CN1305109A - 对艾滋病与丙型肝炎病毒抗体的联合快速检测方法 - Google Patents

Abstract

对艾滋病与丙型肝炎病毒抗体的联合快速检测方法,是在同一包被于支持物上的载体表面设置有含HIV和HCV病毒抗原以及高、低两种浓度二硝基酚内部对照成分在内的包被检测区,被检测样品点加于包被检测区所在部位一端的载体表面处并使其向包被检测区的另一端作正向的第一次浸润迁移扩散,至全部覆盖包被检测区后,自上述包被检测区所在部位的另一端用由缓冲液溶解的已与抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的示踪标记物质向上述被检测样品点加端作逆向的第二次浸润迁移扩散,至再次全部覆盖上述包被检测区。检测和比较示踪标记物质与包被检测区中各检测成分的沉积量,得到检测判别结果。

Description

对艾滋病与丙型肝炎病毒抗体的       联合快速检测方法

本发明涉及的是可用于对Ⅰ型和Ⅱ型艾滋病病毒抗体和丙型肝炎病毒抗体进行联合快速检测的方法。

艾滋病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)在人群中的一个重要传播和感染途径是血液或血液制品。目前对这两种病毒的血清学诊测方法可有两种：(1)检测病毒抗原或人体内相应抗体的免疫学方法，如常用的酶联免疫法和蛋白质印迹技术；(2)以聚合酶链式放大反应(PCR)为基础的检测病毒基因组的核酸检测技术和方法。上述的免疫学方法现在对这两类病毒还尚难直接对该相应的抗原进行检测，在临床和血站等医疗、防疫单位均采用的是对机体内的相应抗体进行检测的方式。其中的酶联免疫法因费用较低、一次可检测多达近百个样本和可进行机械化操作，以及其灵敏度和特异性较好，已成为目前最广为使用的一种方法，但其检测所需时间为4-8小时，不能满足如海关、防疫部门和血站等对受染者或献血员等进行快速鉴别检测的特殊要求。蛋白质印迹技术的检测费用昂贵，且检测所用时间更长，要超过一天。上述的核酸检测技术和方法，是目前对艾滋病病毒和丙型肝炎病病毒最常用的确认手段，但也还存在有检测费用高和检测耗费时间长的问题，且进行检测时常需有大规模样本时才能开机进行一次，同样也无法满足海关、防疫和血站等单位或部门对快速鉴别检测的特殊要求，以及中、小医疗单位对检测工作的开展，而且其结果还会因实验室器械的污染而造成假阳性。此外，这些方法共同的一点是还均要求有较大型的仪器设备的支持，使缺乏成套检验设备和能力的医疗单位及时做出诊断感到困难。除一次检测周期需耗时数小时甚至更长外，其一次检测也只能对艾滋病毒或丙型肝炎病毒进行分开的单项检测，也是不能满足中、小型医院、血站、海关等对待检测对象必须做出迅速检测判断需要一个重要方面。

在公开号为CN 1140090A的中国专利文献中曾提出了一种“人类免疫缺陷病毒丙肝病毒抗体联合诊断试剂的制备方法”，该方法是将艾滋病毒和丙肝病毒的抗原用pH9.5的碳酸盐缓冲液稀释制成诊断试剂包被液，然后将其包被于聚苯乙烯、聚乙烯、纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、玻璃材料及细胞等载体之上。按该文献方法制备的检测载体及其所适用的检测方法，实际上仍是一种基于或等同于目前以孔板或类似方式进行的上述酶联免疫法。该方法除检测的全程操作时间仍超过6小时外，由于其检测方式是在同一检测孔中同时检测HIV和HCV两种抗体，因此对检测中所显示出的阳性结果尚无法直接判断究竟是属于HIV阳性还是HCV阳性，抑或是这二者兼而有之，因而还必须要求作第二次的HIV或HCV单项检测，以区别和确定该阳性结果的归属，使检测的时间至少又要延长2天。

鉴于此，本发明首先的一个目的是提供一种能对Ⅰ型和Ⅱ型艾滋病病毒抗体及丙型肝炎病毒抗体进行联合快速检测的方法。在此基础上本发明的另一个目的是提供一种能对被检测样品在Ⅰ型和Ⅱ型艾滋病病毒抗体及丙型肝炎病毒抗体中是否存在有单项指标阳性情况进行联合快速检测的方法。

本发明对艾滋病与丙型肝炎病毒抗体的联合快速检测方法是，在包被于同一支持物上的载体表面设置有含艾滋病毒(HIV)抗原、丙型肝炎病毒(HCV)抗原以及高、低两种浓度的二硝基酚(DNP)内部对照成分在内的包被检测区，将被检测样品点加于所说的包被检测区所在部位一端外的载体表面处并使其向包被检测区的另一端作正向的第一次浸润或迁移扩散，至全部覆盖包被检测区后，自上述包被检测区所在部位的另一端用由缓冲液溶解的已与抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的示踪标记物质向上述被检测样品点加端作逆向的第二次浸润或迁移扩散，至再次全部覆盖上述包被检测区后，检测和比较示踪标记物质对包被检测区中各病毒抗原和对照检测成分的沉积量，得到检测判别结果。

对于上述所说的包被于支持物上的载体，可以为在生物学实验中常用的硝基纤维素膜、聚苯乙烯膜、聚乙烯膜、尼龙膜、纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃纤维膜等固体形式的载体。

上述方法中所说的用缓冲液溶解的已与抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的示踪标记物质可以包括生物学检测实验中常用的能用肉眼进行观察和判别，或者是不能由肉眼直接观察而须以相应仪器进行分析判读的各类示踪标记物质或显色性物质。这些可供使用的示踪标记物质或显色性物质，可以包括目前已有报导和使用的颗粒显色剂、发光标记物、比色标记物、荧光标记物、化学标记物、酶、放射性标记物、或射频标记物、金属胶体、化学发光标记物等多种类型。进一步以其中的颗粒显色剂为例，其又可以有胶体金颗粒(如颗粒度为16-30纳米的三羟四氯金精酸胶体金材料)、银颗粒、有机分子、脂质体或有机聚合物胶体颗粒等多种形式。使用时可以根据检测的实际需要和/或与相关的检测判读仪器设备相互适配选用。对上述使所说的示踪标记物质或显色物质在各包被检测区中由其显色情况和/或程度所表明的沉积量进行检测和分析判断，是本发明上述检测方法的关键。虽然对在各包被检测区中示踪标记或显色性物质的沉积量可以采用以肉眼直接观察的方式进行检测判别，但通过仪器或设备进行的检测和判别一般情况下显然更为客观和准确可靠。

在本发明的上述检测方法中，根据所使用的示踪标记物质或显色物质的种类和/或示踪显示特性的不同，在包被于支持物上的载体表面设置的含艾滋病毒(HIV)抗原、丙型肝炎病毒(HCV)抗原以及高、低两种浓度的二硝基酚(DNP)内部对照成分的包被检测区的方式也可以相应有所不同。例如，若将HIV、HCV及高、低两浓度DNP内部对照成分分别以不同种类或不同示踪显示特性的示踪标记或显色物质相偶合时，所说的该四种检测用的抗原和内部对照成分即可以以共同混合物的形式包被于所说载体表面的同一检测区域中；使用时只需根据其各自所偶合的示踪标记或显色物质再行或特性对这四种检测用成分分别进行各自的检测和判读，即能准确得到相应的示踪标记或显色物质分别在该四种检测用成分中的沉积量数据，用于检测结果的判断。若所说的该四种检测用成分中有两种或两种以上的成分使用的是同一种示踪标记物质或显色物质，则使用该同一示踪标记或显色物质的检测用成分显然只能通过将其分别包被在所说载体表面的不同区域，才能使其各自的沉积量能相互区别和被分别地检测和判读。其中，采用后者的示踪标记方式在实际使用中有时会显示出如有利于用肉眼直接进行观察判别操作等一定的简便性。例如，使所说的艾滋病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原以及高、低两种浓度的二硝基酚内部对照成分的包被检测区在包被于支持物上的载体表面为沿同一排布方向以保持有间隔距离的方式单独分别设置，就是在采用上述后者方式时可供选择的具体设置方式之一。

本发明上述检测方法的工作过程和原理是：将血清、血浆、全血或其它体液形式的被检测样品标本点加在所说的各包被检测区所在部位排布方向一端外的载体表面处，并使其在通常的毛细管层析作用和水平侧流扩散作用，或是以其它适当方式的作用下向各包被检测区排布方向的另一端作正向的第一次的浸润或迁移扩散，至全部覆盖各包被检测区的过程中，若被检测样品标本中含有HIV和/或HCV抗体，则其将与已在载体表面的各相应包被检测区中相应的HIV和/或HCV抗原反应，形成抗原一抗体第一免疫复合物。此时自上述各包被检测区所在部位的另一端用由适当缓冲液溶解的已与抗DNP抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的示踪标记物质向上述被检测样品点加端作逆向的第二次浸润或迁移扩散时，并同时也推动经第一次迁移扩散至此的被检测样品标本液体也向其原点加端作逆向的第二次浸润或迁移扩散，直至再次全部覆盖上述各包被检测区。在此第二次的逆向浸润或迁移扩散过程中将发生的反应有：

(1)被检测样品标本中尚未与相应包被区中的相应抗原结合的剩余抗HIV

   和/或抗HCV抗体再次相遇，继续抗原-抗体反应并再次形成上述的

   第一免疫复合物。

(2)溶解于适当缓冲液中与显色性物质相偶合的抗DNP抗体将与已包被

   于支持物上的载体表面的高、低两浓度DNP内部对照检测区中的DNP

   相遇而反应，形成供内部对照检测用的另一种抗原-抗体复合物，并

   使示踪标记或显色物质被沉积在这两个内部对照检测区中。实验表明

   在此两个内部对照检测区中示踪标记或显色物质的沉积量与被包被在

   载体上的DNP的量之间存在有线性相关关系。

(3)溶解于适当缓冲液中与示踪标记或显色物质相偶合的抗人丙种球蛋白

   抗体将与已在载体上包被的相应检测区中形成的HIV-抗HIV和/或

   HCV-抗HCV第一免疫复合物发生反应，并在该第一免疫复合物上

   形成最终的抗原-抗体-抗人丙种球蛋白抗体-示踪标记或显色物质

   的第二免疫复合物，使示踪标记或显色物质也分别沉积在已结合有HIV

   抗体和/或HCV抗体的相应检测区中而显色或以其它相应方式显示，

   从而能被相应的扫描和判读仪器或是其它适当的观察或判别方式以定

  性和/或定量地得出检测结果。

上述对被检测样品标本中抗HIV和/或抗HCV抗体的检测反应和全过程可表示为：

被检样品中的抗HIV和/或抗HCV抗体(正向第一次迁移扩散)-→与已包被的HIV和/或HCV抗原结合生成第一免疫复合物-→(逆向第二次迁移扩散)再同已与示踪标记或显色物质相偶合的抗人丙种球蛋白抗体结合生成第二免疫复合物-→示踪标记或显色物质在相应包被检测区中沉积和显色或显示-→对示踪标记或显色物质的沉积量进行检测和分析并作出检测结果判断。

在本发明的上述检测方法中，各包被检测区中的高、低两种浓度的DNP内部对照检测区的设置是必要的。由于被检测样品点加后进行的第一次浸润或迁移扩散，以及用溶解缓冲液进行的第二次浸润或迁移扩散过程，有可能会受某些因素影响而产生足以对检测结果造成干扰或影响的异常，因此设置低浓度DNP内部对照检测区并通过对其中示踪标记或显色物质的沉积量进行检测，可以用于判断该次检测实验中的浸润或迁移扩散过程是否正常，以判断该次检验是否有效。在证明了此次检测过程正常有效的基础上，通过对高浓度DNP内部对照检测区中示踪标记或显色物质的沉积量的检测，即可被用于对HIV和/或HCV检测区的检测结果进行定量性的分析和判断。例如，可通过相应的扫描或判读仪器对高浓度DNP内部对照检测区中由示踪标记或显色物质的沉积量所决定的如光密度值等检测值，与在HIV和/或HCV抗原检测区中同样由示踪标记或显色物质沉积量所表现出的该检测值间的比值或其它形式的相关关系，与预设的检测判断标准值进行对照，从而即可对被检测样品标本中的抗HIV和/或抗HCV抗体在该次检测中的结果做出阴性或阳性的准确判别。

上述方法中所说的在载体表面各包被检测区的包被形式，可以分别有点状、片状、条带状等多种形式，为有利于使所点加的被检测样品和用缓冲液溶解的已与抗DNP抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的显色性物质在相应的浸润或迁移扩散过程中能与所包被的抗原等检测用成分充分接触和反应生成抗原-抗体复合物，以采用使各包被检测区分别为与试剂进行浸润及迁移扩散的方向，或是单独分散排布的方向相垂直的条状包被带的形式为佳。

上述所说的在载体表面包被的各检测区采用在同一方向上以保持有间隔距离的方式排布的基础上，所说的包被于支持物上的载体或连同其所包被的支持物，虽然不排除可以采用各种形式，但尤以采用与各包被检测区所设置的排布方式相适应的平面条状的形式，例如，目前在生物学检测试验中常用的条形试纸或类似的平面条状结构就是可供选择的较理想形式之一。

上述包被于支持物上的载体表面的各包被检测区采用单独分别设置时，所说的HIV抗原包被检测区、HCV抗原包被检测区和高、低两种浓度DNP内部对照包被检测区在其所在设置区域中的排布顺序无需有特别的限定和要求。例如，各包被检测区的排布方式，可以采取将高、低两种浓度DNP内部对照检测区排布在检测区所在区域两端位置的形式，也可以采取以一种或两种浓度的DNP内部对照检测区位于HIV和HCV两抗原检测区之间的方式排布。

由上述内容可以理解，使被检测样品和适当的试剂溶液在所说的包被于支持物上的载体表面的各包被检测区所在部位进行正向和逆向的两次浸润或迁移扩散操作，是本发明检测方法中必不可少的。进行所说的各浸润或迁移扩散操作时，包被于支持物上的载体所处的状态一般情况下无需有特别的限定和要求。例如，所说的各次浸润或迁移扩散过程的操作可以在处于垂直或斜置状态的载体表面进行，必要时还可以在进行正向和逆向的两次浸润或迁移扩散时根据需要对载体所处的状态进行调整或调换；也可以使所说的浸润或迁移扩散过程的操作为在呈水平状态的包被于支持物上的载体上进行的方式，并且以采用后者的水平方式较好而方便，更有利于检测中载体表面上的试剂以通常的毛细管层析作用和水平侧流扩散过程的进行。检测时，包被有载体及在其上已包被有各检测区的支持物可以被置放于相应的试纸盒或其它适当形式的置放或承托定位容器中进行操作。

在上述所说的载体上对艾滋病毒抗原检测区、丙型肝炎病毒抗原检测区、以及高、低两种浓度的DNP内部对照检测区包被时所用的缓冲液，可以为目前生物学试验中常用的pH7.0-7.5含有10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐和1m MEDTA的Tris缓冲液，也可以为pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.02％氯化钾、0.8％氯化钠、0.02％磷酸氢二钾和0.215％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液中的一种。对HIV抗原检测区和HCV抗原检测区进行包被时所用的抗原浓度和/或包被量，可以根据检测反应、检测仪器和设备的需要及其它具体情况，由相应的适用性筛选试验确定。例如，包被HIV抗原检测区和HCV抗原检测区时，可以由已溶解于上述两种缓冲液之一的HIV和HCV抗原溶液，用上述缓冲液将相应抗原分别稀释成0.1-1毫克/毫升的浓度后，按0.5-1微升/厘米的量进行包被。包被高、低两种浓度的DNP内部对照检测区时，可以用上述的缓冲液将DNP稀释成浓度分别为3-4毫克/毫升和1-2毫克/毫升后，再按0.5-1微升/厘米的量进行包被。

上述方法中所说的作逆向第二次浸润或迁移扩散所用的溶解缓冲液，一般也可根据需要和实际情况，按照本领域中的常规方式经适当的适用性试验筛选确定。例如，在pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.2％氯化钾、8％氯化钠、0.2％磷酸氢二钾和2.15％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液中还含有重量/体积比为0.1％酪蛋白、1％小牛血清白蛋白、0.1％叠氮钠及体积比为1％的吐温-20和2毫摩尔EDTA组成的磷酸盐缓冲液，是可供选择使用的溶解缓冲液方案之一。

在本发明的上述检测方法中，点加被检测样品的操作，虽无必要将直接把被检测样品标本点加在所说的样品点加部位处的载体表面的方式排除在外，但建议采用的方式是在已覆盖于该被检测样品点加部位处并用封闭缓冲液作过封闭处理的醋酸纤维素膜等具有较强吸水性能的纤维素膜材料的样品吸收垫片上进行。这里所说的封闭缓冲液可以为在pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.02％氯化钾、0.8％氯化钠、0.02％磷酸氢二钾和0.215％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液中，还含有重量/体积比为1％小牛血清白蛋白、1％Triton X-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1-2％蔗糖和2毫克/毫升兔丙种球蛋白组成的封闭缓冲液。

同样，用由缓冲液溶解的已与抗DNP抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的示踪标记或显色物质向被检测样品点加端作逆向的第二次浸润或迁移扩散的操作，虽可以采取将所说的试剂溶液直接施加在所说的各包被检测区所在部位另一端部位处的载体表面的方式，但更好的是建议以采用在设置于所说的各包被检测区所在部位另一端部位处并用已与抗DNP抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的示踪标记或显色物质在玻璃纤维膜介质材料体表面进行包被的化学偶合物垫片上加入用于溶解和释放已包被于其上的与抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的示踪标记或显色物质的溶解缓冲液的方式。例如，采用将分别已用三羟四氯金精酸胶体金材料显色物质偶合标记的颗粒度为16-30纳米的抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体分别均用在pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.11％氯化钾、4.4％氯化钠、0.11％磷酸氢二钾和1.18％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液中还含有重量/体积比为0.05％酪蛋白、1％小牛血清白蛋白、0.1％叠氮钠及体积比为0.5％的吐温-20和2mM EDTA所组成的缓冲液溶解并稀释成浓度为0.5-2毫克/毫升后，按5-10微升/厘米的量进行包被，是可供选择的方式之一。

在上述所说的用于偶合标记抗人丙种球蛋白抗体显色物质的抗人丙种球蛋白抗体中，一般可采用常用的兔抗人丙种球蛋白抗体，也可以采用鼠抗人丙种球蛋白抗体或羊抗人丙种球蛋白抗体，以及其它生物种或细胞株所产生的其它形式的抗人丙种球蛋白抗体。根据其不同的活性指标，使用时包被用的抗人丙种球蛋白抗体的终浓度一般可控制在1-50微克/毫升范围内。

以制备包被用的胶体金抗体偶合物为例，其中所用三羟四氯金精酸胶体金材料的制备，可以将三羟四氯金精酸颗粒用超纯水配制成100微克/毫升的溶液并加热至沸腾后，再加入1％枸橼酸三钠至枸橼酸三钠的终浓度为130微克/毫升继续加热并保持沸腾5分钟，在室温下搅拌冷却至45℃后经滤孔孔径为0.2微米的介质过滤，再将所得到的胶体金颗粒用200毫摩尔的常用碳酸盐调至pH7.0。然后再取浓度分别均为1毫克/毫升的兔抗DNP及兔(或鼠、羊等其它种类)抗人抗体，分别用滤孔孔径为0.2微米(μm)的介质过滤后，在室温搅拌下加入上述的胶体金溶液，使兔抗DNP终浓度为2.5微克/毫升，兔(或鼠、羊等其它种类)抗人抗体的终浓度为1-50微克/毫升，并以充分搅拌等方式使胶体金与抗体蛋白充分吸附后，在搅拌下加入用滤孔孔径为0.2微米的介质过滤的小牛血清白蛋白至终浓度为2微克/毫升，超速离心后的沉淀物用含有分子量为20,000、重量/体积比为1％聚乙二醇(PEG)的pH9.0和浓度为2mM的硼酸盐缓冲液至少洗涤一次，洗涤后的离心沉淀物以1％浓度(w/v)悬浮于其原体积量的硼酸盐缓冲液中，用滤孔孔径为0.2微米的介质过滤，用测定其520纳米波长的光密度值OD520的方法或其它的适当方式计算溶液中抗体-胶体金标记物的量。

这里所说的化学偶合物垫片所用的玻璃纤维膜介质材料体，最好在包被已与抗DNP抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的显色物质前已用pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.02％氯化钾、0.8％氯化钠、0.02％磷酸氢二钾和0.215％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液中还含有重量/体积比为1％小牛血清白蛋白、1％Triton X-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1-2％蔗糖和2毫克/毫升兔丙种球蛋白组成的封闭缓冲液进行过封闭处理，以避免可能存在的杂质对检测结果产生不必要的干扰。

上述所说对化学偶合物垫片所用的玻璃纤维膜介质材料体用封闭缓冲液作封闭处理时，将被处理的玻璃纤维膜介质材料体用封闭缓冲液浸透后，平铺在网格型支持物上37℃烘干，是可以供选择采用的处理方式之一。当然这并不意味着排除也可以采用现在生物学试验中对载体材料进行封闭处理中常用的其它适当方式进行封闭处理。

在所说的采用上述在覆盖于该化学偶合物垫片上加入溶解缓冲液形式的基础上，还可以进一步采取在已覆盖于该化学偶合物垫片上并也已用封闭缓冲液作过封闭处理的如醋酸纤维素膜或其它具有较强吸水性能的常用纤维素膜材料形式的缓冲液吸收垫片上的方式进行。以在pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.02％氯化钾、0.8％氯化钠、0.02％磷酸氢二钾和0.215％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液中还含有重量/体积比为1％小牛血清白蛋白、1％Triton X-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1-2％蔗糖和2毫克/毫升兔丙种球蛋白组成的封闭缓冲液，是在作封闭处理时可供选则的封闭缓冲液形式之一。

在本发明上述方法的操作过程中，被检测样品标本点加后，以及在包被于支持物上的载体表面进行正向和逆向的两次浸润或迁移扩散后，含有被检测样品成分的液体有不同程度的溢出是难以避免的。为避免其外溢对检测环境及有关的仪器设备等的污染，可以在所说的与各包被检测区所在部位相反的被检测样品点加部位另一方向的载体部位处，设置有用于吸收在浸润或迁移扩散过程中溢出液体的液体吸收材料，如常用的具有液体吸收作用的试纸或其它具有液体吸收能力的适当材料即可。

大量的实验结果表明，采用本发明的上述方法对于血清、血浆、全血或其它体液形式的常用被检测样品的标本进行HIV和HCV两种病毒抗体的同步联合检测，一般在15分钟以内，最快仅需几分钟即可分别得到相应的检测结果，不仅对于同时含有HIV和HCV两种病毒抗体的样品可以同时得到相应的检测结果外，对于只含有HIV或HCV中的一种病毒的被检测样品同样可以准确地区分并对所含的该病毒抗体给出相应的单项检测结果。

以下结合适当的附图，通过具体的操作和检测实例对本发明上述方法的内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述主题所实现的同样技术均应属于本发明的范围。

图1是可在本发明方法使用的一种试纸条形式的包被有载体的支持物的结构示意。

图2是显示有设置在图1试纸条的载体表面各包被检测区可采用的一种排布形式的示意图。

如图所示的试纸条中，在平面条状支持物1的一侧表面包被有硝基纤维素膜6形式的载体，在该硝基纤维素膜6表面的一端以与其呈T形状态设置的由具有液体吸收功能的新华48号滤纸材料制成的液体吸收垫片2；在与之相对的硝基纤维素膜6表面的另一端设置有在已作过预封闭处理的玻璃纤维膜表面用与抗DNP抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的胶体金颗粒进行包被所制成的化学偶合物垫片9，其上还覆盖有也已用封闭缓冲液作过封闭处理的醋酸纤维素膜缓冲液吸收垫片10。在液体吸收垫片2和化学偶合物垫片9之间靠近液体吸收垫片2的部位处，以与其保持有间隔距离的方式设置有也已用封闭缓冲液作过封闭处理的醋酸纤维素膜样品吸收垫片3。在该样品吸收垫片3与化学偶合物垫片9之间的硝基纤维素膜6表面区域中，沿该条状支持物1的长度方向以保持有间隔距离和垂直横贯硝基纤维素膜6宽度的方式依次设置有条状的高浓度DNP内部对照检测区包被带4、HIV抗原检测区包被带5、低浓度DNP内部对照检测区包被带7和HCV抗原检测区包被带8。

上述对HIV抗原检测区包被带5和HCV抗原检测区包被带8的包被，采用将已溶于pH7.0-7.5的含有10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐和1mM EDTA的Tris缓冲液中供检测用的HIV和HCV两种标准抗原溶液，分别用由重量/体积比组成为0.02％氯化钾、0.8％氯化钠、0.02％磷酸氢二钾和0.215％磷酸氢二钠的pH7.0磷酸盐(PBS)缓冲液稀释成HIV抗原浓度为0.5毫克/毫升和HCV抗原浓度为0.25毫克/毫升的抗原溶液后，分别按0.75微升/厘米的量进行包被；对高浓度的DNP内部对照检测区包被带4和低浓度的DNP内部对照检测区包被带7的包被，采用将已溶于pH7.0-7.5的PBS缓冲液的DNP溶液，用与稀释HIV/HCV相同的PBS缓冲液分别稀释成3.0毫克/毫升(高浓度)和1.0毫克/毫升(低浓度)溶液后，同样分别按0.75微升/厘米的量进行包被。

制备所用的与抗DNP抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的胶体金颗粒在玻璃纤维膜介质材料体表面进行包被所成的化学偶合物垫片9的方式是：

(1)预封闭化学偶合物垫片

将玻璃纤维膜介质材料体用在pH7.0且重量/体积比组成为0.02％氯化钾、0.8％氯化钠、0.02％磷酸氢二钾和0.215％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液中还含有重量/体积比为1％小牛血清白蛋白、1％TritonX-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1.5％蔗糖和2毫克/毫升兔丙种球蛋白所组成的封闭缓冲液浸透后，平铺在网格型支持物上37℃烘干。

(2)制备胶体金颗粒

将三羟四氯金精酸胶体金颗粒用超纯水配制成100微克/毫升的溶液并加热至沸腾后，再加入1％枸橼酸三钠至枸橼酸三钠的终浓度为130微克/毫升，继续加热并保持沸腾5分钟，在室温下搅拌冷却至45℃后经滤孔孔径为0.2微米的滤器过滤，并将已制备的30纳米的胶体金颗粒用200毫摩尔的常用碳酸盐调至pH7.0。再取浓度分别均为1毫克/毫升的兔抗DNP及兔抗人抗体，分别用滤孔孔径为0.2微米的滤器过滤。在室温搅拌下加入胶体金溶液，使兔抗DNP终浓度为2.5微克/毫升，兔抗人抗体的浓度为10微克/毫升。室温搅拌10分钟，使胶体金与抗体蛋白充分吸附。然后搅拌下加入用孔径为0.2微米的滤膜过滤的小牛血清白蛋白至终浓度为2微克/毫升，并于室温搅拌30分钟。然后于15℃用13,000转/分超速离心30分钟。沉淀物加入与其离心处理前原体积量相等的pH9.0，浓度为2mM的硼酸盐缓冲液(含1％(w/v)聚乙二醇(PEG)，分子量20,000)悬浮，然后用同样方法再作离心处理，进行洗涤后，再以上述1/2体积量的同样硼酸盐缓冲液用同样的方法作一次洗涤。最后离心得到的沉淀物以1％浓度(w/v)悬浮于其原体积量的硼酸盐缓冲液，用孔径为0.2微米(μm)的滤器过滤，然后用测定其520纳米波长处的光密度值OD₅₂₀的方式计算溶液中抗体-胶体金标记物的量，于4℃保存。

(3)制备胶体金抗体包被的化学偶合物垫片

用于偶合标记抗DNP抗体和抗人丙种球蛋白抗体的颗粒度分别均为16纳米(或30纳米)。将均已溶解于重量/体积比浓度为上述包被各检测区带所用PBS缓冲液5.5倍的PBS缓冲液的抗DNP抗体和抗人丙种球蛋白抗体，以在该溶解用的缓冲液中还含有重量/体积比例为0.05％酪蛋白、1％小牛血清白蛋白、0.1％叠氮钠及体积比为0.5％的吐温-20和2mM EDTA组成的混合形式的包被缓冲液稀释成抗DNP抗体和抗人丙种球蛋白抗体的量分别均为1毫克/毫升的抗原溶液后，按0.75微升/厘米的量进行包被后，于37℃干燥1小时，密闭备用。

上述缓冲液吸收垫片10和样品吸收垫片3的制备，均为将醋酸纤维膜用与上述对化学偶合物垫片9作预封闭处理所用的相同封闭缓冲液浸湿后，37℃干燥2小时。

将上述试纸条置于在与其样品吸收垫片3、缓冲液吸收垫片10及各包被检测带所在区域位置相对应的部位开设有适当形式和大小的加样口和检测观察口等操作窗口且呈水平状放置的相应试纸盒中使用。

检测时，先将被检测样品的标本点加在样品吸收垫片3上，使其向各包被检测区排布方向的另一端作正向的第一次毛细管层析作用浸润扩散，至全部覆盖各包被检测区后，再向缓冲液吸收垫片10上加入由在pH7.0且重量/体积比组成为0.2％氯化钾、8％氯化钠、0.2％磷酸氢二钾和2.15％磷酸氢二钠的10倍浓缩形式的磷酸磷酸盐缓冲液中还含有重量/体积比为0.1％酪蛋白、1％小牛血清白蛋白、0.1％叠氮钠及体积比为1％的吐温-20和2毫摩尔EDTA组成的磷酸盐缓冲液，使其溶解和释放包被在化学偶合物垫片9上的已与抗DNP抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的胶体金颗粒，并使其向样品吸收垫片3端作逆向的第二次毛细管层析作用浸润扩散，至再次全部覆盖上述各包被检测区。然后用相应的检测仪器对在各包被检测区中由胶体金的显色所表明的其沉积量进行自动扫描读取检测。由低浓度DNP内部对照检测区带7的检测结果与保证实验有效性的最低预置值进行比较，以确定本次检测过程及其结果是否有效。然后用由同一仪器读取的HIV抗原和HCV抗原包被检测区带的光密度值(Dr)与对高浓度DNP内部对照检测区带4读取的光密度值(Dr)之比值作为相对光密度的信号值，并将其与预设背景噪声值间的信/噪比，参考或对照经实验设定的判断标准得出被检测样品标本在该次检测实验中为阴性或阳性的检测判断结果。

以上述的试纸和操作方法，分别进行了以下各项检测实验。实验结果可以证明本发明检测方法对HIV和HCV两种病毒检测的特异性、灵敏性和精密性。

检测实例1

由中国药品与生物制品检定所提供国家医药管理局判断酶联免疫法(EIA)HIV诊断试剂的质量检定标准品。用该所提供的参比血清进行检定应复合以下标准：

(1)特异性：对20份阴性参比血清检测，假阳性结果不得超出1份；

(2)灵敏度：对20份阳性强度不等的Ⅰ型或Ⅱ型HIV抗体参比血清进行

   检测，不得出现假阴性；

(3)精密性：用精确度测参比血清是(n=10)，其测定的信/噪比(S/CO)

   值之百分变异系数(％CV)应＜15％。

用上述本发明的方法对批号为9911的上述参比血清进行的检测实验结果如下：

对20份HIV阳性参比血清的检测实验结果如表1所示。此结果显示本发明方法的检测结果也阳性，表明符合国家标准品对灵敏度的检定要求。

对20份HIV阴性参比血清的检测结果如表2所示。此结果中，除第3号外其余全部为阴性，符合国家标准品对特异性的检定要求。其中第3号呈现可疑阳性。

第18号标准品为精密性实验标准品，连续用10份上述的试纸条检测，结果如表3所示。此结果显示：信/噪比值之百分变异系数为6.5％，符合国家标准品对精密性的要求。

表1  对国家标准品HIV阳性参比血清的灵敏度检测实验结果

实验号	信/噪比	结果	实验号	信/噪比	结果
						1	6.11	(+)	11	5.07	(+)
2	2.41	(+)	12	5.46	(+)
						3	4.22	(+)	13	1.07	(+)
4	4.67	(+)	14	17.85	(+)
						5	5.27	(+)	15	16.79	(+)
6	4.48	(+)	16	11.08	(+)
						7	2.95	(+)	17	2.86	(+)
8	6.08	(+)	18	3.36	(+)
						9	1.02	(+)	19	22.37	(+)
10	3.60	(+)	20	24.54	(+)

表2  对国家标准品HIV阴性参比血清的特异性检测实验结果

实验号	信/噪比	结果	实验号	信/噪比	结果
						1	0.00	(-)	11	0.00	(-)
2	0.00	(-)	12	0.00	(-)
						3	0.89	(+/-)	13	0.00	(-)
4	0.00	(-)	14	0.07	(-)
						5	0.00	(-)	15	0.00	(-)
6	0.00	(-)	16	0.62	(-)
						7	0.00	(-)	17	0.00	(-)
8	0.51	(-)
						9	0.00	(-)
10	0.00	(-)

表3  对国家标准品HIV第18号标准品阳性参比血清精密度检测实验结果

实验号	信/噪比	结果	实验号	信/噪比	结果
						1	3.36	(+)	6	3.20	(+)
2	4.41	(+)	7	3.54	(+)
						3	4.25	(+)	8	2.96	(+)
4	3.62	(+)	9	3.68	(+)
						5	3.14	(+)	10	2.71	(+)

检测实例2

由中国药品与生物制品检定所提供国家医药管理局判断酶联免疫法(EIA)HCV诊断试剂的质量检定标准品。用该所提供的参比血清进行检定应复合以下标准：

(1)特异性：对40份阴性参比血清检测，假阳性结果不得超出1份；

(2)灵敏度：对40份阳性参比血清进行检测，假阴性不得超出2份。

用上述本发明的方法对参比血清进行的检测实验结果如下：

灵敏度检测实验结果如表4所示。此结果中除第38号和第40号阳性参比血清外，38/40份阳性血清经本发明方法检出阳性，符合国家标准品对灵敏度的要求。

特异性检测实验结果如表5所示。此结果中除第18号阴性参比血清外，39/40份阳性血清经本发明方法检出阴性，符合国家标准品对特异性的要求。

表4  对国家标准品HCV阳性参比血清的灵敏度检测实验结果

实验号	信/噪比	结果	实验号	信/噪比	结果
						1	2.59	(+)	21	1.74	(+)
2	3.19	(+)	22	2.24	(+)
						3	2.31	(+)	23	1.93	(+)
4	2.33	(+)	24	1.82	(+)
						5	2.12	(+)	25	1.98	(+)
6	1.74	(+)	26	2.54	(+)
						7	1.99	(+)	27	2.17	(+)
8	2.42	(+)	28	1.46	(+)
						9	2.26	(+)	29	1.74	(+)
10	1.72	(+)	30	2.35	(+)
						11	1.18	(+)	31	1.25	(+)
12	1.33	(+)	32	2.35	(+)
						13	2.21	(+)	33	1.62	(+)
14	2.19	(+)	34	2.72	(+)
						15	2.22	(+)	35	1.45	(+)
16	1.26	(+)	36	1.78	(+)
						17	1.33	(+)	37	1.06	(+)
18	2.04	(+)	38	0.26	(-)
						19	1.41	(+)	39	2.08	(+)
20	2.79	(+)	40	0.90	(-)

表5  对国家标准品HCV阴性参比血清的特异性检测实验结果

实验号	信/噪比	结果	实验号	信/噪比	结果
						1	0.34	(-)	21	0.56	(-)
2	0.33	(-)	22	0.62	(-)
						3	0.13	(-)	23	0.15	(-)
4	0.34	(-)	24	0.13	(-)
						5	0.17	(-)	25	0.16	(-)
6	0.14	(-)	26	0.13	(-)
						7	0.08	(-)	27	0.20	(-)
8	0.28	(-)	28	0.28	(-)
						9	0.21	(-)	29	0.55	(-)
10	0.42	(-)	30	0.13	(-)
						11	0.37	(-)	31	0.32	(-)
12	0.09	(-)	32	0.54	(-)
						13	0.10	(-)	33	0.18	(-)
14	0.45	(-)	34	0.10	(-)
						15	0.07	(-)	35	0.22	(-)
16	0.14	(-)	36	0.54	(-)
						17	0.41	(-)	37	0.21	(-)
18	1.04	(+)	38	0.63	(-)
						19	0.20	(-)	39	0.13	(-)
20	0.28	(-)	40	0.14	(-)

检测实例3

将三份已知HIV单项阳性血清(实验标本号分别为106-1,106-3,106-8)各40微升，分别均自上述试纸盒的被检样品加样口点加在样品吸收垫片3上，待其正向第一次迁移扩散完成后，再自缓冲液加样口在缓冲液吸收垫片10上加入150微升用于溶解和释放已包被于化学偶合物垫片9上已与抗DNP抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的胶体金颗粒的溶解缓冲液，使其完成逆向的第二次迁移扩散。作第二次迁移扩散的同时，室温下孵育15分钟，然后用相应的仪器对试纸条中相应包被检测带中的由胶体金显色状况所表明的沉积量进行自动扫描读取和分析，给出检测结果。对此三份已知HIV单项阳性血清的检测，同时还用Abbott两种酶联免疫法及其它三种快速HIV检测法的结果进行比较，并以蛋白印迹法(Western Blot)作为权威方法进行验证。检测实验结果如表6所示。此实验结果表明：上述三份已知HIV单项阳性血清经本发明方法检测均为阳性，且其灵敏度与Abbott酶联免疫法相等，可检出HIV-Ⅰ型及HIV-Ⅱ型，优于其它三种快速HIV检测试纸(分别为Orgenics,Murex SUDS和Trinity)，与Ortho的蛋白印迹法(Western Blot)结果相符。

表6  已知HIV单项阳性血清检测实验结果

标本号	酶联免疫法(EIA)				快速检测方法					Ortho/CBC蛋白印迹法
											AbbottHIV-1/2		AbbottHIV-1		本发明HIV-1/2		Ofgenics	Murex	Trinity
	信/噪比	结果	信/噪比	结果	信/噪比	结果	HIV-1/2	HIV-1	HIV											HIV-1
										106-1	7.5	(+++)	8.7	(+++)	1.46	(++)	(+++)	(++)	(+)		p24,GP160
106-3	2	(+)	7.3	(+++)	2.18	(+++)	(+)	(-)	(-)											p24,GP160
										106-8	15.7	(++++)	2.9	(+)	1.97	(+++)	(-)	(+++)	(-)		P24

检测实例4

取HCV单项阳性血清(实验标本号分别为B1l和B40)各40微升，用上述检测实例3的同样方法操作，并分别与Ortho的HCV3.O酶联免疫法及RIBA检测法的结果进行比较。检测实验结果如表7所示。表7结果显示：本发明检测方法可检出HCV单项阳性的标本，与Ortho的HCV3.O酶联免疫法检测结果一致；甚至对RIBA显示仅单项C22强阳性的B11号标本，在本发明的上述检测试纸中也显示了强阳性的结果。

表7  HCV单项阳性血清检测实验结果

标本号	Ortho的HCV 3.0酶联免疫法		RIBA的HCV 3.0						本发明方法
											信/噪比	结果	c100P	c33c	c22p	NS5	SOD	结果	信/噪比	结果
	B11	1.18	(+)	(-)	(+/-)	(+++)	(-)	(-)	c22(+)	3.00											(+++)
B40											5.10	(+++)	(+/-)	(++)	(-)	(++)	(-)	(++)	2.02	(++)

Claims (21)

1．对艾滋病与丙型肝炎病毒抗体的联合快速检测方法，其特征在于在同一包被于支持物上的载体表面设置有含艾滋病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原以及高、低两种浓度的二硝基酚内部对照成分在内的包被检测区，将被检测样品点加于所说的包被检测区所在部位一端外的载体表面处并使其向包被检测区的另一端作正向的第一次浸润或迁移扩散，至全部覆盖包被检测区后，自上述包被检测区所在部位的另一端用由缓冲液溶解的已与抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的示踪标记物质向上述被检测样品点加端作逆向的第二次浸润或迁移扩散，至再次全部覆盖上述包被检测区后，检测和比较示踪标记物质对包被检测区中各检测成分的沉积量，得到检测判别结果。

2．如权利要求1所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的包被于支持物上的载体为硝基纤维素膜。

3．如权利要求1所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的用缓冲液溶解的已与抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的示踪标记物质为显色性物质。

4．如权利要求1所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的艾滋病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原以及高、低两种浓度的二硝基酚内部对照成分的包被检测区为在包被于支持物上的载体表面沿同一排布方向以保持有间隔距离的方式单独分别设置的形式。

5．如权利要求4所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的包被有载体的支持物为与其上设置的各包被检测区排布方向一致的平面条状形式。

6．如权利要求4所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的各包被检测区分别为与其排布方向相垂直的条状包被带形式。

7．如权利要求1所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的各浸润或迁移扩散过程均在呈水平置放状态的包被于支持物上的载体上进行。

8．如权利要求1至7之一所述的联合快速检测方法，其特征在于在所说的载体上对艾滋病毒抗原检测区、丙型肝炎病毒抗原检测区的包被为以pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.02％氯化钾、0.8％氯化钠、0.02％磷酸氢二钾和0.215％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液将相应抗原分别稀释成抗原浓度为0.1-1毫克/毫升后，按0.5-1微升/厘米的量进行包被。

9．如权利要求1至7之一所述的联合快速检测方法，其特征在于在所说的载体上对高、低两种浓度的二硝基酚内部对照检测区的包被为以pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.02％氯化钾、0.8％氯化钠、0.02％磷酸氢二钾和0.215％磷酸氢二钠的的磷酸盐缓冲液将二硝基酚分别稀释成3-4毫克/毫升和1-2毫克/毫升浓度后，按0.5-1微升/厘米的量进行包被。

10．如权利要求1至7之一所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的用由缓冲液溶解的已与抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的显色性物质向被检测样品点加端作逆向的第二次浸润或迁移扩散时，采用向设置于所说的各包被检测区所在部位的另一端部位处并用已与抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的显色物质在玻璃纤维膜介质材料体表面进行包被所成的化学偶合物垫片上加入用于溶解和释放已包被于其上的与抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的显色物质的溶解缓冲液的方式。

11．如权利要求10所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的化学偶合物垫片所用的玻璃纤维膜介质材料体在包被已与抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体相偶合的显色物质前已用在pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.02％氯化钾、0.8％氯化钠、0.02％磷酸氢二钾和0.215％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液中还含有重量/体积比为1％小牛血清白蛋白、1％Triton X-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1-2％蔗糖和2毫克/毫升兔丙种球蛋白所组成的封闭缓冲液进行过封闭处理。

12．如权利要求11所述的联合快速检测方法，其特征在于对所说的化学偶合物垫片所用的玻璃纤维膜介质材料体用封闭缓冲液作封闭处理的方法是将被处理的玻璃纤维膜介质材料体用所说的封闭缓冲液浸透后，平铺在网格形式的支持物上37℃烘干。

13．如权利要求10所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的向化学偶合物垫片上加入溶解缓冲液的操作采用在覆盖于该化学偶合物垫片上并已用封闭缓冲液作过封闭处理的吸水性纤维素膜材料的缓冲液吸收垫片上进行，所用的封闭缓冲液为在pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.02％氯化钾、0.8％氯化钠、0.02％磷酸氢二钾和0.215％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液中还含有重量/体积比为1％小牛血清白蛋白、1％Triton X-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1-2％蔗糖和2毫克/毫升兔丙种球蛋白所组成的封闭缓冲液。

14．如权利要求13所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的覆盖于化学偶合物垫片上的吸水性纤维素膜材料缓冲液吸收垫片为醋酸纤维素膜。

15．如权利要求1至7之一所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的作逆向第二次浸润或迁移扩散所用的溶解缓冲液为在pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.2％氯化钾、8％氯化钠、0.2％磷酸氢二钾和2.15％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液中还含有重量/体积比为0.1％酪蛋白、1％小牛血清白蛋白、0.1％叠氮钠及体积比为1％的吐温-20和2毫摩尔EDTA所组成的磷酸盐缓冲液。

16．如权利要求1至7之一所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的用于偶合标记抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体的显色物质为颗粒度为16-30纳米的三羟四氯金精酸胶体金材料。

17．如权利要求1至7之一所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的用于偶合标记抗人丙种球蛋白抗体显色物质的抗人丙种球蛋白抗体为兔抗人丙种球蛋白抗体。

18．如权利要求10所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的化学偶合物垫片的包被采用将分别已用三羟四氯金精酸胶体金材料显色物质偶合标记的颗粒度为16-30纳米的抗二硝基酚抗体和抗人丙种球蛋白抗体分别均用在pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.11％氯化钾、4.4％氯化钠、0.11％磷酸氢二钾和1.18％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液中还含有重量/体积比为0.05％酪蛋白、1％小牛血清白蛋白、0.1％叠氮钠及体积比为0.5％的吐温-20和2mM EDTA所组成的缓冲液溶解并稀释成浓度为0.5-2毫克/毫升后，按5-10微升/厘米的量进行包被。

19．如权利要求18所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的在偶合物垫片上包被的胶体金抗体偶合物，所用的三羟四氯金精酸胶体金材料为先将三羟四氯金精酸颗粒用超纯水配制成100微克/毫升的溶液并加热至沸腾后，再加入1％枸橼酸三钠至枸橼酸三钠终浓度为130微克/毫升，继续加热并保持沸腾5分钟，在室温下搅拌冷却至低于45℃，经滤孔孔径为0.2微米的介质过滤后，再将得到的胶体金颗粒用200毫摩尔的碳酸盐调至pH7.0，再取分别经滤孔孔径为0.2微米的介质过滤且浓度分别均为1毫克/毫升的兔抗DNP及兔抗人抗体，在室温搅拌下加入该胶体金溶液，使兔抗DNP的终浓度为2.5微克/毫升，兔抗人抗体的终浓度为1-50微克/毫升，使胶体金与抗体蛋白充分吸附后的溶液在搅拌下再加入经孔径为0.2微米的介质过滤的小牛血清白蛋白至其终浓度为2微克/毫升，经超速离心分离后对沉淀物用含有分子量为20,000及重量/体积比为1％聚乙二醇的pH9.0且浓度为2mM的硼酸盐缓冲液至少洗涤一次，洗涤后的离心沉淀物以1％重量/体积浓度悬浮于其原体积量的硼酸盐缓冲液后，再用孔径为0.2微米的介质过滤，测定并计算其抗体-胶体金标记物的含量。

20．如权利要求1至7之一所述的联合快速检测方法，其特征在于所说的点加被检测样品的操作采用在已覆盖于该被检测样品点加部位处并用封闭缓冲液作过封闭处理的吸水性纤维素膜材料的样品吸收垫片上进行，所用的封闭缓冲液为在pH7.0-7.5且重量/体积比组成为0.02％氯化钾、0.8％氯化钠、0.02％磷酸氢二钾和0.215％磷酸氢二钠的磷酸盐缓冲液中还含有重量/体积比为1％小牛血清白蛋白、1％Triton X-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1-2％蔗糖和2毫克/毫升兔丙种球蛋白组成的封闭缓冲液。

21．如权利要求1至7之一所述的联合快速检测方法，其特征在于在所说的与各包被检测区所在部位相反的被检测样品点加部位另一方向的载体部位处设置有用于吸收在浸润或迁移扩散过程中溢出液体的液体吸收材料。

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