KR20150140560A - 가변 대조선을 구비한 분석 스트립 및 이를 구비한 진단 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가변 대조선을 구비한 분석 스트립, 상기 분석 스트립을 구비한 진단 키트 및 이를 사용하여 검체 내 표적물질을 정성 또는 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 분석 스트립은 가변 대조선을 구비함으로써, 후크 현상으로 인한 표적물질 정량 측정의 어려움을 극복하고, 육안으로 정성적 분석뿐만 아니라 신뢰성 높은 정량적 분석까지 신속하고 편리하게 수행할 수 있다. 나아가 검사선과 가변 대조선과의 상호 보완을 통하여 분석 물질의 농도 측정 범위가 개선된 효과가 있다.

Description

가변 대조선을 구비한 분석 스트립 및 이를 구비한 진단 키트{Assay strip having variable control line, and diagnosis kit using the same}

본 발명은 가변 대조선을 구비한 분석 스트립, 상기 분석 스트립을 구비한 진단 키트 및 이를 사용하여 검체 내 표적물질을 정성 또는 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.

분석용 스트립을 이용한 각종 진단 및 분석 방법은 시험이 간편하고, 필요에 따라 한 스트립에 여러 개의 리간드를 고정시켜 한 번의 실험으로 많은 분석 결과를 얻을 수 있다. 래피드 테스트법(rapid testing)은 미량의 표적물질(analyte)을 단시간에 정성 및 정량적으로 분석할 수 있는 방법으로서, 각종 질병의 진단 또는 검사를 비롯하여, 의학, 농업, 축산업, 식품, 군사, 환경 등 다양한 분야에서 사용되고 있다.

래피드 테스트법 중 가장 널리 사용되는 면역크로마토그래피 분석법은 항원-항체 반응을 이용하여 검출하고자 하는 표적물질과 반응하여 변화를 나타낼 수 있는 반응물질을 포함하는 분석 스트립(assay strip) 또는 상기 분석 스트립을 플라스틱 케이스에 장착한 디바이스 형태의 분석 장치가 일반적으로 사용되고 있다.

도 1은 통상적인 면역크로마토그래피 분석에 사용되는 분석 스트립의 단면도이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 통상적인 분석 스트립은 액상 검체를 수용하는 샘플 패드; 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 시그널을 발생시키는 표지(예를 들어, 금입자)를 항원, 항체 등의 리간드에 접합시킨 접합체(conjugate)를 함유하는 접합체 패드; 검체 중의 표적물질 및/또는 상기 접합체와 특이적으로 결합하는 결합제(항체 또는 항원)를 고정시킨 검사선과 검체의 전개를 확인할 수 있는 대조선이 형성된 검출패드; 및 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드로 구성되며, 이러한 기능성 패드들은 상기 나열한 순서대로 일부 중첩된 형태로 연결되어 고체 지지체 상에 부착되어 연속적으로 배열된다.

상기 분석 스트립이 플라스틱 케이스 내부에 장착되어 사용되는 경우, 케이스의 상부에는 샘플 패드의 위치에 검체를 적하하기 위한 검체 투입구가, 검출패드의 결합제가 고정된 위치에는 검사 결과를 확인하기 위한 결과 확인창이 형성된다.

이와 같이, 분석 스트립을 이용한 면역크로마토그래피 분석법에 있어서, 샘플 패드에 액상 검체를 적하하면, 액상 검체는 모세관 현상에 의하여 접합체 패드 및 검출패드를 통하여 이동하며, 최종적으로 흡습 패드에 수용된다. 예를 들어, 측정하고자하는 항원과 결합할 수 있는 항체를 막(membrane) 패드에 라인형으로 고정시키고(검사선), 또 하나의 항체는 금입자와 같은 표지물질에 결합시키고, 검체를 전개시킨다. 전개되는 검체는 접합체 패드를 거치면서, 일부는 항원-금입자 항체의 복합체를 형성하여 전개되고, 상기 항원-금입자 항체는 고정된 검사선에 포획되어 '검사선 고정된 항체-항원-금입자 항체'가 형성된다. 이로써 상기 검사선 라인은 금입자에 의하여 붉은 색으로 나타나게 된다.

이와 같이, 상기 접합체 패드에 함유되어 있던 접합체도 액상 검체와 함께 이동하여, 검체 중에 분석하고자 하는 물질이 존재하면, 접합체가 표적물질을 매개하여 검출패드에 고정된 결합제와 결합한다(통상, "샌드위치(sandwich) 반응"이라 한다). 또는, 접합체와 표적물질이 경쟁적으로 결합제와 결합하기도 한다(통상, "경쟁(competition) 반응"이라 한다). 상기의 원리를 통한 분석 스트립을 이용하여, 검체 중 표적물질의 존재 여부를 육안으로 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있다.

앞서 설명한 래피드 테스트, 즉 신속검사 키트(Rapid kit)를 이용한 면역크로마토그래피 분석법은, 주로 긴 막에 특정 물질들을 각각 라인 형태로 가로로 여러 줄을 그려놓고, 세로로 잘라서 스트립(strip) 형태로 제조하기 때문에 생산 공정이 단순하고 대량 생산이 가능한 이점이 있다. 또한 엘리사(ELISA) 등과 비교해볼 때, 세척 과정이나 2차 반응이 별도로 필요 없고, 반응시간도 10분 정도로 간편성이 탁월하다. 그러나 상대적으로 검출한계(detection limit)가 낮다는 점, 및 일반적으로 육안으로 판단하기 때문에 정량성이 부족하다는 점이 단점으로 꼽히고 있다. 이러한 이유로, 종래 면역크로마토그래피 분석법은 주로 정성적인 분석을 하는데 사용되고, 정량적인 분석을 하는데 많은 한계가 있는 문제점이 있다.

본 발명자들은 분석 스트립의 정성적인 분석뿐만 아니라 정량적인 분석의 신뢰성을 향상시키기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 표적물질과 동일한 물질 또는 유사체를 포함하는 가변 대조선을 추가함으로써, 검사선과 가변 대조선의 신호 세기를 비교하여 정량적인 분석이 가능함을 확인하였다. 본 발명에 따른 분석 스트립은 가변 대조선을 구비하고 있어 검체 내 표적물질의 정성적인 분석뿐만 아니라, 육안으로 신뢰도 높은 정량적인 분석도 가능하다는 장점을 갖는다.

일 양태로서, 본 발명은 접합체 패드 및 검출패드를 구비한 분석 스트립에 있어서,

상기 접합체 패드가 표적물질과 반응하는 제2 일정량의 제1 리간드 및 제1 리간드에 결합하는 신호검출 표지물질을 구비하고, 제1 리간드와 표지물질이 검체 전개 전 또는 검체 전개 시 서로 연결되어 접합체를 형성하고, 검체 전개 시 접합체가 검출패드로 이동할 수 있고,

상기 검출패드가 검사선 및 가변 대조선이 격리되어 구비되어 있고,

상기 검사선이 검체 내 표적물질과 반응하는 제2 리간드가 고정되어 있고,

상기 가변 대조선이 표적물질과 동일하거나 제1 리간드와 반응하는 표적물질의 유사체인 제3 리간드가 제2 일정량으로 고정되어 있어서, 검체 내 표적물질과 결합되지 않은 베어(bare) 접합체와 반응할 수 있는 것인, 분석 스트립을 제공한다.

일 실시양태에서, 본 발명의 분석 스트립은,

제1 일정량의 제1 리간드 중 일부가 검체 내 표적물질과 반응하여 상기 제1 리간드 및 표지물질을 구비한 접합체에 표적물질이 결합된 복합체를 형성하고,

검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 상기 형성된 복합체의 개수가 증가하고, 반대로 상기 베어 접합체의 개수는 감소하는 것을 특징으로 한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 분석 스트립은,

상기 제1 리간드, 표지물질 및 표적물질을 구비한 복합체가 제2 리간드와 반응하여 검사선에 포획되고,

상기 검체 내 표적물질과 결합되지 않고, 제1 리간드 및 표지물질을 구비한 베어 접합체는 제3 리간드와 반응하여 가변 대조선에 포획되고,

상기 검사선 및 상기 가변 대조선 상의 표지물질로부터의 신호를 측정하여 검체 내 표적물질의 유무, 양 또는 둘 모두를 측정할 수 있는 것을 특징으로 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 분석 스트립은, 가변 대조선으로부터의 신호 세기가 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 감소하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 분석 스트립은,

상기 가변 대조선으로부터의 신호 세기가 검체 내 표적물질의 농도가 M 값까지는 일정하게 유지되다가, 이를 초과 시 점차 감소하며, 최종적으로 신호 세기가 0으로 수렴하고,

상기 M 값이 상기 제2 일정량으로 고정된 제3 리간드가 상기 베어 접합체에 모두 반응하여 포화되는 경우에 있어서의 검체 내 표적물질의 최대농도인 것을 특징으로 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 분석 스트립은, 상기 검출패드가 검체의 전개를 확인할 수 있는 불변 대조선이 추가로 구비되어 있고, 상기 불변 대조선이 리포터 분자가 고정되어 있는 것을 특징으로 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 분석 스트립은,

표적물질 포함 여부를 확인하고자 하는 검체가 도입되는 샘플패드;

일 말단이 상기 샘플패드와 연결되는 상기 접합체 패드;

일 말단이 상기 접합체 패드의 다른 일 말단과 연결되는 상기 검출 패드;

일 말단이 상기 검출 패드의 다른 일 말단과 연결되고, 상기 샘플패드로부터 검체 이송을 위한 구동력을 제공하는 흡습패드; 및

상기 분석 스트립 하부에 위치하는 고체 지지대를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 분석 스트립은, 상기 지지대가 니트로셀룰로스, 나일론, 피브이디에프(PVDF), 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택된 재료로 형성된 것을 특징으로 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 분석 스트립은, 상기 제1 리간드, 상기 제2 리간드 및 상기 제3 리간드가 단백질, 항원, 항체, DNA, RNA, PNA 또는 압타머인 것을 특징으로 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 분석 스트립은, 상기 표지물질이 금콜로이드(colloidal gold), 라텍스 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자, 효소, 형광성 염료, 전도성 고분자, 발광 물질, 또는 자성입자인 것을 특징으로 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 분석 스트립은 래피트 테스트용, 바람직하게는 면역크로마토그래피용 스트립인 것을 특징으로 한다.

다른 양태로서, 본 발명은 상기 분석 스트립이 추가적으로 케이스 내에 고정되는 진단 키트로서,

하부 케이스에는 가이드 및 스트립 지지부가 구비되어 있고,

상부 케이스에는 검체 투입구; 및

검사선 및 가변 대조선에 상응하는 위치에 결과 확인창이 구비된 것인 진단 키트를 제공한다.

일 실시양태에서, 본 발명의 진단 키트는, 여러 기지농도의 표적물질이 포함된 검체들에 대한 검사선과 가변 대조선의 색상 기준표를 포함하는 표준 신호 데이터가 추가로 제공되는 것을 특징으로 한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 진단 키트는, 상기 검사선과 상기 가변 대조선으로부터 표지물질의 신호 유무 및 세기를 육안으로 확인하는 정성 또는 반정량 분석할 수 있는 것을 특징으로 한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분석 스트립을 사용하여 검체 내 표적물질을 정성 또는 정량 분석하는 방법으로서,

검체를 상기 접합체 패드 또는 그 이전에 위치한 패드에 투입하여 전개시키는 제1 단계;

검사선과 가변 대조선으로부터 표지물질의 신호 유무 및 세기를 확인하는 제2 단계; 및

검사선과 가변 대조선으로부터 확인된 신호 세기를 표준 신호 데이터와 비교하여 표적물질의 양을 측정하는 제3 단계를 포함하며,

상기 표준 신호 데이터가 여러 기지농도의 표적물질이 포함된 검체들에 대하여, 각각 상기 제1 단계 및 제2 단계를 수행하여 얻어진 것을 특징으로 한다.

일 실시양태에서, 본 발명의 분석 방법은, 상기 제2 단계의 검사선과 가변 대조선으로부터 표지물질의 신호 유무 및 세기를 농도계(densitometer)로 확인하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 시료를 고체상에 흡착된 리간드와 반응시키는 단계를 포함하는, 시료 내 하나 이상의 표적 물질을 정성 또는 정량 분석하는 방법으로서, 하나의 표적 물질에 대해 2개의 상이한 반응 기작이 적용되는 것을 특징으로 하는 분석 방법을 제공한다.

일 실시양태에서, 본 발명의 분석 방법은, 상기 2개의 상이한 반응 기작이 경쟁적 반응 및 샌드위치 반응인 것을 특징으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 접합체 패드 및 검출패드를 구비한 분석 스트립에 있어서, 상기 접합체 패드는 표적물질과 반응하는 제2 일정량의 제1 리간드 및 제1 리간드에 결합하는 신호검출 표지물질을 구비하고, 제1 리간드와 표지물질은 검체 전개 전 또는 검체 전개 시 서로 연결되어 접합체를 형성하고, 검체 전개 시 접합체는 검출패드로 이동할 수 있고, 상기 검출패드는 검사선 및 가변 대조선이 격리되어 구비되어 있고, 상기 검사선은 검체 내 표적물질과 반응하는 제2 리간드가 고정되어 있고, 상기 가변 대조선은 표적물질과 동일하거나 제1 리간드와 반응하는 표적물질의 유사체인 제3 리간드가 제2 일정량으로 고정되어 있어서, 검체 내 표적물질과 결합되지 않은 베어(bare) 접합체와 반응할 수 있는 것인, 분석 스트립을 제공한다.

본 발명에서 상기 분석 스트립은 래피드 분석용, 바람직하게는 면역크로마토그래피용 스트립일 수 있다.

본 발명은, 검사선 및 검체의 전개를 확인할 수 있는 대조선 만이 형성된 검출패드를 구비한 종래의 분석 스트립에 있어서, 표적물질과 동일한 물질 또는 유사체가 고정된 가변 대조선을 추가함으로써, 정성적 분석뿐만 아니라 신뢰성 높은 정량적 분석까지 수행할 수 있는 특징이 있다.

나아가 본 발명은, 특수한 분석 기구를 사용할 필요 없이, 육안을 통하여 신뢰성 높은 반정량적 분석을 수행할 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 용어 "면역크로마토그래피"는 항원-항체반응에 기초한 면역반응 원리와 검체 및 시약이 이동상에 의해 매질을 따라 이동하는 크로마토그래피 원리를 결합시킨 분석방법이다. 간략히 살펴보면, 다공성 막(membrane)에 분석하고자 하는 항체 또는 항원을 미리 분주시켜 고정하고 막의 일 말단으로부터 상기 고정시켜 놓은 항체 또는 항원을 향해 혈액을 전개시켜 혈액 중의 항원 또는 항체와의 반응을 관찰하는 것이다. 일반적인 의미의 면역반응은 항원-항체의 반응을 의미하나 본 발명에서는 광의적으로 항원-항체의 반응 이외에도 서로 간에 특이적으로 결합하는 수용체와 이에 특이적으로 결합하는 리간드의 반응도 포함하며, 이에 제한되지 않고, 효소와 기질 간의 반응 등 서로를 특이적으로 인식하여 일어나는 반응들까지 모두 포함할 수 있다.

면역크로마토그래피에 의한 분석은 매질을 통하여 모세관 현상에 의해 이동상과 함께 표적물질을 포함하는 검체가 이동하면서 이루어진다. 따라서, 이러한 면역크로마토그래피 전개를 위한 매질로서, 스트립을 제조하여 이용할 수 있다. 이러한 분석 스트립의 구체적인 구성요소 및 각각의 기능은 후술할 것이다.

상기 항원-항체 반응을 육안으로 또는 센서를 이용하여 용이하게 확인할 수 있도록 표지물질을 이용할 수 있다. 또한 이러한 표지물질이 분석하고자 하는 표적물질과 결합할 수 있도록 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 표지물질에 연결시켜 이용할 수 있다.

본 발명의 용어 "접합체(conjugate)"는 상기 표지물질과 상기 리간드가 서로 연결되어 형성된 결합체를 의미하는 것으로, 상기 접합체는 신호검출을 위한 표지물질이 결합되고, 검체 내 표적물질과 반응하는 제1 리간드를 포함한다. 상기 제1 리간드란, 후술하는 다른 리간드와 구별하기 위하여, 상기 표지물질과 결합되어 접합체를 형성시키는 리간드를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 제1 리간드는 표적물질과 반응할 수 있는 물질로, 표적물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미한다.

상기 표지물질과 제1 리간드는 물리적 또는 화학적으로 연결시킬 수 있다. 즉, 표지물질과 제1 리간드가 수동 흡착(passive adsorption)에 의해 연결되도록 할 수 있고, 반응성 그룹을 가지도록 표지물질을 개질시켜 제1 리간드와 공유결합으로 연결시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 표지물질과 제1 리간드의 연결은 당업자에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

단, 상기 표지물질과 제1 리간드는 분석 스트립에 검체를 전개시키기 전부터 접합체의 형태로 연결되어 접합체 패드에 존재할 수 있다. 또한 이들은 서로 연결되지 않고 분리된 상태로 접합체 패드에 존재하다가, 검체가 전개되면서 서로 연결되어 접합체를 형성할 수 있다. 어느 경우이던, 검체 전개 시 표지물질과 제1 리간드는 접합체의 상태로 검출패드로 이동할 수 있으며, 이는 이들이 접합체 패드에 고정되어 있는 것이 아니기 때문이다.

본 발명의 용어 "표지물질"은 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 신호를 발생시키는 물질을 의미한다. 상기 표지물질로는 금콜로이드(금 입자), 라텍스 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자, 효소, 형광성 염료, 전도성 고분자, 발광 물질 또는 자성입자 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 신호는 발광 등과 같이 표지물질의 내재적 특성에 의해 자체적으로 발생할 수 있는 것이거나, 형광 등과 같이 외부의 자극에 의해 발생하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "리간드"는 서로 특이적으로 결합하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 특정 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드 등이 서로 리간드로 작용한다. 상기 리간드의 비제한적인 예로는 단백질, 항원, 항체, DNA, RNA, PNA 또는 압타머가 있을 수 있으며, 이외에도 본 발명에서 리간드는 상기 정의된 특성을 나타내는 물질이면 제한 없이 사용될 수 있다. 본 명세서 전반에서 사용된 리간드의 의미는 특정 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드라고 구체화하여 표기되지 않는 한 상기 정의된 바와 같이 서로 특이적으로 결합하는 물질을 의미한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 있어서, 표지물질과 제1 리간드가 미리 연결되어, 접합체로서 접합체 패드에 존재할 수 있다. 이 경우, 표지물질과 제1 리간드를 각각 기지농도의 용액으로 제조하여 혼합시킨 후 일정시간 반응하도록 하여 접합체 용액을 제조하고, 이를 접합체 패드에 분주하여 접합체가 구비된 접합체 패드를 준비할 수 있다. 이때, 각각의 용액의 농도 및 혼합비율은 표지물질과 리간드의 결합비를 고려하여 결정할 수 있다. 상기 표지물질과 리간드의 결합은 하나의 표지물질에 하나의 리간드가 결합하는 경우, 하나의 표지물질에 복수개의 리간드가 결합하는 경우 또는 복수개의 표지물질이 하나의 리간드에 결합하는 경우일 수 있다. 구체적인 결합비는 중요하지 않으나, 바람직한 양태는 일정한 비율을 유지하는 것일 수 있다. 상기 결합비는 표지물질과 리간드의 종류에 따라 변할 수 있으며, 이들의 상대적인 크기 및 결합자리의 개수 등을 고려하여 예측될 수 있다. 예를 들어, 표지물질로서 수 마이크론 사이즈의 라텍스 비드를, 리간드로서 항체를 사용하는 경우, 복수개의 항체가 1개의 라텍스에 결합할 수 있다. 바람직하게 각각의 라텍스 표면에 균일한 개수로 항체를 결합시키기 위하여 항체가 라텍스 표면에 포화되어 결합되도록 항체 및 라텍스 용액의 농도 및 혼합 비율을 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기한 바와 같이 각각 기지농도의 표지물질과 제1 리간드를 혼합하여 반응시킴으로써 기지농도의 접합체 용액을 얻을 수 있다. 상기 접합체 용액은 일정 농도의 접합체 분자가 용액 상에 균일하게 분산되어 있는 분산액의 형태이다.

상기 분석 스트립은, 가변 대조선을 구비하는 분석 스트립으로서,

표적물질과 반응하는 제2 일정량의 제1 리간드 및 제1 리간드에 결합하는 신호검출 표지물질을 구비하는 접합체 패드; 및

검사선 및 가변 대조선이 격리되어 구비된 검출패드를 포함할 수 있다.

검체 내 표적물질을 정성적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라 정량적으로도 분석할 수 있도록, 제3 리간드를 검출패드에 고정하여 "가변 대조선(variable control line)"을 형성하였다. 본 발명의 분석 스트립의 가변 대조선에는, 검출패드에 전개되는 이동상(mobile phase) 내의 베어 접합체와 반응할 수 있도록, 표적물질과 동일한 물질이거나 제1 리간드와 반응하는 표적물질의 유사체를 제3 리간드로서 고정시킬 수 있다. 검체 내 표적물질과 결합되지 않은 베어(bare) 접합체는 제1 리간드를 포함하므로, 이러한 제1 리간드는 표적물질과 동일한 물질 또는 유사체, 즉 제3 리간드와 특이적으로 결합하게 된다.

나아가 상기 제3 리간드는 기 결정된 특정량 만큼을 가변 대조선에 고정시킬 수 있다. 즉 상기 제2 일정량은, 상기 제3 리간드가 가변 대조선에 고정된 특정량을 의미한다. 이와 같이 제2 일정량으로 제3 리간드를 고정시킴으로써, 가변 대조선에서의 신호 세기를 조절하고, 검출 가능한 검체 내 표적물질의 농도범위를 조절하고, 나아가 신뢰성 높은 정량분석에 도움을 줄 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제3 리간드는 후술하는 다른 리간드와 구별하기 위하여, 검출패드에 고정되어 가변 대조선을 형성하는 리간드를 의미한다.

나아가, 검체 내 표적물질을 검출하기 위하여 이와 특이적으로 결합하여 선택적으로 포획할 수 있는 제2 리간드를 검출패드에 고정하여 "검사선(test line)"을 형성하였다. 본 발명의 분석 스트립의 검사선에는, 검출패드에 전개되는 이동상 내의 표적물질-접합체 복합체, 즉 표적물질과 반응할 수 있도록, 검체 내 표적물질과 반응하는 제2 리간드가 고정된다. 상기 제2 리간드는 상기 제1 리간드와 동일한 물질 또는 유사체이거나, 또는 표적물질과 특이적으로 결합하는 제3의 물질일 수 있다. 검체 내 표적물질이 이동상과 함께 전개되면서, 접합체 패드 내 접합체와 결합하여 복합체를 형성하며 전개된다. 이러한 복합체는 표적물질을 포함하고, 앞서 설명한바와 같이 제1 리간드는 표적물질과 특이적으로 결합할 수 있기 때문에, 제1 리간드와 동일한 물질 또는 유사체; 또는 표적물질과 특이적으로 결합하는 별도의 물질인 제2 리간드는 표적물질과의 결합을 통해 상기 복합체를 검사선에 포획시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제2 리간드는 후술하는 다른 리간드와 구별하기 위하여, 검출패드에 고정되어 검사선을 형성하는 리간드를 의미한다.

상기한 바와 같이 면역크로마토그래피는 매질을 따라 표적물질을 포함하는 이동상이 이동하는 크로마토그래피의 원리를 이용한다. 따라서, 분석 스트립을 이용한 면역분석을 위해서는 표적물질을 포함하는 검체를 스트립을 따라 이동시키기 위한 이동상을 필요로 한다. 이에 따라, 본 발명의 면역분석용 키트는 완충액을 추가로 포함할 수 있다. 상기 완충액은 분석 스트립을 따라 검체를 이동시키는 이동상(mobile phase)으로서 작용할 뿐만 아니라, 접합체를 용해시키는 용매로 작용할 수 있으며, 필요에 따라서는 검체를 희석시키기 위한 희석액으로서의 역할도 겸할 수 있다. 또한, 예를 들어 전혈분석을 하는 경우, 적혈구 등의 혈구성분을 용해(lysis)시키기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 완충액으로는 10 mM 내지 1 M 농도의 인산염 완충액(phophate buffered solution; PBS), 비이온성 또는 양쪽성 계면활성제 또는 이들의 혼합물 등 통상의 완충액을 제한 없이 사용할 수 있으며, 항원-항체 반응 등 원하는 반응의 종류에 따라 적절히 선택될 수 있다.

상기 접합체 패드는, 앞서 설명한 표적물질과 반응하는 제2 일정량의 제1 리간드 및 제1 리간드에 결합하는 신호검출 표지물질을 구비하는 패드로서, 상기 제1 리간드와 상기 표지물질은 검체가 전개되기 전부터 접합체의 형태로 연결되어 접합체 패드에 존재할 수 있으며, 또는 서로 연결되지 않고 분리된 상태로 접합체 패드에 존재하다가, 검체가 전개되면서 이들이 서로 연결되어 접합체를 형성할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 접합체 패드 내에 존재하는 제1 리간드의 경우, 기 결정된 특정량만 존재하도록 할 수 있다. 즉 상기 제2 일정량은, 상기 제1 리간드가 접합체 패드 내에 존재하는 특정량을 의미한다. 접합체 패드 내 제1 리간드가 제2 일정량으로 정해져 있기 때문에, 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록, 제1 리간드와 표적물질이 결합하면서 형성된 복합체의 개수는 증가하게 되며, 반대로 표적물질과 결합되지 않은 베어 접합체의 개수는 감소하게 되는, 반비례적 관계를 보일 수 있다.

바람직하기로, 상기 접합체 패드는 제1 리간드와 표지물질이 이미 연결된 접합체 상태로 상기 패드 내에 존재할 수 있다. 이때, 앞서 설명한 바와 같이, 상기 기지농도의 접합체 용액을 패드에 적용하여 준비할 수 있다.

나아가 상기 접합체 패드는 내부 대조군(internal control)으로 이용할 수 있도록 제4 리간드와 표지물질이 결합된 제2 접합체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제4 리간드는 리포터 분자와 특이적 또는 비특이적으로 반응할 수 있는 리간드를 의미한다. 상기 제2 접합체는 불변 대조선의 리포터 분자에 의해 포획되어, 검체의 전개를 확인하게 할 수 있다. 상기 불변 대조선 및 리포터 분자에 대한 보다 구체적인 설명은 후술한다.

상기 검출패드는, 이동상과 검체가 전개되는 매질로서, 이동상과 검체가 검출패드를 이루는 다공성 막의 모세관 현상에 의해 이동할 수 있다. 나아가 상기 검출패드는 상기 검사선 및 상기 가변 대조선이 격리되어 구비되어 있고, 검체의 전개를 확인할 수 있는 불변 대조선이 추가로 구비될 수 있다. 상기 검출패드의 일 말단은 상기 접합체 패드와, 다른 일 말단은 검체 이송을 위한 구동력을 제공하는 흡습패드와 연결될 수 있다. 상기 접합체 패드와 상기 흡습패드는 검출패드에 일부 중첩되어 위치할 수 있다. 상기 검출패드는 다공성 막으로 이루어질 수 있으며, 상기 다공성 막으로는 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane), 유리섬유(glass fiber) 막, 폴리에테르술폰(polyethersulfone; PES) 막, 셀룰로스(cellulose) 막, 나일론(nylon) 막 및 이들의 조합을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 15 m의 기공을 가지는 니트로셀룰로스 막이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 분석 스트립을 이용한 정성 및 정량 분석 원리에 대하여 보다 구체적으로 설명한다.

종래 분석 스트립은 막 패드에 검사선을 형성하고, 전개되는 표적물질-접합체 복합체가 검사선에 포획되어 신호를 발생시킨다(샌드위치 반응). 이때, 신호의 세기는 표적물질의 농도가 증가함에 따라 증가하지만, 표적물질이 일정 농도 이상으로 증가하면 오히려 신호의 세기는 후크(hook) 현상으로 감소하는 현상을 보인다. 이러한 현상으로 인해, 종래 분석 스트립은 표적물질의 정량적 분석을 하기에는 커다란 제약이 따른다.

그러나 본 발명은 샌드위치 반응뿐만 아니라, 접합체 패드에서 제2 일정량의 제1 리간드들이 검체 내 유한한 표적물질에 경쟁적으로 결합하여 전개되는 특성을 이용하는 특수한 경쟁 반응을 하나의 스트립에 적용하므로, 종래의 면역크로마토그래피 분석법에 비하여 신속성, 사용 편이성 및 특히 정량적 분석 가능성이 개선된 특징이 있다.

구체적으로, 액상 검체를 본 발명 스트립의 샘플패드에 도입하면, 이동상과 검체의 전개가 시작된다. 접합체 패드에서, 제2 일정량의 제1 리간드들이 검체 내 유한한 표적물질에 경쟁적으로 반응한다. 제2 일정량의 제1 리간드 중 일부는 검체 내 표적물질과 반응하여, 상기 제1 리간드 및 표지물질을 구비한 접합체에 표적물질이 결합된 복합체를 형성하고, 반대로 표적물질과 반응하지 못한 나머지 제1 리간드는 베어 접합체의 상태로 이동상과 함께 전개된다. 여기에서, 제1 리간드가 제2 일정량으로 일정하기 때문에, 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 상기 형성된 복합체의 개수는 증가하고, 반대로 상기 베어 접합체의 개수는 감소하는 특징이 있다.

상기 제1 리간드, 표지물질 및 표적물질을 구비한 복합체는 전개되는 중 제2 리간드와 반응하여 검사선에 포획되고, 상기 검체 내 표적물질과 결합되지 않고, 제1 리간드 및 표지물질을 구비한 베어 접합체는 전개되는 중 제3 리간드와 반응하여 가변 대조선에 포획된다. 상기 복합체와 베어 접합체는 제2 리간드가 검사선에, 제3 리간드가 가변 대조선에 고정되어 있기 때문에, 각각의 선에 포획되는 것이다.

상기 복합체 및 베어 접합체는 모두 표지물질을 구비하고 있으므로, 이들이 포획된 상기 검사선 및 상기 가변 대조선 상의 표지물질로부터의 신호를 측정하여 검체 내 표적물질의 유무, 양 또는 둘 모두를 측정할 수 있다.

앞서 언급한 바와 같이, 상기 복합체는 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 그 개수가 증가하고, 반대로 상기 베어 접합체는 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 그 개수가 감소하게 된다. 따라서, 베어 접합체가 포획되는 가변 대조선으로부터의 신호 세기는 검체 내 표적물질의 농도가 증가할수록 감소하는 양상을 보이게 된다.

보다 구체적으로, 상기 가변 대조선으로부터의 신호 세기는 검체 내 표적물질의 농도가 M 값까지는 일정하게 유지되다가, 이를 초과시 점차 감소하며, 최종적으로 신호 세기가 0으로 수렴하고, 여기서 상기 M 값은 상기 제2 일정량으로 고정된 제3 리간드가 상기 베어 접합체에 모두 반응하여 포화되는 경우에 있어서의 검체 내 표적물질의 최대농도이다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 검체 내 표적물질의 농도가 0에서부터 90 ng/㎖까지는 가변 대조선으로부터의 신호 세기가 가장 강한 신호로 유지됨으로써, 상기 제3 리간드가 상기 베어 접합체에 모두 반응된 상태임을 알 수 있으며, 따라서 본 실시예에서의 M 값은 약 90 ng/㎖임을 확인할 수 있다(실시예 2 참조). 그러나 상기 M 값은 제2 일정량, 제3 리간드 및 표적물질의 종류 등에 따라 변화하며, 따라서 분석 목적에 맞게 당업자가 적절하게 선택할 수 있다.

검사선의 경우는, 앞서 설명한 바와 같이 표적물질의 양이 증가할수록 신호의 세기가 증가하다가, 후크 현상으로 인해 일정 수준 이상부터는 감소하는 양상을 보이게 된다. 이러한 본 발명의 표적물질의 농도 증가에 따른 검사선 및 가변 대조선의 신호 세기 양상을 도 3에 나타내었다.

결과적으로 상기 검사선 및 상기 가변 대조선 상의 표지물질로부터의 신호를 통해 표적물질에 대한 정성 및 정량 분석이 가능하다. 보다 구체적으로, 상기 검사선과 가변 대조선에서의 신호를, 기지농도의 표적물질에 대해 미리 완성해둔 표준 신호 데이터와 비교하여, 표적물질의 농도를 분석할 수 있다. 이는 신호의 세기를 육안으로 확인하여 반정량적으로 분석할 수 있고, 또는 농도계(densitometer)와 같은 리더(reader)를 사용하여 보다 엄밀하게 정량적으로 분석할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 검출패드는, 검체의 전개를 확인할 수 있는 불변 대조선이 추가로 구비되어 있고, 상기 불변 대조선은 리포터 분자가 고정되어 있을 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "불변 대조선(constant control line)"은 검체 또는 검체 중 표적물질의 농도와 관계없이 일정한 신호를 내는 부분을 의미한다. 상기 불변 대조선은 상기 검사선 및 상기 가변 대조선과 유사한 방법을 이용하여 형성할 수 있다. 다만, 상기 불변 대조선은 분석하고자 하는 물질(표적물질)과는 결합하지 않으면서, 검체와 함께 이동상에 의해 검출패드를 따라 이동하는 제2 접합체의 제4 리간드와 특이적 또는 비특이적으로 결합하여 포획할 수 있는 리간드를 고정시켜 형성할 수 있다. 또는 상기 불변 대조선은 검체와 함께 이동상에 의해 검출패드를 따라 이동하는, 표지물질 또는 표지물질이 결합된 별도의 물질과 특이적 또는 비특이적으로 결합하여 포획할 수 있는 리간드를 고정시켜 형성할 수 있다. 결과적으로, 검체 중의 표적물질의 농도 및 존재 유무와 무관하게 일정한 신호를 방출할 수 있는 물질을 리간드로 고정시켜 형성되는 것이다. 상기 불변 대조선으로서 사용될 수 있는 리간드는 "리포터 분자"라는 용어를 사용하여 표현하였으며, 예를 들어, 상기 리포터 분자로는 항-래빗 IgG, 항-치킨 IgY, 스트렙타비딘(streptavidin), 소혈청알부민 등이 사용될 수 있다.

상기 불변 대조선은 고정되는 리포터 분자의 농도를 달리하여 2개 이상으로도 형성될 수 있다. 상기 불변 대조선에 고정된 리포터 분자의 농도가 높을수록, 불변 대조선은 강한 신호를 일정하게 방출할 수 있다.

상기 불변 대조선에 특정농도의 리포터 분자를 고정시키는 경우, 여기서 발생하는 신호의 세기는 언제나 일정하므로, 해당 신호 세기와 대응되는 검사선 또는 가변 대조선에서의 신호 세기가, 표적물질의 농도가 어느 정도일 때 발생되는지 결정할 수 있다. 이러한 불변 대조선을 리포터 분자의 농도를 달리하여 수개 형성함으로써, 서로 다른 신호 세기를 갖는 불변 대조선이 수개 형성될 수 있다. 이들을 검사선 또는 가변 대조선에서의 신호 세기와 비교하여 정량 분석할 수 있다. 즉, 상기 불변 대조선을 내부적 표준 신호 데이터로 활용할 수 있다.

예를 들어, 2개의 불변 대조선이 형성되어 있고, 각각 1 및 3만큼의 신호세기를 방출한다고 하자. 기지농도의 표적물질을 통해, 검사선이 1만큼의 신호세기를 갖을 때 표적물질의 농도가 10 ng/㎖인 경우이고, 검사선이 3만큼의 신호세기를 갖을 때 표적물질의 농도가 30 ng/㎖인 경우라는 것은 미리 결정될 수 있다. 미지농도인 표적물질을 분석한 결과, 검사선이 2만큼의 신호 세기를 보였다면, 이를 불변 대조선의 신호 세기와 비교하였을 때, 2개의 불변 대조선의 사이 값에 해당하는 신호 세기임을 쉽게 알 수 있다.

상기 검사선, 상기 가변 대조선 및 상기 불변 대조선의 크기 및 위치는 사용되는 항원-항체 반응 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 불변 대조선 신호의 유무로부터 성공적인 검체의 전개 여부를 확인할 수 있고, 검사선의 신호의 세기와 가변 대조선의 신호의 세기를 기 결정된 표준 신호 데이터와 비교하여 표적물질의 정량분석을 수행할 수 있다. 상기 표준 신호 데이터에 대해서는 후술한다.

본 발명에 있어서, 검사선 및 가변 대조선의 신호 세기를 통한 정량분석의 경우, 검체 내 표적물질의 농도 측정 범위(dynamic range)가 1 ng/㎖ 내지 1 ㎎/㎖ 사이일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 검체 내 표적물질을 분석한 결과, 검체 내 표적물질의 농도 측정 범위(dynamic range)가 5 내지 100,000 ng/㎖ 사이로 넓게 나타남을 확인하였다(실시예 2 참조). 즉, 종래 분석 스트립은 검체 내 표적물질이 일정 농도를 초과하게 되면 후크 현상의 발생으로, 검사선에서의 신호 세기가 오히려 감소하는 현상을 보임은 앞서 설명하였다. 그러나 본 발명의 분석 스트립은 검체 내 표적물질의 농도가 증가함에 따라 점차 감소하는 가변 대조선을 추가로 포함하고 있고, 상기 가변 대조선은 후크 현상에 영향을 받지 않기 때문에, 검사선 및 가변 대조선의 조합을 통하여 종래 검사선만으로는 한계가 있던 농도 측정 범위를, 후크 현상이 발생하는 범위까지 넓힌 특징이 있다. 그러나 상기 농도 측정 범위는 표적물질의 종류, 검출패드 상에 고정되는 리간드의 양 및 신호 검출 장치 등에 따라 변화될 수 있으므로, 본 발명의 농도 측정 범위는 상기 범위로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 분석 스트립에 대하여 보다 구체적으로 설명한다.

상기 분석 스트립은, 표적물질 포함 여부를 확인하고자 하는 검체가 도입되는 샘플패드; 일 말단이 상기 샘플패드와 연결되는 상기 접합체 패드; 일 말단이 상기 접합체 패드의 다른 일 말단과 연결되는 상기 검출 패드; 일 말단이 상기 검출 패드의 다른 일 말단과 연결되고, 상기 샘플패드로부터 검체 이송을 위한 구동력을 제공하는 흡습패드; 및 상기 분석 스트립 하부에 위치하는 고체 지지대를 포함할 수 있다. 본 발명의 분석 스트립에 대한 구성도를 도 2에 나타내었다.

상기 고체 지지대는 니트로셀룰로스, 나일론, 피브이디에프(PVDF), 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택된 재료로 형성된 것일 수 있다. 상기 고체 지지대 상에 스트립을 부착하여 제조함으로써 스트립의 내구성을 높일 수 있고, 취급 및 보관을 용이하게 할 수 있다. 또한, 추가적인 외부 케이스 장착을 용이하게 할 수 있다. 상기 고체 지지대로 사용될 수 있는 플라스틱 재질로는 폴리프로필렌(polypropylene) 필름, 폴리에스테르(polyester) 필름, 폴리카보네이트(polycarbonate) 필름, 아크릴(acrylic) 필름 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 분석 스트립이 추가적으로 케이스 내에 고정되는 것인 키트로서, 하부 케이스에는 가이드 및 스트립 지지부가 구비되어 있고, 상부 케이스에는 검체 투입구; 및 검사선 및 가변 대조선에 상응하는 위치에 결과 확인창이 구비된 것인 진단 키트를 제공한다.

상기 분석 스트립은 추가적으로 케이스 내에 고정될 수 있다. 하부 케이스의 내부에는 상기 분석 스트립을 적절한 위치에 배치시키고 고정 또는 압착시키기 위한 다수의 가이드 및/또는 스트립 지지부가 구비될 수 있다. 선택적으로 하부 케이스에 구비된 가이드 및 스트립 지지부에 대응되는 위치에 가이드 및 스트립 지지부가 상부 케이스에도 구비된 것일 수 있다. 즉, 상기 가이드 및/또는 스트립 지지부는 필요에 따라 하부 케이스에 형성되거나, 또는 상부 케이스 및 하부 케이스 모두에 형성될 수 있다.

또한, 상부 케이스에는 검체 투입구 및 검사선, 가변 대조선, 불변 대조선에 상응하는 위치에 표지물질로부터의 신호를 검출하기 위한 결과 확인창을 구비할 수 있다. 상기 검체 투입구는 검출패드의 일 말단에 즉, 검사선을 기준으로 흡습패드의 반대편 말단이면서, 동시에 검체가 막을 따라 전개될 수 있도록 검사선과 충분히 이격된 지점에 홀 또는 슬릿 등의 형태로 형성될 수 있다.

상기 결과 확인창은 검출패드 상에 검사선 및 가변 대조선이 위치한 지점 및/또는 경우에 따라서 추가적으로 불변 대조선이 형성되어 있는 경우 불변 대조선까지 포함하여 외부로부터 육안으로 또는 센서를 통해 식별 가능하기에 충분한 크기로 형성될 수 있다. 상기 검사선, 가변 대조선 및 불변 대조선을 확인할 수 있는 한 그 크기 및 모양은 제한 없이 형성될 수 있다.

상기 상부 및 하부 케이스는 통상의 플라스틱 소재를 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어 폴리카보네이트, 아크릴로니트릴부타디엔스티렌(acrylonitrile butadiene styrene; ABS) 등의 소재가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 상부 및 하부 케이스는 별도로 제작하여 결합 홈, 결합 돌기 등을 구비하여 통상의 수단으로 결합될 수 있고, 경우에 따라서는 일체형으로 제조될 수 있다.

나아가 상기 진단 키트는 여러 기지농도의 표적물질이 포함된 검체들에 대한 검사선과 가변 대조선의 색상 기준표를 포함하는 표준 신호 데이터가 추가로 함께 제공될 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 표준 신호 데이터란, 다양한 기지농도의 표적물질이 포함된 검체에 대하여, 본 발명의 분석 스트립을 사용해 각각에 대한 검사선과 가변 대조선에서의 신호 세기를 정리한 데이터를 의미한다. 이러한 표준 신호 데이터는 다양한 형태로 정리될 수 있으며, 대표적으로 각각의 표적물질의 농도에 대응하는 검사선과 가변 대조선의 색상으로 정리될 수 있다. 유사하기로, pH를 측정하기 위한 리트머스 시험지의 경우, 각각의 pH에 대응하는 시험지의 색상을 정리한 색상 기준표를 함께 제공하는 것을 예로 들 수 있다. 특히 상기 색상 기준표를 포함하는 표준 신호 데이터의 경우에는, 단순히 육안으로도 표적물질에 대한 신호의 세기를 표준 신호 데이터와 용이하게 비교할 수 있기 때문에, 간편하고 신속하게 반정량적인 분석이 가능할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 진단 키트는, 상기 검사선과 상기 가변 대조선으로부터 표지물질의 신호 유무 및 세기를 육안으로 확인함으로써, 정성 또는 반정량 분석을 수행하도록 할 수 있다. 즉, 앞서 제공될 수 있는 색상 기준표를 포함하는 표준 신호 데이터와, 상기 키트에 검체를 전개시킨 후 상기 검사선과 상기 가변 대조선에 나타나는 신호 유무 및 세기를 육안으로 비교함으로써, 검체 내 표적물질의 유무 및 이의 농도를 분석할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 분석 스트립을 사용하여 검체 내 표적물질을 정성 또는 정량 분석하는 방법으로서, 검체를 상기 접합체 패드 또는 그 이전에 위치한 패드에 투입하여 전개시키는 제1 단계; 검사선과 가변 대조선으로부터 표지물질의 신호 유무 및 세기를 확인하는 제2 단계; 및 검사선과 가변 대조선으로부터 확인된 신호 세기를 표준 신호 데이터와 비교하여 표적물질의 양을 측정하는 제3 단계를 포함하며, 상기 표준 신호 데이터는 여러 기지농도의 표적물질이 포함된 검체들에 대하여, 각각 상기 제1 단계 및 제2 단계를 수행하여 얻어진 것인 분석 방법을 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 시료를 고체상에 흡착된 리간드와 반응시키는 단계를 포함하는, 시료 내 하나 이상의 표적 물질을 정성 또는 정량 분석하는 방법으로서, 하나의 표적 물질에 대해 2개의 상이한 반응 기작이 적용되는 것을 특징으로 하는 분석 방법을 제공한다. 상기 분석 방법은, 상기 2개의 상이한 반응 기작이 경쟁적 반응 및 샌드위치 반응인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 분석 방법은, 하나의 스트립에 2개의 리간드 반응 영역이 서로 다른 위치에 존재하는 분석 스트립을 사용하거나, 상기 2개의 리간드 반응 영역이 분리된 스트립에 각각 존재하는 분석 스트립을 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 분석 방법은 측면 유동(lateral flow) 방식 또는 반응용기에서 한 번에 반응시키는 방식 등 전개방식에 있어 별다른 제한을 받지 않는다.

본 발명의 분석 스트립을 사용하여 검체 내 표적물질을 정성 및/또는 정량 분석하는 방법에 대한 구체적인 원리는 앞서 설명한 바와 동일하다. 나아가 표준 신호 데이터 역시 앞서 설명한 바와 동일하다.

구체적인 분석 방법을 수행함에 있어서, 하기의 순서로 진행할 수 있다.

먼저, 분석하고자 하는 물질(표적물질)이 포함된 액상 검체를 상기 접합체 패드 또는 그 이전에 위치한 패드에 투입할 수 있다. 즉, 액상 검체는 바로 접합체 패드에 투입하여 검체가 스트립에 도입될 수 있지만, 바람직하기로 접합체 패드 이전, 예를 들어 샘플패드에 투입하여 도입될 수 있다. 또한 상기 검체는 PBS와 같은 완충액을 가하여 균일하게 혼합하고, 이를 동일한 방법으로 스트립에 도입시킬 수 있다.

상기와 같이 검체가 분석 스트립에 로딩(도입)되면 전개가 시작되고, 그 후 불변 대조선을 통해 검체의 전개가 잘 이루어졌는지 확인할 수 있다. 검체의 전개가 잘 이루어 졌다면, 검사선과 가변 대조선으로부터 표지물질의 신호 유무 및 세기를 확인한다. 검사선으로부터 신호가 확인됐다면, 이는 표적물질이 검체 내에 포함되어 있음을 나타낸다(정성 분석). 나아가 검사선과 가변 대조선으로부터 확인된 신호 세기를 표준 신호 데이터와 비교하여, 표적물질이 검체 내에 어느 정도의 농도로 포함되어 있음을 확인할 수 있다(정량 분석).

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 가변 대조선을 추가로 포함하는 분석 스트립을 이용한 사람 면역글로불린 G(human IgG; 표적물질)의 분석을 수행함으로써, 검체 내 표적물질의 농도가 5 내지 100,000 ng/㎖ 범위에서 후크 현상의 발생에도 불구하고 육안으로 신뢰성 높은 정량분석이 가능함을 확인하였다(표 1 및 도 5 참조).

본 발명의 면역분석을 위한 검체로는 포유류, 바람직하게는 인간으로부터 분리된 전혈, 혈구, 혈청, 혈장, 골수액, 땀, 오줌, 눈물, 침, 피부, 점막, 모발 등의 모든 생체시료를 포함하며, 예컨대 혈액일 수 있다. 혈액은 혈구성분을 제거한 혈청 또는 혈장성분을 이용할 수도 있고, 전혈을 이용할 경우 혈구성분을 용해(lysis)시킬 수 있는 성분을 완충액에 추가하여 사용할 수 있다. 이는 예시적인 것이며, 본 발명의 면역분석을 위한 검체는 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 면역분석 방법은 말라리아 항원(Ag), 에이즈, C형 간염, B형 간염, 매독, 위궤양 원인균, 암 표지자(AFP, PSA, CEA), 결핵, 사스, 뎅기열, 나병 등 주로 전혈을 검체로 사용하는 질병의 진단에 유용할 수 있다.

본 발명의 분석 스트립은 가변 대조선을 구비함으로써, 후크 현상으로 인한 표적물질 정량 측정의 어려움을 극복하고, 육안으로 정성적 분석뿐만 아니라 신뢰성 높은 정량적 분석까지 신속하고 편리하게 수행할 수 있다. 나아가 검사선과 가변 대조선과의 상호 보완을 통하여 분석 물질의 농도 측정 범위가 개선된 효과가 있다.

도 1은 통상적인 면역크로마토그래피 분석에 사용되는 분석 스트립의 단면을 나타낸 개요도이다.
도 2는 본 발명의 면역크로마토그래피 분석에 사용되는 분석 스트립을 나타낸 개요도이다.
도 3은 본 발명의 분석 스트립에 있어서, 검체를 도입하기 전 및 검체 도입 후의 검사선, 가변 대조선 및 불변 대조선의 양상을 나타낸 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 분석 스트립의 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 다양한 검체 내 표적물질의 농도에 대한 분석 결과를 비교하여 나타낸 사진이다. 표적물질로는 사람 면역글로불린 G(human IgG)가 사용되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 분석 스트립의 제조

A. 검사선 , 가변 대조선 및 불변 대조선이 형성된 검출패드의 제작

3개의 분석 선을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 분주하였다. 적층기(laminator)를 이용하여 니트로셀룰로오스 막을 플라스틱 카드에 적층하였다. 그 후, 검사선의 제2 리간드로는 산양 항-사람 IgG(anti-human IgG from goat, Arista, USA)를, 가변 대조선의 제3 리간드로는 사람 IgG(human IgG)를, 불변 대조선의 리포터 분자로는 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 이용하여, 이들 각각을 자동분주기를 이용하여 분주한 후, 25 내지 30℃에서 2일간(48시간) 건조시켰다.

B. 접합체 패드( conjugate pad )의 제작

0.5% PVA(polyvinylalcohol)가 함유된 트리스 완충액(10 mM, pH 8.5)으로 패드를 충분히 적셔 건조기에서 완전히 건조시켜 접합체 패드를 전-처리하였다.

직경이 약 40 nm인 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)와 산양 항-사람 IgG(anti-human IgG from goat)가 결합된 접합체 용액을 준비하였고, 또한 직경이 약 40 nm인 콜로이드성 금 입자와 스트렙타비딘(streptavidin)이 결합된 제2 접합체 용액을 준비하였다. 상기 접합체 용액 및 제2 접합체 용액을 전-처리된 접합체 패드에 분주하고, 완전히 건조시킨 후, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

C. 샘플패드 ( sample pad )의 제작

1% Triton X-100, 0.5% NaN₃, 0.1% BSA가 함유된 0.08 M 붕산염(borate) 완충액에 샘플패드를 충분히 적셔, 건조기에서 완전히 건조시킨 후, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

D. 흡수패드( absorbance pad )의 제작

흡수패드는 건조기에서 수분을 완전히 건조시킨 상태로 아무런 처리 없이 그대로 사용하며, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.

E. 분석 스트립의 제작

위의 각 과정을 통해 준비된 검출패드, 접합체 패드, 샘플패드 및 흡수패드를 도 4에 나타난 구조에 따라 조립한다.

즉, 스티커가 부착된 샘플패드를 접합체 패드의 일 말단과 중첩되도록 부착하고, 검출패드의 일 말단을 상기 접합체 패드의 다른 일 말단과 중첩되도록 부착하고, 검출패드의 다른 일 말단과 상단표시용 스티커가 부착된 흡수패드의 일 말단을 서로 중첩되도록 부착하였다. 이를 절단기를 이용하여 21.0 mm 정도로 절단하여 도 4와 같은 스트립을 제조하였다.

도 4에 있어서, 각각의 도면 부호가 의미하는 바는 아래와 같다.

1: 샘플패드; 16442 mm

2: 항-사람 IgG와 금 입자의 접합체 패드; 61.042 mm

3: 니트로셀룰로오스 검출패드; 25542 mm

4: 플라스틱 고체 지지체

5: 흡습패드; 18442 mm

6: 항-사람 IgG가 고정된 검사선

7: 사람 IgG가 고정된 가변 대조선

8: 소혈청알부민이 고정된 불변 대조선

실시예 2: 분석 스트립을 이용한 면역분석

96-웰 플레이트에, 표적물질인 사람 IgG와 인산염 완충액(PBS)을 포함하는 검체 용액을 100 씩 분주하였다. 검체 용액에는 사람 IgG의 농도가 각각 0 ng/㎖, 5.6 ng/㎖, 11.2 ng/㎖, 22.5 ng/㎖, 45 ng/㎖, 90 ng/㎖, 187 ng/㎖, 375 ng/㎖, 750 ng/㎖, 1.5 ㎍/㎖, 3.12 ㎍/㎖, 6.25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖이 되도록 준비하였다.

상기 검체 용액이 들어 있는 96-웰 플레이트에 상기 실시예 1에서 제작한 분석 스트립을 넣은 후 10분간 전개시켰다.

도 5는 표적물질인 사람 IgG의 농도에 따른 크로마토그래피용 스트립의 전개 결과를 나타낸 사진이다.

나아가, 검사선, 가변 대조선 및 불변 대조선에서 나타나는 신호의 세기를 육안으로 확인하여, 아래의 표 1에 나타내었다. 이때, 각각의 신호 세기는 색의 강도를 통해 판단하였으며, 가장 높은 색도를 임의적으로 5로 기준 잡고, 가장 낮은 색도를 0으로 기준 잡아 나타내었다.

표 1에 나타난 바와 같이, 검체 내 표적물질(IgG)의 농도가 증가할수록 검사선의 신호 세기는 점차 증가하여, 약 375 ng/㎖ 내지 750 ng/㎖ 사이에서 가장 강한 세기를 보이다가, 점차 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 앞서 언급한 후크(hook) 현상에 의한 것이다. 따라서, 검사선의 신호 세기 만으로는 표적물질의 농도를 정량적으로 분석할 수 없다.

예를 들어, 검사선의 신호 세기가 2인 경우는, 검체 내 표적물질(IgG)의 농도가 약 40 ng/㎖인 부근과 약 10 ㎍/㎖인 부근에서 나타남을 확인할 수 있으므로, 검사선에서 나타나는 신호 세기가 같더라도 표적물질의 농도는 상이할 수 있는 것이다.

그러나 가변 대조선의 경우, 검체 내 표적물질(IgG)의 농도가 증가할수록 신호 세기는 점차 감소함을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 표적물질의 농도가 0에서부터 90 ng/㎖까지는 신호의 세기가 가장 높은 5로 거의 일정하게 유지됨을 확인할 수 있다. 이와 같이 표적물질의 농도가 낮은 경우는, 상기 검사선에서 후크 현상이 발생하지 않으므로, 검사선의 신호 세기를 통해 표적물질의 농도를 분석할 수 있다. 표적물질의 농도가 더 증가하는 경우, 검사선에서는 후크 현상의 발생으로 신호의 세기가 불규칙하지만, 가변 대조선은 신호의 세기가 계속하여 감소하므로, 가변 대조선을 통해 표적물질의 농도를 분석할 수 있다.

예를 들어, 검사선의 신호 세기가 2인 경우, 검사선은 앞서 설명한 바와 같이 표적물질의 농도가 약 40 ng/㎖인 부근과 약 10 ㎍/㎖인 부근으로 2종류가 존재할 수 있으나, 가변 대조선은 각각의 농도에 대하여 신호 세기가 5 또는 2로 나타나므로, 종래 검사선 1개만으로는 측정이 불가능했던 농도를 정량적으로 측정할 수 있음을 확인할 수 있다.

또한 상기 분석 스트립의 표적물질에 대한 농도 측정 범위(dynamic range)가 5 ng/㎖ 이하부터 100,000 ng/㎖ 이상까지 넓게 나타남을 확인할 수 있다.

Claims (2)

1. 표적물질, 상기 표적물질에 결합하는 리간드, 및 상기 리간드에 결합하는 신호검출 표지물질 사이에서 샌드위치 반응과 경쟁적 반응을 동시에 수행하는 단계를 포함하는, 검체 내 표적물질을 정성 또는 정량적으로 분석하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 샌드위치 반응과 경쟁적 반응이 하나의 분석 용기 상에서 동시에 수행되는 것인, 분석 방법.
   

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