CN113495159A - 一种系统反应液、一种25羟基维生素d定量检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种系统反应液、一种25羟基维生素D定量检测试剂盒及其使用方法,一种系统反应液,包括EDTA、十二烷基磺酸钠、二甲基亚砜和乙醇。一种25羟基维生素D定量检测试剂盒,包括权利要求所述的系统反应液,还包括包被有25(OH)VD‑BSA的包被板、含有酶标记25(OH)VD单抗的酶结合物和25(OH)VD的校准品。在检测过程中消除新旧样本差异的有效成分,消除HAMA样本干扰的有效成分,从而使本申请提供的25羟基维生素D定量检测试剂盒达到更快速更便捷的操作和获取更准确的检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学检测技术领域,尤其是涉及一种系统反应液、一种25羟基维生素D定量检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
维生素D(vitamin D)为类固醇激素,具抗佝偻病作用,又称抗佝偻病维生素。维生素D均为不同的维生素D原经紫外照射后的衍生物。维生素D是一种脂溶性维生素,有五种化合物,对健康关系较密切的是维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。它存在于部分天然食物中,人体皮下储存有从胆固醇生成的7-脱氢胆固醇,受紫外线的照射后,可转变为维生素D。当维生素D运到肝脏中,在微粒体中经单氧酶系统作用,将其25位羟基化形成25(OH)VD,肝外的其他组织也可吸取维生素d及25-(OH)VD。25(OH)VD是维生素D在循环中的主要存在形式,半衰期21天左右,能够反映人体维生素D的真实水平,是反映个体维生素D状态的最佳指标。
针对25羟基维生素D现有的检测方法有液相色谱-串联质谱法、免疫学方法。其中免疫学方法因其检测快捷,成本低廉是目前临床应用的主流方法。平台上又形成了化学发光、酶联免疫、免疫荧光、免疫比浊、荧光免疫等产品形式。
应用免疫学方法的产品中,目前的方法是:使用的是固相化抗25羟基维生素D抗体,酶标记25羟基维生素D抗原,对样本进行前处理使25羟基维生素D从结合蛋白上解离为游离态。然后酶标记的25羟基维生素D抗原和样本处理后游离的25羟基维生素D抗原,竞争结合固相化的抗25羟基维生素D抗体,进行竞争法检测。例如:北京博晖创新生物、广州菲康生物、北京美康生物、北京正旦国际科技等公司使用的都是这种方法,这种方法需要单独进行一步样本前处理,重要的是该方法容易造成一定比例的结合蛋白异常的样品检测结果错误。原因是这些样本的结合蛋白解离后有机会与酶标记的25羟基维生素D抗原形成新的结合,从而造成干扰竞争反应的后果。或者只能使用两步法操作,避免结合蛋白与酶标记抗原发生结合。
发明内容
本发明为解决上述问题,提供一种系统反应液、一种25羟基维生素D定量检测试剂盒及其使用方法,在检测过程中消除新旧样本差异的有效成分,消除HAMA样本干扰的有效成分,从而使本申请提供的25羟基维生素D定量检测试剂盒达到更快速更便捷的操作和获取更准确的检测结果。
本发明的目的是以下述方式实现的:一种系统反应液,包括EDTA、十二烷基磺酸钠、二甲基亚砜和乙醇。
所述的系统反应液,EDTA为EDTA-2K,每升中含有EDTA-2K 5.8-7g、十二烷基磺酸钠1.5-2.5g、二甲基亚砜90ml-110ml和乙醇45ml-55ml。
所述的系统反应液,还包括缓冲液和防腐剂。
所述的系统反应液,缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液,防腐剂为Proclin300、NaN3、卡松中的至少一种。
一种25羟基维生素D定量检测试剂盒,包括权利要求所述的系统反应液,还包括包被有25(OH)VD-BSA的包被板、含有酶标记25(OH)VD单抗的酶结合物和25(OH)VD的校准品。
酶结合物的稀释液中包含有酪蛋白。
酶结合物的稀释液中包括缓冲液、防腐剂,缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液,防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种,酶结合物的稀释液还包括小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种;酶标记的25羟基维生素D单克隆抗体与酶结合物稀释液按体积比1:(4800—5200)的比例混合得到酶结合物。
校准品的稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂和制霉菌素;缓冲液为HEPES缓冲液,保护蛋白牛血清白蛋白、Casein中的至少一种,防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
校准品分别为包含0ng/ml,7.5ng/ml,15ng/ml,30ng/ml,75ng/ml,150ng/ml浓度25(OH)VD的的校准品。
所述的25羟基维生素D定量检测试剂盒的使用方法,包括以下步骤,
(1)加样:取出一定量的包被板上编号的包被孔,依次加入50μl校准品及待测样本,然后分别加入50μl系统反应液,再加入酶结合物50μl;
(2)温育:将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟;
(3)洗涤:甩去包被孔内液体,用稀释后的洗涤液注满各包被孔,静置20秒,甩掉,如此反复洗涤5次,每次均需甩净液体,最后在吸水纸上拍干;
(4)显色:每包被孔加底物液100μl,18-23℃下避光反应20分钟;
(5)终止:每包被孔加终止液50μl,终止反应。
本发明试剂盒基于酶免免疫法制备而成,配合酶标仪使用,操作简便,检测速度快。与已上市的25羟基维生素D检测试剂盒相比,本试剂盒采用固相化25羟基维生素D抗原,酶标记抗25羟基维生素D抗体的反应方式;并优化系统反应液配方,添加了解离剂、EDTA,酶结合物配方添加阻断剂和一种特殊的蛋白保护剂酪蛋白。该反应原理因参与竞争的25羟基维生素D抗原固相化,可以不受样本解离后结合蛋白的影响。样品中的25羟基维生素D的解离无需单独进行,另外,上述有效物质的添加,可以同时满足样品中25羟基维生素D解离、降低新旧样本干扰和HAMA干扰。
作用原理如下:
25羟基维生素D自然状态下通过化学键与结合蛋白相结合,其结合力稳固且有相对应结合比例。当使用解离剂将25羟基维生素D与结合蛋白解离后,结合蛋白因其理化性质决定了其会与基质环境形成新的游离结合关系。以往采用固相化抗体,酶标记抗原的反应原理,如果使用解离与竞争同步反应的方法,则样本中的结合蛋白会对酶标抗原造成一定的结合干扰。或者为了规避这一风险,已上市产品往往采用一种两步操作的方式,第一步进行样本解离,解离后的抗原与固相化抗体结合,然后清洗掉未参与反应的抗原和基质液(包含结合蛋白),第二步加入酶结合抗原在与未参与参与第一步结合反应的固相化抗体结合。通过两步反应避免结合蛋白与酶标记抗原的接触来解决上述问题。
本发明将抗原与抗体的位置进行互换,将抗原进行固相化,抗体进行标记。抗原进行固相化以后失去了再与结合蛋白相结合的条件,同时所对应的抗原决定簇还得以完整保留,在与样品中的抗原进行竞争时具有天然抗原的特性,竞争反应效果良好,梯度显著。
系统缓冲液中的十二烷基磺酸钠、二甲基亚砜和乙醇为解离剂的有效成分,系统缓冲液中的EDTA为消除新旧样本差异的有效成分,其主要作用原理为消除补体效应;酶结合物中的阻断剂为消除HAMA样本干扰的有效成分,其主要作用原理为主动亲和HAMA样本嗜异性抗体的Fc表位,使其失去与25羟基维生素D抗体的结合能力。
附图说明
图1是回归曲线图。
图2是本申请试剂盒与现有产品的相关性参考图。
具体实施方式
一种系统反应液,包括EDTA、十二烷基磺酸钠、二甲基亚砜和乙醇。
所述的系统反应液,EDTA为EDTA-2K,每升中含有EDTA-2K 5.8-7g、十二烷基磺酸钠1.5-2.5g、二甲基亚砜90ml-110ml和乙醇45ml-55ml。
所述的系统反应液,还包括缓冲液和防腐剂。
所述的系统反应液,缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液,防腐剂为Proclin300、NaN3、卡松中的至少一种。
一种25羟基维生素D定量检测试剂盒,包括权利要求所述的系统反应液,还包括包被有25(OH)VD-BSA的包被板、含有酶标记25(OH)VD单抗的酶结合物和25(OH)VD的校准品。
酶结合物的稀释液中包含有酪蛋白。
酶结合物的稀释液中包括缓冲液、防腐剂,缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液,防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种,酶结合物的稀释液还包括小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种;酶标记的25羟基维生素D单克隆抗体与酶结合物稀释液按体积比1:(4800—5200)的比例混合得到酶结合物。
校准品的稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂和制霉菌素;缓冲液为HEPES缓冲液,保护蛋白牛血清白蛋白、Casein中的至少一种,防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
校准品分别为包含0ng/ml,7.5ng/ml,15ng/ml,30ng/ml,75ng/ml,150ng/ml浓度25(OH)VD的的校准品。
所述的25羟基维生素D定量检测试剂盒的使用方法,包括以下步骤,
(1)加样:取出一定量的包被板上编号的包被孔,依次加入50μl校准品及待测样本,然后分别加入50μl系统反应液,再加入酶结合物50μl;
(2)温育:将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟;
(3)洗涤:甩去包被孔内液体,用稀释后的洗涤液注满各包被孔,静置20秒,甩掉,如此反复洗涤5次,每次均需甩净液体,最后在吸水纸上拍干;
(4)显色:每包被孔加底物液100μl,18-23℃下避光反应20分钟;
(5)终止:每包被孔加终止液50μl,终止反应。
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明,以利于本领域技术人员的理解。如无特殊说明,本发明所使用的物料和检测仪器均为本行业常规物料产品,所使用的检测方法为本行业常规使用方法。
制备25羟基维生素D定量检测试剂盒
1、制备包被板
①将25(OH)VD-BSA(采购自厦门同仁心生物,型号为GD12)按照1ug/ml加入到0.05MPH7.4的PBS缓冲液中配制成包被液,在室温18-23℃下条件充分混匀。
②将配制好的包被液按100μl/孔加入空白酶标板(采购自厦门云鹏生物)内,在冰箱2~8℃下放置16-24hr。
③甩去酶标板中的包被液,拍干后用洗液洗板2次。
④洗板后2分钟内封闭,按150μl/孔加入封闭液1%明胶,在冰箱2~8℃下放置16-24hr。
⑤将酶标板的封闭液甩出,然后将酶标板放置在烘干箱干燥(湿度≤30%)4~8hr。
制备完成。
2、本发明系统反应液的配制
第一步配制巴比妥钠缓冲液,采用下表表1中的原料混合配制成巴比妥钠水溶液;
表1
品名 | 含量 | 原料要求 |
纯化水 | 996ml | 分析纯 |
巴比妥钠 | 10.3g | 分析纯 |
然后使用6M的盐酸调整巴比妥钠水溶液PH值为7.4,制备成巴比妥钠缓冲液。
第二步配制系统反应液
采用下表表2中的原料混合配制成系统反应液。
表2
品名 | 含量 | 原料要求 |
巴比妥钠缓冲液 | 838ml | |
十二烷基磺酸钠 | 2g | 分析纯 |
二甲基亚砜 | 100ml | 分析纯 |
乙醇 | 50ml | 分析纯 |
EDTA-2K | 6.4g | 分析纯 |
Proclin300 | 1ml | 分析纯 |
3、本发明酶结合物的配制
第一步配制巴比妥钠缓冲液,采用下表表3中的原料混合配制成巴比妥钠水溶液;
表3
品名 | 含量 | 原料要求 |
纯化水 | 996ml | 分析纯 |
巴比妥钠 | 10.3g | 分析纯 |
然后使用6M的盐酸调整巴比妥钠水溶液PH值为7.4,制备成巴比妥钠缓冲液。
第二步配制酶稀释液
采用下表表4中的原料混合配制成酶稀释液。
表4
品名 | 含量 | 原料要求 |
巴比妥钠缓冲液 | 978ml | |
BSA | 30g | 分析纯 |
酪蛋白 | 10g | 分析纯 |
HBR | 50mg | Scantibodies |
Proclin300 | 1ml | 分析纯 |
制得的酶稀释液与含有HRP标记的25羟基维生素D单克隆抗体(采购自bioventix,型号为5H10)按5000:1体积比进行混合制得酶结合物。
4、本发明校准品的配制
第一步配制HEPES缓冲液,采用下表表5中的原料混合配制成HEPES溶液;
表5
品名 | 含量 | 原料要求 |
纯化水 | 993ml | 分析纯 |
HEPES | 6.5g | 分析纯 |
Nacl | 8.0g | 分析纯 |
然后使用1M的氢氧化钠调整HEPES溶液PH值为7.2,制备成HEPES缓冲液;
第二步配制校准品稀释液,采用下表表6中的原料混合配制成校准品稀释液;
表6
品名 | 含量 | 原料要求 |
HEPES缓冲液 | 983ml | |
BSA | 30g | 分析纯 |
制霉菌素 | 0.05g | |
Proclin300 | 1ml | 分析纯 |
将25羟基维生素D(sigma H4014)用该稀释液进行稀释,分别配制成0ng/ml、7.5ng/ml、15ng/ml、30ng/ml、75ng/ml、150ng/ml六个浓度的校准品。制霉菌素的厂家和型号分别为源叶生物、S17029。
4、其他通用试剂组分:底物、终止液、洗液采购自郑州达诺生物。
5、试验过程
(一)【主要组成成份】如下表表7
表7
(二)【检验方法】
实验前准备
1、将所有试剂及样本恢复至室温18~25℃至少30分钟。
2、将恒温箱或水浴锅调至反应温度37℃。
3、每瓶洗涤液用1000ml纯化水稀释,摇匀后备用。
实验步骤
1、加样:取出一定量的包被板上编号的包被孔。用微量移液器依次加入50μl校准品及待测样本,再加入酶结合物50μl。
2、温育:将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟。
3、洗涤:甩去包被孔内液体,用稀释后的洗涤液注满各包被孔,静置20秒,甩掉,如此反复洗涤5次(每次均需甩净液体),最后在吸水纸上拍干。
4、显色:每包被孔加底物液100μl,室温18~23℃下避光反应20分钟。
5、终止:每包被孔加终止液50μl,终止反应。
(三)结果计算
(1).酶标仪检测:选择酶标仪波长450nm,参考波长630nm。在终止反应后的10分钟内测定各孔OD值。
(2).计算:本试剂盒推荐采用点到点回归拟和方式,即以系列校准品浓度值为横坐标(X轴),以标准品OD值为纵坐标(Y轴),建立点到点标准曲线,计算待测样本25羟基维生素的含量。参考区间如下表表8,计算示例数据如下表表9,从而建立的点到点标准曲线如曲线参考图1。
表8
浓度(ng/ml) | |
缺乏 | <10 |
不足 | 10~29 |
充足 | 30~100 |
潜在毒性 | >100 |
参考区间的范围是试剂盒测试正常人群根据统计学方法计算的。
表9
6、本发明试剂盒的临床性能评价及发明优点
采用本发明试剂盒与roche公司生产的25羟基维生素D测定试剂盒通过电化学发光法平行考核168份体检人群样本,浓度范围为0.5~140ng/ml,检测结果进行临床相关性分析,检测结果如下表表10,根据表中数据制得相关性参考图如图2。
表10
根据图2相关性参考图可知,本发明制得的试剂盒与现有产品相关性良好,从而说明本发明解决了已上市现有产品两步法反应的操作复杂性,同时也保持了良好的检测效果。国内企业大多数商品化产品都是两步反应,第一步单独完成解离过程,第二步实现竞争反应,需经过两次洗板,且反应时间较长。新反应模式得以实现一步反应,提高检测效率,降低操作错误率。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明整体构思前提下,还可以作出若干改变和改进,这些也应该视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种系统反应液,其特征在于:包括EDTA、十二烷基磺酸钠、二甲基亚砜和乙醇。
2.根据权利要求1所述的系统反应液,其特征在于:EDTA为EDTA-2K,每升中含有EDTA-2K 5.8-7g、十二烷基磺酸钠1.5-2.5g、二甲基亚砜90ml-110ml和乙醇45ml-55ml。
3.根据权利要求1所述的系统反应液,其特征在于:还包括缓冲液和防腐剂。
4.根据权利要求3所述的系统反应液,其特征在于:缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液,防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
5.一种25羟基维生素D定量检测试剂盒,其特征在于:包括权利要求1-4任一权利要求所述的系统反应液,还包括包被有25(OH)VD-BSA的包被板、含有酶标记25(OH)VD单抗的酶结合物和25(OH)VD的校准品。
6.根据权利要求5所述的25羟基维生素D定量检测试剂盒,其特征在于:酶结合物的稀释液中包含有酪蛋白。
7.根据权利要求5或6所述的25羟基维生素D定量检测试剂盒,其特征在于:酶结合物的稀释液中包括缓冲液、防腐剂,缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液,防腐剂为Proclin300、NaN3、卡松中的至少一种,酶结合物的稀释液还包括小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种;酶标记的25羟基维生素D单克隆抗体与酶结合物稀释液按体积比1:(4800—5200)的比例混合得到酶结合物。
8.根据权利要求5所述的25羟基维生素D定量检测试剂盒,其特征在于:校准品的稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂和制霉菌素;缓冲液为HEPES缓冲液,保护蛋白牛血清白蛋白、Casein中的至少一种,防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的25羟基维生素D定量检测试剂盒,其特征在于:校准品分别为包含0ng/ml,7.5ng/ml,15ng/ml,30ng/ml,75ng/ml,150ng/ml浓度25(OH)VD的的校准品。
10.根据权利要求5-9任一权利要求所述的25羟基维生素D定量检测试剂盒的使用方法,其特征在于:包括以下步骤,
(1)加样:取出一定量的包被板上编号的包被孔,依次加入50µl校准品及待测样本,然后分别加入50µl系统反应液,再加入酶结合物50µl;
(2)温育:将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟;
(3)洗涤:甩去包被孔内液体,用稀释后的洗涤液注满各包被孔,静置20秒,甩掉,如此反复洗涤5次,每次均需甩净液体,最后在吸水纸上拍干;
(4)显色:每包被孔加底物液100µl,18-23℃下避光反应20分钟;
(5)终止:每包被孔加终止液50µl,终止反应。
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