WO2015172689A1 - 一种免疫层析检测试纸及检测方法 - Google Patents

一种免疫层析检测试纸及检测方法 Download PDF

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WO2015172689A1
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    • G01N2333/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]

Definitions

  • the present invention relates to the field of in vitro diagnostic reagents, and more particularly to an immunochromatographic test strip and a test method.
  • FIG. 1 shows the structure of immunochromatographic test strips in the prior art, as shown in Figure 1, including samples. a mat 4, a conjugate release pad 5, a reaction membrane 2, an absorbent pad 3, and a backing 1.
  • the reaction membrane 2 includes a detection zone T and a control zone C, the principle of which is to immobilize a specific antibody on the reaction membrane 2 first.
  • the sample pad 4 of the test paper is immersed in the sample to be inspected, the sample to be tested will move forward along the film due to capillary action, and when moving to the region where the antibody is immobilized, the corresponding antigen in the sample to be tested is generated with the antibody.
  • Specific binding if the immunocolloidal gold can be used to display a certain color in the area, thus achieving a specific immunological diagnosis.
  • Immunochromatography techniques generally include a double antibody sandwich method, an indirect method, and a competitive inhibition method.
  • the double antibody sandwich method which is a non-competitive binding assay, is suitable for detecting multivalent antigens having at least two antigenic determinants in a molecule.
  • the basic working principle is as follows: The antibody and the labeled antibody attached to the reaction membrane 2 are respectively combined with two antigenic determinants on the detected antigen molecule in the sample to be tested to form a labeled antibody-antigen-solid phase antibody immune complex.
  • the indirect method is a non-competitive binding assay.
  • the principle is that the antigen is solidified in the reaction membrane 2, and the antibody to be tested is first bound to the labeling molecule to form a complex, and then combined with the antigen on the reaction membrane 2 to form a labeling molecule - the antibody-antigen complex to be detected.
  • the basic principle is that the test antigen in the sample to be tested and the coated antigen of the solid phase compete for binding with the labeled antibody.
  • the labeled antibody is It does not bind to the solid phase coating antigen; if there is no antigen in the sample to be tested, the labeled antibody binds directly to the solid phase coating antigen.
  • the immunochromatographic test paper technology mainly represented by colloidal gold test paper has been widely used in various aspects of immunoassay, and the technique mainly fixes specific antibodies or antigens on the reaction membrane 2 in a strip shape. Detection The color development result of a strip-shaped detection line 8 of the region T is qualitatively analyzed, and the color development results of the plurality of strip-shaped detection lines 8 are subjected to semi-quantitative and quantitative detection.
  • each test line 8 on the test strip can only provide one type of detection information, and increasing the number of detection lines 8 in a certain area may cause confusion or even interpretation of the identification.
  • the invention patent No. 201210200364.5 discloses a colloidal gold immunochromatographic quantitative test strip and a detection method thereof, and at least three detection lines on the detection zone are passed through a plurality of detection lines and the quantification of the sample to be detected. Combining and detecting, quantitative detection of the sample to be tested is achieved. However, the immune response between the detection lines arranged side by side may constitute interference, which is not conducive to accurate determination of results. .
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide an immunochromatographic test strip and a detection method, which solve the problem of interference between a plurality of detection lines in the existing immunochromatographic detection method, and incapable of accurately determining the result.
  • the technical solution of the present invention to solve the above problems lies in: providing an immunochromatographic test strip comprising a sample pad, a conjugate release pad, a reaction film, an absorption pad, a backing, and the sample liquid to be tested is along the capillary
  • the reaction film moves, the reaction film includes a detection area and a quality control area, and the quality control area is provided with a quality control line or a quality control point, and the detection area is provided with 2 to 30 mutually independent detection points and the detection points There is a certain distance between them, wherein at least two detection points are spaced apart by a certain distance in the vertical direction of the moving direction of the sample liquid to be tested; the detection points are coated with antibodies or antigens.
  • the shape of the detection point is at least one of a dot, a polygon, a card-pass pattern, or a combination of several.
  • the type and content of the antibody or antigen coated in the detection point, and the number of the detection points are determined according to the object to be detected in the sample to be examined.
  • the immunochromatographic reaction between the target to be detected and the antibody or antigen coated in the detection site includes a double antibody sandwich method, an indirect method, and a competitive inhibition method. .
  • the conjugate release pad is provided with a target to be inspected a specificity-specific label; wherein the labeling method of the specific label comprises a quantum dot labeling method, a colloidal gold labeling method, a colloidal selenium labeling method, a colored or fluorescent latex labeling method, and a magnetic particle labeling method.
  • the present invention also provides an immunochromatographic detection method for qualitative, semi-quantitative or quantitative detection of a sample to be tested using the immunochromatographic test strip according to any of the preceding items.
  • the sample to be tested includes blood or body fluid, urine, saliva, genital tract secretion or other liquid sample or viscous sample from clinical or non-clinical.
  • a sample to be inspected is added to the sample pad, and after the immunochromatographic reaction is completed, the waiting for the sample to be inspected is first determined according to the color development of the detection point. Inspection target
  • the present invention has the following beneficial effects:
  • the operation is simple and rapid, and the qualitative, semi-quantitative or quantitative detection of different objects to be inspected in the sample to be inspected can be realized, and can be widely applied to the field of in vitro diagnostic reagents for the drawings.
  • FIG. 1 is a schematic structural view of a conventional immunochromatographic test strip
  • FIG. 2 is a schematic structural view of a first preferred embodiment of an immunochromatographic test strip of the present invention
  • FIG. 3 is a schematic structural view of a second preferred embodiment of the immunochromatographic test strip of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic structural view of a third preferred embodiment of the immunochromatographic test strip of the present invention. Embodiments of the invention
  • the existing immunochromatographic test strips are provided with detection lines in the detection area, usually only one detection line, and a plurality of side-by-side detection lines are arranged, and the sample to be inspected moves along the reaction film due to capillary action, which inevitably drives a small amount.
  • the movement of the immune substance, and the detection line is set perpendicular to the direction of advancement of the sample to be inspected, and does not reserve a channel for the movement of the sample to be inspected, the interference between the detection lines is unavoidable, and in addition, a certain limited detection area Adding more detection lines will cause confusion and even misinterpretation of the identification.
  • the main innovation of the present invention is that there are 2 to 30 mutually independent detection points in the detection zone, each detection point is separated by a certain distance, and at least 2 detection points are in the vertical direction of the moving direction of the sample liquid to be tested. A certain distance is separated, as a moving channel of the sample to be tested, the immune interference is reduced, and the detection point is coated with an antibody or an antigen for realizing qualitative, semi-quantitative or quantitative detection of different objects to be detected in the sample to be inspected.
  • the reaction film 2 shows the structure of the first preferred embodiment of the immunochromatographic test strip of the present invention.
  • the main structure is consistent with the prior art, including the sample pad 4, the conjugate release pad 5,
  • the reaction film 2 includes a detection zone T and a quality control zone C, and the detection zone is provided with 2 to 30 mutually independent detection points, and the detection points are coated with an antibody or an antigen.
  • the coated antibody or antigen content in the detection point is different, for example, six detection points T1 are set in the figure. ⁇ T6, the same antibody is coated in each detection point, but the content of the antibody in each detection point is different, and the content is sequentially increased one by one.
  • the detection only one detection point display is needed to indicate that the object to be inspected exists, and qualitative detection is completed accordingly; the more the number of detection points displayed, the more the amount of the object to be inspected is, according to this Complete semi-quantitative detection; if the content of antibody in each detection point can be accurately controlled, the number of detection points can accurately determine the amount of the target to be inspected. For example, one detection point shows that the amount of the target to be inspected is 100 units. , two detection points show that the amount of the target to be inspected is 200 units, three The detection point display indicates that the amount of the object to be inspected is 300 units... According to this, the quantitative detection of the object to be inspected is completed.
  • the coating of the antigen in the detection point is also fully applicable to the above description, because the immunochromatographic reaction between the target to be detected and the antibody or antigen coated in the detection point in the present application includes double antibody sandwich method, indirect method, competition Inhibition method.
  • the conjugate release pad is provided with a specific label related to the target to be detected; wherein the labeling method of the specific label includes a quantum dot labeling method, a colloidal gold labeling method, a colloidal selenium labeling method, a colored or fluorescent latex labeling method, Magnetic particle labeling method.
  • the shape of the detection point is at least one of a dot, a polygon, a cartoon figure, or a combination of several.
  • Example 1 Test paper for detecting human chorionic gonadotropin using colloidal gold immunochromatography
  • FIG. 3 is a view showing the structure of a second preferred embodiment of the immunochromatographic test strip of the present invention, as shown in FIG. 3, specifically a test paper for detecting human chorionic gonadotropin using colloidal gold immunochromatography,
  • the detection point is coated with the same kind of antibody or antigen, and the type of the target to be detected is human chorionic gonadotropin.
  • the content of the antibody in some detection points is different, for example, the detection points T1 to T4, and the content of the antibody in some of the detection points is the same. For example, 2 detection points T1 and 2 detection points ⁇ 2.
  • the specific preparation method is as follows
  • Bioactive raw materials ot-HCG monoclonal antibodies, ⁇ -HCG monoclonal antibodies, and IgG polyclonal antibodies were all commercially available.
  • Bovine serum albumin is commercially available.
  • Nitrocellulose membranes are commercially available.
  • test paper preparation procedure is as follows:
  • coated antibody species is determined according to the target to be detected in the sample to be tested: ot-HCG monoclonal antibody, IgG polyclonal antibody.
  • the centrifuged concentrate was diluted and spread on a 90 cm x 30 cm nonwoven fabric, the amount of liquid added was 10-11 ml/sheet, dried for 24 hours, the temperature was 37 ° C, and the humidity was ⁇ 40 ⁇ 3 ⁇ 4 RH.
  • the glass fiber and the nonwoven fabric which are cut into 83.5 cm ⁇ 30 cm are composed of 0.5 ⁇ 3 ⁇ 4 NaCl (potassium chloride), 0.5% sucrose, 0.1% BSA (bovine serum albumin) and Tris-HCl.
  • the backing 1 is placed flat on the operation table, and double-sided tape is attached.
  • a coated good reaction film 2 is attached to the backing 1.
  • a layer of the nonwoven fabric pressure reaction film 2 was attached to 2 mm.
  • the conjugate release pad 5 is pressed against the nonwoven fabric.
  • the glass fibers are pressed against the conjugate release pad 5 - half position and the other end is aligned with the backing 1 .
  • One end of a nonwoven fabric is aligned with the upper end of the conjugate release pad 5, and the other end is aligned with the backing 1.
  • the types of the target to be detected are various, the number of types of the target to be detected, and the antibody or antigen coated in the detection point.
  • the number of species is the same.
  • 4 is a view showing the structure of a third preferred embodiment of the immunochromatographic test strip of the present invention, as shown in FIG. 4, specifically using colloidal gold immunochromatography for urine microalbumin, urine ⁇ 2 microglobulin, Cystatin C three joint test strips.
  • the specific preparation method is as follows:
  • Bioactive raw materials human albumin monoclonal antibody, mouse anti-human albumin monoclonal antibody, Cys-C (cytosine C) monoclonal antibody, mouse anti-human Cys-C (cytosine C) antibody, ⁇ 2 microglobulin monoclonal antibody, mouse anti-human ⁇ 2 microglobulin antibody, and IgG polyclonal antibody were purchased from the market.
  • Bovine serum albumin is commercially available.
  • Nitrocellulose membranes are commercially available.
  • test paper preparation procedure is as follows:
  • determining the type of coated antibody according to the target to be detected in the sample to be tested human albumin monoclonal antibody, Cys-C (cytosine C) monoclonal antibody, ⁇ 2 microglobulin monoclonal antibody, IgG polyclonal antibody.
  • the detection point 12 is set with 3 points, each point is a detection antibody;
  • the quality control point 13 Set 2 points, 1 content.
  • the centrifuged concentrate was diluted and spread on a 90 cm x 30 cm nonwoven fabric, the amount of liquid was 10-l lml/sheet, dried for 24 hours, the temperature was 37 ° C, and the humidity was ⁇ 40 ⁇ 3 ⁇ 4 RH.
  • the % ratio is added to the BSA (bovine serum albumin) stabilizer.
  • the centrifuged concentrate is diluted according to the specified concentration, and spread on a 90 cm x 30 cm nonwoven fabric, and the amount of liquid added is 10
  • BSA bovine serum albumin
  • the centrifuged concentrate is diluted according to the specified concentration, and spread on a 90 cm x 30 cm non-woven fabric, and the amount of liquid added is 10
  • the glass fiber and the non-woven fabric which are cut into 83.5 cm ⁇ 30 cm are used to contain 0.5 ⁇ 3 ⁇ 4 NaCl (potassium chloride), 0.5% sucrose, 0.1% BSA (bovine serum albumin) and Tris-HCl buffer (trimethylol). Aminomethane-hydrochloric acid) (pH 7.4)
  • the backing 1 is placed on the operation table, and double-sided tape is attached.
  • the coated reaction film 2 is attached to the backing 1.
  • the absorbent pad 3 was pressed 2 mm of the reaction film 2, and the other end was aligned with the backing 1.
  • a layer of the nonwoven fabric pressure reaction film 2 was attached to 2 mm.
  • the urinary microalbumin conjugate release pad, the urinary ⁇ 2 microglobulin conjugate release pad, and the cystatin C conjugate release pad are sequentially pressed onto the nonwoven fabric.
  • the glass fibers are pressed against the conjugate release pad 5 - half position and the other end is aligned with the backing 1 .
  • One end of a nonwoven fabric is aligned with the upper end of the conjugate release pad 5, and the other end is aligned with the backing 1.
  • the present invention also provides an immunochromatographic detection method, which uses the aforementioned immunochromatographic detection method, and the sample to be tested includes blood, body fluid, urine, saliva, reproductive tract from clinical or non-clinical. Exudates or other liquid samples or viscous samples.
  • the sample to be inspected is added to the sample pad, and after the immunochromatographic reaction is completed, the object to be inspected in the sample to be inspected is first determined according to the coloration of the detection point, and then the detection zone is independent of each other by the naked eye.
  • the color of the detection point is qualitatively or semi-quantitatively detected by the sample to be inspected, or the characteristic signal of the detection point on the test paper is collected by an instrument having a signal detection function for qualitative, semi-quantitative or quantitative detection.

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Abstract

一种免疫层析检测试纸及检测方法，其中，免疫层析检测试纸包括样本垫、结合物释放垫、反应膜、吸收垫、背衬，待检样本液由于毛细管作用沿着所述反应膜移动，所述反应膜包括检测区和质控区，质控区设置有质控线或者质控点，所述检测区设置有2至30个相互独立的检测点且所述检测点之间间隔一定距离，其中，至少有2个检测点在待检样本液移动方向的垂直方向上间隔一定距离；所述检测点包被有抗体或抗原。该免疫层析检测试纸及检测方法，操作简单、快速，可实现对待检样本中不同的待检目标物的定性、半定量或定量检测，能够广泛应用于体外诊断试剂领域。

Description

说明书 发明名称：一种免疫层析检测试纸及检测方法 技术领域
[0001] 本发明属于体外诊断试剂领域， 更具体的说， 涉及一种免疫层析检测试纸及检 测方法。
背景技术
[0002] 免疫层析法是九十年代兴起的一种基于免疫胶体金技术的快速诊断技术， 图 1 示出了现有技术中免疫层析检测试纸的结构， 如图 1所示， 包括样本垫 4、 结合 物释放垫 5、 反应膜 2、 吸收垫 3、 背衬 1， 反应膜 2包括检测区 T和质控区 C， 其原 理是将特异性的抗体先固定于反应膜 2上， 当试纸的样本垫 4浸入待检样本后， 由于毛细管作用， 待检样本将沿着该膜向前移动， 当移动至固定有抗体的区域 吋， 待检样本中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合， 若用免疫胶体金可使 该区域显示一定的颜色， 从而实现特异性的免疫诊断。
[0003] 免疫层析技术大体包括双抗体夹心法、 间接法、 竞争抑制法。
[0004] 双抗体夹心法， 属于非竞争结合测定， 适用于检测分子中具有至少两个抗原决 定簇的多价抗原。 其基本工作原理是： 利用连接于反应膜 2上的抗体和标记抗体 分别与待检样本中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合， 形成标记抗体-抗原- 固相抗体免疫复合物。
[0005] 间接法， 测定抗体最常用的方法， 属非竞争结合测定。 其原理是将抗原固化于 反应膜 2， 待检样本中待测抗体首先与标记分子结合， 形成复合物， 再与反应膜 2上的抗原结合， 形成标记分子 -待检抗体-抗原复合物。
[0006] 竞争法可用于抗原和抗体测定。 以测定抗原为例， 其基本原理是待检样本中的 受检抗原和固相的包被抗原竞争与标记抗体结合， 当待检样本中的受检抗原的 量大于试剂的阈值， 标记抗体则不会与固相的包被抗原结合； 若待检样本中无 受检抗原， 标记抗体直接与固相的包被抗原结合。
[0007] 以胶体金试纸为主要代表的免疫层析试纸技术现已广泛用于免疫检测的各个方 面， 该技术主要是将特异性的抗体或抗原以条带状固定在反应膜 2上， 通过检测 区 T一条条带状检测线 8的显色结果进行定性分析， 多条条带状检测线 8的显色结 果进行半定量和定量检测。
[0008] 现有的免疫层析检测方法及试纸， 试纸上的每条检测线 8只能提供一种检测信 息， 在一定面积中增加较多的检测线 8数量会给识别造成信息混乱甚至判读错误
[0009] 申请号为 201210200364.5的发明专利公幵了一种胶体金免疫层析定量检测试纸 及其检测方法， 检测区 Τ上的检测线至少有三条， 通过多条检测线与待检测样品 的定量结合与检测， 实现对待检测样品的定量检测。 但是， 前后并排设置的检 测线相互之间的免疫反应会构成干扰， 不利于准确判定结果。 。
技术问题
[0010] 本发明所要解决的技术问题在于： 提供一种免疫层析检测试纸及检测方法， 解 决现有免疫层析检测法中多条检测线之间的干扰、 无法准确进行结果判定的问 题。
问题的解决方案
技术解决方案
[0011] 本发明解决上述问题的技术方案在于： 提供一种免疫层析检测试纸， 包括样本 垫、 结合物释放垫、 反应膜、 吸收垫、 背衬， 待检样本液由于毛细管作用沿着 所述反应膜移动， 所述反应膜包括检测区和质控区， 质控区设置有质控线或者 质控点， 所述检测区设置有 2至 30个相互独立的检测点且所述检测点之间间隔一 定距离， 其中， 至少有 2个检测点在待检样本液移动方向的垂直方向上间隔一定 距离； 所述检测点包被有抗体或抗原。
[0012] 在本发明提供的免疫层析检测试纸中， 所述检测点的形状为圆点、 多边形、 卡 通图形中的至少一种或者几种的组合。
[0013] 在本发明提供的免疫层析检测试纸中， 根据待检样本中的待检目标物确定所述 检测点中包被的抗体或抗原的种类和含量、 以及所述检测点的数量。
[0014] 在本发明提供的免疫层析检测试纸中， 待检目标物与所述检测点中包被的抗体 或抗原之间的免疫层析反应包括双抗体夹心法、 间接法、 竞争抑制法。
[0015] 在本发明提供的免疫层析检测试纸中， 所述结合物释放垫上设置有与待检目标 物相关的特异性标记物； 其中， 所述特异性标记物的标记方法包括量子点标记 法、 胶体金标记法、 胶体硒标记法、 有色或荧光乳胶标记法、 磁性颗粒标记法
[0016] 本发明还提供一种免疫层析检测方法， 使用前述任意一项所述的免疫层析检测 试纸， 对待检样本进行定性、 半定量或者定量检测
[0017] 在本发明提供的免疫层析检测方法中， 所述待检样本包括来自临床或非临床的 血液、 体液、 尿液、 唾液、 生殖道分泌液或其他液态样品或粘稠状样品。
[0018] 在本发明提供的免疫层析检测方法中， 在所述样本垫中加入待检样本， 免疫层 析反应完成后， 首先根据所述检测点的显色情况确定待检样本中的待检目标物
， 再通过肉眼观察检测区中相互独立的检测点的显色情况对待检样本进行定性 或者半定量检测， 或者， 采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测点的特 征信号进行定性、 半定量或者定量检测。
发明的有益效果
有益效果
[0019] 实施本发明， 具有如下有益效果： 操作简单、 快速， 可实现对待检样本中不同 的待检目标物的定性、 半定量或定量检测， 能够广泛应用于体外诊断试剂领域 对附图的简要说明
附图说明
[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或 现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的 附图仅仅是本发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创 造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021] 图 1为现有的免疫层析检测试纸的结构示意图；
[0022] 图 2为本发明免疫层析检测试纸第一较佳实施例的结构示意图；
[0023] 图 3为本发明免疫层析检测试纸第二较佳实施例的结构示意图；
[0024] 图 4为本发明免疫层析检测试纸第三较佳实施例的结构示意图。 本发明的实施方式
[0025] 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部 的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳 动的前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。
[0026] 现有的免疫层析检测试纸在检测区设置检测线， 通常只有一条检测线， 在设置 多条并排的检测线吋， 待检样本由于毛细管作用沿着反应膜移动， 必然会带动 少量的免疫物质的移动， 而检测线与待检样本的前进方向垂直设置， 并没有给 待检样本的移动预留通道， 检测线相互之间的干扰不可避免， 另外， 在一定有 限的检测区面积中增加较多的检测线数量会给识别造成信息混乱甚至判读错误 。 本发明的主要创新点在于， 在检测区设置有 2至 30个相互独立的检测点， 每个 检测点间隔一定的距离， 另外， 至少有 2个检测点在待检样本液移动方向的垂直 方向上间隔一定距离， 作为待检样本的移动通道， 减少免疫干扰， 检测点包被 有抗体或抗原， 用于实现对待检样本中不同的待检目标物的定性、 半定量或定 量检测。
[0027] 图 2示出了本发明免疫层析检测试纸第一较佳实施例的结构， 如图 2所示， 其主 体结构与现有技术一致， 包括样本垫 4、 结合物释放垫 5、 反应膜 2、 吸收垫 3、 背衬 1， 反应膜 2包括检测区 T和质控区 C， 检测区设置 2至 30个相互独立的检测点 ， 检测点包被有抗体或抗原。
[0028] 当检测点包被有相同种类的抗体或抗原吋， 待检目标物的种类为一种， 则检测 点中的包被的抗体或抗原含量不同， 例如图中设置 6个检测点 T1〜T6， 每个检测 点中包被同一种抗体， 只是每个检测点中抗体的含量不同， 并且含量依次逐个 递增。 在检测吋， 只需要有一个检测点显示， 即可说明具有待检目标物存在， 据此完成定性检测； 显示出的检测点数量越多， 则说明待检目标物的量越多， 据此完成半定量检测； 如果每个检测点中抗体的含量能够准确控制， 检测点显 示的数量可以准确判定待检目标物的量， 例如， 一个检测点显示说明待检目标 物的量在 100个单位， 两个检测点显示说明待检目标物的量在 200个单位， 三个 检测点显示说明待检目标物的量在 300个单位…， 据此完成待检目标物的定量检 测。 当然， 检测点中包被抗原也完全适用前述描述， 因为， 本申请中待检目标 物与检测点中包被的抗体或抗原之间的免疫层析反应包括双抗体夹心法、 间接 法、 竞争抑制法。 结合物释放垫上设置有与待检目标物相关的特异性标记物； 其中， 特异性标记物的标记方法包括量子点标记法、 胶体金标记法、 胶体硒标 记法、 有色或荧光乳胶标记法、 磁性颗粒标记法。 为了更好的将各个检测点以 示区别， 检测点的形状为圆点、 多边形、 卡通图形中的至少一种或者几种的组 合。
[0029] 实施例 1使用胶体金免疫层析法对人绒毛膜促性腺激素进行检测的试纸
[0030] 在本实施例中， 至少一部分包被有相同种类抗体或抗原的检测点中， 抗体或抗 原的含量不同。 图 3示出了本发明免疫层析检测试纸第二较佳实施例的结构， 如 图 3所示， 具体为一种使用胶体金免疫层析法对人绒毛膜促性腺激素进行检测的 试纸， 检测点包被有相同种类的抗体或抗原吋， 待检目标物的种类为人绒毛膜 促性腺激素， 一部分检测点中抗体的含量不同， 例如检测点 T1〜T4， 一部分检 测点中抗体的含量相同， 例如 2个检测点 Tl、 2个检测点 Τ2。 具体制备方式如下
[0031] 材料：
[0032] 生物活性原料： ot-HCG单克隆抗体、 β-HCG单克隆抗体、 IgG多克隆抗体均来 自市场购买。
[0033] 试剂： 牛血清白蛋白来自市场购买。
[0034] 硝酸纤维素膜来自市场购买。
[0035] 试纸制备程序如下：
[0036] 步骤 1.反应膜 2包被
[0037] 根据待检样本中的待检目标物确定包被抗体种类： ot-HCG单克隆抗体、 IgG多 克隆抗体。
[0038] 根据待检样本中的待检目标物设定检测点 10及质控点 11的含量和数量： 检测点
10设置 6个点， 4个不同含量； 质控点 11设置 2个点， 1个含量。
[0039] 将 15.42mg/ml的 α-HCG单克隆抗体、 8.02mg/ml的 IgG多克隆抗体用按照附图 3 的图形包被于硝酸纤维素膜上， 干燥 24h， 温度为 37°C， 湿度≤40%RH。
[0040] 步骤 2.结合物释放垫 5制备
[0041] 取 40nm的胶体金溶液， 按 1.2%比例加入 0.2M的 K 2CO 3 (碳酸钾） 调节 PH值， 按 15 g/ml比例加入 β-HCG单克隆抗体， 制成标记物， 放置室温 5min， 按 0.8%比 例加入 BSA (牛血清白蛋白） 稳定剂。
[0042] 4500r离心 30min， 取浓缩沉淀物； 将上清液继续 6500r离心 45min， 取浓缩沉淀 物； 将上清液继续 9000r离心 60min， 取浓缩沉淀物； 将三次离心浓缩沉淀物混合 均匀。
[0043] 将离心好的浓缩液稀释好， 铺于 90cmx30cm的无纺布上， 加液量 10- 11ml/张， 干燥 24h， 温度 37°C， 湿度≤40<¾RH。
[0044] 步骤 3.样本垫 4的制备
[0045] 将切割成 83.5cmx30cm的玻璃纤维和无纺布用包含 0.5<¾NaCl (氯化钾） 、 0.5% 蔗糖、 0.1%BSA (牛血清白蛋白） 和 Tris-HCl
缓冲液 (三羟甲基氨基甲烷-盐酸) (pH7.4)工作液浸泡。 在 37°C将所述垫干燥 24h， 获得样本垫 4。
[0046] 步骤 4.组装试纸
[0047] 将背衬 1平放在操作台上， 贴上双面胶。
[0048] 将包被好的反应膜 2贴在背衬 1上。
[0049] 将吸收垫 3压反应膜 2的 2mm贴上， 另一端与背衬 1对齐。
[0050] 将一层无纺布压反应膜 2的 2mm处贴上。
[0051] 将结合物释放垫 5齐压于无纺布上面。
[0052] 将玻璃纤维压于结合物释放垫 5—半位置， 另一端与背衬 1对齐。
[0053] 再将一层无纺布一端与结合物释放垫 5上端对齐， 另一端与背衬 1对齐。
[0054] 步骤 5.产品检测
[0055] 取含有 HCG的待检样本尿液滴加到样本垫 4上， 5min吋判读结果， T3显色， 其 它 T点无显色， 表示待检样本尿液中含 HCG浓度为 25-125mIU/ml; T2和 T3显色， 其它 T无显色， 表示待检样本尿液中含 HCG浓度为 125-500mIU/ml; Tl、 Τ2、 Τ3 显色， Τ4无显色， 表示待检样本尿液中含 HCG浓度为 500-2500mIU/ml; T全部显 色， 则表示待检样本尿液中含 HCG浓度为高于 2500mIU/ml。
[0056] 实施例 2使用胶体金免疫层析法对尿微量白蛋白、 尿 β2微球蛋白、 抑胱素 C三 项联合检测试纸
[0057] 在本实施例中， 当检测点包被有不同种类的抗体或抗原吋， 待检目标物的种类 为多种， 待检目标物的种类数量与检测点中包被的抗体或抗原种类数量相一致 。 图 4示出了本发明免疫层析检测试纸第三较佳实施例的结构， 如图 4所示， 具 体为一种使用胶体金免疫层析法对尿微量白蛋白、 尿 β2微球蛋白、 抑胱素 C三项 联合检测试纸。 具体制备方式如下：
[0058] 材料：
[0059] 生物活性原料： 人白蛋白单克隆抗体、 鼠抗人白蛋白单克隆抗体、 Cys-C (抑 胱素 C) 单克隆抗体、 鼠抗人 Cys-C (抑胱素 C) 抗体、 β2微球蛋白单克隆抗体、 鼠抗人 β2微球蛋白抗体、 IgG多克隆抗体均来自市场购买。
[0060] 试剂： 牛血清白蛋白来自市场购买。
[0061] 硝酸纤维素膜来自市场购买。
[0062] 试纸制备程序如下：
[0063] 步骤 1.反应膜 2包被
[0064] 根据待检样本中的待检目标物确定包被抗体种类： 人白蛋白单克隆抗体、 Cys- C (抑胱素 C) 单克隆抗体、 β2微球蛋白单克隆抗体、 IgG多克隆抗体。
[0065] 根据待检样本中的待检目标物设定检测点 12及质控点 13的抗体含量和数量： 检 测点 12设置 3个点， 每个点为一种检测抗体； 质控点 13设置 2个点， 1个含量。
[0066] 将 2.5mg/ml的人白蛋白单克隆抗体、 2.26mg/ml的 β2微球蛋白单克隆抗体、 2.42 mg/ml的 Cys-C (抑胱素 C) 单克隆抗体、 8.02mg/ml的 IgG多克隆抗体根据附图 4 的图形包被于硝酸纤维素膜上， 干燥 24h， 温度为 37°C， 湿度≤40%RH。
[0067] 步骤 2.结合物释放垫 5制备
[0068] 尿微量白蛋白金标结合物释放垫制备
[0069] 取 40nm的胶体金溶液， 按 1.2%比例加入 0.2M的 K 2CO 3 (碳酸钾） 调节 PH值， 按 12 g/ml比例加入鼠抗人白蛋白单克隆抗体， 制成标记物， 放置室温 5min， 按 0 .8%比例加入 BSA (牛血清白蛋白） 稳定剂。 [0070] 4500r离心 30min， 取浓缩沉淀物； 将上清液继续 6500r离心 45min， 取浓缩沉淀 物； 将上清液继续 9000r离心 60min， 取浓缩沉淀物； 将三次离心浓缩沉淀物混合 均匀。
[0071] 将离心好的浓缩液稀释好， 铺于 90cmx30cm的无纺布上， 加液量 10-l lml/张， 干燥 24h， 温度 37°C， 湿度≤40<¾RH。
[0072] 尿 β2微球蛋白金标结合物释放垫制备
[0073] 取 40nm的胶体金溶液， 按 1.2%比例加入 0.2M的 K 2CO 3 (碳酸钾） 调节 PH值， 按 l(Vg/ml比例加入鼠抗人 β2微球蛋白抗体， 制成标记物， 放置室温 5min， 按 0.8
%比例加入 BSA (牛血清白蛋白） 稳定剂。
[0074] 4500r离心 30min， 取浓缩沉淀物； 将上清液继续 6500r离心 45min， 取浓缩沉淀 物； 将上清液继续 9000r离心 60min， 取浓缩沉淀物； 将三次离心浓缩沉淀物混合 均匀。
[0075] 将离心好的浓缩液按规定浓度稀释好， 铺于 90cmx30cm的无纺布上， 加液量 10
-11ml/张， 干燥 24h， 温度 37°C， 湿度≤40<¾RH。
[0076] 抑胱素 C金标结合物释放垫制备
[0077] 取 40nm的胶体金溶液， 按 1.2%比例加入 0.2M的 K 2CO 3 (碳酸钾） 调节 PH值， 按 l l g/ml比例加入鼠抗人 Cys-C (抑胱素 C) 抗体， 制成标记物， 放置室温 5min
， 按 0.8%比例加入 BSA (牛血清白蛋白） 稳定剂。
[0078] 4500r离心 30min， 取浓缩沉淀物； 将上清液继续 6500r离心 45min， 取浓缩沉淀 物； 将上清液继续 9000r离心 60min， 取浓缩沉淀物； 将三次离心浓缩沉淀物混合 均匀。
[0079] 将离心好的浓缩液按规定浓度稀释好， 铺于 90cmx30cm的无纺布上， 加液量 10
-11ml/张， 干燥 24h， 温度 37°C， 湿度≤40<¾RH。
[0080] 步骤 3.样本垫 4的制备
[0081] 将切割成 83.5cmx30cm的玻璃纤维和无纺布用包含 0.5<¾NaCl (氯化钾） 、 0.5% 蔗糖、 0.1%BSA (牛血清白蛋白） 和 Tris- HC1缓冲液 (三羟甲基氨基甲烷-盐酸) (pH7.4)
工作液浸泡。 在 37°C将所述垫干燥 24h， 获得样本垫 4。 [0082] 步骤 4.组装试纸
[0083] 将背衬 1放在操作台上， 贴上双面胶。
[0084] 将包被好的反应膜 2贴在背衬 1上。
[0085] 将吸收垫 3压反应膜 2的 2mm贴上， 另一端与背衬 1对齐。
[0086] 将一层无纺布压反应膜 2的 2mm处贴上。
[0087] 将尿微量白蛋白结合物释放垫、 尿 β2微球蛋白结合物释放垫、 抑胱素 C结合物 释放垫依次齐压于无纺布上面。
[0088] 将玻璃纤维压于结合物释放垫 5—半位置， 另一端与背衬 1对齐。
[0089] 再将一层无纺布一端与结合物释放垫 5上端对齐， 另一端与背衬 1对齐。
[0090] 步骤 5.产品检测
[0091] 取待检样本尿液样本垫 4上， 8min吋， 判读结果， T1显色， 表示待检样本尿液 中尿微量白蛋白为阳性； T2显色， 表示待检样本尿液中含尿 β2微球蛋白为阳性
； Τ3显色， 表示待检样本尿液中含抑胱素 C为阳性。
[0092] 除此以外， 本发明还提供一种免疫层析检测方法， 使用前述一种免疫层析检测 方法， 待检样本包括来自临床或非临床的血液、 体液、 尿液、 唾液、 生殖道分 泌液或其他液态样品或粘稠状样品。
[0093] 使用过程如下：
[0094] 在样本垫中加入待检样本， 免疫层析反应完成后， 通过肉眼观察检测区中相互 独立的检测点的显色情况对待检样本进行定性或者半定量检测， 或者， 采用具 有信号检测功能的仪器采集试纸上检测点的特征信号进行定性、 半定量或者定 量检测。
[0095] 或者， 在样本垫中加入待检样本， 免疫层析反应完成后， 首先根据检测点的显 色情况确定待检样本中的待检目标物， 再通过肉眼观察检测区中相互独立的检 测点的显色情况对待检样本进行定性或者半定量检测， 或者， 采用具有信号检 测功能的仪器采集试纸上检测点的特征信号进行定性、 半定量或者定量检测。
[0096] 以上所述仅为本发明的实施例， 并不限制本发明， 凡在本发明基础上， 所作的 任何修改、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

权利要求书
[权利要求 1] 一种免疫层析检测试纸， 包括样本垫、 结合物释放垫、 反应膜、 吸收 垫、 背衬， 待检样本液由于毛细管作用沿着所述反应膜移动， 所述反 应膜包括检测区和质控区， 质控区设置有质控线或者质控点， 其特征 在于， 所述检测区设置有 2至 30个相互独立的检测点且所述检测点之 间间隔一定距离， 其中， 至少有 2个检测点在待检样本液移动方向的 垂直方向上间隔一定距离； 所述检测点包被有抗体或抗原。
[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的免疫层析检测试纸， 其特征在于， 所述检测点 的形状为圆点、 多边形、 卡通图形中的至少一种或者几种的组合。
[权利要求 3] 根据权利要求 1所述的免疫层析检测试纸， 其特征在于， 根据待检样 本中的待检目标物确定所述检测点中包被的抗体或抗原的种类和含量
、 以及所述检测点的数量。
[权利要求 4] 根据权利要求 1所述的免疫层析检测试纸， 其特征在于， 待检目标物 与所述检测点中包被的抗体或抗原之间的免疫层析反应包括双抗体夹 心法、 间接法、 竞争抑制法。
[权利要求 5] 根据权利要求 1所述的免疫层析检测试纸， 其特征在于， 所述结合物 释放垫上设置有与待检目标物相关的特异性标记物； 其中， 所述特异 性标记物的标记方法包括量子点标记法、 胶体金标记法、 胶体硒标记 法、 有色或荧光乳胶标记法、 磁性颗粒标记法。
[权利要求 6] —种免疫层析检测方法， 其特征在于， 使用权利要求 1〜5中任意一项 所述的免疫层析检测试纸， 对待检样本进行定性、 半定量或者定量检
[权利要求 7] 根据权利要求 6所述的免疫层析检测方法， 其特征在于， 所述待检样 本包括来自临床或非临床的血液、 体液、 尿液、 唾液、 生殖道分泌液 或其他液态样品或粘稠状样品。
[权利要求 8] 根据权利要求 6所述的免疫层析检测方法， 其特征在于， 在所述样本 垫中加入待检样本， 免疫层析反应完成后， 首先根据所述检测点的显 色情况确定待检样本中的待检目标物， 再通过肉眼观察检测区中相互 独立的检测点的显色情况对待检样本进行定性或者半定量检测， 或者 ， 采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测点的特征信号进行定 性、 半定量或者定量检测。
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