KR102138192B1

KR102138192B1 - 다수 개의 검사선을 구비한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립 및 이를 포함하는 임신진단키트

Info

Publication number: KR102138192B1
Application number: KR1020180172576A
Authority: KR
Inventors: 임국진; 김태형; 박동석; 최동섭; 김미정; 박영우
Original assignee: (주)프로테옴텍
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2020-07-27
Also published as: WO2020138614A1; CN113227791A; EP3904878B1; EP3904878A1; CN113227791B; KR20200082208A; US20220146509A1; EP3904878A4

Abstract

본 발명은 다수 개의 검사선을 구비한 임신진단용 크로마토그래피용 스트립, 상기 크로마토그래피용 스트립을 구비한 임신진단키트 및 이를 사용하여 임신여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 hCG 변이체로 인한 위음성의 문제를 극복함으로써, 육안으로 임신여부를 보다 정확하고 편리하게 수행할 수 있다. 나아가, 다수 개의 검사선과 대조선으로 구성된 임신진단용 크로마토그래피 스트립을 이용하여 hCG 또는 그 변이체의 농도 측정 범위가 개선된 효과가 있다.

Description

다수 개의 검사선을 구비한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립 및 이를 포함하는 임신진단키트{Chromatography strip having multiple test line for pregnancy test and diagnosis kit using the same}

본 발명은 임신진단에서 인간 융모성 성선자극호르몬(hCG)뿐 아니라 그 변이체를 함께 측정하여 보다 정확하게 임신을 진단하기 위한 임신진단키트에 관한 것이다.

면역크로마토그래피 분석법은 항원-항체 반응을 이용하여, 미량의 표적물질(analyte)을 단시간에 정성 및 정량적으로 분석할 수 있는 방법이다. 가정 및 병원등에서 널리 이용되는 임신진단키트는 이러한 면역크로마토그래피 분석법을 사용하고 있다. 일반적인 임신진단키트에 사용되는 면역크로마토그래피 스트립의 경우 임신시 소변 및 혈청에서 그 양이 증가하는 인간 융모성 성선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG)을 검출하고자 하는 표적물질로 사용한다. hCG에 결합하는 항체를 맴브레인 패드에 라인형으로 고정시키고(검사선), 또 하나의 항체는 골드입자 등과 같은 표지물질에 결합시키고 접합체 패드에 고정시킨 후, 검체를 전개시킨다. 전개되는 검체는 접합체 패드를 거치면서, 검체 내의 hCG-항 hCG 항체-골드입자의 복합체를 형성하여 전개되고, 상기 복합체는 검사선에 고정된 항-hCG 항체에 포획되어 '검사선 고정된 항체-항 hCG 항체-골드입자'의 결합체가 형성된다. 이를 "샌드위치 (sandwich) 반응"이라 한다. 검체 내에 임신으로 판정할 수 있는 농도로 hCG가 존재할 경우 상기 검사선은 골드입자에 의하여 붉은 색으로 나타나게 되며 임신으로 판정한다. 또한 대조선은 검체 내의 hCG의 농도와 상관없이 항상 골드 입자 항체를 포획하여 골드입자에 의하여 붉은색이 나타나므로 검사의 정상적인 종료를 확인할 수 있다. 결과가 나타난 분석스트립을 육안으로 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있다.

인간 융모성 성선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG)은 36.5 kD의 당단백질로, 알파(α)와 베타(β), 두개의 소단위로 구성되어 있으며, 난소의 황체형성, 배란유발, 정소의 간질세포에 있어서의 안드로겐분비 촉진 등, 황체혈성호르몬 (luteinizing hormone, LH)과 유사작용을 한다. hCG는 여성이 임신하게 되면 태반의 영양막세포로부터 생산, 분비되며 모체의 혈액과 소변 그리고 양수에 존재한다. 이밖에도 포상기태나 융모막암종과 같은 영양막질환, 그리고 여러가지 배아세포 종양환자에서도 증가하는 것으로 알려져 있으며, 정상적인 남성과 임신하지 않은 여성의 혈액과 소변에도 매우 소량 존재 한다. hCG는 태반에서 생성되어 혈액을 거쳐 소변으로 배출되게 되는데, 이러한 단계를 거치는 동안 여러 가지 분해 산물과 변이체가 생성되며, 태반과 혈액, 그리고 소변에서 나타나는 hCG 형태에 차이가 있다. 알파 소단위는 두개의 N-틈새올리고당곁가(N-nicked oligosaccharaide side chain)를 가지며, 베타 소단위는 145개의 아미노산 연결이 6개의 다리에 있는 독특한 형태로 hCG를 다른 글리콜 단백질과 구별한다. 이 아미노체인의 변화에 따라 태반에서는 큰 자유 α(large free α), 비틈새 자유 β(non-nicked free β)의 형태를 보이며, 혈액에서는 정규 자유 α(regular free α), 틈새 자유 β(nicked free β)의 형태가 추가되고, 특히 소변에서는 hCG 베타코어절편(hCG β core fragment; hCGβcf)의 형태도 존재하게 된다(대한응급의학회지: 2011, 제 22 권 제5호 503-507).

임신 5주 이전의 소변에는 hCG 베타코어절편(hCG β core fragment; hCGβcf)이 상대적으로 적게 존재하지만, 임신 6주 이후의 소변에는 hCGβcf가 정상 hCG(intact hCG; I-hCG) 보다 많이 존재하며, 특히 8주 후에는 정상 hCG 보다 3배 이상 존재한다. 이러한 높은 농도의 hCGβcf는 정상 hCG의 측정을 방해하여 임신진단에서 위음성의 오류를 유발 시킬 수 있다(J. Emergency Medicine 2013, 44:155).

이에 본 발명자들은 소변에 높은 농도로 존재하는 hCGβcf의 영향을 받지 않고 정확하게 임신여부를 판단할 수 있는 임신진단키트의 제조방법에 관하여 지속적으로 연구 노력한 결과, 본 발명의 다수 개의 검사선을 구비한 임신진단용 크로마토그래피 스트립을 사용하면, hCG 변이체가 고농도로 존재하는 경우에도 정확하게 임신여부를 판단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 소변에 높은 농도로 존재하는 hCG 변이체의 간섭을 배제하여 정확성이 높은 임신진단용 크로마토그래피 스트립을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 크로마토그래피용 스트립을 포함하는 임신진단키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 크로마토그래피용 스트립 또는 임심진단키트를 사용하여 임신여부를 진단하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 접합체 패드 및 검출패드를 구비한 임신진단용 크로마토그래피 스트립을 제공한다.

본 발명의 임신진단용 크로마토그래피 스트립에 있어서, 상기 접합체 패드는 제1 항-hCG(human chorionic gonadotropin) 단일클론항체 및 신호검출 표지물질를 포함하고, 상기 검출패드는 검사선 1 및 검사선 2가 격리되어 구비되어 있고, 상기 검사선 1은 제2 항-hCG 단일클론항체를 포함하고, 상기 검사선 2는 인간 융모성 성선자극 호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG)를 포함한다.

상기 "제1 항-hCG 단일클론항체"는 "제1 항-hCG 항체"와 혼용하여 사용할 수 있으며, 인간 융모성 성선자극 호르몬의 베타코어 절편(hCG β-core fragment; hCGβcf) 부위를 인지할 수 있는 항체를 의미한다. 따라서, 본 발명의 제1 항-hCG 단일클론항체는 정상 hCG 뿐 아니라 hCGβcf를 포함하는 hCG 변이체에도 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "제2 항-hCG 단일클론항체"는 "제2 항-hCG 항체"와 혼용하여 사용할 수 있으며, hCGβcf 부위가 아닌 hCG의 다른 부위를 인지하여 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 따라서, 본 발명의 제2 항-hCG 단일클론항체는 정상 hCG에만 특이적으로 결합할 수 있고, hCGβcf에는 결합할 수 없다. 본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 hCG의 다른 부위는 정상 hCG β subunit 중 일부 부위일 수 있다.

본 발명의 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립에 있어서, 상기 제1 항-hCG 단일클론항체는 신호검출 표지물질과 검체 전개 전 또는 검체 전개 시 서로 연결되어 제1 접합체를 형성하고, 검체 내 hCG 또는 그 변이체가 존재하는 경우 제1 접합체에 hCG 또는 그 변이체가 결합된 복합체를 형성하고, 검체 내 hCG 또는 그 변이체의 농도가 증가할수록 상기 형성된 복합체의 개수는 증가하며, 반대로 검체 내 hCG와 결합되지 않은 베어(bare) 접합체의 개수는 감소하게 된다.

상기 제1 접합체에 정상 hCG가 결합된 복합체는 검사선 1에 포획되어 신호를 나타내고, 제1 접합체에 변이체가 결합된 복합체는 검사선 1에 포획되지 않으며, 상기 검체 내 hCG 또는 그 변이체와 결합되지 않은 베어 접합체는 검사선 2에 일정량으로 고정되어 있는 hCG와 반응함으로써 검사선 2에 포획되어 신호를 생성할 수 있다.

본 발명의 용어 "접합체 (conjugate)"는 상기 표지물질과 상기 리간드가 서로 연결되어 형성된 결합체를 의미하는 것으로, 상기 접합체는 신호검출을 위한 표지물질과 제1 항-hCG 항체가 서로 연결된 제1 접합체를 포함한다. 상기 표지물질과 제1 항-hCG 항체는 물리적 또는 화학적으로 연결시킬 수 있다. 즉, 표지물질과 제1 항-hCG 항체가 수동 흡착 (passive adsorption)에 의해 연결되도록 할 수 있고, 반응성 그룹을 가지도록 표지물질을 개질시켜 제1 항-hCG 항체와 공유결합으로 연결되도록 할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 표지물질과 제1 항-hCG 항체의 연결은 당업자에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 단, 상기 표지물질과 제1 항-hCG 항체는 임신진단용 크로마토그래피 스트립에 검체를 전개시키기 전부터 접합체의 형태로 연결되어 접합체 패드에 존재할 수 있고, 또는 서로 연결되지 않고 분리된 상태로 접합체 패드에 존재하다가, 검체가 전개되면서 이들이 서로 연결되어 접합체를 형성할 수 있으며, 또는 용액상으로 존재하여 사용 전 접합체 패드에 첨가하여 사용할 수 있다. 어느 경우이던, 검체 전개 시 표지물질과 제1 항-hCG 항체는 접합체의 상태로 검출패드로 이동할 수 있으며, 이는 이들이 접합체 패드에 고정되어 있는 것이 아니기 때문이다.

본 발명의 용어 "표지물질"은 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 신호를 발생시키는 물질을 의미한다. 상기 표지물질로는 금콜로이드 (골드 입자), 라텍스 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자, 효소, 형광성 염료, 전도성 고분자, 발광 물질 또는 자성입자 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 신호는 발광 등과 같이 표지물질의 내재적 특성에 의해 자체적으로 발생할 수 있는 것이거나, 형광 등과 같이 외부의 자극에 의해 발생하는 것일 수 있다.

본 발명의 임신진단용 크로마토그래피 스트립에 있어서, 상기 접합체 패드는 내부대조군(internal control)으로 이용할 수 있는 물질 및 신호검출 표지물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 내부대조군 물질과 표지물질은 검체 전개 전 또는 검체 전개 시 서로 연결되어 제2 접합체를 형성하고, 상기 제2 접합체는 대조선의 리간드에 의해 포획됨으로써, 검체의 전개를 확인할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "대조선(Control line)"은 검체 또는 검체 중 hCG의 농도와 관계없이 일정한 신호를 내는 부분을 의미한다. 상기 대조선은 상기 검사선 및 상기 이종 검사선과 유사한 방법을 이용하여 형성할 수 있다. 다만, 상기 대조선은 hCG와는 결합하지 않으면서, 검체와 함께 이동상에 의해 검출패드를 따라 이동하는, 제2 접합체로서 골드입자와 결합된 별도의 물질과 특이적 또는 비특이적으로 결합하여 포획할 수 있는 물질을 고정시켜 형성할 수 있다. 상기 대조선에 고정시키는 물질을 리간드라 할 수 있다. 결과적으로, 검체 중의 융모성성선자극호르몬의 존재 유무와 무관하게 일정한 신호를 방출할 수 있는 리간드를 고정시켜 형성되는 것이다. 상기 대조선으로서 항-래빗 IgG, 항-치킨 IgY, 스트렙트아비딘(streptavidin), 소혈청알부민 등이 사용될 수 있다. 상기 대조선은 고정되는 리간드의 농도를 달리하여 두 개 이상으로도 형성될 수 있다. 상기 대조선에 고정된 리간드의 농도가 높을수록, 대조선은 강한 신호를 일정하게 방출할 수 있다.

본 발명의 임신진단용 크로마토그래피 스트립에 있어서, 검사선의 위치 및 대조선의 위치는 사용되는 항원-항체 반응 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은, 검사선 및 검체의 전개를 확인할 수 있는 대조선만 형성된 검출패드를 구비한 종래의 분석스트립을 사용한 임신진단키트와 달리 정상 hCG만을 검출하는 검사선 1 및 그 변이체를 동시에 검출하는 검사선 2로 이루어진 2개의 검사선을 보유함으로서 보다 신뢰성 높게 임신에 대한 판정을 수행할 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 접합체 패드 내에 존재하는 제1 접합체는 액상 검체(가임기 여성의 소변 등)와 검출패드로 이동 전개시 검체 내 hCG의 β-core fragment 위치에 결합하여 hCG-제1 항-hCG 항체-골드입자 복합체를 형성하게 된다. 상기 복합체는 전개되는 중 검사선 1에 고정된 제2 항-hCG 항체에 포획되고 (샌드위치 면역반응, Sandwich immune reaction), 상기 검체 내 hCG와 결합되지 않은 제1 항-hCG 항체-골드입자 접합체는 전개되는 중 검사선 2에 포획된다(경쟁 면역반응, Compatitive immune reaction). 상기 접합체 패드 내에 존재하는 제1 항 hCG 항체-골드입자 접합체의 양은 특정량으로 정하여 사용하므로, 검체 내 hCG의 농도가 증가할수록, 접합체 패드 내에 존재하는 제1항-hCG 항체-골드입자 접합체와 검체 내 hCG가 결합하면서 형성된 복합체의 갯수는 증가하게 되며, 반대로 융모성성선자극호르몬과 결합되지 않은 베어 접합체의 갯수는 감소하게 되는, 반비례적 관계를 보일 수 있다. 검사선 1에서는 샌드위치 면역 방법에 의하여 정상적인 hCG β subunit을 측정 할 수 있으며, 검사선 2에서는 경쟁적 면역 방법으로 hCG와 그 유도체를 동시에 측정할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 검사선의 신호의 세기는 검체 내의 hCG의 농도가 증가함에 따라 증가하지만, 일정 농도 이상으로 증가하면 오히려 신호의 세기가 감소하는 현상을 보인다. 베어 접합체가 포획되는 검사선 2로부터의 신호 세기는 hCG의 농도가 증가할수록 감소하는 양상을 보이게 된다. 특히 임신 6주 이후에 크게 증가하는 hCGβcf 농도에 영향을 받아 감소하게 된다. 결과적으로 상기 검사선 1 및 검사선 2 상의 표지물질로부터의 신호를 통해 hCG에 대한 분석이 가능하다. 보다 구체적으로, hCGβcf의 농도가 낮은 경우에는 검사선 1의 샌드위치 면역검사에 영향을 미치지 못하여 검사선 1 만으로도 hCG를 측정하여 임신여부를 정확하게 진단할 수 있다. 즉, 검사선 1이 발색을 보이면 임신 양성으로 판단할 수 있다. 그러나 hCGβcf를 다량으로 함유하게 되면, 검사선 1의 면역 검사를 방해할 수 있으므로, 검사선 1과 검사선 2를 종합하여 임신여부를 정확하게 진단할 수 있다. 즉, 검사선 1이 발색을 보이지 않더라도 검사선 2가 보이지 않거나 대조선 이하의 강도로 보일 경우 임신 양성으로 판단하여 보다 정확하게 임신여부를 진단할 수 있다.

본 발명의 임신진단용 크로마토그래피 스트립의 구성에 대하여 보다 구체적으로 설명한다. 상기 임신진단용 크로마토그래피 스트립은, 표적물질 포함여부를 확인하고자 하는 검체가 도입되는 샘플패드; 일 말단이 상기 샘플패드와 연결되는 접합체 패드; 일 말단이 상기 접합체 패드의 다른 일 말단과 연결되는 검출 패드; 일 말단이 상기 검출 패드의 다른 일 말단과 연결되고, 상기 샘플패드로부터 검체 이송을 위한 구동력을 제공하는 흡습패드; 및 상기 임신진단용 크로마토그래피 스트립 하부에 위치하는 고체 지지대를 포함할 수 있다. 본 발명의 임신진단용 크로마토그래피 스트립에 대한 구성도를 [도 1] 및 [도 2]에 나타내었다.

상기 고체 지지대는 니트로셀룰로스, 나일론, 피브이디에프 (PVDF), 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택된 재료로 형성된 것일 수 있다. 상기 고체 지지대 상에 스트립을 부착하여 제조함으로, 스트립의 내구성을 높일 수 있고, 취급 및 보관을 용이하게 할 수 있다. 또한, 추가적인 외부 케이스 장착을 용이하게 할 수 있다. 상기 고체 지지대로 사용될 수 있는 플라스틱 재질로는 폴리프로필렌 (polypropylene) 필름, 폴리에스테르 (polyester) 필름, 폴리카보네이트 (polycarbonate) 필름, 아크릴 (acrylic) 필름 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 임신진단용 크로마토그래피 스트립이 추가적으로 케이스 내에 고정되는 것인 키트로서, 하부 케이스에는 가이드 및 스트립 지지부가 구비되어 있고, 상부 케이스에는 검체 투입구; 및 여러 개의 검사선 및 대조선에 상응하는 위치에 결과 확인창이 구비된 것인 진단 키트를 제공한다.

상기 임신진단용 크로마토그래피 스트립은 추가적으로 케이스 내에 고정될 수 있다. 하부 케이스의 내부에는 상기 임신진단용 크로마토그래피 스트립을 적절한 위치에 배치시키고 고정 또는 압착시키기 위한 다수 개의 가이드 및/또는 스트립 지지부가 구비될 수 있다. 선택적으로 하부 케이스에 구비된 가이드 및 스트립 지지부에 대응되는 위치에 가이드 및 스트립 지지부가 상부 케이스에도 구비된 것일 수 있다. 즉, 상기 가이드 및/또는 스트립 지지부는 필요에 따라 하부 케이스에 형성되거나, 또는 상부 케이스 및 하부 케이스 모두에 형성될 수 있다. 또한, 상부 케이스에는 검체 투입구 및 검사선, 대조선에 상응하는 위치에 표지물질로부터의 신호를 검출하기 위한 결과 확인창을 구비할 수 있다. 상기 검체 투입구는 검출패드의 일 말단에 즉, 검사선을 기준으로 흡습패드의 반대편 말단이면서, 동시에 검체가 멤브레인을 따라 전개될 수 있도록 검사선과 충분히 이격된 지점에 홀 또는 슬릿 등의 형태로 형성될 수 있다. 상기 결과 확인창은 검출패드 상에 다수 개의 검사선 및 대조선까지 포함하여 외부로부터 육안 또는 센서를 통해 식별 가능하기에 충분한 크기로 형성될 수 있다. 상기 다수 개의 검사선 및 대조선을 확인할 수 있는 한 그 크기 및 모양은 제한없이 형성될 수 있다.

상기 상부 및 하부 케이스는 통상의 플라스틱 소재를 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어 폴리카보네이트, 아크릴로니트릴부타디엔스티렌 (acrylonitrile butadiene styrene; ABS) 등의 소재가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 상부 및 하부 케이스는 별도로 제작하여 결합 홈, 결합 돌기 등을 구비하여 통상의 수단으로 결합될 수 있고, 경우에 따라서는 일체형으로 제조될 수 있다.

상기한 바와 같이 크로마토그래피는 매질을 따라 표적물질을 포함하는 이동상이 이동하는 크로마토그래피의 원리를 이용한다. 따라서, 임신진단용 크로마토그래피 스트립을 이용한 분석을 위해서는 표적물질을 포함하는 검체를 스트립을 따라 이동시키기 위한 이동상을 필요로 한다. 이에 따라, 본 발명의 분석용 키트는 완충액을 추가로 포함할 수 있다. 상기 완충액은 임신진단용 크로마토그래피 스트립을 따라 검체를 이동시키는 이동상 (mobile phase)으로서 작용할 뿐만 아니라, 접합체를 용해시키는 용매로 작용할 수 있으며, 필요에 따라서는 검체를 희석시키기 위한 희석액으로서의 역할도 겸할 수 있다. 또한, 예를 들어 전혈 분석을 하는 경우, 적혈구 등의 혈구성분을 용해 (lysis)시키기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 완충액으로는 10 mM 내지 1 M 농도의 인산염 완충액 (phosphate buffered solution; PBS), 비이온성 또는 양쪽성 계면활성제 또는 이들의 혼합물 등 통상의 완충액을 제한없이 사용할 수 있으며, 항원-항체 반응 등 원하는 반응의 종류에 따라 완충액의 조성 및 사용 비율은 적절히 선택될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 임신진단용 크로마토그래피 스트립을 사용하여 임신여부를 진단하는 방법으로서, 검체를 상기 접합체 패드 또는 그 이전에 위치한 패드에 투입하여 전개시키는 단계; 및 다수 개의 검사선과 대조선으로부터 표지물질의 신호 유무를 확인하는 단계;를 포함하여 수행되는 임신여부를 진단하는 방법을 제공한다.

구체적인 분석 방법을 수행함에 있어서, 하기의 순서로 진행할 수 있다. 먼저, 액상 검체를 상기 접합체 패드 또는 그 이전에 위치한 패드에 투입할 수 있다. 즉, 액상 검체는 바로 접합체 패드에 투입하여 검체가 스트립에 도입될 수 있지만, 바람직하기로 접합체 패드 이전, 예를 들어 샘플패드에 투입하여 도입될 수 있다. 또한 상기 검체는 PBS와 같은 완충액을 가하여 균일하게 혼합하고, 이를 동일한 방법으로 스트립에 도입시킬 수 있다.

상기와 같이 검체가 임신진단용 크로마토그래피 스트립에 로딩(도입)되면 전개가 시작되고, 그 후 대조선을 통해 검체의 전개가 잘 이루어졌는지 확인할 수 있다. 검체의 전개가 잘 이루어 졌다면, 여러 개의 검사선과 대조선으로부터 표지물질의 신호 유무를 확인한다. 하기 1)에 해당되면, 비임신으로 진단하고, 하기 2) 내지 4)에 해당되면 임신으로 진단할 수 있다.

1) 대조선과 검사선 2가 나타났다면, 이는 hCG 또는 그 변이체가 검체 내에 포함되어 있지 않음을 나타내며, 비임신으로 진단될 수 있다.

2) 검사선 1, 검사선 2 및 대조선이 모두 나타났다면, 이는 hCG 또는 그 변이체가 검체 내에 포함되어 있음을 나타내며, 임신으로 진단될 수 있다.

3) 검사선 1 및 대조선이 나타났다면, hCG가 검체 내에 포함되어 있음을 나타내며, 임신으로 진단될 수 있다.

4) 대조선만 나타났다면, hCG 또는 그 변이체가 검체 내에 고농도로 포함되어 있음을 나타내며, 임신으로 진단될 수 있다.

본 발명의 분석을 위한 검체로는 일반 수용액뿐만 아니라 포유류, 바람직하게는 인간으로부터 분리된 전혈, 혈구, 혈청, 혈장, 골수액, 땀, 오줌, 눈물, 침, 피부, 점막, 모발 등의 모든 생체시료를 포함할 수 있고, 바람직하게는 소변일 수 있다.

본 발명은 임산부의 소변 중에 존재하는 정상 hCG와 그 변이체를 각각 감지하기 위한 단일클론항체를 서로 짝이 되도록 구성하여, hCG 변이체로 인한 위음성의 문제를 극복함으로써, 육안으로 임신여부를 보다 정확하고 편리하게 수행할 수 있다.

나아가, 다수 개의 검사선과 대조선으로 구성된 임신진단용 크로마토그래피 스트립을 이용하여 hCG 또는 그 변이체의 농도 측정 범위가 개선된 효과가 있다.

도 1은 통상적인 임신진단키트에 사용되는 면역 크로마토그래피 스트립의 단면을 나타낸 개요도이다.
도 2는 본 발명의 임신진단키트에 사용되는 다수 개의 검사선을 구비한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립을 나타낸 개요도이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립의 모식도이다.
도 4는 다양한 농도의 hCG 표준용액을 본 발명의 임신진단키트를 사용하여 분석한 결과이다.
도 5는 다양한 농도의 hCG 및 hCGβcf가 존재하는 검체 용액을 본 발명의 임신진단키트를 사용하여 분석한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

면역크로마토그래피 스트립의 제조

1-1. 검사선, 이종 검사선 및 대조선이 형성된 검출패드의 제작

3개의 분석선을 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)에 분주하였다. 라미네이터기(laminator)를 이용하여 니트로셀룰로오스막을 플라스틱카드에 라미네이션(lamination)하였다. 그 후, 검사선 1의 제2 항-인간융모성성선자극호르몬 항체로서 단일클론 항-인간융모성성선자극호르몬 항체 (monoclonal anti-hCG 5014, Medix, Finland)를, 검사선 2에는 인간융모성성선자극호르몬(hCG)을, 대조선의 리간드로는 산양 항 쥐이뮤노글로불린 항체(anti mouse antibody from goat, arista, USA)를 이용하여, 이들 각각을 자동분주기를 이용하여 분주한 후, 25~30℃에서 2일 (48시간) 동안 건조시켰다.

1-2. 접합체 패드(conjugate pad)의 제작

0.5% PVA (polyvinylalcohol)가 함유된 트리스완충액(10mM, pH 8.5)으로 패드를 충분히 적셔 건조기에서 완전히 건조시켜 접합체 패드를 전처리하였다.

직경이 약 40nm인 콜로이드성 골드입자(colloidal gold particle)와 제1 항- 융모성성선자극호르몬 항체로서 복합클론 항-인간융모성성선자극호르몬 항체 (monoclonal anti-hCG 5006, Medix, Finland)가 결합된 제1 접합체 용액을 준비하였고, 또한 직경이 약 40nm인 콜로이드성 골드입자와 쥐이뮤노글로불린(mouse IgG, Arista, USA)이 결합된 제2 접합체 용액을 준비하였다. 상기 제1 접합체 용액 및 제2 접합체 용액을 전처리된 접합체 패드에 분주하고, 완전히 건조시킨 후, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

1-3. 샘플패드(sample pad)의 제작

1% Triton X-100, 0.5% NaN3, 0.1% BSA가 함유된 0.08 M borate 완충액에 샘플패드를 충분히 적시고, 건조기에서 완전히 건조시킨 후, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

1-4. 흡습패드(absorbance pad)의 제작

흡습패드는 건조기에서 수분을 완전히 건조시킨 상태로 아무런 처리없이 그대로 사용하며, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

1-5. 면역크로마토그래피 스트립의 제작

위의 각 과정을 통해 준비된 검출패드, 접합체 패드, 샘플패드 및 흡습패드를 도 4에 나타난 구조대로 조립하였다.

즉, 샘플패드를 접합체 패드의 일 말단과 중첩되도록 부착하고, 검출패드의 일 말단을 상기 접합체 패드의 다른 일 말단과 중첩되도록 부착하고, 검출패드의 다른 일 말단과 흡습패드의 일 말단을 서로 중첩되도록 부착하였다. 이를 절단기를 이용하여 4 ± 2.0 mm 정도로 절단하여 도 4와 같은 스트립을 제조하였다.

도 4에 있어서, 각각의 도면 부호가 의미하는 바는 아래와 같다.

1: 샘플패드; 16±4Х4±2 mm

2: 제1 항-hCG 항체와 골드입자의 접합체 패드;

6±1.0Х4±2 mm

3: 니트로셀룰로오스 검출패드; 25±5Х4±2 mm

4: 플라스틱 고체 지지체

5: 흡습패드; 18±4Х4±2 mm

6: 제2 항-hCG 항체가 고정된 검사선 1

7: 항 쥐이뮤노글로불린이 고정된 대조선

8: hCG가 고정된 검사선 2

1-6. 케이스의 조립

제조된 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립을 플라스틱 하부 케이스의 스트립 고정 위치에 넣은 후 검체 투입구와 결과 확인창이 있는 상부 케이스를 끼운 후 압착기로 눌러 조립하였다.

[실험예 1]

hCG 표준용액을 이용한 임신진단용 크로마토그래피 스트립의 평가

비임신 소변에 인간 hCG 표준물질을 스파이킹하여 융모성성선자극호르몬 표준검체를 제조하여 정량 및 정성 시험을 실시하였다. 제조된 표준검체 용액을 케이스의 검체 투입구에 100㎕씩 분주 후 5분 간 전개시켰다. 검체 용액에는 정상적인 인간융모성성선자극호르몬 농도가 각각 0, 12.5, 25, 200, 5000, 50000, 500000, 1000000, 2000000 mIU/ml 가 되도록 준비하였다.

도 4는 정상적인 인간융모성선자극호르몬(hCG)의 농도에 따른 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립의 전개 결과를 나타낸 도면이다. 나아가, 대조선, 검사선 1 및 검사선 2에서 나타나는 신호의 세기를 육안으로 확인하였으며, 대조선 강도를 ++로 기준을 정하고, 반응 후 검사선의 생성 강도를 아래 [표 1]에 나타내었다.

검체 번호	1	2	3	4	5	6	7	8	9
정상 hCG 농도 (mIu/ml)	0	12.5	25	200	5000	50000	500000	1000000	2000000
검사선 1 강도	-	+/-	+	++	+++	+++	++	+	+/-
검사선 2 강도	+++	+++	+++	+++	+	+/-	-	-	-
대조선 강도	++	++	++	++	++	++	++	++	++

[표 1] 및 [도 4]에 나타난 바와 같이, 정상 hCG만 존재 할 때 25 mIU/ml 이상인 경우부터 뚜렷하게 양성 반응을 보였으며 200mIu/ml 인 경우 ++의 높은 강도의 반응을 보였다.

[실험예 2]

hCG 및 hCGcf가 존재하는 검체 용액을 이용한 임신진단용 크로마토그래피 스트립의 평가

다음으로, β-core fragment가 포함된 소변으로 임신진단을 하였을 때 본 발명의 분석방법의 정확성을 확인하기 위하여 비임신 소변에 β-core fragment와 정상 hCG 표준물질을 스파이킹한 검체 용액을 만들어 100㎕씩 분주 후 5분간 전개시켰다. 검체 용액은 아래 [표 2]와 같이 제조하였다.

[도 5]는 정상 hCG 및 hCGcf가 모두 존재하는 검체에서 농도에 따른 분석 결과를 비교하여 나타낸 도면이다. 나아가, 대조선, 검사선 1 및 검사선 2에서 나타나는 신호의 세기를 육안으로 확인하였으며, 대조선 강도를 ++로 기준을 정하고, 반응 후 검사선의 생성 강도를 아래 [표 2]에 나타내었다.

검체	1	2	3	4	5	6
정상 hCG 농도 (mIu/ml)	0	200	0	0	200	200
β-core fragment(pmol/ml)	0	0	30	250	30	125
검사선 1 강도	-	++	-	-	+/-	-
검사선 2 강도	+++	+++	+/-	-	+/-	-
대조선 강도	++	++	++	++	++	++

[표 2] 및 [도 5]에 나타난 바와 같이, hCG만 존재하는 검체 2에서는 상기 실험예 1과 마찬가지로 검사선 1에서 뚜렷하게 양성반응을 보였으나, hCGcf가 존재하는 검체 5 및 검체 6에서는 hCG가 200 mIu/ml 인 경우에도 검사선 1에서 거의 발색을 하지 못하였다. 이로부터, 검사선이 하나만 존재하는 종래 임신진단키트에서는 hCGcf가 존재할 경우 위음성의 소지가 있음을 확인할 수 있다.

본 발명의 임신진단키트는 검사선을 추가로 구비하고 있으므로, hCGcf가 존재하는 경우에는 검사선 2의 결과를 참고하여 임신여부를 진단할 수 있으며, 검사선 1이 발색을 보인 경우뿐 아니라, 검사선 2가 보이지 않거나 대조선 이하의 강도로 보일 경우 양성으로 판단하여 보다 정확하게 임신여부를 진단할 수 있다.

Claims

접합체 패드 및 검출패드를 구비한 임신진단용 크로마토그래피 스트립에 있어서,
상기 접합체 패드는 인간 융모성 성선자극 호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG)의 베타코어 절편(βfragment) 부위를 인지하는 제1 항-hCG(human chorionic gonadotropin) 단일클론항체 및 신호검출 표지물질를 포함하고,
상기 검출패드는 검사선 1 및 검사선 2가 격리되어 구비되어 있고, 상기 검사선 1은 hCG의 베타코어 절편 부위가 아닌 hCG의 다른 부위를 인지하는 제2 항-hCG 단일클론항체를 포함하고, 상기 검사선 2는 인간 융모성 성선자극 호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG)를 포함하며,
상기 제1 항-hCG 단일클론항체는 신호검출 표지물질과 검체 전개 전 또는 검체 전개 시 서로 연결되어 제1 접합체를 형성하고,
검체 내 hCG 또는 그 변이체가 존재하는 경우 제1 접합체에 hCG 또는 그 변이체가 결합된 복합체를 형성하여, 검체 내 hCG 또는 그 변이체의 농도가 증가할수록 상기 형성된 복합체의 개수는 증가하고, 반대로 검체 내 hCG와 결합되지 않은 베어(bare) 접합체의 개수는 감소하며, 상기 제1 접합체에 정상 hCG가 결합된 복합체는 검사선 1에 포획되어 신호를 나타내고, 제1 접합체에 변이체가 결합된 복합체는 검사선 1에 포획되지 않으며,
상기 검체 내 hCG 또는 그 변이체와 결합되지 않은 베어 접합체는 검사선 2에 일정량으로 고정되어 있는 hCG와 반응함으로써 검사선 2에 포획되어 신호를 나타내는 임신진단용 크로마토그래피 스트립.
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제1항에 있어서,
상기 변이체는 hCG 베타코어 절편(hCG β core fragment; hCGβcf)을 포함하는 것인 임신진단용 크로마토그래피 스트립.
제1항에 있어서,
상기 표지물질은 금콜로이드(colloidal gold), 라텍스 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자, 효소, 형광성 염료, 전도성 고분자, 발광 물질, 또는 자성입자인 것인 임신진단용 크로마토그래피 스트립.
제1항에 있어서,
상기 검출패드는 검체의 전개여부를 확인할 수 있는 대조선을 추가로 포함하는 것인 임신진단용 크로마토그래피 스트립.
제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 임신진단용 크로마토그래피 스트립을 사용하여 임신 여부를 진단하기 위한 정보제공방법으로서,
검체를 상기 접합체 패드 또는 그 이전에 위치한 패드에 투입하여 전개시키는 단계; 및
검사선 1, 검사선 2 및 대조선으로부터 표지물질의 신호 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 임신 여부를 진단하기 위한 정보제공방법.
제8항에 있어서,
비임신의 경우 대조선 및 검사선 2가 나타나고,
임신일 경우 저농도의 hCG에서는 검사선 1, 검사선 2 및 대조선이 모두 나타나고, 고농도의 hCG에서는 검사선 1 및 대조선이 나타나거나, 대조선만 나타나는 것을 특징으로 하는 임신 여부를 진단하기 위한 정보제공방법.
제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 임신진단용 크로마토그래피 스트립이 추가적으로 케이스 내에 고정되는 것인 임신진단키트로서,
하부 케이스에는 가이드 및 스트립 지지부가 구비되어 있고,
상부 케이스에는 검체 투입구; 및
검사선 또는 대조선에 상응하는 위치에 결과 확인창;이 구비된 것인 임신진단키트.