酸荧光素抗体标记的磁性微粒的制备方法如下：
(1)磁微粒加磁场，用pH值为3.5～5.5的MES缓冲液清洗，然后采用MES缓冲液悬浮磁微粒，得磁微粒浓度为50mg/mL的悬浮液；
(2)向悬浮液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，混匀；其中每毫升悬浮液中加入0.5～2.5mg的抗异硫氰酸荧光素抗体；
(3)向步骤(2)处理后的悬浮液中加入10mg/mL的EDC溶液；其中悬浮液和EDC溶液的体积比为1:1，搅拌2～6h，然后加磁场，静置10～30min，倒出上清液，即得。
本发明中25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒的原理为：将待测血清样本、R1试剂混合温育，使蛋白与待测物解离；然后加入R2试剂和R3试剂混合温育，使R2试剂中的碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体与血清样本中的25羟基维生素D抗原结合，形成免疫复合物；然后该免疫复合物与含有异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物和抗异硫氰酸荧光素抗体标记磁性微粒的磁分离试剂混合温育。磁分离试剂中的磁微粒表面的抗异硫氰酸荧光素抗体会与标记有25羟基维生素D抗原的异硫氰酸荧光素形成磁微粒-FITC免疫复合物。而磁微粒-FITC免疫复合物中的25羟基维生素D抗原会与血清样本中的25羟基维生素D抗原，竞争结合试剂R2中的标记有碱性磷酸酶的抗25羟基维生素D单克隆抗体，形成磁微粒-FITC/25OHD免疫复合物。洗涤，去除未结合的抗体和杂质后加入发光底物。磁微粒-FITC/25OHD免疫复合物上的碱性磷酸酶催化底物发光，测定相对发光强度(RLU)，在一定范围内RLU与血清样本中25羟基维生素D抗原浓度呈反比，通过内插法就可以从RLU-25羟基维生素D抗原浓度标准曲线上读取待测血清样本中的25羟基维生素D含量。
从上面所述可以看出，本发明的优点和有益效果是：
(1)本发明提供的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒通过强碱试剂从结合蛋白中解离25羟基维生素D，然后在中和试剂作用下实现磁微粒化学发光检测，该试剂盒具有较高的灵敏度、特异性和较宽的检测范围，能够用来评价患者维生素D代谢状态，提示钙、骨代谢状态。
(2)本发明提供的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒使用悬浮磁微球捕捉待测抗原，比表面积大，可更好捕捉样本中的待测物，灵敏度高、检测范围宽。
(3)本发明提供的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒使用磁微球作为固相载体，方便清洗，去除非特异性结合，有利于提高检测准确度。
(4)本发明提供的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。
(5)本发明提供的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒只需要2mL血液就可以进行检测，患者体验好，有利于患者接受。
(6)本发明提供的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒使用高质量单抗抗干扰能力强，检测范围完全涵盖现有临床检测需求，具有极强的市场推广潜力。
附图说明
图1为本发明实施例2中校准品剂量-发光强度的回归曲线；
图2为本发明实施例3中A，B点连点拟合曲线；
图3为本发明实施例4中25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒与进口化学发光微粒免疫检测法试剂盒测定值的相关性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
实施例1 25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒的组成
在本实施例中，25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、磁分离试剂、校准品液系列和质控品液系列；其中，
本实施例中，R1试剂为摩尔浓度为0.2～0.5M的氢氧化钠；优选地，R1试剂为摩尔浓度为0.5M的氢氧化钠。
本实施例中，R2试剂包括碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体、牛血清白蛋白、动物血清、防腐剂和缓冲液；碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体浓度为0.5～2.0μg/mL；优选地，碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体浓度为1.0μg/mL；牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5～5.0％；优选地，牛血清白蛋白的质量百分比浓度为5.0％；动物血清选自羊血清、牛血清、马血清和鸡血清中的一种；优选地，动物血清为质量百分比浓度为5.0％的牛血清；防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，防腐剂的质量百分比浓度为0.1～0.3％；优选地，防腐剂为质量百分比浓度为0.2％的叠氮化钠；缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，缓冲液pH值为6.0～9.0；优选地，缓冲液为pH为7.5的HEPES缓冲液。
碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体的制备方法如下：
(1)用去离子水配制10～15mg/mL的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液；优选地，配制10mg/mL的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液；
(2)取25羟基维生素D单克隆抗体置于尖底试管中，加入试管体积1/100的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，混匀，室温放置20～60min，得活化的25羟基维生素D单克隆抗体；优选地，室温放置60min；
(3)称取碱性磷酸钠置于试管中，碱性磷酸钠的质量为25羟基维生素D单克隆抗体质量的0.5～1.5倍；优选地，碱性磷酸钠的质量为25羟基维生素D单克隆抗体质量的1.0倍；
(4)用无水N,N-二甲基甲酰胺配制5～10mg/mL的Sulfo-SMCC溶液，向装有碱性磷酸钠的试管中加入1/20试管体积的Sulfo-SMCC溶液，混匀，室温放置10～30min，得活化的碱性磷酸钠；优选地，配制10mg/mL的Sulfo-SMCC溶液；
(5)向装有活化的25羟基维生素D单克隆抗体的试管中加入1/500体积的1M的MgCl2溶液，然后加入活化的碱性磷酸钠，4℃放置12～20h；
(6)利用蛋白质纯化系统收集步骤(5)中制得的碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体；即安装蛋白质纯化系统(AKTA purifier100)，使用Superdex200制备级柱子，使用去离子水配制质量百分比浓度为2％的三乙醇胺溶液平衡柱子，流速为1mL/min；收集各洗脱峰流分，测定各洗脱峰流分的280nm处吸光值，收集280nm处吸光值大于0.02的流分，即得。
本实施例中，R3试剂包括缓冲液、两性试剂和还原剂；缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，缓冲液pH值为6.0～9.0；优选地，缓冲液为pH为6.0的MES缓冲液；两性试剂选自DMSO、DMF、甲醇、乙醇和吐温80中的一种，两性试剂的质量百分比浓度为0.2～60％；优选地，两性试剂为质量百分比浓度为10％的乙醇；还原剂选自DTT、β-巯基乙醇、TCEP和SDS中的一种，还原剂的质量百分比浓度为0.1～5.0％；优选地，还原试剂为质量百分比浓度为0.5％的DTT。
本实施实例中，磁分离试剂包括异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物、抗异硫氰酸荧光素抗体标记的磁性微粒、牛血清白蛋白、动物血清、防腐剂和缓冲液；异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物的浓度为0.05～2.0μg/mL，优选地，异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物的浓度为1.0μg/mL；抗异硫氰酸荧光素抗体标记的磁性微粒的浓度为0.5～2.0mg/mL；优选地，抗异硫氰酸荧光素抗体标记的磁性微粒的浓度为1.0mg/mL；异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物中的蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵蛋白和γ球蛋白中的一种；优选地，异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物中的蛋白为牛血清白蛋白；牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5～5.0％，优选地，牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5％；动物血清选自羊血清、牛血清、马血清和鸡血清中的一种，优选地，动物血清为质量百分比浓度为5.0％的马血清；防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，防腐剂的质量百分比浓度为0.1～0.3％；优选地，防腐剂为质量百分比浓度为0.2％的叠氮化钠；缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，缓冲液pH值为6.0～9.0；优选地，缓冲液为pH为7.0的MOPS缓冲液。
异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物的制备方法如下：
(1)将25羟基维生素D衍生物置于透析袋中，采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析；
(2)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制浓度为0.2～1mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液；优选地，异硫氰酸荧光素溶液的浓度为0.5mg/mL；
(3)向步骤(1)处理后的25羟基维生素D衍生物中加入步骤(2)制备的异硫氰酸荧光素溶液，混匀，室温反应20h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得；其中，每毫克25羟基维生素D衍生物加入0.15mL的异硫氰酸荧光素溶液。
抗异硫氰酸荧光素抗体标记的磁性微粒的制备方法如下：
(1)磁微粒加磁场，静置15min，倒出上清液，用pH值为3.5～5.5的MES缓冲液清洗磁微粒，然后采用MES缓冲液悬浮磁微粒，得磁微粒浓度为50mg/mL的悬浮液；
(2)向悬浮液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，混匀；其中每毫升悬浮液中加入0.5～2.5mg的抗异硫氰酸荧光素抗体；优选地，每毫升悬浮液中加入0.5mg的抗异硫氰酸荧光素抗体；
(3)用去离子水配制浓度为10mg/mL的EDC溶液，向步骤(2)处理后的悬浮液中加入EDC溶液；其中悬浮液和EDC溶液的体积比为1:1，搅拌2～6h，然后加磁场，静置10～30min，倒出上清液，即得；优选地，搅拌2h，静置10min。
本实施例中，校准品液系列和质控品液系列分别包括25羟基维生素D抗原、牛血清白蛋白、动物血清、防腐剂和缓冲液；牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5～5.0％，优选地，牛血清白蛋白的质量百分比浓度为5.0％；动物血清选自羊血清、牛血清、马血清和鸡血清中的一种，优选地动物血清为质量百分比浓度为2.0％的牛血清；防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，防腐剂的质量百分比浓度为0.1～0.3％；优选地，防腐剂为质量百分比浓度为0.2％的叠氮化钠；缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，缓冲液pH值为6.0～9.0；优选地，缓冲液为pH值为7.4的Tris-Hcl缓冲液；校准品液系列中25羟基维生素D抗原浓度分别为0.0ng/mL、15.0ng/mL、30.0ng/mL、50.0ng/mL、90.0ng/mL和150.0ng/mL；质控品液系列中25羟基维生素D抗原浓度分别为15.0ng/mL和40.0ng/mL。
校准品液系列和质控品液系列的制备方法为：
(1)用缓冲液、牛血清白蛋白、动物血清和防腐剂配制成校准品稀释液；
(2)用DMSO溶解25羟基维生素D纯品；
(3)用步骤(1)中的校准品稀释液稀释溶解后的25羟基维生素D，得25羟基维生素D浓度分别为0.0ng/mL、15.0ng/mL、30.0ng/mL、50.0ng/mL、90.0ng/mL和150.0ng/mL的校准品液系列；或者，用步骤(1)中的校准品稀释液稀释溶解后的25羟基维生素D，得25羟基维生素D浓度分别为15.0ng/mL和40.0ng/mL的质控品液系列。
实施例2 25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒的测定方法和绘制标准曲线
将试剂盒从储存条件下取出后平衡至室温再用于样本检测；磁分离实际使用前彻底混匀以确保磁微粒悬浮均匀，并且不能使用磁力搅拌器进行搅拌；根据实际需要准备试管并做好标记。
步骤1.取2.0mL静脉血至玻璃试管中，不加抗凝剂，室温静置，然后3000rpm离心5min，取上清；
步骤2.分别取10-50μL校准品液系列、质控品液系列和采集的血清样本置于对应的试管中；每次取样前都需要更换移液器头避免交叉污染；
步骤3.分别加10～50μLR1试剂至步骤2的各试管中，将各试管采用多管混匀器2000rpm振荡混匀30s，然后置于36.5℃～37.5℃的水浴中3min；
步骤4.分别加50-100μLR3试剂和50μLR2试剂于步骤3处理后的各试管中，将各试管采用多管混匀器2000rpm振荡混匀30s，然后置于36.5℃～37.5℃的水浴中20min；
步骤5.分别将25μL磁分离试剂于步骤4处理后的各试管中，将各试管采用多管混匀器2000rpm振荡混匀30s，然后置于磁分离器上吸附2min；
步骤6.采用大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出各试管中的上清液，把倒转的各试管连同圆周运动倒转分离器一同放置于滤纸上，拍击，除去沾在各试管壁上的液滴；
步骤7.分别加300μL清洗液至步骤6处理后的各试管中，将各试管采用多管混匀器2000rpm振荡混匀30s，重复清洗3次；
步骤8.分别加100μL发光底物溶液至步骤7处理后的各试管中，混匀3s，5min内采用化学发光分析仪测定各试管的发光强度；
步骤9.校准品液系列发光强度测定结果如表1所示，利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-发光强度的回归曲线，如图1所示，根据测定的血清样本的发光强度由回归曲线反算出血清样本中待测物的浓度。
表1。
实施例3 25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒的方法学检定
按照本领域中的常规的制造及检定规程对实施例1中的试剂盒进行检定，结果如下：
1.试剂盒精密度测定
1.1批内精密度分析
将实施例1中的试剂盒一批，分别测定高、低浓度的质控品液系列，10孔平行测定，得出批内变异系数分别为3.58％、4.93％，结果如表2所示。
| 靶值(ng/mL) | 测定次数 | 分析内CV(％) |
| 15.45 | 10 | 4.93 |
| 39.17 | 10 | 3.58 |
表2。
1.2批间精密度分析
将实施例1中的试剂盒取三批，每批试剂盒均测定高、低浓度的质控品液系列，10孔平行测定，每份质控品液得到30个浓度测值，统计批间变异系数分别为5.28％、5.50％，结果如表3所示。
| 测定血清浓度(ng/mL) | 测定次数 | 分析内CV(％) |
| 15.45 | 30 | 5.28 |
| 39.17 | 30 | 5.50 |
表3。
2.试剂盒准确度测定
采用实施例1中的试剂盒测量国际参考物质SRM 972a的浓度，检测值与参考物质标示值的相对偏差应不超过±15％，结果如表4所示。
表4。
3.试剂盒最低检测限
最低检测限是在一给定的显著性水平上可与零剂量相区别的剂量。用零浓度较准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的相对发光强度(RLU)值，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M-2SD，根据零浓度较准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M-2SD的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。
3.1A点发光值结果如表5所示，其中25OHD-STD-A表示25羟基维生素D的A点发光值。
由表5可见，A点发光值的均值X＝830910、SD＝7670、X-ZSD＝815569
表5。
3.2B点发光值结果如表6所示，其中25OHD-STD-B表示25羟基维生素D的B点发光值。
由表6可见，B点发光值的均值X＝647820
表6。
3.3A，B点连点拟合曲线如图2所示。
由图2可知，A，B点连点拟合曲线方程为y＝-12206x+830910，R2＝1。
3.4根据A-B点浓度-RLU线性拟合方程，将M-2SD的RLU值带入上述方程中，求得对应的浓度值，即为最低检测限，即实施例1中试剂盒的最低检测限为1.26ng/mL。
4.试剂盒交叉反应试验
使用校准品稀释液分别配制浓度为1mg/mL的维生素D2、维生素D3、3异位25羟基维生素D3和1,25羟基维生素D3的特异性样本；向180μL浓度介于30.00ng/ml～50.00ng/ml区间的血清样本中加入20μL校准品稀释液，配制对照样本；各样本重复检测3次。按照下述公式计算加样回收率变化：
加样回收率＝(加样样本测值-对照样本测值)/加样终浓度×100％
交叉反应实验结果如表7所示，由表7可知，对非25羟基维生素D的维生素D代谢物的加样回收率小于5.0％。
| 对照样本 | VD2 | VD3 | 3-Epi-25-OHD | 1,25-OHD | |
| 样本浓度(ng/ml) | 30.00～50.00 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 检测值(ng/ml) | 41.34±0.76 | 43.52±1.28 | 43.05±0.78 | 43.92±0.56 | 41.87±1.49 |
| 加样回收率 | -- | 2.18％ | 1.71％ | 2.58％ | 0.52％ |
表7。
5.试剂盒抗干扰试验
向180μL浓度为30～50ng/mL的正常血清中添加20μL校准品稀释液配制成干扰物，作为干扰样本；向180μL浓度为30～50ng/mL的正常血清中添加20μL较准品稀释液，作为对照样本；采用实施例1中的试剂盒测定对照样本和干扰样本，每个样本测定3次。结果如表8所示。
| 添加物 | 拟合浓度ng/mL | 偏差 |
| 对照样本 | 38.34±0.09 | |
| 0.3％脂浊 | 37.06±0.51 | -3.35％ |
| 2.5g/L血红蛋白 | 37.21±0.41 | -2.95％ |
| 500uM游离胆红素 | 40.44±0.50 | 5.48％ |
| 500uM结合胆红素 | 41.02±0.38 | 6.97％ |
| 100IU/ml肝素钠 | 39.32±0.33 | 2.54％ |
表8。
由表8结果可知，干扰样本测值与对照样本测值的偏差均小于±15％。本发明的试剂盒抗干扰效果良好。
6.试剂盒稳定性试验
对实施例1中的试剂盒分别进行4℃和37℃放置的稳定性实验，试剂盒4℃放置12个月和37℃放置7天，标准品定标正常，质控品测值在规定范围内，最低检测限低于4ng/mL，分析内和分析间精密度分别小于±10％和±15％、准确度测值偏差小于±15％、交叉反应加样回收率小于±5％。因此，试剂盒有效期可达12个月。
经过大量的实验证明，本发明的试剂盒方法学指标如下：
检测范围：6.00～150.00ng/mL
最低检测限：最小检测限不高于4.00ng/mL
精密度：批内变异系数小于±10％，批间变异系数小于±15％
准确性：测量参考物质SRM 972a，测值与参考物质标示值的相对偏差应不超过±15.0％。
交叉反应：对非25羟基维生素D的维生素D代谢物的加样回收率均小于5.0％。
稳定性：试剂各组分置4℃12个月和37℃7天后测定结果均符合要求，试剂盒效期可达12个月。
实施例4本发明试剂盒同进口化学发光微粒免疫检测法试剂盒临床样本测值比对
用实施例1中的试剂盒和进口化学发光微粒子免疫检测法试剂盒对40份人血清样品同时进行检测，其检测结果如表9所示；以本发明试剂盒测定的血清25羟基维生素D浓度为纵坐标，以进口化学发光微粒子免疫检测法试剂盒测定的结果为横坐标作图，如图3所示。
采用本发明试剂盒测定的血清25羟基维生素D浓度为纵坐标，以进口化学发光微粒子免疫检测法试剂盒测定的结果为横坐标作回归分析，相关方程为：y＝1.0686x+1.218，相关系数R2＝0.9436，经统计学处理结果表明，本方法同进口化学发光微粒免疫检测法试剂盒临床样本测定值相关性良好。
表9。
从上面所述可以看出，本发明的优点和有益效果是：
(1)本发明提供的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒通过强碱试剂从结合蛋白中解离25羟基维生素D，然后在中和试剂作用下实现磁微粒化学发光检测，该试剂盒具有较高的灵敏度、特异性和较宽的检测范围，能够用来评价患者维生素D代谢状态，提示钙、骨代谢状态。
(2)本发明提供的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒使用悬浮磁微球捕捉待测抗原，比表面积大，可更好捕捉样本中的待测物，灵敏度高、检测范围宽。
(3)本发明提供的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒使用磁微球作为固相载体，方便清洗，去除非特异性结合，有利于提高检测准确度。
(4)本发明提供的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。
(5)本发明提供的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒只需要2mL血液就可以进行检测，患者体验好，有利于患者接受。
(6)本发明提供的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒使用高质量单抗抗干扰能力强，检测范围完全涵盖现有临床检测需求，具有极强的市场推广潜力。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、磁分离试剂；其中，
所述R2试剂包括碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体；
所述磁分离试剂包括异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物、抗异硫氰酸荧光素抗体标记的磁性微粒，所述异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物中的蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵蛋白和γ球蛋白中的一种。
2.根据权利要求1所述的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体浓度为0.5～2.0μg/mL，所述异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物的浓度为0.05～2.0μg/mL，所述抗异硫氰酸荧光素抗体标记的磁性微粒的浓度为0.5～2.0mg/mL。
3.根据权利要求1所述的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂还包括牛血清白蛋白、动物血清、防腐剂和缓冲液；所述牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5～5.0％，所述动物血清选自羊血清、牛血清、马血清和鸡血清中的一种，所述防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.1～0.3％，所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为6.0～9.0。
4.根据权利要求1所述的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂还包括缓冲液、牛血清白蛋白、动物血清和防腐剂；所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为6.0～9.0，所述牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5～5.0％，所述动物血清选自羊血清、牛血清、马血清和鸡血清中的一种，所述防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.1～0.3％。
5.根据权利要求1所述的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂为摩尔浓度为0.2～0.5M的氢氧化钠。
6.根据权利要求1所述的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R3试剂包括缓冲液、两性试剂和还原剂；所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为6.0～9.0；所述两性试剂选自DMSO、DMF、甲醇、乙醇和吐温80中的一种，所述两性试剂的质量百分比浓度为0.2～60％；所述还原剂选自DTT、β-巯基乙醇、TCEP和SDS中的一种，所述还原剂的质量百分比浓度为0.1～5.0％。
7.根据权利要求1所述的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括校准品液系列和质控品液系列，所述校准品液系列和质控品液系列分别包括25羟基维生素D抗原、牛血清白蛋白、动物血清、防腐剂和缓冲液；所述牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5～5.0％，所述动物血清选自羊血清、牛血清、马血清和鸡血清中的一种，所述防腐剂选自叠氮化钠和Procline300中的一种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.1～0.3％，所述缓冲液选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为6.0～9.0；所述校准品液系列中25羟基维生素D抗原浓度分别为0.0ng/mL、15.0ng/mL、30.0ng/mL、50.0ng/mL、90.0ng/mL和150.0ng/mL；所述质控品液系列中25羟基维生素D抗原浓度分别为15.0ng/mL和40.0ng/mL。
8.根据权利要求1所述的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体的制备方法如下：
(1)配制10～15mg/mL的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液；
(2)取25羟基维生素D单克隆抗体置于试管中，加入2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，混匀，室温放置20～60min，得活化的25羟基维生素D单克隆抗体；
(3)称取碱性磷酸钠置于试管中，碱性磷酸钠的质量为25羟基维生素D单克隆抗体质量的0.5～1.5倍；
(4)向装有碱性磷酸钠的试管中加入5～10mg/mL的Sulfo-SMCC溶液，混匀，室温放置10～30min，得活化的碱性磷酸钠；
(5)向装有活化的25羟基维生素D单克隆抗体的试管中加入1M的MgCl2溶液，然后加入活化的碱性磷酸钠，4℃放置12～20h；
(6)利用蛋白质纯化系统收集步骤(5)中制得的碱性磷酸酶标记的抗25羟基维生素D单克隆抗体。
9.根据权利要求1所述的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂中异硫氰酸荧光素标记的25羟基维生素D蛋白衍生物的制备方法如下：
(1)将25羟基维生素D衍生物采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析；
(2)采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.2～1mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液；
(3)向步骤(1)处理后的25羟基维生素D衍生物中加入步骤(2)制备的异硫氰酸荧光素溶液，混匀，室温反应20h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得；其中，每毫克25羟基维生素D衍生物加入0.15mL的异硫氰酸荧光素溶液。
10.根据权利要求1所述的25羟基维生素D磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂中抗异硫氰酸荧光素抗体标记的磁性微粒的制备方法如下：
(1)磁微粒加磁场，用pH值为3.5～5.5的MES缓冲液清洗，然后采用MES缓冲液悬浮磁微粒，得磁微粒浓度为50mg/mL的悬浮液；
(2)向悬浮液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，混匀；其中每毫升悬浮液中加入0.5～2.5mg的抗异硫氰酸荧光素抗体；
(3)向步骤(2)处理后的悬浮液中加入10mg/mL的EDC溶液；其中悬浮液和EDC溶液的体积比为1:1，搅拌2～6h，然后加磁场，静置10～30min，倒出上清液，即得。
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