CN113495156A - 一种酶结合物稀释液、一种amh定量检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种酶结合物稀释液、一种amh定量检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种酶结合物稀释液、一种AMH定量检测试剂盒及其使用方法，一种酶结合物稀释液，包括EDTA、酪蛋白、缓冲液、保护蛋白。一种AMH定量检测试剂盒，包括包被有抗AMH单克隆抗体的包被板、含有酶标记的抗AMH单克隆抗体的酶结合物和AMH校准品，所述的酶结合物稀释液与酶标记抗AMH单克隆抗体按体积比为（7800‑8300）:1的比例混合得到酶结合物。在检测过程中消除新旧样本差异的有效成分，降低补体效应带来的新旧样本的差异，另外本发明试剂盒采用一步法反应，减少反应时间和简化操作步骤，实现更方便快捷的操作方法，更灵活和便于操作。

Description

一种酶结合物稀释液、一种AMH定量检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种酶结合物稀释液、一种AMH定量检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
抗缪勒氏管激素(AMH)是转化生长因子β超家族的成员之一，由Professor AlfredJost 首先发现。AMH是由两个相同的70KDa亚基，通过二硫键连接组成的二聚糖蛋白，相对分 子质量为140KDa[1]；人类AMH编码基因位于19号染色体短臂，大小2.4～2.8kb，含有5个外显子。AMH在性腺器官发育过程中起着重要作用，是男女性腺功能的重要标记物之一。男性AMH主要由睾丸间质细胞产生，始于胚胎形成并贯穿生命始终；在男性胎儿的发育过程中，AMH导致缪勒氏管退化，形成正常发育的男性生殖管道。女性的AMH主要由卵巢颗 粒细胞产生，血清AMH水平较低于男性，在青春期后浓度达到高峰，并在整个生育年龄维 持在高水平，之后AMH浓度随着年龄及各种因素逐渐降低，直到绝经后无法测出[2]。
AMH是一种由卵巢小滤泡的颗粒层细胞所分泌的激素，能够反映整个生命周期的卵泡 活性，因此AMH值会随着卵巢功能的变化呈起伏变化。相对于其它指标，AMH水平不受周期内与周期之间的变化影响，值相对稳定，可在月经周期的任何一天进行检测[3]，且不受 激素药物的影响，更便于临床应用。研究表明，AMH可更早更准确反映年龄相关卵巢储备功能的下降，提前预测绝经年龄。因此，AMH是目前预测卵巢反应、评估卵巢储备功能的最理想生物标志物。
目前，临床上用于AMH检测主要采用酶联免疫法、电化学发光法等制备的试剂盒，电化学发光法的缺点是检测成本高，并可能会存在交叉污染潜在问题，并且对环境要求比较 高，酶联免疫法目前存在的缺点是检测时间长、操作步骤复杂。目前国内外酶联免疫法的操 作流程：使用的是固相化的抗AMH抗体，生物素标记的抗AMH抗体，碱性磷酸酶标记的辣根过氧化物酶，形成生物素-碱性磷酸酶在内的双抗体夹心法的“三明治”结构，操作步骤多为三步法或者两步法，操作步骤繁琐，并且AMH检测还存在新旧样本差异的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种酶结合物稀释液、一种AMH定量检测试剂盒及其使用方法，在检测过程中消除新旧样本差异的有效成分，降低补体效应带来的新旧样本的差 异，另外本发明试剂盒采用一步法反应，减少反应时间和简化操作步骤，实现更方便快捷的 操作方法，更灵活和便于操作。
本发明的目的是以下述方式实现的：一种酶结合物稀释液，包括EDTA、酪蛋白、缓冲液、保护蛋白。
所述的酶结合物稀释液，EDTA为EDTA-2K，缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓 冲液，保护蛋白为小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种。
所述的酶结合物稀释液，每升酶结合物稀释液中含有EDTA-2K 5.8-7g、酪蛋白7-13g。
所述的酶结合物稀释液，还包括防腐剂。
所述的酶结合物稀释液，防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
一种AMH定量检测试剂盒，包括包被有抗AMH单克隆抗体的包被板、含有酶标记 的抗AMH单克隆抗体的酶结合物和AMH校准品，所述的酶结合物稀释液与酶标记抗AMH 单克隆抗体按体积比为(7800-8300):1的比例混合得到酶结合物。
包被板制备过程中的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，所用的抗AMH的单克隆抗体的浓度为2-10ug/ml，所用的封闭液是BSA—PBS溶液；校准品的稀释液包括缓冲液、 保护蛋白、防腐剂和庆大霉素；缓冲液为HEPES缓冲液，保护蛋白牛血清白蛋白、Casein中 的至少一种，防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种 酶标记的抗AMH单克隆抗体的酶结合物为HRP标记的抗AMH单克隆抗体的酶结合物。
校准品分别为包含0ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml浓度AMH的校准品。
所述的AMH定量检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤，
(1)加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50μl校准品及待测样本，然后 分别加入50μl系统反应液，再加入酶结合物50μl；
(2)温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
(3)洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
(4)显色：每包被孔加底物液100μl，18-23℃下避光反应20分钟；
(5)终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
本试剂盒基于酶联免疫法制备而成，配合酶标仪使用，操作简便，检测速度快。与已 上市的AMH检测试剂盒相比，本试剂盒采用酶直接标记抗AMH抗体的双抗体夹心法的方法，实现一步法的反应方式，减少反应时间和简化操作步骤，实现更方便快捷的操作方法，更灵活和便于操作。并优化酶结合物稀释液的配方，酶结合物稀释液中EDTA和特殊的蛋白保护剂酪蛋白，EDTA作为消除新旧样本差异的有效成分，降低补体效应带来的新旧样本的差异。
附图说明
图1是本申请试剂盒与现有产品的相关性参考图。
具体实施方式
一种酶结合物稀释液，包括EDTA、酪蛋白、缓冲液、保护蛋白。
所述的酶结合物稀释液，EDTA为EDTA-2K，缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓 冲液，保护蛋白为小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种。
所述的酶结合物稀释液，每升酶结合物稀释液中含有EDTA-2K 5.8-7g、酪蛋白7-13g。
所述的酶结合物稀释液，还包括防腐剂。
所述的酶结合物稀释液，防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
一种AMH定量检测试剂盒，包括包被有抗AMH单克隆抗体的包被板、含有酶标记 的抗AMH单克隆抗体的酶结合物和AMH校准品，所述的酶结合物稀释液与酶标记抗AMH 单克隆抗体按体积比为(7800-8300):1的比例混合得到酶结合物。
包被板制备过程中的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，所用的抗AMH的单克隆抗体的浓度为2-10ug/ml，所用的封闭液是BSA—PBS溶液；校准品的稀释液包括缓冲液、 保护蛋白、防腐剂和庆大霉素；缓冲液为HEPES缓冲液，保护蛋白牛血清白蛋白、Casein中 的至少一种，防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
酶标记的抗AMH单克隆抗体的酶结合物为HRP标记的抗AMH单克隆抗体的酶结合物。
校准品分别为包含0ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml浓度AMH的校准品。
所述的AMH定量检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤，
(1)加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50μl校准品及待测样本，然后 分别加入50μl系统反应液，再加入酶结合物50μl；
(2)温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
(3)洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
(4)显色：每包被孔加底物液100μl，18-23℃下避光反应20分钟；
(5)终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以利于本领域技术人员的理解。如 无特殊说明，本发明所使用的物料和检测仪器均为本行业常规物料产品，均为市场上普通所 售产品。所使用的检测方法为本行业常规使用方法。
制备AMH定量检测试剂盒
1、制备包被板
①将AMH单克隆抗体(来源和型号分别为博岳生物M103)按照5ug/ml加入到0.1M PBS缓冲液PH6.5中配制成包被液，室温18-23℃下条件充分混匀。
②将配制好的包被液按100μl/孔加入空白酶标板(采购自厦门云鹏生物)内，在冰箱 2～8℃下放置16-24hr。
③甩去酶标板中的包被液，拍干后用洗液洗板2次。
④洗板后2分钟内封闭，按150μl/孔加入封闭液—1％的BSA—PBS溶液，PBS溶液为0.05M PBS缓冲液PH7.4，在冰箱2～8℃下放置16-24hr。
⑤将酶标板的封闭液甩出，然后将酶标板放置在烘干箱干燥(湿度≤30％)4～8hr。
制备完成。
2、酶结合物的制备
酶结合物的缓冲液采用Tris-NaCl缓冲液，所用的保护蛋白可以是牛血清白蛋白，所用的防腐 剂为Proclin 300，EDTA为EDTA-2K。
(1)Tris-NaCl缓冲液的制备：采用6.05g的Tris和8.5g的NaCl，溶于900mL纯化 水中，用6M HCl调pH至7.4，定容至1000mL制得包被液；
(2)先取一部分Tris-NaCl缓冲液，在Tris-NaCl缓冲液中加入20g的BSA、10g的酪蛋白、1ml的Proclin300和6.4g的EDTA-2K，然后通过加入Tris-NaCl缓冲液的方式定容至1000ml制得酶结合物稀释液；
(3)得到的酶结合物稀释液与酶标记抗AMH单克隆抗体(博岳生物M104)按体积比为8000:1 的比例混合得到酶结合物。
Tris、NaCl、BSA、纯化水、酪蛋白、EDTA-2K、Proclin300分别为分析纯。
3、本发明校准品的配制
(1)配制HEPES缓冲液：采用6.5g的HEPES、8.0g的NaCl溶于900mL纯化水中，然后使 用1M的氢氧化钠调整HEPES溶液PH值为7.2，定容至1000mL，制备成HEPES缓冲液；
(2)配制校准品稀释液：先取一部分HEPES缓冲液，在HEPES缓冲液中加入30g BSA、5g庆大霉素、2ml Proclin300，然后通过加入HEPES缓冲液的方式定容至1000ml制得校准品稀释液。
(3)将AMH抗原(博岳生物H1033)用校准品稀释液进行稀释，分别配制成0ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml六个浓度的校准品。
HEPES、NaCl、BSA、庆大霉素、纯化水、Proclin300分别为分析纯。
4、其他通用试剂组分：底物、终止液、洗液采购自郑州达诺生物。
5、试验过程
【检验方法】
(一)实验前准备
1、将所有试剂及样本恢复至室温18～25℃至少30分钟。
2、将恒温箱或水浴锅调至反应温度37℃。
3、每瓶洗涤液用1000ml纯化水稀释，摇匀后备用。
(二)实验步骤
1、加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔。用微量移液器依次加入50μl校准品及待测 样本，再加入酶结合物50μl。
2、温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟。
3、洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次(每次均需甩净液体)，最后在吸水纸上拍干。
4、显色：每包被孔加底物液100μl，室温18～23℃下避光反应20分钟。
5、终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
(三)结果计算
(1).酶标仪检测：选择酶标仪波长450nm，参考波长630nm。在终止反应后的10分钟内测定各孔OD值。
(2).计算：本试剂盒推荐采用点到点回归拟和方式，即以系列校准品浓度值为横坐 标(X轴)，以标准品OD值为纵坐标(Y轴)，建立点到点标准曲线，计算待测样本AMH 的含量，计算示例数据如下表表1。
计算示例数据如下表表1。
表1
Figure BDA0002419945820000051
(四)、本发明试剂盒临床验证
为了验证本发明试剂盒AMH与对比厂家anshlabs结果的一致性，共收集94例血清样本进行 平行检测，检测结果进行临床相关性分析，结果如下表表2，根据表中数据制得相关性参考 图如图1。
表2
Figure BDA0002419945820000061
从图1显示比对结果表明，本发明试剂盒与对比试剂盒的现行相关R2为0.9881，证明本发 明试剂盒与对比试剂盒间相关性较好。
本发明试剂盒采用一步法反应，将辣根过氧化物酶直接偶联在抗AMH单克隆抗体上， 同时在酶稀释液中添加了EDTA和特殊的蛋白保护剂酪蛋白，减少反应时间和简化操作步骤， 实现更方便快捷的操作方法，更灵活和便于操作。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在 不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护 范围。

Claims (10)

1.一种酶结合物稀释液，其特征在于：包括EDTA、酪蛋白、缓冲液、保护蛋白。
2.根据权利要求1所述的酶结合物稀释液，其特征在于：EDTA为EDTA-2K，缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，保护蛋白为小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的酶结合物稀释液，其特征在于：每升酶结合物稀释液中含有EDTA-2K 5.8-7g、酪蛋白7-13g。
4.根据权利要求1所述的酶结合物稀释液，其特征在于：还包括防腐剂。
5.根据权利要求4所述的酶结合物稀释液，其特征在于：防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
6.一种AMH定量检测试剂盒，其特征在于：包括包被有抗AMH单克隆抗体的包被板、含有酶标记的抗AMH单克隆抗体的酶结合物和AMH校准品，根据权利要求1-5任一权利要求所述的酶结合物稀释液与酶标记抗AMH单克隆抗体按体积比为（7800-8300）:1的比例混合得到酶结合物。
7.根据权利要求6所述的AMH定量检测试剂盒，其特征在于：包被板制备过程中的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，所用的抗AMH的单克隆抗体的浓度为2-10ug/ml，所用的封闭液是BSA—PBS溶液；校准品的稀释液包括缓冲液、保护蛋白、防腐剂和庆大霉素；缓冲液为HEPES缓冲液，保护蛋白牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，防腐剂为Proclin300、NaN3、卡松中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的AMH定量检测试剂盒，其特征在于：酶标记的抗AMH单克隆抗体的酶结合物为HRP标记的抗AMH单克隆抗体的酶结合物。
9.根据权利要求6所述的AMH定量检测试剂盒，其特征在于：校准品分别为包含0ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml浓度AMH的校准品。
10.根据权利要求6-9任一权利要求所述的AMH定量检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤，
（1）加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50µl校准品及待测样本，然后分别加入50µl系统反应液，再加入酶结合物50µl；
（2）温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
（3）洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
（4）显色：每包被孔加底物液100µl，18-23℃下避光反应20分钟；
（5）终止：每包被孔加终止液50µl，终止反应。
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