CN107402302A - 一种环境监测用原核生物数量快速评估芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明具体公开了一种环境监测用原核生物数量快速评估芯片，包括新型复合胶体金试纸，包括D区和Z区，所述试纸包括样品池Y、胶体金标记层D1、检测反应层D2、吸水层D3、胶体金标记层Z1、检测反应层Z2、吸水层Z3和背衬托板B。本发明的新型复合胶体金试纸，创造性地将两种原核生物的检测整合到同一个试纸上，该设计方案可以显著提高检测的效率，同时降低检测的经济成本和人力成本，将胶体金的快速检测速度提升到一个新的水平，适合基层单位进行快速大规模的水质筛查工作的开展，提高区域内水质监控力度。
Description
技术领域
本发明涉及原核生物快速评估技术领域，具体地，涉及一种环境监测用原核生物数量快速评估芯片。
背景技术
水质细菌学检验是给水和污水水质分析工作中的一项重要指标。目前水质卫生标准中规定的细菌学指标主要是细菌总数和大肠菌群指数，我们知道，由于现在的人类活动频繁，各种生活用水、工业用水大量排放聚集，长期以来，自然水网中的各种细菌种群繁杂多样；主要的种类有引起腹泻的大肠杆菌，引起伤寒的沙门氏菌，引起霍乱的霍乱弧菌，引起痢疾的志贺氏菌。
按细菌的标准检测方法，细菌总数用标准平皿计数法(SPS)需24小时以上，大肠菌群指数用发酵(最近似数法)需72小时以上，或滤膜法需24小时左右。如果按照这种传统的检测方法，多种细菌都要平行进行一样的试验，且耗时也比较长。为了改变以往常规方法的费时费事及短期内尚难反映水的细菌学质量等缺陷，争取及早检验出给水系统存在的问题，加强公共卫生防护，长期以来，微生物学工作者在探索新的快速简易的细菌学检测方法方面做了大量的研究工作
因此，急需开发一种可以快速高通量的微生物菌群检测方法。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供一种环境监测用原核生物数量快速评估芯片，以解决上述的技术问题：
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种环境监测用原核生物数量快速评估芯片，包括新型复合胶体金试纸，包括D区和Z区，所述试纸包括样品池Y、胶体金标记层D1、检测反应层D2、吸水层D3、胶体金标记层Z1、检测反应层Z2、吸水层Z3和背衬托板B；所述样品层、胶体金标记层和检测反应层按照从中间到两侧、从上至下的顺序依次结合在背衬板同一面上，胶体金标记层和检测反应层的端部重叠；所述吸水层结合在检测反应层的另一端。
附图说明
图1是本发明的结构示意图。
其中：D区-D，Z区-Z，样品池-Y，胶体金标记层D1，检测反应层D2，吸水层D3，胶体金标记层Z1，检测反应层Z2，吸水层Z3，检测线-T/t，质控线-C/c。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
一种环境监测用原核生物数量快速评估芯片，包括新型复合胶体金试纸，包括D区和Z区，所述试纸包括样品池Y、胶体金标记层D1、检测反应层D2、吸水层D3、胶体金标记层Z1、检测反应层Z2、吸水层Z3和背衬托板B；所述样品层、胶体金标记层和检测反应层按照从中间到两侧、从上至下的顺序依次结合在背衬板同一面上，胶体金标记层和检测反应层的端部重叠；所述吸水层结合在检测反应层的另一端。
本发明的新型复合胶体金试纸，创造性地将两种原核生物的检测整合到同一个试纸上，该设计方案可以显著提高检测的效率，同时降低检测的经济成本和人力成本，将胶体金的快速检测速度提升到一个新的水平，适合基层单位进行快速大规模的水质筛查工作的开展，提高区域内水质监控力度。
优选地，所述胶体金标记层D1上包被有抗大肠杆菌的单克隆抗体，所述检测反应层D2设置有检测线T和质控线C，所述检测线上包被有大肠杆菌抗原，所述质控线包被有羊抗兔IgG，所述检测用金标抗体可以与检测用包被抗原结合反应并显色，且检测用金标抗体上只有一个与抗原特异结合的位点；所述胶体金标记层上包被的抗体是以大肠杆菌菌体作为抗原免疫动物后制备获得的。
优选地，所述胶体金标记层Z1上包被有抗志贺氏菌的多克隆抗体，所述检测反应层Z2设置有检测线t和质控线c，所述检测线上包被有志贺氏菌抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG，所述检测用金标抗体可以与检测用包被抗原结合反应并显色，且检测用金标抗体上只有一个与抗原特异结合的位点；所述胶体金标记层上包被的抗体是以志贺氏菌菌体作为抗原免疫动物后制备获得的。
优选地，所述检测线为1～4条，质控线为1～4条。
更优选地，所述检测线为1～3条，质控线为1～3条。
优选地，所述样品层为吸水性良好的材料制成；所述背衬板为塑料制成。
优选地，所述胶体金标记层和检测反应层的材料为禽类蛋壳膜制备的生物膜。
优选地，所述禽类蛋壳膜为鸡蛋壳膜制备的生物膜。
优选地，所述胶体金标记层为鸡蛋壳膜的内膜制备的生物膜，所述检测反应层为鸡蛋壳膜外模制备的生物膜。
D区结果判断：
质控线的作用是：无论样品溶液中是否含有目标菌体，胶体金标记层包被的金标抗体上移到达质控线时都可以与质控线上的IgG结合，聚集形成肉眼可见的红色颗粒，质控线始终显色，如果质控线不显色，表示本次测试无效。
本发明严格控制胶体金标抗体、大肠杆菌抗原和羊抗兔IgG的比例。具体应用时，可根据不同的检测线或参数线的显色与否以及颜色的深浅，判定样液中是否含有大肠杆菌，以及含量的多与少，实现半定量检测。
当两条检测线T1和T2均显红色时，则样品为阴性(即不含大肠杆菌)；当检测线T1显色，检测线T2不显色时，则样品中含有大肠杆菌，但其浓度不高；当两条检测线均不显色时，则样品中大肠杆菌的浓度很高，以此进行半定量检测。
当检测线T颜色深于参考线C3时，则样品为阴性(不含大肠杆菌或极微量)；当检测线T颜色深于C3浅于参考线C2时，则样品含有大肠杆菌，浓度比较低；当检测线T颜色深于C2浅于C1时，则样品中含有大肠杆菌，浓度比较高；当检测线T不显色时，则样品中含有大肠杆菌，浓度非常高，以此进行半定量检测。
Z区结果判断：
质控线的作用是：无论样品溶液中是否含有目标菌体，胶体金标记层包被的金标抗体上移到达质控线时都可以与质控线上的IgG结合，聚集形成肉眼可见的红色颗粒，质控线始终显色，如果质控线不显色，表示本次测试无效。
本发明严格控制胶体金标抗体、志贺氏菌抗原和羊抗鼠IgG的比例。具体应用时，可根据不同的检测线或参数线的显色与否以及颜色的深浅，判定样液中是否含有志贺氏菌，以及含量的多与少，实现半定量检测。
当两条检测线t1和t2均显红色时，则样品为阴性(即不含志贺氏菌)；当检测线t1显色，检测线t2不显色时，则样品中含有志贺氏菌，但其浓度不高；当两条检测线均不显色时，则样品中志贺氏菌的浓度很高，以此进行半定量检测。
当检测线t颜色深于参考线c3时，则样品为阴性(不含志贺氏菌或极微量)；当检测线t颜色深于c3浅于参考线c2时，则样品含有志贺氏菌，浓度比较低；当检测线t颜色深于c2浅于c1时，则样品中含有志贺氏菌，浓度比较高；当检测线t不显色时，则样品中含有志贺氏菌，浓度非常高，以此进行半定量检测。
作为优选的实施例，以下将详细介绍鸡蛋壳膜应用于生物膜的方法，包括以下步骤：
S1.将收集到的鸡蛋壳膜保湿，具体为定期喷淋37℃去离子水，后续操作过程保持鸡蛋壳膜保持湿润的状态；
S2.轻轻地将半球状鸡蛋壳膜沿着经线切开、摊平，即将鸡蛋壳膜平面化；
S3.将上述步骤的鸡蛋壳膜置于烧杯中，加入适量去离子水，将烧杯置于振荡器上，46℃，100-120rpm，振荡1-2h，振荡结束后，将蛋壳膜置于流动缓慢的水中漂洗，清除膜表面杂质；
S4.将上述步骤的鸡蛋壳膜置于平面上，使用镊子将鸡蛋壳膜分层外膜和内膜；
S5.将外膜置于50mMTris-HCl(pH7.5)，10mM CaCl2溶液中，置于磁力搅拌器上，孵育40-55℃，30min，每100ml上述溶液加入20mg/ml的蛋白酶K 100ul，继续孵育10-20min；
S6.将内膜置于50mMTris-HCl(pH7.0)，10mM CaCl2溶液中，置于磁力搅拌器上，孵育40-55℃，10min，每100ml上述溶液加入20mg/ml的蛋白酶K 10ul，继续孵育5-10min；
S7.步骤S5和S6反应结束后，快速取出，置于流动的自来水中冲洗3-5min，之后使用75％酒精清洗3-5次，每次5min；
S8.上述步骤的膜使用去离子水清洗3-5次，每次3min，结束后4℃，保湿保存备用。
本发明的免疫层析试剂盒，金标抗体上只有一个与抗原特异结合的位点，具有特异性强；灵敏度高，检测速度快、通量大、操作简单方便、颜色稳定、检测温度适宜范围宽、试纸保质期长和成本低廉等优点，并能够实现半定量检测。本发明的检测试剂盒不管是检出量还在准确率方法，都与高效液相法相近。该快速检测试纸条在4～40℃都可使用，5～15min以后便可观察结果，适合于食品药品、环保、检验检疫等部门对样品中的副溶血性弧菌进行快速检测。
实验例不同来源水产品检测
分别使用本发明的免疫层析试剂盒、高效液相色谱、紫外分光光度计检测未经处理的城市污水的大肠杆菌和志贺氏菌，同种方法进行10次检测，检测结果取平均值计算，评估结果如表1所示。
表1
综合表1检测结果可以看出，本发明的免疫层析试剂盒不管是检出量还是准确度，与精度较高的高效液相色谱法都非常接近，同时本发明的试剂盒使用方便，检测成本更低，由于本发明的胶体金法操作简单，耗时短，对检测样品不需要进行复杂的预处理，有利于条件一般的基层单位开展工作，也方便相关部门进行现场快速检测。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种环境监测用原核生物数量快速评估芯片，其特征在于，包括新型复合胶体金试纸，包括D区和Z区，所述试纸包括样品池Y、胶体金标记层D1、检测反应层D2、吸水层D3、胶体金标记层Z1、检测反应层Z2、吸水层Z3和背衬托板B；所述样品层、胶体金标记层和检测反应层按照从中间到两侧、从上至下的顺序依次结合在背衬板同一面上，胶体金标记层和检测反应层的端部重叠；所述吸水层结合在检测反应层的另一端。
2.根据权利要求1所述的环境监测用原核生物数量快速评估芯片，其特征在于，所述胶体金标记层D1上包被有抗大肠杆菌的单克隆抗体，所述检测反应层D2设置有检测线T和质控线C，所述检测线上包被有大肠杆菌抗原，所述质控线包被有羊抗兔IgG，所述检测用金标抗体可以与检测用包被抗原结合反应并显色，且检测用金标抗体上只有一个与抗原特异结合的位点；所述胶体金标记层上包被的抗体是以大肠杆菌菌体作为抗原免疫动物后制备获得的。
3.根据权利要求2所述的环境监测用原核生物数量快速评估芯片，其特征在于，所述胶体金标记层Z1上包被有抗志贺氏菌的多克隆抗体，所述检测反应层Z2设置有检测线t和质控线c，所述检测线上包被有志贺氏菌抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG，所述检测用金标抗体可以与检测用包被抗原结合反应并显色，且检测用金标抗体上只有一个与抗原特异结合的位点；所述胶体金标记层上包被的抗体是以志贺氏菌菌体作为抗原免疫动物后制备获得的。
4.根据权利要求3所述的环境监测用原核生物数量快速评估芯片，其特征在于，所述检测线为1～4条，质控线为1～4条。
5.根据权利要求4所述的环境监测用原核生物数量快速评估芯片，其特征在于，所述检测线为1～3条，质控线为1～3条。
6.根据权利要求5所述的环境监测用原核生物数量快速评估芯片，其特征在于，所述样品层为吸水性良好的材料制成；所述背衬板为塑料制成。
7.根据权利要求6所述的环境监测用原核生物数量快速评估芯片，其特征在于，所述胶体金标记层和检测反应层的材料为禽类蛋壳膜制备的生物膜。
8.根据权利要求7所述的环境监测用原核生物数量快速评估芯片，其特征在于，所述禽类蛋壳膜为鸡蛋壳膜制备的生物膜。
9.根据权利要求8所述的环境监测用原核生物数量快速评估芯片，其特征在于，所述胶体金标记层为鸡蛋壳膜的内膜制备的生物膜，所述检测反应层为鸡蛋壳膜外模制备的生物膜。
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