KR102346178B1 - 면역 크로마토그래피용 스트립, 키트 및 이를 이용하는 경쟁적 면역 크로마토그래피 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 액상 검체를 수용하는 검체패드, 검체패드의 일측에 연결되며 표지물질 및 표적물질 유사체를 수용하는 접합체패드, 상기 접합체패드의 일측에 연결되며 검사선, 제1 대조선 및 제2 대조선을 포함하는 검출패드 및 상기 검출패드의 일측에 연결되며 반응 후 잔존하는 액상을 수용하는 흡습패드를 포함하고, 상기 검사선은 제1 리간드를 포함하며, 상기 제1 리간드는 표적물질 및 제1 접합체와 반응할 수 있고, 상기 제1 대조선은 제2 접합체와 반응하는 제2-1 리간드를 포함하며, 상기 제2 대조선은 제2 접합체와 반응하는 제2-2 리간드를 포함하되, 상기 제2-1 리간드와 상기 제2-2 리간드의 농도는 서로 상이하여 검체 내 표적물질의 정성적 분석 및 정량적 분석을 편리하게 수행할 수 있는 면역 크로마토그래피용 스트립을 제공한다.

Description

면역 크로마토그래피용 스트립, 키트 및 이를 이용하는 경쟁적 면역 크로마토그래피 분석 방법 {STRIPS, KITS FOR IMMUNOCHROMATOGRAPHY AND COMPETITIVE IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAYS USING THE SAME}

본 발명은 경쟁적 면역측정 반응을 이용하는 검사선을 구비한 면역 크로마토그래피용 스트립, 상기 면역 크로마토그래피용 스트립을 구비한 진단 키트 및 이를 사용하여 검체 내 표적물질을 정성 또는 정량 분석하는 방법에 관한 것으로서 더욱 상세하게는 상기 면역 크로마토그래피용 스트립을 구비한 진단 키트를 사용하여 초유 검체 내 면역글로불린 지(IgG)를 정성 또는 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.

래피드 테스트 (rapid test)법으로 알려진 면역 크로마토그래피 분석법은 항원-항체 반응을 이용하여, 미량의 표적물질 (analyte)을 단시간에 정성 및 정량적으로 분석할 수 있는 방법으로서, 각종 질병의 진단 또는 검사를 비롯하여, 의학, 농업, 축산업, 식품, 군사, 환경 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 이러한 면역 크로마토그래피 분석에는 검출하고자 하는 표적물질과 반응하여 변화를 나타낼 수 있는 반응물질을 포함하는 분석 스트립 (assay strip) 또는 상기 분석스트립을 플라스틱 케이스에 장착한 디바이스 형태의 분석장치가 일반적으로 사용되고 있다.

통상적인 분석 스트립은 액상 검체를 수용하는 검체 패드, 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 신호를 발생시키는 표지 (예를 들어, 골드입자)물질을 항원, 항체 등의 리간드에 접합시킨 접합체 (conjugate)를 함유하는 접합체 패드, 검체 중의 표적물질 및/또는 상기 접합체와 특이적으로 결합하는 결합제 (항체 또는 항원)를 고정시킨 검사선과 검체의 전개를 확인할 수 있는 대조선이 형성된 검출패드 및 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드로 구성되며, 이러한 기능성 패드들은 상기 나열한 순서대로 일부 중첩된 형태로 연결되어 고체 지지체 상에 부착되어 연속적으로 배열된다. 상기 분석 스트립이 플라스틱 케이스 내부에 장착되어 사용되는 경우, 케이스의 상부에는 샘플 패드의 위치에 검체를 적하하기 위한 검체 투입구가, 검출패드의 결합제가 고정된 위치에는 검사 결과를 확인하기 위한 결과 확인 창이 형성된다. 이와 같이, 분석 스트립을 이용한 면역 크로마토그래피 분석법에 있어서, 검체 패드에 액상 검체를 적하하면, 액상 검체는 모세관 현상에 의하여 접합체 패드 및 검출패드를 통하여 이동하며, 최종적으로 흡습 패드에 수용된다. 예를 들어, 측정하고자 하는 항원과 결합할 수 있는 항체를 맴브레인 패드에 라인형으로 고정시키고 (검사선), 또 하나의 항체는 골드입자와 같은 표지물질에 결합시키고, 검체를 전개시킨다. 전개되는 검체는 접합체 패드를 거치면서, 일부는 항원-골드입자 항체의 복합체를 형성하여 전개되고, 상기 항원-골드입자 항체는 고정된 검사선에 포획되어 '검사선 고정된 항체-항원-골드입자 항체'가 형성된다. 이로써 상기 검사선 라인은 골드입자에 의하여 붉은 색으로 나타나게 된다. 이와 같이, 상기 접합체 패드에 함유되어 있던 접합체도 액상 검체와 함께 이동하여, 검체 중에 분석하고자 하는 물질이 존재하면, 접합체가 표적물질을 매개하여 검출패드에 고정된 결합제와 결합한다 (통상, "샌드위치 (sandwich) 반응"이라 한다). 그러나 샌드위치 면역분석법으로 분석할 경우 표적물질이 제1결합 항체, 제2결합 항체-표지물질에 결합하여 샌드위치 반응이 나타날 수 있도록 항체 또는 리간드의 결합부위 (epitope)가 2군데 이상이어야 하며 표적물질의 크기가 작은 경우 (펩타이드 단백질, 약물, 알러젠등) 은 입체 방해(Steric hinderence) 등에 의한 결합력 (binding affinity)의 문제, 항체가 생산되는 기원 동물 (host)등에 의한 특이성 (specificity), 민감도 (sensitivity) 및 상호 반응성 (cross-reactivity)의 문제가 발생할 수 있다.

상기의 원리를 통한 분석스트립을 이용하여, 검체 중 표적물질의 존재 여부를 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있다. 그러나 이러한 경쟁 반응을 사용한 래피드 키트의 손쉬운 대량생산 적용, 쉬운 사용방법 및 빠른 결과 판독, 비싸고 큰 전문 분석 장비가 필요 없어 저렴한 비용의 장점을 가지고 있으나 상대적으로 검출한계 (detection limit)가 낮다는 점 및 일반적으로 육안으로 판단하기 때문에 정량성이 부족하다는 점이 단점으로 꼽히고 있다. 또한 고농도의 표적물질을 정량 하는 것은 훅 효과(Hook effect) 때문에 정확한 양을 측정하기가 어렵기 때문에 여러 번 혹은 높은 희석배수를 사용해야 한다. 이러한 이유로, 종래 면역 크로마토그래피 분석법은 주로 정성적인 분석을 하는데 사용되고, 정량적인 분석을 하기에는 많은 한계가 있는 문제점이 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, 하나의 검사선 만으로도 검체 내 표적물질의 정량, 정성 분석 가능한 크로마토그래피용 스트립을 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, 검체 내 표적물질의 정성적인 분석뿐만 아니라, 육안, 또는 센서 등을 이용하여 신뢰도 높은 정량적인 분석이 가능하며 검체 내 표적물질과 직접 경쟁반응을 일으키는 하나의 검사선 만을 구비하지만 높은 농도의 표적 물질을 지정된 검체 양으로 누구나 빠르고 쉽게 정확한 정량이 가능한 면역 크로마토그래피용 스트립을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는, 상기 면역 크로마토그래피용 스트립을 포함하는 진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 면역 크로마토그래피용 스트립 또는 진단키트를 사용하여 검체 내 표적물질을 정성 분석 및 정량 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 액상 검체를 수용하는 검체패드, 검체패드의 일측에 연결되며 표지물질 및 표적물질 유사체를 수용하는 접합체패드, 상기 접합체패드의 일측에 연결되며 검사선, 제1 대조선 및 제2 대조선을 포함하는 검출패드 및 상기 검출패드의 일측에 연결되며 반응 후 잔존하는 액상을 수용하는 흡습패드를 포함하고, 상기 검사선은 제1 리간드를 포함하며, 상기 제1 리간드는 표적물질 또는 제1 접합체와 반응할 수 있고, 상기 제1 대조선은 제2 접합체와 반응하는 제2-1 리간드를 포함하며, 상기 제2 대조선은 제2 접합체와 반응하는 제2-2 리간드를 포함하되, 상기 제2-1 리간드와 상기 제2-2 리간드의 농도는 서로 다른 것을 특징으로 하는, 면역 크로마토그래피용 스트립을 제공한다.

구체적으로 본 발명은 검체 내 표적물질의 농도 측정범위(dynamic range)는 5 mg/ml 내지 140 mg/ml 인 면역 크로마토그래피용 스트립을 제공한다.

본 발명의 상기 제1 접합체는 표적물질 유사체와 표지물질의 결합으로 이루어지고, 이동상 내 상기 제1 접합체와 상기 검체 내 표적물질은 경쟁적으로 검사선의 제1 리간드와 반응하며, 상기 제1 접합체가 상기 검사선의 제1 리간드와 반응하는 경우 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 제1 복합체의 개수는 상기 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 감소하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피용 스트립을 제공한다.

구체적으로, 상기 제1 복합체는 검사선에 포획되어 신호를 나타내고, 상기 신호를 이용하여 상기 검체 내 표적물질의 양을 측정하는 면역 크로마토그래피용 스트립을 제공한다.

본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립은 상기 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 상기 검사선의 신호 세기는 감소할 수 있다.

또한 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립에서 상기 제1 리간드, 상기 제2-1 리간드 및 상기 제2-2 리간드는 단백질, 항원, 항체, DNA, RNA, PNA 및 압타머로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 이루어지며, 상기 제1 리간드는 상기 제2-1 리간드 및 상기 제2-2 리간드와 상이한 리간드로 이루어질 수 있다.

또한, 상기 표지물질은 금콜로이드 (colloidal gold), 라텍스 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자, 효소, 형광성 염료, 전도성 고분자, 발광 물질 및 자성입자로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 면역 크로마토그래피용 스트립을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 면역 크로마토그래피용 스트립이 케이스 내에 고정되는 키트로서, 상기 케이스는 상부 케이스 및 하부 케이스를 포함하며, 하부 케이스는 스트립 지지부을 포함하고, 상부 케이스는 검체 투입구 및 검사선 또는 대조선과 상응하는 위치에 결과 확인창을 포함하는 진단 키트를 제공된다.

또한, 상기 지지부는 니트로셀룰로스, 나일론, 피브이디에프 (PVDF), 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나로 이루어진 진단 키트가 제공된다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 검체 투입구에 검체를 포함하는 소정의 액체를 주입하는 단계, 검체패드에서 상기 액체를 수용하여 이동상을 형성하는 단계, 상기 이동상이 접합체 패드로 전개되며 제1 접합체를 포함하는 단계, 상기 제1 접합체를 포함하는 이동상이 검사선으로 전개되면서 상기 제1 접합체 및 상기 검체 내 표적물질이 경쟁적으로 제1 리간드와 결합하는 단계, 상기 제1 접합체가 상기 제1 리간드와 결합하여 제1 복합체를 형성하고, 형성된 제1 복합체가 표지물질에 따른 소정의 제1 신호를 나타내는 단계, 상기 이동상이 제2-1 리간드가 고정된 제1 대조선 및 제2-2 리간드가 고정된 제2 대조선으로 전개되는 단계, 농도가 서로 다른 상기 제2-1 리간드 및 제2-2 리간드에 제2 접합체가 결합되어 제1 대조선 및 제2 대조선에서 소정의 제2 신호를 나타내는 단계 및 상기 제1 신호 및 제2 신호에 따라 상기 검체 내 표적물질의 양을 분석하는 단계를 포함하는, 면역 크로마토그래피 분석 방법이 제공될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립은 직접적 경쟁 면역측정반응을 이용하는 검사선을 구비함으로써, 고농도의 표적물질을 정량 측정하는데 어려움을 극복하고, 육안으로 정성적 분석뿐만 아니라 신뢰성 높은 정량적 분석까지 신속하고 편리하게 수행할 수 있다. 나아가 한 개의 검사선과 각각 다른 농도 비로 구성된 두개의 대조선을 사용하여 표적물질의 민감도와 농도 측정 범위가 개선되고 나아가 사용자가 결과를 쉽고 빠르게 이해할 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 면역 크로마토그래피용 스트립이 포함된 진단 키트를 이용하여 검체 내 표적물질의 용량을 간편하게 측정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 표적물질의 용량 측정 시 민감도가 높은 면역 크로마토그래피 분석 방법이 제공된다.

도 1은 통상적인 면역 크로마토그래피 분석에 사용되는 분석 스트립의 단면을 나타낸 개요도이다.
도 2는 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석에 사용되는 분석 스트립을 나타낸 개요도이다.
도 3는 본 발명의 일 실시 예에 따른 면역 크로마토그래피용 스트립의 결과를 도출할 수 있는 방식의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립에 있어서, 담금 (Dipping) 검사 방식의 검체를 도입하기 전 검사선 및 불변 대조선의 양상을 나타낸 개요도이다.
도 5는 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립에 있어서, 담금 (Dipping) 검사 방식의 검체 도입 후의 검사선 및 불변 대조선의 양상을 나타낸 개요도이다.
도 6는 본 발명의 일 실시 예에 따른, 다양한 검체 내 표적물질의 농도에 대한 정량 분석 결과를 비교하여 나타낸 실제 스트립의 결과이다.
도 7은 본 발명의 실험 결과에 의해 나타나는 여러 개의 검사선의 표적물질의 농도에 따른 각각의 신호의 세기에 대하여 나타낸 정량 그래프이며 정량 측정 범위를 나타낸다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 또한, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발 명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.

도 1은 통상적인 면역 크로마토그래피 분석에 사용되는 분석 스트립의 단면을 나타낸 개요도이며, 도 2는 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석에 사용되는 분석 스트립을 나타낸 개요도이다.

도 1과 도 2를 참조하면, 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립(10)은, 액상 검체를 수용하는 검체패드(14), 검체패드의 일측에 연결되며 표지물질 및 표적물질 유사체를 수용하는 접합체패드(13), 상기 접합체패드(13)의 일측에 연결되며 검사선, 제1 대조선 및 제2 대조선을 포함하는 검출패드(12) 및 상기 검출패드(12)의 일측에 연결되며 반응 후 잔존하는 액상을 수용하는 흡습패드(11)를 포함하고, 상기 검사선은 제1 리간드를 포함하며, 상기 제1 리간드는 표적물질 또는 제1 접합체와 반응할 수 있고, 상기 제1 대조선은 제2 접합체와 반응하는 제2-1 리간드를 포함하며, 상기 제2 대조선은 제2 접합체와 반응하는 제2-2 리간드를 포함하되, 상기 제2-1 리간드와 상기 제2-2 리간드의 농도는 서로 상이할 수 있다.

구체적으로, 초유 속의 높은 농도의 표적물질(bovine IgG)을 정량 하고자 하는 상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 접합체패드 및 검출패드를 구비한 면역 크로마토그래피용 스트립에 있어서, 상기 접합체패드는 표적물질과 경쟁하는 일정량의 표적물질 유사체 및 유사체에 결합하는 신호검출 표지물질을 구비하고 이 유사체와 표지물질은 검체 전개 전 또는 검체 전개 시 서로 연결되어 제1 접합체를 형성한다. 검체 전개 시 상기 제1 접합체는 검출패드로 이동할 수 있으며, 상기 검출패드에는 검사선 및 대조선이 격리되어 구비되어 있고, 상기 검사선에는 검체 내 표적물질과 반응하는 제1 리간드가 고정되어 있으며, 이러한 검사선은 하나의 선으로 이루어진다. 대조선은 상기 제1 접합체 또는 검체 내 표적물질과 반응하지 않고, 검체 내 소정의 물질(일 예로 표지물질이 결합된 제2 접합체)과 반응하는 제2 리간드가 포함되어, 제2 접합체와 결합반응이 일어날 수 있도록 이루어진 면역 크로마토그래피용 스트립을 제공된다. 특히 본 발명에서의 상기 대조선은 제1 대조선과 제2 대조선을 포함할 수 있으며, 제1 대조선에는 제2-1 리간드가, 제2 대조선에는 제2-2 리간드가 고정될 수 있고, 제2-1 리간드와 제2-2 리간드는 서로 농도가 상이하여, 제2 접합체의 결합 비율이 서로 다르게 나타날 수 있다. 따라서, 제2 접합체의 제2 리간드 결합에 따른 신호의 세기가 각 대조선 별로 상이하게 나타나, 이를 이용하여 표적물질의 농도를 분석할 수 있는 것이다.

도 4는 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립에 있어서, 검체를 도입하기 전 검사선 및 불변 대조선의 양상을 나타낸 개요도이며, 도 5는 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립에 있어서, 검체 도입 후의 검사선 및 불변 대조선의 양상을 나타낸 개요도이다. 도 4 및 도 5를 참조하면, 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립을 이용하는 경우 육안으로 표적물질의 정량, 정성 분석이 가능함을 알 수 있다.

표적물질과 동일한 물질 또는 유사체를 검출하는 항체가 고정된 검사선 및 검체의 전개에 영향을 미치지 않는 면역반응 시스템으로 확인할 수 있는 대조선만이 형성된 두 개 라인 검출패드를 구비한 종래의 면역 크로마토그래피용 스트립과 다르게, 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립은 소정의 물질을 인식할 수 있는 리간드(제2 리간드)의 농도가 서로 다른 대조선 2개를 포함할 수 있다. 따라서, 육안 혹은 소정의 센서로 표적물질을 표시하는 검사선과 일정한 신호를 나타내는 2개의 대조선의 신호를 비교하여 검체 내 표적물질의 정성적 분석뿐만 아니라 신뢰성 높은 정량적 분석까지 수행할 수 있는'직접적 경쟁 면역 반응 시스템’을 이용한다는 점에 특징이 있다. 특히 본 발명은, 특수한 분석 기구를 사용할 필요 없이, 농도의 구획이 이루어진 2개의 대조선만을 사용하여 육안을 통해 누구나 신뢰성 높은 반정량적 분석을 수행할 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 용어 "면역 크로마토그래피"는 항원-항체반응에 기초한 면역반응 원리와 검체 및 시약이 이동상에 의해 매질을 따라 이동하는 크로마토그래피 원리를 결합시킨 분석방법이다. 간략히 살펴보면, 다공성 막 (membrane)에 분석하고자 하는 항체 또는 항원을 미리 분주시켜 고정하고 막의 일 말단으로부터 상기 고정시켜 놓은 항체 또는 항원을 향해 혈액을 전개시켜 혈액 중의 항원 또는 항체와의 반응을 관찰하는 것이다. 일반적인 의미의 면역반응은 항원-항체의 반응을 의미하나 본 발명에서는 광의적으로 항원-항체의 반응 이외에도 서로 간에 특이적으로 결합하는 수용체와 이에 특이적으로 결합하는 리간드의 반응도 포함하며, 이에 제한되지 않고, 효소와 기질 간의 반응 등 서로를 특이적으로 인식하여 일어나는 반응들까지 모두 포함할 수 있다.

면역 크로마토그래피에 의한 분석은 매질을 통하여 모세관 현상에 의해 이동상과 함께 표적물질을 포함하는 검체가 이동하면서 이루어진다. 따라서, 이러한 면역 크로마토그래피 전개를 위한 매질로서, 스트립을 제조하여 이용할 수 있다. 이러한 면역 크로마토그래피용 스트립의 구체적인 구성요소 및 각각의 기능은 후술할 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 상기 제1 접합체는 표적물질 유사체와 표지물질의 결합으로 이루어지고, 이동상 내 상기 제1 접합체와 상기 검체 내 표적물질은 경쟁적으로 검사선의 제1 리간드와 반응하며, 상기 제1 접합체가 상기 검사선의 제1 리간드와 반응하는 경우 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 제1 복합체의 개수는 상기 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 감소하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피용 스트립이 제공될 수 있으며, 상기 제1 복합체는 검사선에 포획되어 신호를 나타내고, 상기 신호를 이용하여 상기 검체 내 표적물질의 양을 측정할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립은 상기 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 상기 검사선의 신호 세기는 감소할 수 있다.

상기 표적물질 또는 표적물질 유사체와 리간드 사이의 반응(일 예로 항원-항체 반응)을 육안으로 또는 센서를 이용하여 용이하게 확인할 수 있도록 하기 위하여 표지물질을 이용할 수 있다. 또한 이러한 표지물질이 분석하고자 하는 표적물질과 경쟁할 수 있는 표적물질 유사체, 즉 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 표지물질을 연결시켜 이용할 수 있다.

본 발명의 용어 "제1 접합체 (conjugate)"는 표지물질과 상기 표적물질 유사체가 서로 연결되어 형성된 결합체를 의미하는 것으로, 상기 제1 접합체는 신호검출을 위한 표지물질 및 검체 내 표적물질과 경쟁하는 표적물질 유사체를 포함한다. "제2 접합체"는 검체 내 소정의 물질(혹은 임의로 주입된 소정의 물질)과 표지물질이 서로 연결되어 형성된 결합체를 의미한다.

상기 표지물질과 소정의 물질과 물리적 또는 화학적으로 연결될 수 있다. 즉, 표지물질과 표적물질 유사체가 수동 흡착 (passive adsorption)에 의해 연결되도록 할 수 있고, 반응성 그룹을 가지도록 표지물질을 개질 시켜 리간드와 공유결합으로 연결되도록 할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 표지물질과 표적물질 유사체(또는 검체 내 소정의 물질)의 연결은 당업자에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

단, 상기 표지물질과 표적물질 유사체는 면역 크로마토그래피용 스트립에 검체를 전개하기 전부터 제1 접합체의 형태로 연결되어 접합체 패드에 존재하거나 서로 연결되지 않고 분리된 상태로 접합체 패드에 존재하다가, 검체가 전개되면서 이들이 서로 연결되어 제1 접합체를 형성할 수 있다. 어느 경우이던, 검체 전개 시 표지물질과 표적물질 유사체는 제1 접합체의 상태로 검출패드로 이동할 수 있으며, 이는 이들이 접합체 패드에 고정되어 있는 것이 아니기 때문이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 표지물질은 금콜로이드 (colloidal gold), 라텍스 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자, 효소, 형광성 염료, 전도성 고분자, 발광 물질 및 자성입자로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 용어 "표지물질"은 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 신호를 발생시키는 물질을 의미한다. 상기 표지물질로는 금 콜로이드 (골드 입자), 라텍스 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자, 효소, 형광성 염료, 전도성 고분자, 발광 물질 또는 자성입자 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 상기 신호는 발광 등과 같이 표지물질의 내재적 특성에 의해 자체적으로 발생할 수 있는 것이거나, 형광 등과 같이 외부의 자극에 의해 발생하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면 상기 제1 리간드, 상기 제2-1 리간드 및 상기 제2-2 리간드는 단백질, 항원, 항체, DNA, RNA, PNA 및 압타머로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 이루어지며, 상기 제1 리간드는 상기 제2-1 리간드 및 상기 제2-2 리간드와 상이한 리간드로 이루어지는 면역 크로마토그래피용 스트립 제공된다.

본 발명의 용어 "리간드"는 서로 특이적으로 결합하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 특정 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드 등이 서로 리간드로 작용한다. 상기 리간드의 비제한적인 예로는 단백질, 항원, 항체, DNA, RNA, PNA 또는 압타머가 있을 수 있으며, 이외에도 본 발명에서 리간드는 상기 정의된 특성을 나타내는 물질이면 제한 없이 사용될 수 있다. 본 명세서 전반에서 사용된 리간드의 의미는 특정 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드라고 구체화하여 표기되지 않는 한 상기 정의된 바와 같이 서로 특이적으로 결합하는 물질을 의미한다.

본 발명의 바람직한 일 구현 예에 있어서, 표지물질과 표적물질 유사체가 미리 연결되어, 제1 접합체로서 접합체 패드에 존재할 수 있다. 이 경우, 표지물질과 또는 표적물질 유사체 각각을 기지농도의 용액으로 제조하여 혼합시킨 후 일정시간 반응하도록 하여 접합체 용액을 제조하고, 이를 접합체 패드에 분주하여 접합체가 구비된 접합체 패드를 준비할 수 있다. 이때, 각각의 용액의 농도 및 혼합비율은 표지물질과 표적물질 유사체의 결합 비를 고려하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기 표지물질과 표적물질 유사체의 결합은 하나의 표지물질에 하나의 표적물질 유사체가 결합하는 경우, 하나의 표지물질에 복수개의 표적물질 유사체가 결합하는 경우 또는 복수개의 표지물질이 하나의 표적물질 유사체에 결합하는 경우일 수 있다. 구체적인 결합 비는 중요하지 않으나, 바람직한 양태는 일정한 비율을 유지하는 것일 수 있다. 상기 결합 비는 표지물질과 표적물질 유사체의 종류에 따라 변할 수 있으며, 이들의 상대적인 크기 및 결합자리의 개수 등을 고려하여 예측될 수 있다. 예를 들어, 표지물질로서 수 마이크론 사이즈의 라텍스 비드를, 표적물질 유사체로서 항체를 사용하는 경우, 복수개의 항체가 1개의 라텍스에 결합할 수 있다. 바람직하게 각각의 라텍스 표면에 균일한 개수로 항체를 결합시키기 위하여 항체가 라텍스 표면에 포화되어 결합되도록 항체 및 라텍스 용액의 농도 및 혼합비율을 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기한 바와 같이 각각 기지농도의 표지물질과 표적물질 유사체를 혼합하여 반응시킴으로써 기지농도의 제1 접합체 용액을 얻을 수 있다. 상기 제1 접합체 용액은 일정 농도의 제1 접합체 분자가 용액 상에 균일하게 분산되어 있는 분산액의 형태이다.

도3을 참조하면, 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립은, 표적물질 또는 표적물질 유사체 특이적으로 결합하는 리간드를 사용하여 고정시킨 한 개의 검사선(T)을 구비하는 면역 크로마토그래피용 스트립으로서, 한 개의 검사선(T)과 두 개의 대조선(C1, C2)이 각각 격리되어 구비된 검출패드를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 이동상 내 상기 제1 접합체와 상기 검체 내 표적물질은 경쟁적으로 검사선의 제1 리간드와 반응하며, 상기 제1 접합체가 상기 검사선의 제1 리간드와 반응하는 경우 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 제1 복합체의 개수는 상기 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 감소하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피용 스트립이 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립은 상기 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 상기 검사선의 신호 세기는 감소할 수 있다.

본 발명은 검체 내 표적물질을 정성적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라 정량적으로도 분석할 수 있도록, 하나의 검사선을 검출패드에 고정하여 "직접적 경쟁면역반응 검사선 (directly competition immune response test line)"을 형성한다. 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립의 대조선의 제2 리간드는 검출패드에 전개되는 이동상 (mobile phase) 내의 표적물질, 표적물질 유사체 및 제1 접합체와 반응하지 않으며, 검출패드에 고정하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제1 리간드는 검출패드의 검사선에 고정되어 검체 내 표적물질, 표적물질 유사체 또는 제1 접합체와 반응을 일으키는 리간드를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 제2 리간드는 검출패드에 고정되어 대조선을 형성하는 리간드를 의미하며, 제1 리간드와 종류를 달리한다.

상기 제1 리간드, 제2-1 리간드 및 제2-2 리간드는 기결정된 특정량만큼을 사용하여, 신호 세기를 조절하고, 농도에 따라 변화하며 나타나는 검사선과의 신호세기와 비교를 통하여 검출 가능한 검체 내 표적물질의 농도범위를 조절하고, 나아가 신뢰성 높은 정량분석에 도움을 줄 수 있다.

본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립의 검사선에는 접합체 패드의 일정량의 표적물질, 표적물질 유사체 또는 제1 접합체와 반응하는 제1 리간드가 고정되며 대조선 두 개는 서로 양을 달리하거나 같게 하여 고정될 수 있다. 제1 리간드는 접합체 패드에 고정된 표적물질과 특이적으로 결합할 수 있기 때문에 제1 접합체는 검체 내 표적물질이 존재하지 않을 경우 이동상과 함께 전개되면서, 검출패드 내 제1 리간드를 고정시킨 검사선과 결합하여 제1 접합체-제1 리간드 복합체(제1 복합체)를 형성하고, 이에 따라 강한 신호를 나타낸다. 검체 내 표적물질이 존재할 경우 검체 내의 표적물질과 제1 접합체는 검출패드로 이동상으로 함께 전개되며 이때 표적물질의 양에 따라 검사선의 제1 접합체-제1 리간드 복합체를 형성하는 양이 줄어들고 이에 따라 신호가 줄어들게 된다. 즉 검체 내의 표적물질의 양에 따라 검사선의 신호가 비례하여 줄어들게 된다.

접합체 패드에 수용되는 제2 접합체는 제1 리간드와 반응하지 않으며 검출패드에 고정된 대조선의 제2-1 리간드 및 제2-2 리간드와 (결합)반응하여 신호를 나타낸다.

이러한 검체 내의 표적물질의 농도에 따라 나타나는 검사선 신호의 비와 대조선 신호를 비교하여 표적물질의 넓은 범위에서 정량적인 분석을 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 접합체가 상기 제1 리간드와 결합하여 제1 복합체를 형성하고, 형성된 제1 복합체가 표지물질에 따른 소정의 제1 신호를 나타내는 단계, 상기 이동상이 제2-1 리간드가 고정된 제1 대조선 및 제2-2 리간드가 고정된 제2 대조선으로 전개되는 단계, 농도가 서로 다른 상기 제2-1 리간드 및 제2-2 리간드에 제2 접합체가 결합되어 제1 대조선 및 제2 대조선에서 소정의 제2 신호를 나타내는 단계 및 상기 제1 신호 및 제2 신호에 따라 상기 검체 내 표적물질의 양을 분석하는 단계를 포함하는, 면역 크로마토그래피 분석 방법이 제공될 수 있다.

상기한 바와 같이 면역 크로마토그래피는 매질을 따라 표적물질을 포함하는 이동상이 이동하는 크로마토그래피의 원리를 이용한다. 따라서, 면역 크로마토그래피용 스트립을 이용한 면역분석을 위해서는 표적물질을 포함하는 검체를 스트립을 따라 이동시키기 위한 이동상을 필요로 한다. 이에 따라, 본 발명의 면역분석용 키트는 완충액을 추가로 포함할 수 있다. 상기 완충액은 면역 크로마토그래피용 스트립을 따라 검체를 이동시키는 이동상 (mobile phase)으로서 작용할 뿐만 아니라, 접합체를 용해시키는 용매로 작용할 수 있으며, 필요에 따라서는 검체를 희석시키기 위한 희석액으로서의 역할도 겸할 수 있다. 예를 들어 전 혈 분석을 하는 경우, 적혈구 등의 혈구성분을 용해 (lysis)시키기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 완충액으로는 100 mM 내지 1 M 농도의 탄산나트륨 완충액 (Sodium carbonate), 비이온성 또는 양쪽성 계면활성제 또는 이들의 혼합물 등 통상의 완충액을 제한 없이 사용할 수 있으며, 항원-항체 반응 등 원하는 반응의 종류에 따라 완충액의 조성 및 사용 비율은 적절히 선택될 수 있다.

상기 접합체 패드는, 앞서 설명한 표적물질과 경쟁하여 제1 리간드에 결합하는 표적물질 유사체 및 표지물질을 구비하는 패드로서, 상기 표적물질 유사체 및 표지물질은 검체가 전개되기 전부터 제1 접합체의 형태로 연결되어 접합체 패드에 존재할 수 있으며, 또는 서로 연결되지 않고 분리된 상태로 접합체 패드에 존재하다가, 검체가 전개되면서 이들이 서로 연결되어 접합체를 형성할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 접합체 패드 내에 존재하는 제1 접합체의 경우, 기결정된 특정량만 존재하도록 할 수 있다. 즉 상기 제1 접합체의 양은, 상기 표적물질 유사체가 접합체 패드 내에 존재하는 특정량을 의미한다. 접합체 패드 내 제1 접합체가 일정량으로 정해져 있기 때문에, 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록, 제1 접합체와 표적물질은 검사선의 제1 리간드와 결합 경쟁하면서 표적물질의 농도가 높아질수록 제1 접합체와 검사선의 표적물질 특이 리간드(제1 리간드) 결합 개수는 감소하게 된다. 이와 반대로 검체 내의 표적물질 농도가 낮아지면 제1 접합체와 검사선의 표적물질 특이 리간드(제1 리간드)사이의 결합 개수는 접합체의 개수는 증가하게 되는, 반비례적 관계를 보일 수 있다.

바람직하게는, 상기 접합체 패드는 표적물질 유사체와 표지물질이 이미 연결된 접합체 상태로 상기 패드 내에 존재할 수 있다. 이때, 앞서 설명한 바와 같이, 상기 기지농도의 접합체 용액을 패드에 적용하여 준비할 수 있다.

나아가 상기 접합체 패드는 내부대조군 (internal control)으로 이용할 수 있도록 특정 검출물질과 표지물질이 결합된 제2 접합체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제2 접합체는 대조선의 제2 리간드와 특이적 또는 비특이적으로 반응할 수 있다. 상기 제2 접합체는 대조선의 제2-1 리간드 또는 제2-2 리간드에 의해 포획되어, 검체의 전개의 유무를 확인하게 할 수 있다. 상기 대조선 및 제2 리간드에 대한 보다 구체적인 설명은 후술한다.

상기 검출패드는, 이동상과 검체가 전개되는 매질로서, 이동상과 검체가 검출패드를 이루는 다공성 멤브레인의 모세관 현상에 의해 이동할 수 있다. 나아가 상기 검출패드는 상기 검사선 및 상기 대조선이 격리되어 구비되어 있다. 상기 검출패드의 일 말단은 상기 접합체 패드와, 다른 일 말단은 검체 이송을 위한 구동력을 제공하는 흡습패드와 연결될 수 있다. 상기 접합체 패드와 상기 흡습패드는 검출패드에 일부 중첩되어 위치할 수 있다. 상기 검출패드는 다공성 멤브레인으로 이루어질 수 있으며, 상기 다공성 멤브레인으로는 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membrane), 유리섬유 (glass fiber) 멤브레인, 폴리에테르술폰 (polyethersulfone; PES) 멤브레인, 셀룰로스 (cellulose) 멤브레인, 나일론 (nylon) 멤브레인 및 이들의 조합을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 15 μm의 기공을 가지는 니트로셀룰로스 멤브레인이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립을 이용한 정성 및 정량 분석 원리에 대하여 보다 구체적으로 설명한다.

종래 경쟁반응을 이용하는 면역 크로마토그래피용 스트립은 검출 패드에 표적물질과 동일하거나 그 유사체를 고정하여 검사선을 형성하고, 전개되는 검체를 포함하는 이동상에 표적물질이 없을 때는 제1 리간드-표지물질이 검사선의 표적물질과 결합 포획되어 신호를 발생시킨다. 검체 내에 표적물질이 있을 경우 제1 리간드와 표적물질이 특이적으로 반응하여 표적물질-제1리간드-표지물질의 복합체가 생성되고 이동상을 따라 전개하며 검사선의 표적물질과 복합체를 형성하는 양이 이동상에 포함된 표적물질-제1리간드-표지물질의 양에 따라 줄어들게 된다 (경쟁반응). 이때, 신호의 세기는 검체 내 표적물질의 농도가 증가함에 따라 감소하게 된다. 이 때 제1리간드와 검사선의 표적물질의 반응 시 강한 특이적 결합력으로 인하여 검체 내 적은 농도의 표적물질의 존재할 때 단일 검사선을 사용한 경우 검체 내 표적물질과 제1 리간드의 결합이 일어나도 검사선의 표적물질-제1리간드-표지물질의 복합체의 형성에 영향을 주지 못하며 검사선의 발색이 육안, 또는 센서로 확인한 경우 변화가 거의 나타나지 않으므로 어느 정도 고농도로 검체 내에 표적물질이 존재할 경우만 경쟁반응이 일어나게 되고, 높은 농도의 표적물질이 반응 시에는 검사선의 발색의 포화점을 벗어나게 되어 민감도가 낮아져 정량분석 범위가 좁아지게 되고 표적물질의 정량적 분석을 하기에는 커다란 제약이 따른다.

그러나 본 발명에서는 일반적인 경쟁반응을 이용하는 면역 크로마토그래피용 스트립에서 단일 검사선을 사용하는 것에는 차이가 없으나, 검사선에 고정되는 것은 표적물질(또는 표적물질 유사체, 제1 접합체)과 특이적 결합하는 리간드(제1 리간드)이며, 검체 내의 표적물질과 제1 접합체의 직접적 경쟁면역반응(directly competitive immune response)이 일어나는 방식을 사용하여 검체 내 표적물질의 농도가 높아도 분석이 가능하도록 하여 민감도를 향상시켰으며 넓은 농도 범위로 정량적인 분석이 가능하도록 고안하였다.

도 3 내지 도 7을 참조하면, 한 개의 검사선과 두 개의 대조선을 사용할 수 있으며, 접합체 패드에 가까운 순으로 검사선과 대조선의 번호를 주면 검사선 1에 대한 제1 대조선(C1) 또는 제2 대조선(C2)로의 비율로 검체 내 표적물질의 농도에 따른 경쟁반응에 대한 정량 그래프 얻을 수 있다. 따라서 검체 내 표적물질의 높은 농도범위까지 직선성의 그래프를 얻을 수 있어서 표적 물질의 민감도를 향상시키고 저 농도에서 고농도까지 정량적 측정 범위(Dynamic range)를 넓힐 수 있다 (도 7). 검사선 접합체 패드에서 일정량의 제1 리간드에 대하여 검체 내의 표적물질과 제1 접합체는 경쟁적으로 반응하며, 표적물질의 농도를 정량적으로 분석이 가능하도록 고안하여 하나의 스트립에 적용하므로, 종래의 면역 크로마토그래피 분석법에 비하여 신속성, 사용 편의성 및 특히 고농도 표적물질의 높은 희석배수 없이 한번의 희석 만으로 정량적 분석 가능성이 개선된 특징이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 제1 대조선에는 제2-1 리간드가 고정될 수 있고, 상기 제2 대조선에는 제2-2 리간드가 고정될 수 있으며 상기 제2-1 리간드 및 상기 제2-2 리간드는, 표적물질과 상이한 소정의 물질이 표지물질과 결합한 제2 접합체와 결합할 수 있다. 상기 제1 대조선에 고정된 제2-1 리간드의 농도는 0.5 초과 내지 1.0 mg/ml 일 수 있으며, 상기 제2 대조선에 고정된 제2-2 리간드의 농도는 0.1 내지 0.5 mg/ml 일 수 있다. 제2-1 리간드와 제2-2 리간드는 각 대조선에서 농도를 달리하여 결합되는 제2 접합체의 양이 서로 다르므로, 제2 접합체의 결합으로 나타나는 신호의 세기가 서로 달라 표적물질의 정량적 분석에 이용할 수 있다.

구체적으로, 액상 검체를 본 발명 스트립의 검체패드(샘플패드)에 도입하면, 이동상과 검체의 전개가 시작된다. 접합체 패드에서, 일정량의 제1 접합체들이 검체 내 표적물질에 경쟁적으로 반응한다. 도입된 검체, 일정량의 제1 접합체는 이동상과 함께 전개된다. 여기에서, 제1 접합체의 양은 일정하기 때문에, 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 검사선에 고정된 제1 리간드와 결합하는 제1 접합체의 개수는 감소하고, 반대로 상기 검체 내 표적물질의 농도가 감소할수록 검사선에 고정된 제1리간드와의 결합하는 제1 접합체의 개수는 증가하는 특징이 있다.

상기 제1 접합체는 모두 표지물질을 구비하고 있으므로, 이들 중 검사선에 포획된 상기 제1접합체에 표지물질로부터의 신호를 측정하여 검체 내 표적물질의 유무, 양 또는 둘 모두를 측정할 수 있다.

앞서 언급한 바와 같이, 상기 제1 접합체는 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 검사선과의 결합수가 감소하고, 반대로 상기 제1 접합체는 검체 내 표적물질의 농도가 감소할수록 그 결합수가 증가하게 된다. 따라서, 접합체가 포획되는 검사선으로부터의 신호 세기는 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 감소하는 양상을 보이게 된다. 또한 도 2와 같이 한 개의 검사선과 두 개의 대조선 사용하는 경우 제1 접합체와 검사선의 제1 리간드의 결합으로 인하여 대조선은 발색되어 신호가 나타나며, 검체 내 표적물질의 양에 따라 신호가 변화되어 나타난다. 제2 접합체는 제2-1 리간드의 농도가 낮은 제1 대조선, 제2-2 리간드의 농도가 높은 제2 대조선에 포획되어 발색될 수 있으며, 발색의 정도는 제2-1 리간드 및 제2-2 리간드의 농도에 따라 상이하게 나타날 수 있다. 따라서, 육안으로도 검체 내 표적물질의 양에 따라 검사선의 발색 정도를 비교 평가하여 한 번의 실험으로 넓은 농도 범위에 따라 정확한 정량 그래프를 이용하여 정량 가능하므로 표적 물질의 민감도를 향상시키고 검체 내 고농도 표적물질의 직선성 (Linearity)의 정량적 측정 검사 범위 (Dynamic range)를 넓힐 수 있다.

결과적으로 상기 경쟁적 반응이 일어나는 검사선에 포획되는 제1 접합체의 표지물질로부터의 신호를 통해 표적물질에 대한 정성 및 정량 분석이 가능하다. 보다 구체적으로, 상기 검사선의 신호를, 기지농도의 표적물질에 대해 미리 완성해둔 표준 신호 데이터와 비교하여, 표적물질의 농도를 분석할 수 있다. 이는 신호의 세기를 육안으로 확인하여 반정량적으로 분석할 수 있고, 또는 농도계 (densitometer)와 같은 리더(reader)를 사용하여 보다 엄밀하게 정량적으로 분석할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "대조선 (control line)"은 검체 또는 검체 중 표적물질의 농도와 관계없이 일정한 신호를 내는 부분을 의미한다. 상기 불변 대조선은 상기 검사선과 유사한 방법을 이용하여 형성할 수 있다. 다만, 상기 대조선은 분석하고자 하는 물질(표적물질)과는 결합하지 않으면서, 검체와 함께 이동상에 의해 검출패드를 따라 이동하는 제2 접합체와 결합가능한 제2 리간드를 고정시켜 형성할 수 있다. 또는 상기 대조선은 검체와 함께 이동상에 의해 검출패드를 따라 이동하는, 표지물질 또는 표지물질 유사체가 결합된 별도의 물질(제1 접합체)과 결합하지 않는 리간드(제2 리간드)를 고정시켜 형성할 수 있다. 결과적으로, 검체 중의 표적물질의 농도 및 존재 유무와 무관하게 일정한 신호를 방출할 수 있는 물질을 리간드(제2 리간드)로 고정시켜 형성되는 것이다. 상기 대조선으로서 사용될 수 있는 제2리간드로는 항-토끼 IgG, 항-닭 IgY, 스트렙트아비딘 (streptavidin), 소 혈청 알부민 등이 사용될 수 있다.

상기 대조선에 특정농도의 제2 리간드를 고정시키는 경우, 여기서 발생하는 신호의 세기는 언제나 일정하므로, 검사선에서의 신호 세기를 대조선의 신호세기와 비교하여 그 비로 나타내 좀 더 쉽게 알아볼 수 있으며, 표적물질의 농도가 어느 정도일 때 검사선의 세기가 어느 정도 발생되는지 결정할 수 있다. 대조선의 신호세기는 검사선의 신호 세기와 비교하여 정량 분석에 이용할 수 있다. 즉, 상기 각 대조선과 검사선의 신호세기의 비를 내부적 표준 신호 데이터로 활용할 수 있다.

예를 들어, 도 6에 나타나듯이 한 개의 검사선이 형성되어 있고, 기지농도의 표적물질을 통해, 일정 농도의 대조선1 (C1)에 대한 검사선(T)이 각각 2.5배, 1.5배, 1.0배의 신호가 나타났을 때 대조선2 (C2)에 대한 농도 비는 1.5배, 1.0배. 0.5배의 신호를 나타냄을 확인하였다면, 미지 농도인 표적물질을 분석한 결과, 검사선(T)이 대조선1(C1)과 2(C2)에 대하여 각각 저, 중, 고 농도의 신호세기를 방출, 농도가 5 ~ 140 mg/ml 사이 인 것을 알 수 있다. 검사선과 대조선의 신호세기와 비교하여 센서와 같은 간편한 POCT 의료장비뿐 아니라 대조선의 발색 강도를 비교함으로써 육안으로도 농도를 쉽게 알 수 있다.

상기 표적물질의 경쟁반응을 사용하는 검사선의 위치와 수 및 대조선의 위치는 사용되는 항원-항체 반응 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 대조선 신호의 유무로부터 성공적인 검체의 전개 여부를 확인할 수 있고, 검사선의 신호의 세기와 대조선의 신호의 세기를 기 결정된 표준 신호 데이터와 비교하여 표적물질의 정량분석을 수행할 수 있다. 상기 표준 신호 데이터에 대해서는 후술한다.

구체적으로 본 발명은 검체 내 표적물질의 농도 측정범위(dynamic range)는 5 mg/ml 내지 140 mg/ml 인 면역 크로마토그래피용 스트립을 제공한다.

본 발명에 있어서, 고정된 하나의 검사선의 신호 세기 및 각 대조선의 신호 세기를 통한 정량분석의 경우, 검체 내 표적물질의 농도 측정 범위 (dynamic range)가 5 mg/ml 내지 140 mg/ml 사이일 수 있다. 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립은 높은 농도의 표적물질을 함유하고 있는 검체로부터 하나의 검사선과 한번의 희석만으로 표적물질의 직접적 경쟁면역 반응을 통해 보통의 단일 검사선에서 분석할 수 없는 낮은 농도와 높은 농도를 다수의 적합한 대조선을 사용하므로 종래 하나의 검사선과 하나의 대조선만으로는 한계가 있던 정량 측정을 가능하게 하며 농도 측정 범위를 넓히고 민감도를 향상시켜 사용자가 쉽고 간단하게 결과를 분석할 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립에 대하여 보다 구체적으로 설명한다. 상기 면역 크로마토그래피용 스트립은, 표적물질 포함 여부를 확인하고자 하는 검체가 도입되는 검체패드(샘플패드), 일 말단이 상기 검체패드(샘플패드)와 연결되는 상기 접합체 패드, 일 말단이 상기 접합체 패드의 다른 일 말단과 연결되는 상기 검출 패드, 일 말단이 상기 검출 패드의 다른 일 말단과 연결되고, 상기 검체패드(샘플패드)로부터 검체 이송을 위한 구동력을 제공하는 흡습 패드 및 상기 면역 크로마토그래피용 스트립 하부에 위치하는 고체 지지대를 포함할 수 있다. 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립에 대한 구성도를 도 2에 나타냈다.

상기 고체 지지대는 니트로셀룰로스, 나일론, 피브이디에프 (PVDF), 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택된 재료로 형성된 것일 수 있다. 상기 고체 지지대 상에 스트립을 부착하여 제조함으로, 스트립의 내구성을 높일 수 있고, 취급 및 보관을 용이하게 할 수 있다. 또한, 추가적인 외부 케이스 장착을 용이하게 할 수 있다. 상기 고체 지지대로 사용될 수 있는 플라스틱 재질로는 폴리프로필렌 (polypropylene) 필름, 폴리에스테르 (polyester) 필름, 폴리카보네이트 (polycarbonate) 필름, 아크릴 (acrylic) 필름 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 면역 크로마토그래피용 스트립이 케이스 내에 고정되는 키트로서, 상기 케이스는 상부 케이스 및 하부 케이스를 포함하며, 하부 케이스는 스트립 지지부을 포함하고, 상부 케이스는 검체 투입구 및 검사선 또는 대조선과 상응하는 위치에 결과 확인창을 포함하는 진단 키트가 제공될 수 있다. 또한, 상기 지지부는 니트로셀룰로스, 나일론, 피브이디에프 (PVDF), 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나로 이루어진 진단 키트가 제공될 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 상기 면역 크로마토그래피용 스트립이 추가적으로 케이스 내에 고정되는 것인 키트로서, 하부 케이스에는 가이드 및 스트립 지지부가 구비되어 있고, 상부 케이스에는 검체 투입구, 검사선 및 대조선에 상응하는 위치에 결과 확인 창이 구비된 것인 진단 키트가 제공될 수 있다.

상기 면역 크로마토그래피용 스트립은 추가적으로 케이스 내에 고정될 수 있다. 하부 케이스의 내부에는 상기 면역 크로마토그래피용 스트립을 적절한 위치에 배치시키고 고정 또는 압착시키기 위한 다수의 가이드 및/또는 스트립 지지부가 구비될 수 있다. 선택적으로 하부 케이스에 구비된 가이드 및 스트립 지지부에 대응되는 위치에 가이드 및 스트립 지지부가 상부 케이스에도 구비된 것일 수 있다. 즉, 상기 가이드 및/또는 스트립 지지부는 필요에 따라 하부 케이스에 형성되거나, 또는 상부 케이스 및 하부 케이스 모두에 형성될 수 있다. 또한, 상부 케이스에는 검체 투입구 및 검사선, 대조선에 상응하는 위치에 표지물질로부터의 신호를 검출하기 위한 결과 확인 창을 구비할 수 있다. 상기 검체 투입구는 검출패드의 일 말단에 즉, 검사선을 기준으로 흡습 패드의 반대편 말단이면서, 동시에 검체가 멤브레인을 따라 전개될 수 있도록 검사선과 충분히 이격 된 지점에 홀 또는 슬릿 등의 형태로 형성될 수 있다. 상기 결과 확인 창은 검출패드 상에 검사선 및 다수의 대조선까지 포함하여 외부로부터 육안으로 또는 센서를 통해 식별 가능하기에 충분한 크기로 형성될 수 있다. 상기 검사선 및 다수의 대조선을 확인할 수 있는 한 그 크기 및 모양은 제한 없이 형성될 수 있다.

상기 상부 및 하부 케이스는 통상의 플라스틱 소재를 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어 폴리카보네이트, 아크릴로니트릴부타디엔스티렌 (acrylonitrile butadiene styrene; ABS) 등의 소재가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 상부 및 하부 케이스는 별도로 제작하여 결합 홈, 결합 돌기 등을 구비하여 통상의 수단으로 결합될 수 있고, 경우에 따라서는 일체형으로 제조될 수 있다.

나아가 상기 진단 키트는 여러 기지농도의 표적물질이 포함된 검체들에 대한 검사선과 다 수의 대조선의 색상 기준표를 포함하는 표준 신호 데이터가 추가로 함께 제공될 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 표준 신호 데이터란, 다양한 기지농도의 표적물질이 포함된 검체에 대하여, 본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립을 사용한 한 개의 검사선과 두 개의 대조선에서의 신호 세기를 정리한 데이터를 의미한다. 이러한 표준 신호 데이터는 다양한 형태로 정리될 수 있으며, 대표적으로 각각의 표적물질의 농도에 대응하는 두 개의 대조선과 검사선 색상으로 정리될 수 있다. 유사하기로, pH를 측정하기 위한 리트머스 시험지의 경우, 각각의 pH에 대응하는 시험지의 색상을 정리한 색상 기준표를 함께 제공하는 것을 예로 들 수 있다. 특히 상기 색상 기준표를 포함하는 표준 신호 데이터의 경우에는, 단순히 육안으로도 표적물질에 대한 신호의 세기를 표준 신호 데이터와 용이하게 비교할 수 있기 때문에, 간편하고 신속하게 반 정량적인 분석이 가능할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 진단 키트는, 상기 검사선과 상기 두 개의 대조선으로부터 표지물질의 신호 유무 및 세기를 육안으로 확인함으로써, 정성 또는 반 정량 분석을 수행하도록 할 수 있다. 즉, 앞서 제공될 수 있는 색상 기준표를 포함하는 표준 신호 데이터와, 상기 키트에 검체를 전개시킨 후 상기 검사선과 상기 두 개의 대조선에 나타나는 신호 유무 및 세기를 육안으로 비교함으로써, 검체 내 표적물질의 유무 및 이의 농도를 분석할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 검체 투입구에 검체를 포함하는 소정의 액체를 주입하는 단계, 검체패드에서 상기 액체를 수용하여 이동상을 형성하는 단계, 상기 이동상이 접합체 패드로 전개되며 제1 접합체를 포함하는 단계, 상기 제1 접합체를 포함하는 이동상이 검사선으로 전개되면서 상기 제1 접합체와 상기 검체 내 표적물질이 경쟁적으로 제1 리간드와 결합하는 단계, 상기 제1 접합체가 상기 제1 리간드와 결합하여 제1 복합체를 형성하고, 형성된 제1 복합체가 표지물질에 따른 신호를 나타내는 단계, 상기 신호에 따라 상기 검체 내 표적물질의 양을 분석하는 단계를 포함하는, 면역 크로마토그래피 분석 방법이 제공된다.

또한, 상기 검사선을 통과하는 단계 이후 상기 이동상은 대조선을 통과하며 제2 리간드에 소정의 물질이 결합하여 별도의 신호를 나타내는 단계 및 상기 검사선에 나타난 신호와 상기 대조선에 나타난 신호를 비교하여 상기 검체 내 표적물질의 양을 분석하는 단계를 더 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 방법이 제공된다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 면역 크로마토그래피용 스트립을 사용하여 검체 내 표적물질을 정성 또는 정량 분석하는 방법으로서, 검체를 상기 접합체 패드 또는 그 이전에 위치한 패드에 투입하여 전개시키는 제1단계; 한 개의 검사선과 두 개의 대조선으로부터 표지물질의 신호 유무 및 세기를 확인하는 제2단계; 및 한 개의 검사선과 두 개의 대조선으로부터 확인된 신호 세기를 표준 신호 데이터와 비교하여 표적물질의 양을 측정하는 제3단계를 포함하며, 상기 표준 신호 데이터는 여러 기지농도의 표적물질이 포함된 검체들에 대하여, 각각 상기 제1단계 및 제2단계를 수행하여 얻어진 것인 분석 방법을 제공한다.

본 발명의 면역 크로마토그래피용 스트립을 사용하여 검체 내 표적물질을 정성 및/또는 정량 분석하는 방법에 대한 구체적인 원리는 앞서 설명한 바와 동일하다. 나아가 표준 신호 데이터 역시 앞서 설명한 바와 동일하다.

구체적인 분석 방법을 수행함에 있어서, 하기의 순서로 진행할 수 있다. 먼저, 분석하고자 하는 물질 (표적물질)이 포함된 액상 검체를 상기 접합체 패드 또는 그 이전에 위치한 패드에 투입할 수 있다. 즉, 액상 검체는 바로 접합체 패드에 투입하여 검체가 스트립에 도입될 수 있지만, 바람직하기로 접합체 패드 이전, 예를 들어 검체패드(샘플패드)에 투입하여 도입될 수 있다. 또한 상기 검체는 PB (phosphate buffer)와 같은 완충액을 가하여 균일하게 혼합하고, 이를 동일한 방법으로 스트립에 도입시킬 수 있다.

상기와 같이 검체가 면역 크로마토그래피용 스트립에 로딩(도입)되면 전개가 시작되고, 그 후 대조선을 통해 검체의 전개가 잘 이루어졌는지 확인할 수 있다. 검체의 전개가 잘 이루어 졌다면, 검사선과 두 개의 대조선으로부터 표지물질의 신호 유무 및 세기를 확인한다. 검사선으로부터 신호의 변화가 확인됐다면, 이는 표적물질이 검체 내에 포함되어 있음을 나타낸다 (정성분석). 나아가 한 개의 검사선과 두 개의 대조선으로부터 확인된 신호 세기를 표준 신호 데이터와 비교하여, 표적물질이 검체 내에 어느 정도의 농도로 포함되어 있음을 확인할 수 있다 (정량분석).

본 발명의 구체적인 실시 예에서는, 대조선을 추가로 포함하는 면역 크로마토그래피용 스트립을 이용한 소 면역글로블린 지 (bovine IgG; 표적물질)의 분석을 수행함으로써, 검체 내 표적물질의 농도가 5 내지 140 mg/㎖ 범위에서 육안으로 신뢰성 높은 정량분석이 가능함을 확인하였다 (도 6).

본 발명의 면역 분석을 위한 검체로는 포유류, 바람직하게는 생체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 골수액, 땀, 오줌, 눈물, 침, 피부, 점막, 모발 등의 모든 생체시료를 포함하며, 예컨대 소로부터 분리된 초유일 수 있다. 혈액은 혈구성분을 제거한 혈청 또는 혈장 성분을 이용할 수도 있고, 전혈을 이용할 경우 혈구성분을 용해(lysis)시킬 수 있는 성분을 완충액에 추가하여 사용할 수 있다. 이는 예시적인 것이며, 본 발명의 면역 분석을 위한 검체는 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 면역분석방법은 펩타이드 단백질 등 크기가 작거나 결합위치가 하나만 사용 가능한 단백질, 비타민D, 면역글로불린, 알레르겐, 항생제등 각종 약물 등의 반 정량 또는 정량적 진단에 유용할 수 있다.

면역 크로마토그래피용 dip 스트립의 제조

A. 검사선 및 불변 대조선이 형성된 검출패드 제작

3개의 분석선을 니트로셀룰로오스막 (nitrocellulose membrane)에 분주하였다. 라미네이터기 (laminator)를 이용하여 니트로셀룰로오스막을 플라스틱카드에 라미네이션 (lamination)하였다. 그 후, 검사선에 표적물질 또는 그 유사체를 검출하는 항 bIgG 항체 (anti-bovine immunoglobulin G, USA)를 검사선 1의 위치에, 대조선 1과 2의 위치에는 제2리간드로 항 닭 IgY (anti-chicken Immunoglobulin, USA)를, 자동분주기를 이용하여일정한 간격으로 분주한 후, 20~25℃에서 24시간 동안 건조했다.

B. 접합체 패드 (conjugate pad) 제작

접합패드는 건조기에서 수분을 완전히 건조시킨 상태로 아무런 처리 없이 그대로 사용하며, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다. 폴리에스터(polyester pad)를 접합체 패드로 그대로 사용하였다.

직경이 약 20 nm인 콜로이드 성 골드입자 (colloidal gold particle)와 소 면역글로블린 지 (bovine IgG from cow, Equitech, USA)이 결합된 접합체 용액을 준비하였고, 또한 직경이 약20 nm인 콜로이드 성 골드입자와 닭 IgY (Chicken IgY, Arista, USA)이 결합된 제2 접합체 용액을 준비하였다. 상기 접합체 용액 및 제2접합체 용액을 접합체 패드에 분주하고, 완전히 건조시킨 후, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

C. 검체패드(샘플패드, sample pad) 제작

검체패드(샘플패드)는 건조기에서 수분을 완전히 건조시킨 상태로 아무런 처리 없이 그대로 사용하며, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

D. 흡수패드 (absorbance pad) 제작

흡수패드는 건조기에서 수분을 완전히 건조시킨 상태로 아무런 처리 없이 그대로 사용하며, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

E. 면역 크로마토그래피용 스트립의 제작

위의 각 과정을 통해 준비된 검출패드, 접합체 패드, 검체패드(샘플패드) 및 흡수패드를 도 2에 나타난 구조대로 조립한다.

즉, 검체패드(샘플패드)를 접합체 패드의 일 말단과 중첩되도록 부착하고, 검출패드의 일 말단을 상기 접합체 패드의 다른 일 말단과 중첩되도록 부착하고, 검출패드의 다른 일 말단과 상단표시용 스티커가 부착된 흡수패드의 일 말단을 서로 중첩되도록 부착하였다. 이를 절단기를 이용하여 4 ± 1.0 mm 정도로 절단하여 도 2와 같은 스트립을 제조하였다.

면역 크로마토그래피용 dip 스트립을 이용한 면역분석

96 well plate에, 표적물질인 소 면역글로블린지 (bovine IgG)와 탄산나트륨 완충액을 포함하는 검체 용액을 100 ㎕씩 분주하였다. 검체 용액에는 소 면역글로블린 지(bIgG)의 농도가 각각 2, 5, 10, 20, 40, 80, 100, 142, 213 mg/ml 가 되도록 준비하였다.

상기 검체 용액이 들어 있는 96 well plate에 상기 실시 예 1에서 제작한 면역 크로마토그래피용 스트립을 넣은 후 10분간 전개시켰다.

도 6 초유 내 표적물질인 소 면역글로블린 지의 농도에 따른 크로마토그래피용 스트립의 전개 결과를 나타낸 실제 스트립 사진이다.

검사선 1에 대해 표적물질의 농도에 따라 신호의 세기가 달라지며 대조선 1, 2의 농도 비에 따른 직선성의 정량 곡선을 구할 수 있다는 것을 확인하였다.

또한 상기 면역 크로마토그래피용 스트립의 표적물질에 대한 농도 측정 범위 (dynamic range)가 5 mg/ml 이하부터 140 mg/ml이상까지 넓게 나타남을 확인할 수 있다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.

이상 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

10: 면역 크로마토그래피용 스트립
11: 흡습패드
12: 검출패드
13: 접합체 패드
14: 검체패드

Claims (10)

1. 액상 검체를 수용하는 검체패드;
   상기 검체패드의 일측에 연결되며 표지물질 및 표적물질 유사체를 수용하는 접합체패드;
   상기 접합체패드의 일측에 연결되며 검사선, 제1 대조선 및 제2 대조선을 포함하는 검출패드; 및
   상기 검출패드의 일측에 연결되며 반응 후 잔존하는 액상을 수용하는 흡습패드; 를 포함하고,
   상기 검사선은 표적물질 및 제1 접합체와 반응할 수 있는 제1 리간드를 포함하며, 상기 제1 접합체는 상기 표적물질의 유사체와 표지물질의 결합으로 이루어지고, 상기 제1 접합체와 상기 검체 내 표적물질은 경쟁적으로 검사선의 제1 리간드와 반응하며,
   상기 제1 대조선은 제2 접합체와 반응하는 제2-1 리간드를 포함하며, 상기 제2 대조선은 제2 접합체와 반응하는 제2-2 리간드를 포함하되, 상기 제2-1 리간드와 상기 제2-2 리간드의 농도는 서로 다른 것을 특징으로 하는, 면역 크로마토그래피용 스트립.
2. 제1 항에 있어서, 검체 내 표적물질의 농도 측정범위(dynamic range)는 5 mg/ml 내지 140 mg/ml 인 면역 크로마토그래피용 스트립.
3. 제1 항에 있어서,
   상기 제1 접합체와 상기 검체 내 표적물질은 경쟁적으로 검사선의 제1 리간드와 반응하며, 상기 제1 접합체가 상기 검사선의 제1 리간드와 반응하는 경우 제1 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피용 스트립.
4. 제3 항에 있어서,
   상기 제1 복합체는 검사선에 포획되어 소정의 신호를 나타내고,
   상기 신호를 이용하여 상기 검체 내 표적물질의 양을 측정하는 면역 크로마토그래피용 스트립.
5. 제4 항에 있어서, 상기 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 상기 검사선의 신호 세기는 감소하는 면역 크로마토그래피용 스트립.
6. 제1 항에 있어서, 상기 제1 리간드, 상기 제2-1 리간드 및 상기 제2-2 리간드는 단백질, 항원, 항체, DNA, RNA, PNA 및 압타머로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 이루어지며,
   상기 제1 리간드는 상기 제2-1 리간드 및 상기 제2-2 리간드와 상이한 리간드로 이루어지는 면역 크로마토그래피용 스트립.
7. 제1 항에 있어서, 상기 표지물질은 금콜로이드 (colloidal gold), 라텍스 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자, 효소, 형광성 염료, 전도성 고분자, 발광 물질 및 자성입자로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 면역 크로마토그래피용 스트립.
8. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항의 면역 크로마토그래피용 스트립이 케이스 내에 고정되는 키트로서,
   상기 케이스는 상부 케이스 및 하부 케이스를 포함하며,
   상기 하부 케이스는 스트립 지지부을 포함하고,
   상기 상부 케이스는 검체 투입구; 및 검사선, 제1 대조선 및 제2 대조선과 상응하는 위치에 결과 확인창; 을 포함하는 진단 키트.
9. 제8 항에 있어서, 상기 지지부는
   니트로셀룰로스, 나일론, 피브이디에프 (PVDF), 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나로 이루어진 진단 키트.
10. 검체 투입구에 검체를 포함하는 소정의 액체를 주입하는 단계;
    검체패드에서 상기 액체를 수용하여 이동상을 형성하는 단계;
    상기 이동상이 접합체 패드로 전개되며 제1 접합체를 포함하는 단계;
    상기 제1 접합체를 포함하는 이동상이 검사선으로 전개되면서 상기 제1 접합체 및 상기 검체 내 표적물질이 경쟁적으로 제1 리간드와 결합하는 단계;
    상기 제1 접합체가 상기 제1 리간드와 결합하여 제1 복합체를 형성하고, 형성된 제1 복합체가 표지물질에 따른 제1 신호를 나타내는 단계;
    상기 이동상이 제2-1 리간드가 고정된 제1 대조선 및 제2-2 리간드가 고정된 제2 대조선으로 전개되는 단계;
    농도가 서로 다른 상기 제2-1 리간드 및 제2-2 리간드에 제2 접합체가 결합되어 제1 대조선 및 제2 대조선에서 제2 신호를 나타내는 단계; 및
    상기 제1 신호 및 제2 신호의 세기에 따라 상기 검체 내 표적물질의 양을 분석하는 단계; 를 포함하는, 면역 크로마토그래피 분석 방법.

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