CN110785116B - 具有多个测试线的色谱带、包括其的诊断试剂盒及包括多个竞争反应测定步骤的定性、半定量、定量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有多个竞争分析用测试线的色谱带、具有上述色谱带的诊断试剂盒及利用其来对样本内的靶物质进行定性或定量分析的方法。本发明的色谱带不仅可以通过肉眼或传感器来对只有一个配体的结合位点或大小小的靶物质进行定性分析，而且还可以迅速、方便地执行可靠性高的定量分析。进而，具有通过测试线和对照线之间的相互弥补来改善分析物质的浓度测定范围的效果。

Description

具有多个测试线的色谱带、包括其的诊断试剂盒及包括多个 竞争反应测定步骤的定性、半定量、定量分析方法

技术领域

本发明涉及具有多个测试线的色谱带、具有上述色谱带的诊断试剂盒及利用多个竞争反应来对样本内的靶物质进行定性和/或定量分析的方法。本发明的色谱分析用装置可利用于诊断及预测、食品的安全性测试、环境分析及化合物分析等多种领域的定性(qualitative)、半定量(semi-quantitative)、定量(quantitative)分析。

背景技术

被公认为快速检测(rapid test)方法的色谱分析法作为可以利用靶物质以及与靶物质进行特异性结合的配体的结合反应，来在短时间内对微量的靶物质(analyte)进行定性及定量分析的方法，使用于包括各种疾病的诊断或测试的医疗、农业、畜牧业、食品、军事、环境等多种领域。这种色谱分析普遍使用包括可以与所要检测的靶物质发生反应来呈现出变化的反应物质的试纸条(assay strip)或在塑料外壳安装试试试纸条的装置形态的分析装置。图1为使用于普通色谱分析的试纸条的剖视图。如图1所示，普通的试纸条包括：样本垫，用于收容液相样本；接合体垫，含有接合体(conjugate)，上述接合体(conjugate)由产生可利用肉眼或传感器来进行检测的信号的标记物质(例如，荧光物质或金粒子)与核酸、抗原、抗体等配体相接合而成；检测垫，形成有测试线和对照线，上述测试线固定样本中的靶物质和/或于上述接合体进行特异性结合的结合剂(核酸、抗体或抗原)，上述对照线能够确认样本的展开；以及吸湿垫，最终收容液相样本，而这些功能性垫按上述所罗列的顺序以一部分重叠的形态相连接，并附着于固体支撑体上，从而连续排列。在上述试纸条安装于塑料外壳的内部来使用的情况下，在外壳的上部形成有用于在样品垫的位点滴落样本的样本投入口，在固定有检测垫的结合剂的位点形成有用于确认测试结果的结果确认窗口。

像这样，在利用试纸条的色谱分析法中，若在样本垫滴落液相样本，则液相样本因毛细管现象而通过接合体垫及检测垫来移动，最终被吸湿垫收容。例如，以线型方式在检测垫固定可以与所要测定的抗原相结合的抗体(测试线，第一结合抗体)，另一个抗体(第二结合抗体)与金粒子之类的标记物质相结合，并展开样本。所展开的样本一边经由接合体垫，一边由一部分形成抗原-金粒子第二结合抗体的复合物来展开，而上述抗原-金粒子第二结合抗体被所固定的测试线的第一结合抗体捕获，从而形成“固定于测试线的第一结合抗体-金粒子第二结合抗体复合物”。由此，上述测试线因金粒子而呈现出红色。像这样，上述接合体垫所含有的接合体也与液相样本一同移动，并且，若在样本中存在所要分析的物质，则接合体经由靶物质与固定在检测垫的结合剂相结合(通常称之为“三明治(sandwich)”反应)。

但是，在使用三明治分析法进行分析的情况下，靶物质要与第一结合抗体、第二结合抗体-标记物质相结合来以能够发生三明治反应的方式产生两处以上抗体或配体的结合部位(epitope)，而在靶物质的大小小的情况下，(肽蛋白质、药物、过敏原等)因空间障碍(Steric hinderence)等而有可能发生结合力(binding affinity)变弱的问题，并且，可以发生由产生抗体的起源动物(host)等引起的特异性(specificity)、敏感度(sensitivity)及相互反应性(cross-reactivity)的问题。

因此，为了克服这种问题，还利用在检测垫的测试线固定靶物质，使得样本内的靶物质和测试线的固定的靶物质与接合体垫的抗体-标记物质的结合位点相竞争，从而随着样本内的靶物质的浓度增加，测试线的信号变弱的竞争反应(通常称之为“竞争(competition)反应”)。利用基于上述原理的试纸条，可以通过肉眼或传感器来检测样本中是否存在靶物质。

但是，使用这种竞争反应的快速试剂盒因容易的批量生产适用及容易的使用方法及迅速的结果读取和无需昂贵和大型专业分析装备而具有低廉的分析费用的优点，但存在检测极限(detection limit)相对较低的问题以及参照因通常使用肉眼来进行判断而定量性相对不足的问题。由于这种理由，以往的色谱分析法主要使用于定性分析，在使用于定量分析方面存在诸多极限。

发明内容

技术问题

本发明人员进行不断的努力研究，使得很难使用通常利用三明治反应的色谱带来进行分析的靶物质不仅可以进行定性分析，而且可以进行定量分析，结果，不同于利用包含与靶物质相同的物质或类似物的测试线为一个的以往的竞争反应的色谱条的情况，制作以引起多个竞争反应的方式追加测试线的色谱条来对各测试线的信号强度进行比较或与对照线进行比较，从而在较广的测定浓度范围中确认了可以对靶物质进行定量分析。

因此，本发明的目的在于，提供可以利用多个竞争反应来进行定量分析，且检测极限高的色谱带。

本发明的另一目的在于，提供包括上述色谱带的诊断试剂盒。

本发明的又一目的在于，提供使用上述色谱带或诊断试剂盒来对样本内的靶物质进行定性分析及定量分析的方法。

解决问题的手段

作为用于实现上述目的的一实施方式，本发明提供色谱带，具有接合体垫及检测垫，在上述色谱带中，上述接合体垫具有与靶物质发生反应的第一配体及与上述第一配体相结合的信号检测标记物质，或者在样本展开之前或样本展开时相互连接来形成第一接合体，当样本展开时，接合体能够向检测垫移动，上述检测垫由2个以上的测试线相隔离而成，在上述2个以上的测试线分别固定有与靶物质相同的物质或其类似物，从而能够与不与样本内的靶物质相结合的裸露(bare)接合体发生反应。

并且，本发明提供色谱带，上述色谱带在接合体垫还具有不与靶物质发生反应的第二配体及与上述第二配体相结合的信号检测标记物质，第二配体和标记物质在样本展开之前或样本展开时相连接来形成第二接合体，当样本展开时，第二接合体可向检测垫移动，上述检测垫还具有能够用于确认样本的展开的对照线，在上述对照线固定有不与靶物质或第一接合体发生反应的物质，固定于上述对照线的物质可以与不与靶物质相结合的第二接合体发生反应。

本发明的特征在于，在具有只形成固定有与靶物质相同的物质或其类似物的测试线及可以确认样本的展开的对照线的检测垫的现有的色谱带中，可以增加测试线的数量，并对可以与各测试线呈现出规定的信号的对照线的信号进行比较，从而不仅可以执行定性分析，而且可以执行可靠性高的定量分析。

并且，本发明的特征在于，不仅可以通过竞争分析发来对因大小相对小且配体结合部位仅为一个而难以适用三明治分析法的靶物质执行定性分析，而且还可以执行可靠性高的定量分析。

进而，本发明的特征在于，无需使用特殊分析机构而可以通过肉眼或普通的传感器来执行可靠性高的半定量分析。

本发明的术语“色谱”为将基于抗原-抗体反应的免疫反应原理、配体和受体(receptor)的结合原理、核酸和互补核酸相结合的原理等与样本及试剂通过流动相来沿着介质移动的色谱原理相结合的分析方法。简单观察如下，在多孔性膜(membrane)中预先分株所要进行分析的靶物质或类似物来进行固定，并从膜的一末端向固定好的上述靶物质或类似物展开包含样本的溶液，从而观察与溶液内的靶物质之间的反应。通常意义上的免疫反应意味着抗原-抗体的反应，但在本发明中，除了广义上的抗原-抗体的反应之外，还包括相互之间特异结合的受体和配体的反应，而且本发明并不局限于此，还可以包括酶与底物之间的反应等相互特异性地识别来引起的反应。

基于色谱的分析是通过介质，并借助毛细管现象来由与流动相一同包含靶物质的样本一边移动，一边形成的。因此，作为用于这种色谱展开的介质，可制作条来使用。这种色谱带的具体结构要素及各个功能将进行后述。

为了可以利用肉眼或传感器来容易地确认包含上述抗原-抗体的多种特异反应，可以利用标记物质。并且，可以将这种标记物质所要分析的靶物质或能够以结合靶物质的方式与靶物质特异结合的配体与标记物质相连接来利用。

本发明的术语“接合体(conjugate)”意味着上述标记物质和上述配体相连接来形成的结合体，上述接合体包括由用于进行信号检测的标记物质和第一配体相连接的第一接合体。

在本发明中，上述第一配体作为可以与靶物质发生反应的物质，意味着可以与靶物质特异结合的物质。

上述标记物质和第一配体能够以物理或化学方式相连接。即，标记物质和第一配体能够通过被动吸附(passive adsorption)来相连接，并且能够以具有反应基团的方式使标记物质发生改质来与第一配体连接成共享结合，但本发明并不局限于此，上述标记物质和第一配体的连接可利用本发明所属技术领域的普通技术人员公知的方法来执行。

只是，上述标记物质和第一配体可以在色谱带中展开样本之前以接合体的形态相连接来存在于接合体垫中，或者并不相连接而以分离的状态存在于接合体垫，并随着样本展开，它们相互连接来形成接合体，或者，以溶液相存在，并在使用之前添加到接合体垫来使用。不管是哪种情况，当样本展开时，标记物质和第一配体能够以接合体的状态向检测垫移动，这是因为它们并不固定于接合体垫。

本发明的术语“标记物质”意味着产生可以通过肉眼或传感器来检测的信号的物质。作为上市标记物质，可以使用胶体金(金粒子)、乳胶粒子、有色聚苯乙烯微细粒子、酶、荧光染料、传导性高分子、发光物质或磁性粒子等，但本发明并不局限于此。并且，上述信号可借助发光灯之类的标记物质的内在特性来自行发光，或者可借助荧光灯之类的外部刺激来产生。

本发明的术语“配体”意味着相互特异结合的物质。例如，与抗原特异结合的抗体、与特定受体特异结合的配体等相互起到配体作用。作为上述配体的非限制性的例，可以具有蛋白质、抗原、抗体、DNA、RNA、PNA或核酸适配体，除此之外，在本发明中，配体只要是呈现出以上所定义的特性的物质，就可以不受限制地使用。在整个本说明书中所使用的配体的含义只要是在没有具体化为与特定受体特异结合的配体来标记的情况下，就如以上定义所述，意味着相互特异结合的物质。

在本发明的优选的一实例中，标记物质和第一配体预先连接，从而可以作为接合体来存在于接合体垫。在这种情况下，分别按已知浓度的溶液制作标记物质和第一配体来进行混合后，实施规定时间的反应，来制作接合体溶液，并将此分株于接合体垫来准备具有接合体的接合体垫。或者，在使用所制作的溶液之前，使用人员可以添加于接合体垫来使用。此时，可考虑标记物质和配体的结合比来决定各个溶液的浓度及混合比例。在一个标记物质结合一个配体的情况下，上述标记物质和配体的结合可以为在一个标记物质结合多个配体的情况或在多个标记物质结合一个配体的情况。具体的结合比并不重要，优选的实施方式可以为维持规定比率。上述结合比可以根据标记物质和配体的种类来发生变化，可以考虑它们的相对大小及结合位置的数量等来进行预测。例如，在使用数微米尺寸的乳胶珠作为标记物质，使用抗体作为配体的情况下，多个抗体可以与乳胶相结合。优选地，为了在各个乳胶的表面以均匀的数量结合抗体，能够以抗体在乳胶的表面实现饱和来结合的方式调节抗体及乳胶溶液的浓度及混合比例，但并不局限于此。

如上所述，使各个已知浓度的标记物质和第一配体相混合来发生反应，从而可以获得已知浓度的接合体溶液。上述接合体溶液为规定浓度的接合体分子均匀地分散于溶液上的分散液的形态。

上述色谱带作为具有使用规定量的与靶物质相同或类似的物质来进行固定的2个以上的测试线的色谱带，可以包括：接合体垫，具有与测试线或样本内的靶物质发生反应的第一配体以及与第一配体相结合的信号检测标记物质；以及检测垫，2个以上的测试线和对照线分别隔离。

在检测垫固定2个以上的测试线来形成“多个竞争分析测试线(multiplecompetition assay test line)”，从而既可以定性检测样本内的靶物质，又可以定量分析样本内的靶物质。在本发明的色谱带的对照线中，可在检测垫追加固定在检测垫展开的流动相(mobile phase)内的标记物质-与第一配体裸露接合体的第一配体发生反应，但不与靶物质发生反应的物质或靶物质及不与第一配体发生反应，但与标记物质-第二配体接合体的第二配体发生反应的物质来使用。

在本发明中，上述第一配体意味着固定于样本内的靶物质或检测垫的2个以上的测试线的靶物质或对类似物发生反应的配体。

在本发明中，上述第二配体意味着只对固定于对照线的物质发生反应的配体。

上述第二配体可使用已决定的特定量来调节信号强度，根据样本内的靶物质的浓度来发生变化，通过与所呈现出的测试线比较信号强度来调节可检测的样本内的靶物质的浓度范围，进而可以有助于可靠性高的定量分析。

可在本发明的色谱带的2个以上的测试线固定有与接合体垫的第一配体发生反应的规定量的靶物质或靶物质类似物，2个以上的测试线能够以不同的量或相同的量进行固定。由于固定于接合体垫的第一配体可以与靶物质特异结合，因此，在不存在样本内的靶物质的情况下，第一配体标记物质接合体与流动相一同展开，并与固定检测垫内的靶物质或类似物的测试线的靶物质相结合来形成靶物质-第一配体-标记物质的复合物，并呈现出强大的信号。在样本内的靶物质存在的情况下，形成样本内的靶物质和靶物质-第一配体-标记物质的复合物，并与流动相向检测垫展开，而根据此时所形成的靶物质-第一配体-标记物质的复合物的量，与测试线的靶物质或其类似物形成复合物的量减少，由此减少信号。即，根据样本内的靶物质的量，测试线的信号成正比地减少。

追加固定于接合体垫的第二配体不与靶物质或第一配体发生反应，仅与固定在检测垫的对照线的物质相结合来发生反应，并呈现出信号。

可以比较根据这种样本内的靶物质的浓度来呈现的2个以上的测试线的各个信号之比和对照线的信号，从而在靶物质的广的范围内实施定量分析。

如上所述，色谱利用包含靶物质的流动相沿着介质移动的色谱的原理。因此，为了实施利用色谱带的分析，需要将包含靶物质的样本沿着条移动的流动相。由此，本发明的分析用试剂盒还可以包含缓冲液。上述缓冲液不仅可以起到沿着色谱带移动样本的流动相(mobile phase)的作用，而且可以起到用于溶解接合体的溶剂的作用，并且，可以根据需要来起到用于稀释样本的稀释液的作用。并且，例如，在进行全血分析的情况下，还可以包含用于溶解(lysis)红细胞等血球成分的成分。作为上述缓冲液，可以不受限制地使用10mM至1M浓度的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution；PBS)、非离子性或两性表面活性剂或它们的混合物等通常的缓冲液，并且可以根据抗原-抗体反应等所需反应的种类来适当地选择缓冲液的组成及使用比例。

上述接合体垫作为具有与以上所述的靶物质发生反应的第一规定量的第一配体、与第一配体相结合的信号检测标记物质的垫，上述第一配体和上述标记物质可从样本展开之前以接合体的形态相连接来存在于接合体垫，或者能够以互不相连而分离的状态存在于接合体垫，并在样本展开时相互连接来形成接合体，或者能够以溶液相存在，并在使用之前添加到接合体垫来使用。

在本发明中，在存在于上述接合体垫内的第一配体的情况下，可以仅存在已决定的特定量。即，上述第一规定量意味着上述第一配体存在于接合体垫内的特定量。由于第一配体在接合体垫内以第一规定量存在，因此，随着样本内的靶物质的浓度增加，第一配体和靶物质结合而成的复合物的数量增加，相反，未与靶物质相结合的裸露接合体的数量减少，从而可以呈现出反比关系。

优选地，上述接合体垫能够以第一配体和标记物质已连接的接合体状态存在于上述垫内。此时，如上所述，可以在垫适用已知浓度的上述接合体溶液来进行准备。

进而，上述接合体垫还可以包含第二接合体，上述第二接合体由第二配体和标记物质相结合，以作为内部对照组(internal control)来使用。上述第二配体意味着能够与对照线的物质特异或非特异地发生反应的配体。上述第二接合体可以与对照线的物质相接合来确认样本的展开。针对上述对照线的更加具体的说明将进行后述。

上述检测垫作为流动相和样本展开的介质，流动相和样本可通过形成检测垫的多孔性膜结构的毛细管现象来移动。进而，上述检测垫可以由上述测试线及上述对照线隔离而成。上述检测垫的一末端可以与上述接合体垫相连接，上述检测垫的另一末端可以与提供用于移送样本的驱动力的吸湿垫相连接。上述接合体垫和上述吸湿垫的一部分可以重叠于检测垫。上述检测垫可以由多孔性膜结构形成，而作为上述多孔性膜结构，可以利用硝化纤维膜结构(nitrocellulose membrane)、玻璃纤维(glass fiber)膜结构、聚醚砜(polyethersulfone；PES)膜结构、纤维素(cellulose)膜结构、尼龙(nylon)膜结构及它们的组合，优选地，可以使用气孔为5um至15um的硝化纤维膜结构，但并不局限于此。

对本发明的利用色谱带的定性及定量分析原理进行更加具体的说明。

利用以往的竞争反应的色谱带在检测垫固定与靶物质相同的物质或其类似物来形成测试线，而在包含所展开的样本的流动相中不存在靶物质时，第一配体-标记物质以与测试线的靶物质相结合的方式得到捕获，从而产生信号。在样本内存在靶物质的情况下，第一配体和靶物质发生特异反应，来生成靶物质-第一配体-标记物质的复合物，并沿着流动相展开，而与测试线的靶物质形成复合物的量会随着流动相所包含的靶物质-第一配体-标记物质的量而减少(竞争反应)。此时，信号的强度会随着样本内的靶物质的浓度增加而减少。此时，当第一配体和测试线的靶物质发生反应时，因强大的特异结合力而在样本内存在少浓度的靶物质，此时，若使用单一的测试线，则及时发生样本内的靶物质和第一配体的结合，也不会影响测试线的靶物质-第一配体-标记物质的复合物的形成，并且，在通过肉眼或传感器来确认测试线的发色时，几乎不会呈现出变化，因此，只有在样本内存在某种程度的高浓度的靶物质的情况下，才会发色竞争反应，从而降低敏感度，且定量分析范围小，由此，在进行靶物质的定量分析方面存在巨大的制约。

但是，在本发明中，不同于在利用普通竞争反应的色谱带中使用单一测试线，使用引起固定有靶物质或类似物的2个以上的竞争反应的测试线，从而即使样本内的靶物质的浓度降低，也可以进行分析，由此提高敏感度，并可在广的范围内进行定量分析。如图2所示，在使用3个测试线的情况下，若按接近接合体垫的顺序给测试线编号，则测试线1(T1)(包含样本的流动相最先接近的测试线)的信号最强，越靠近测试线2(T2)及测试线3(T3)，信号逐渐减少，并可以分别获得基于针对测试线1的样本内的靶物质的浓度的竞争反应的定量图表、测试线2的定量图表、测试线3的定量图表。因此，随着样本内的靶物质的浓度范围，在低的浓度使用测试线3的图表，在中间浓度使用测试线2的图表，在高浓度中使用测试线1的浓度来选择适当的浓度范围，因此，既可以提高靶物质的敏感度，又可以扩大从低浓度至高浓度的定量测定范围(Dynamic range)。在测试线接合体垫中可以针对第一规定量的第一配体利用样本内的靶物质以及与固定在检测垫的测试线的靶物质相同的物质或其类似物的竞争反应来定量分析靶物质的浓度，并适用于一个带，因此，与以往的色谱分析法相比，具有改善迅速性、使用方便性，尤其改善定量分析可能性的特征。

具体地，若向本发明的带的样品垫导入液相样本，则开始进行流动相和样本的展开。在接合体垫中，第一规定量的多个第一配体与样本内的靶物质发生特异反应。第一规定量的第一配体中的一部分与样本内的靶物质发生反应，从而在具有上述第一配体及标记物质的接合体形成结合有靶物质的复合物，相反，未与靶物质发生反应的剩余第一配体以裸露接合体的状态与流动相一同展开。在此，由于第一配体以第一规定量恒定，因此，具有样本内的靶物质的浓度越增加，所形成的上述复合物的数量相对增加，相反，上述裸露接合体的数量相对减少的特征。

未与上述样本内的靶物质相结合而具有第一配体及标记物质的裸露接合体在展开的过程中被固定有靶物质或其类似物的多个测试线捕获，此时，根据测试线的位点，呈现出不同的信号。并且，具有上述第一配体、标记物质及靶物质的复合物在展开的过程中不会被测试线捕获而与流动相一同展开。裸露接合体被测试线捕获来呈现出信号，具有第一配体、标记物质及靶物质的复合物不会被捕获而不会呈现出信号。

上述复合物及裸露接合体均具有标记物质，因此，可测定从基于它们之中被测试线捕获的上述裸露接合体的测试线的标记物质的信号来测定样本内是否存在靶物质、量或同时测定这两个。

如上所述，在上述裸露接合体中，随着样本内的靶物质的浓度增加，其数量减少，相反，上述复合物的数量随着样本内的靶物质的浓度增加而增加。因此，来自裸露接合体被捕获的测试线的信号强度呈现出随着样本内的靶物质的浓度增加而减少的形态。并且，由于使用多个测试线，因此，如图4所示，以使用3个测试线和1个对照线为例，若按接近接合体垫的顺序进行编号，则测试线1(包含样本的流动相最先接触的测试线)因裸露接合体及测试线的靶物质的结合而使信号变得最强，并且，根据样本内的靶物质的量而最晚出现信号减少的反应。然后，在测试线2的情况下，与流动相一同展开的裸露接合体的量因与测试线1发生反应而减少，并在低于测试线1的浓度中出现随着样本内的靶物质的量而减少测试线的信号的反应，而在测试线3的情况下，与流动相一同展开的裸露接合体的量与测试线1及测试线2发生反应来进一步减少，并在低于测试线2的浓度中出现随着样本内的靶物质的量而减少测试线的信号的反应，与此同时，能够以如图7所示的方式获得基于各个测试线1的样本内的靶物质的浓度的竞争反应的定量图表、测试线2的定量图表、测试线3的定量图表，因此，如图7所示，根据样本内的浓度范围，在低浓度的测定范围(T3)中可以使用测试线3的图表，在中间浓度的测定范围(T2)中可以使用测试线2的图表，在高浓度测定范围(T1)中使用测试线1的图表，并通过一次实验来选择适合每个浓度范围的定量图表来使用于定量，因此，可以提高靶物质的敏感度，扩大从低浓度到高浓度(T1～T3，Overall dynamic range)的定量测定测试范围(Dynamic range)。

更具体地，如图7所示，直到样本内的靶物质的浓度低的M1值为止，来自上述测试线1的信号强度得到恒定维持，基于此来增加浓度，并逐渐减少信号，最终收敛信号强度为0，直到样本内的靶物质的浓度低的M2值为止，来自测试线2的信号强度得到恒定维持，基于此来增加浓度，并逐渐减少信号，最终收敛信号强度为0，直到样本内的靶物质的浓度低的M3值为止，来自测试线3的信号强度得到恒定维持，基于此来增加浓度，并逐渐减少信号，最终收敛信号强度为0，因此，呈现出基于测试线1的可定量测定范围T1、基于测试线2的可定量测定范围T2、基于测试线3的可定量测定范围T3，这表示作为在1个测试线中相当于N个测定范围的T1～TN为止，根据测试线的数量向范围低的浓度移动。在测试线的情况下，如上所述，呈现出随着靶物质的量增加，信号的强度减少的形态。在图4及图6中示出了这种本发明的由靶物质的浓度的增加引起的多种测试线的强度的形态。

最终，可通过与引起上述竞争反应的2个以上的测试线所捕获的第一配体相接合的标记物质的信号来进行针对靶物质的定性及定量分析。更具体地，可将上述测试线的信号与针对已知浓度的靶物质预先完成的标准信号数据相比较来分析靶物质的浓度。这可以通过肉眼确认信号的强度来进行半定量分析，或者可以使用密度计(densitometer)之类的阅读器(reader)来进行更加精密的定量分析。

在本发明中，上述检测垫还可以具有对照线，上述对照线可以确认样本的展开。

本发明所使用的术语“对照线(control line)”意味着样本或样本中与靶物质的浓度无关地表示规定信号的部分。上述不变对照线可利用与上述测试线类似的方法来形成。只不过，上述对照线可通过固定不与所要分析的物质(靶物质)相结合而与样本一同与通过流动相来沿着检测垫移动的第二接合体的第二配体进行特异结合或非特异结合来进行捕获的物质来形成。或者，上述对照线可通过固定与样本一同与通过流动相来沿着检测垫移动的，结合有标记物质或标记物质的额外的物质进行特异结合或非特异结合来进行捕获的物质来形成。结果，通过固定可以与样本中的靶物质的浓度及存在与否无关地放出规定信号的物质来形成。可使用于上述对照线的物质可使用抗兔IgG，抗鸡、抗IgY、链霉亲和素(streptavidin)，牛血清白蛋白等。

在上述对照线固定特定浓度的物质的情况下，在此产生的信号的强度始终恒定，因此可将N个测试线中的信号强度与对照线的信号强度相比较来按其比呈现，从而可以更容易地掌握，并且，可以确定当靶物质的浓度达到何种程度时，测试线的强度产生何种程度。对照线的信号强度可以与测试线的信号强度进行比较来利用于定量分析。即，可使用上述对照线和各测试线的信号强度之比作为内部标准信号数据。

例如，如图7所示，形成有3个测试线，并且，若通过已知浓度的靶物质来确认了在测试线1、测试线2、测试线3针对对照线分别呈现出10倍、5倍、3倍的信号时，呈现出10ng/ml的浓度，在测试线1、测试线2、测试线3针对对照线分别呈现出5倍、3倍、1倍的信号时，呈现出10ng/ml的浓度，则之后对作为未知浓度的靶物质进行分析，结果，测试线1、测试线2、测试线3针对对照线分别放出7倍、4倍、2倍的信号，由此可知靶物质的浓度在10～30ng/ml之间。与多个测试线的对照线的信号强度相比较，不仅可以通过阅读器之类的方便的POCT医疗设备来容易地掌握浓度，而且可以用肉眼来容易地掌握浓度。

使用上述多个竞争反应的测试线的位点和数及对照线的位点可根据所使用的抗原-抗体反应等而适当地选择，本发明并不局限于此。可从上述对照线信号的存在与否来确认是否存在样本的成功展开，并将测试线的信号的强度和对照线的信号的强度与已决定的标准信号数据相比较来执行靶物质的定量分析。对上述标准信号数据将进行后述。

在本发明中，通过在固定的多个测试线基于在相同的浓度呈现出的互不相同的信号强度及对照线的信号强度的定量分析的情况下，样本内的靶物质的浓度测定范围(dynamic range)可以在0.1ng/ml至1mg/ml之间。本发明的色谱带使用多个测试线，并使用在利用在相同的浓度中呈现出不同强度的多个测试线来引起靶物质的竞争反应的单一测试线中无法进行分析的低浓度及高浓度中分别适合的测试线，因此，具有使多个测试线通过在单一的带内的组合来进行以往只使用测试线就无法进行的定量测定，可以扩大浓度额定范围，提高敏感度。

对本发明的色谱带的结构进行更加具体的说明。

上述色谱带可以包括：样品垫，导入用于确认是否包含靶物质的样本；接合体垫，上述接合体垫的一末端与上述样品垫相连接；检测垫，上述检测垫的一末端与上述接合体垫的另一末端相连接；吸湿垫，上述吸湿垫的一末端与上述检测垫的另一末端相连接，上述吸湿垫提供用于从上述样品垫移送样本的驱动力；以及固体支架，位于上述色谱带的下部。在图3示出了本发明的色谱带的结构图。

上述固体支架可以由选自由硝化纤维、尼龙、聚偏氟乙烯(PVDF)、玻璃及塑料组成的组中材料形成。在上述固体支架上附着带来制作，从而既可以提高带的耐久性，又可以使处理及保管变得容易。并且，还可以容易地安装外部外壳。可以使用聚丙烯(polypropylene)膜、聚酯纤维(polyester)膜、聚碳酸酯(polycarbonate)膜、丙烯酸(acrylic)膜等作为上述固体支架来使用的塑料材质，但并不局限于此。

作为一实施方式，本发明提供诊断试剂盒，作为在上述外壳内还固定上述色谱带的试剂盒，在上述诊断试剂盒的下部外壳具有引导件及条支撑部，在上述诊断试剂盒的上部外壳具有样本投入口及在与测试线或对照线相对应的位点具有结果确认窗口。

上述色谱带还可以追加固定于外壳内。可以在下部外壳的内部设置有多个引导件和/或条支撑部，上述多个引导件和/或条支撑部用于使上述色谱带配置于适当的位点，并实施固定或压接。选择性地，在与设置在下部外壳的引导件及条支撑部相对应的位点，引导件及条支撑部也可以设置于上部外壳。即，上述引导件和/或条支撑部可根据需要形成于下部外壳或同时形成于上部外壳及下部外壳。并且，可以在上部外壳设置有样本投入口及结果确认窗口，上述结果确认窗口用于在与测试线、对照线相对应的位点检测来自标记物质的信号。上述样本投入口可以在检测垫的一末端，即，在以测试线为基准的吸湿垫的反侧末端，同时以使样本可以沿着膜结构展开的方式充分与测试线相隔开的地点形成为孔或缝隙等形态。上述结果确认窗口可在检测垫上包括多个测试线及对照线从外部通过肉眼或传感器来进行识别，从而能够以充分的大小形成。只要可以确认上述多个测试线及对照线，其大小及及形状不受限制。

上述上部外壳及下部外壳可利用通常的塑料原材料来制作，例如，可利用聚碳酸酯、丙烯腈丁二烯苯乙烯(acrylonitrile butadiene styrene；ABS)等原材料，但并不局限于此。上述上部及下部外壳可以单独设置，并具有结合槽、结合突起等来以通常的方法相结合，而根据情况，可制作成一体型。

进而，上述诊断试剂盒还可以一同提供标准信号数据，上述标准信号数据包括针对含有多种已知浓度的靶物质的多个样本的多个测试线和对照线的颜色标准表。

在本发明中，上述标准信号数据意味着对含有多种已知浓度的靶物质的样本使用本发明的色谱带来整理各自的多个测试线及对照线中的信号强度的数据。这种标准信号数据可以被整理为多种形态，代表性地，按各个靶物质的浓度相对应的多个测试线和对照线的颜色进行整理。相似地，举例说明了在用于测定pH的石蕊试纸的情况下，一同提供整理与各个pH相对应的试纸的颜色的颜色标准表。尤其，在包括上述颜色标准表的标准信号数据的情况下，由于可以简单地使用肉眼来容易地与标准信号数据比较靶物质的信号的强度，因此，可以简单和迅速地进行半定量分析。与此相关地，上述诊断试剂盒可以从上述多个测试线和上述对照线中通过肉眼来确认是否存在标记物质的信号及信号强度，从而可以执行定性或半定量分析。即，可通过肉眼来比较以上所提供的包括颜色标准表的标准信号数据以及在上述试剂盒展开样本后呈现在上述多个测试线和上述对照线的信号的存在与否及强度，从而可以分析样本内是否存在靶物质及其浓度。

作为另一实施方式，本发提供分析方法，其作为使用上述色谱带来对样本内的靶物质进行定性或定量分析的方法，包括：第一步骤，使样本投入于上述接合体垫或位于其之前的垫来进行展开；第二步骤，从测试线和对照线确认是否存在标记物质的信号及信号强度；以及第三步骤，与标准信号数据比较从测试线和对照线确认的信号强度，并测定靶物质的量，上述标准信号数据为针对包含多种浓度的靶物质的多个样本分别执行上述第一步骤及第二步骤来获得的。

使用本发明的色谱带来对样本内的靶物质进行定性和/或定量分析的方法的具体原理如同以上所述。进而，标准信号数据同样与如上所述相同。

在执行具体的分析方法方面，可按以下顺序进行。首先，可在上述接合体垫或位于之前的垫投入含有所要分析的物质(靶物质)的液相样本。即，虽然液相样本可直接投入到接合体垫来在带中导入样本，但优选地，在接合体垫之前，例如，可向样品垫投入来进行导入。并且，上述样本可添加PBS之类的缓冲液来进行均匀的混合，并将此通过相同的方法向带导入。

如上所述，若样本装入(导入)色谱带，则开始进行展开，之后，可通过对照线来确认是否很好地完成样本的展开。若很好地完成样本的展开，则从多个测试线和对照线确认是否存在标记物质的信号及信号强度。若从多个测试线确认信号的变化，则这表示靶物质包含于样本内(定性分析)。进而，与标准信号数据比较从多个测试线和对照线确认的信号强度，从而可以确认靶物质以何种浓度包含于样本内(定量分析)。

在本发明的具体实施例中，执行利用还包括对照线的色谱用浸渍(dip)带的兔免疫球蛋白(rabbit IgG；靶物质)的分析，从而确认了可在样本内的靶物质的浓度为1ug/ml至5000ug/ml范围内利用荧光阅读器(reader)进行可靠性高的广范围的定量分析(图6)。

作为用于进行本发明的分析的样本，不仅包含普通的水溶液，还包含哺乳类，优选地，包含从人类分离的全血、血球、血清、血浆、骨髓液、汗液、尿液、眼泪、唾液、皮肤、粘膜、毛发等所有生物试样，例如，可以为血液。血液既可以使用除去血球成分的血清或血浆成分，在利用全血的情况下，可在缓冲液追加可分解(lysis)血球成分的成分来使用。这是例示性的，用于进行本发明的分析的样本不受特殊限制。

本发明的分析方法可有利于肽蛋白质等大小小或可仅使用一个结合位点的蛋白质、维生素D、hIgG、hIgE、过敏原、抗生素等各种药物等的半定量或定量诊断。

发明的效果

本发明的色谱带具有利用多个竞争测定反应的测试线，从而可以克服靶物质定量测定的困难，并且，不仅可以利用荧光阅读器来进行定性分析，而且可以方便地执行可靠性高的定量分析。进而，使用多个测试线来具有改善分析物质的敏感度和浓度测定范围的效果。

附图说明

图1为表示使用于通常的色谱分析的试纸条的剖面的概要图。

图2为表示使用于本发明的色谱分析的试纸条的概要图。

图3为基于本发明的概要的色谱带的示意图。

图4为表示在本发明的色谱带中导入样本之前及导入样本之后的多个测试线及对照线的形态的概要图。

图5为用于本发明一实施例的浸渍(dip)带方法的示意图。

图6为对本发明一实施例的多种样本内的靶物质的浓度的分析结果进行比较来示出的图。使用兔免疫球蛋白(rabbit IgG)作为靶物质。

图7为通过本发明的概要的多个测试线来导出的定量图表。

图8为基于本发明的实验结果来呈现的对基于多个测试线的靶物质的浓度的各个信号强度表示的定量图表，表示定量测定范围。

具体实施方式

以下，通过实施例来对本发明进行更为详细的说明。这些实施例用于更具体地说明本发明，本发明的范围并不局限于这些实施例。实施例使用了作为色谱分析法中的一个的浸渍带(dip strip)方法。

实施例1：色谱用浸渍(dip)带的制作

A.形成有测试线的检测垫的制作

在硝化纤维素膜(nitrocellulose membrane)分株3个测试线。利用层压机(laminator)来在塑料靠层压(lamination)了硝化纤维素膜。之后，将rabbit IgG(rabbitimmunoglobulin G，Arista，USA)作为测试线的靶物质或类似物，并利用自动分株机来在测试线1、测试线2、测试线3的位点中以规定的间隔进行分株后，在25～30℃的条件下进行了2日(48小时)的干燥。

B.吸收垫(absorbance pad)的制作

吸收垫以在干燥机中完全干燥水分的状态下不经由任何处理来使用，并按适当的大小对此进行切割来准备。

C.色谱带的制作

按图5所示的结构组装了通过以上的各过程来准备的检测垫及吸收垫。

即，在附着有贴纸的塑料支架附着检测垫，并以重叠的方式附着检测垫的一末端和吸收垫的一末端。使用切割机按2±1.0mm对此进行切割，并制作了如图3所示的带。

在图5中，各个附图标记的含义如下。

1：吸湿垫；18±4×4±2mm

2：硝化纤维素检测垫；25±5×4±2mm

3：固定有兔免疫球蛋白的测试线1、测试线2、测试线3

4：塑料支撑体

实施例2：利用色谱用浸渍(dip)带的分析

在96well plate中分别分株了100μl的包含作为靶物质的兔免疫球蛋白(rabbitIgG)和磷酸盐缓冲液(PBS)的样本溶液。在样本溶液中以兔免疫球蛋白的浓度分别成为0、5、10、50、100、500、1000、5000ug/ml的方式进行了准备。在样本溶液中添加标记物质(荧光)-第一配体(抗兔免疫球蛋白)溶液作为第一规定量。

在装有上述样本溶液的96well plate放入在上述实施例1中制作的色谱用浸渍带后进行了10分钟的展开。

图6为表示基于作为靶物质的兔免疫球蛋白的浓度的色谱带的展开结果的图。

确认了针对测试线1、测试线2、测试线3，信号的强度根据靶物质的浓度而变得不同，并可以获得不同浓度的定量曲线。

并且，可以确认上述色谱带的靶物质的浓度测定范围(dynamic range)广泛出现在5ug/ml以下至5000ug/ml以上。

Claims (17)

1.一种色谱带，具有接合体垫及检测垫，上述色谱带的特征在于，上述接合体垫具有与靶物质发生反应的第一配体及与上述第一配体相结合的信号检测标记物质，或者在样本展开之前或样本展开时相互连接来形成第一接合体，当样本展开时，接合体能够向检测垫移动，上述检测垫由2个以上的测试线相隔离而成，在上述2个以上的测试线分别固定有与靶物质相同的物质或其类似物，从而能够与不与样本内的靶物质相结合的裸露接合体发生反应，

当使用多个测试线时，随着测试线的数量增加至N(N≥2)，信号的强度恒定维持至浓度Mn值，而当测试线的数量超过N(N≥2)时，信号的强度逐渐减少，最终信号强度收敛为0；

所述多个测试线上固定有相同的与靶物质相同的物质或其类似物，且以相同的量进行固定；

上述接合体垫具有不与靶物质发生反应的第二配体及与上述第二配体相结合的信号检测标记物质，在样本展开之前或样本展开时，第二配体与标记物质相连接来形成第二接合体，当样本展开时，第二接合体能够向检测垫移动，上述检测垫还具有能够确认样本的展开的对照线，在上述对照线固定有不与靶物质或第一接合体发生反应的物质，上述对照线用物质能够与不与靶物质相结合的第二接合体发生反应；

使用上述对照线和所述多个测试线中各测试线的信号强度之比作为内部标准信号数据。

2.根据权利要求1所述的色谱带，其特征在于，上述第一配体在接合体垫内以规定量存在，其中一部分与样本内的靶物质发生反应，来形成在具有上述第一配体及标记物质的第一接合体结合有靶物质的复合物，并且，随着样本内的靶物质的浓度增加，所形成的上述复合物的数量也增加，相反，裸露接合体的数量减少。

3.根据权利要求2所述的色谱带，其特征在于，具有上述第一配体、标记物质及靶物质的复合物未被测试线所捕获，不与上述样本内的靶物质相结合，而具有第一配体及标记物质的裸露接合体与以规定量固定于测试线的靶物质的相同的物质或其类似物发生反应，从而被测试线所捕获来呈现出信号，并能够从上述测试线的标记物质测定信号来测定样本内的是否存在靶物质、靶物质的量或能够同时测定这两种。

4.根据权利要求3所述的色谱带，其特征在于，来自固定于检测垫的所有测试线的信号强度随着样本内的靶物质的浓度增加而减少。

5.根据权利要求4所述的色谱带，其特征在于，样本内的靶物质的浓度达到M值为止，来自上述测试线的信号强度得到恒定维持，当样本内的靶物质的浓度超过M值时，来自上述测试线的信号强度逐渐减少，最终信号强度收敛为0，上述M值为与以规定量固定于上述测试线的靶物质相同的物质或其类似物均与上述裸露接合体发生反应来实现饱和的情况下的样本内的靶物质的最大浓度。

6.根据权利要求1所述的色谱带，其特征在于，上述色谱带包括:

样品垫，导入用于确认是否包含靶物质的样本；

上述接合体垫，上述接合体垫的一末端与上述样品垫相连接；

上述检测垫，上述检测垫的一末端与上述接合体垫的另一末端相连接；

吸湿垫，上述吸湿垫的一末端与上述检测垫的另一末端相连接，并提供用于从上述样品垫移送样本的驱动力；以及

固体支架，位于上述色谱带的下部。

7.根据权利要求6所述的色谱带，其特征在于，上述支架由选自由硝化纤维、尼龙、聚偏氟乙烯、玻璃及塑料组成的组中的材料形成。

8.根据权利要求1所述的色谱带，其特征在于，上述配体为蛋白质、抗原、抗体、DNA、RNA、PNA或核酸适配体。

9.根据权利要求1所述的色谱带，其特征在于，上述标记物质为胶体金、乳胶粒子、有色聚苯乙烯微细粒子、酶、荧光染料、传导性高分子、发光物质或磁性粒子。

10.根据权利要求1所述的色谱带，其特征在于，靶物质能够与配体相结合的部位仅为一个。

11.根据权利要求1所述的色谱带，其特征在于，样本内的靶物质的浓度测定范围在1ng/ml至1mg/ml之间。

12.一种诊断试剂盒，作为在上述试剂盒的外壳内固定权利要求1至权利要求11中任一项所述的色谱带的试剂盒，其特征在于，在上述诊断试剂盒的下部外壳具有引导件及条支撑部，在上述诊断试剂盒的上部外壳具有样本投入口及在与测试线或对照线相对应的位点具有结果确认窗口。

13.根据权利要求12所述的诊断试剂盒，其特征在于，还提供标准信号数据，上述标准信号数据包含针对含有多种浓度的靶物质的多个样本的测试线和对照线的颜色标准表。

14.根据权利要求13所述的诊断试剂盒，其特征在于，能够进行从上述测试线和上述对照线通过肉眼来确认是否存在标记物质的信号及信号强度的定性或半定量分析。

15.根据权利要求13所述的诊断试剂盒，其特征在于，能够进行从上述测试线和上述对照线使用包括阅读器的医疗设备来确认是否存在标记物质的信号及信号强度的定量分析。

16.一种分析方法，作为使用权利要求1至权利要求11中任一项所述的色谱带来对样本内的靶物质进行定性或定量分析的方法，其特征在于，包括：

第一步骤，使样本投入于上述接合体垫或位于其之前的垫来进行展开；

第二步骤，从测试线和对照线确认是否存在标记物质的信号及信号强度；以及

第三步骤，与标准信号数据比较从测试线和对照线确认的信号强度，并测定靶物质的量，

上述标准信号数据为针对包含多种浓度的靶物质的多个样本分别执行上述第一步骤及第二步骤来获得的。

17.根据权利要求16所述的分析方法，其特征在于，使用密度计来从上述第二步骤的测试线和对照线确认是否存在标记物质的信号及信号强度。