KR102594836B1 - 라텍스 비드, 링커 및 항체를 포함하는 면역 크로마토그래피용 시약 및 이를 포함하는 래피드 키트 - Google Patents

라텍스 비드, 링커 및 항체를 포함하는 면역 크로마토그래피용 시약 및 이를 포함하는 래피드 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 라텍스 비드, 링커 및 항체를 포함하는 면역 크로마토그래피용 시약 조성물 및 이를 포함하는 래피드 키트에 관한 것으로, 본 발명의 라텍스 비드를 이용한 진단키트는 라텍스 비드에 항체와 결합가능한 길이가 다른 제1링커 및 제2링커를 도입하여 항체-라텍스 비드 복합체에서 항체의 로딩율을 높이고 물리적 그물망 형태를 구축함에 따라서 기존 진단키트에 비해 검출효율이 현저히 향상되는 효과가 있다.

Description

라텍스 비드, 링커 및 항체를 포함하는 면역 크로마토그래피용 시약 및 이를 포함하는 래피드 키트 {Reagents for immunochromatography including latex beads, linkers and antibodies, and rapid kits comprising the same}
본 발명은 라텍스 비드, 링커 및 항체를 포함하는 면역 크로마토그래피용 시약 및 이를 포함하는 래피드 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 검출대상 항원 또는 호르몬에 대한 항체가 결합 가능한 제1링커, 제2링커가 결합된 형태의 라텍스 비드를 이용한 진단 키트 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다.
면역 크로마토그래피 분석법은 항원-항체 반응을 이용하여, 미량의 표적물질(analyte)을 단시간에 정성 및 정량적으로 분석할 수 있는 방법으로서, 각종 질병의 진단 또는 검사를 비롯하여, 의학, 농업, 축산업, 식품, 군사, 환경 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 가정 및 병원 등에서 널리 이용되는 임신진단키트는 이러한 면역크로마토그래피 분석법을 사용하고 있다. 이러한 면역 크로마토그래피 분석에는 검출하고자 하는 표적물질과 반응하여 변화를 나타낼 수 있는 반응물질을 포함하는 분석 스트립(assay strip) 또는 상기 분석 스트립을 플라스틱 케이스에 장착한 디바이스 형태의 분석장치가 일반적으로 사용되고 있다. 통상적인 분석 스트립은 액상 검체를 수용하는 샘플(검체)패드; 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 시그널을 발생시키는 표지물질(예를 들어 골드입자, 라텍스 비드 등)를 항원, 항체 등의 리간드에 접합시킨 접합체(conjugate)를 함유하는 접합체 패드; 검체 중의 표적물질 및/또는 상기 접합체와 특이적으로 결합하는 결합체(항체 또는 항원)를 고정시킨 검사선과 검체의 전개를 확인할 수 있는 대조선이 형성된 검출패드 (주로 다공성 멤브레인 패드); 및 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드로 구성되며, 이러한 기능성 패드들은 상기 나열한 순서대로 일부 중첩된 형태로 연결되어 고체 지지체 상에 부착되어 연속적으로 배열된다. 상기 분석 스트립이 플라스틱 케이스 내부에 장착되어 사용되는 경우, 케이스의 상부에는 샘플 패드의 위치에 검체를 적하하기 위한 검체 투입구가, 검출패드의 결합제가 고정된 위치에는 검사 결과를 확인하기 위한 결과 확인창이 형성된다. 이와 같이, 분석 스트립을 이용한 면역 크로마토그래피 분석법에 있어서, 샘플 패드에 액상 검체를 적하하면, 액상 검체는 모세관 현상에 의하여 접합체 패드 및 검출패드를 통하여 이동하며, 최종적으로 흡습 패드에 수용된다.
기존 면역 크로마토그래피법을 이용한 진단키트는 검출 범위의 한계가 있어 "후크 효과(hook effect)"로 인한 위음성(false negative)결과를 초래한다. 즉, 시험 샘플에서 높은 분석물 농도가 실제로 분석물에 대한 검정 반응 신호에서의 감소를 유발하여 거짓 음성 또는 거짓의 낮은 농도 결과의 보고를 발생시키는 경우에 후크 효과가 관찰된다.
후크 효과는 항원을 갖는 항체의 포화 곡선을 기초로 하며, 시험 샘플 내의 분석물의 농도가 검정 시약에서 사용된 항체의 결합능을 초과하여 신호의 생성에 필요한 면역 복합체의 불완전한 형성을 발생시키는 경우에 발생한다. 예를 들어, 과도하게 높은 농도의 분석물은 면역검정에서 사용되는 포획 및 검출 항체 둘 모두를 동시에 포화시킬 수 있으며, 이에 의해 도 1에 제시된 "후크" 또는 거짓으로 감소된 농도 측정을 발생시킨다. 이들 예에서, 거짓 음성 또는 거짓의 낮은 결과가 보고되며, 이는 분석기의 정확도에 부정적인 영향을 미치고, 환자 관리에 치명적인 영향을 미칠 수 있다.
본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위해 서로 다른 길이의 링커를 라텍스 비드에 도입하면 라텍스 비드와 항체의 로딩율(결합비율)을 높이고 물리적 그물망 형태를 구축하여 검출 효율이 현저히 향상된다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
대한민국공개특허 제10-2009-0101823호
본 발명의 목적은 라텍스 비드; 제1링커; 제2링커; 및 항체;를 포함하는 면역 크로마토그래피용 시약 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 면역 크로마토그래피용 시약 조성물을 포함하는 래피드(rapid) 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항원 또는 호르몬 존재 여부를 판단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 생물학적 시료 내 존재하는 항원 또는 호르몬의 정량 분석 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 라텍스 비드; 제1링커; 제2링커; 및 항체;를 포함하는 복합체를 포함하고, 상기 제1링커 및 제2링커는 양말단에 반응성 작용기를 갖으며, 제1링커의 주쇄 길이 대비 제2링커의 주쇄 길이가 더 긴 것을 특징으로 하고, 상기 제1링커 및 제2링커의 일말단은 상기 라텍스 비드 표면의 반응성 작용기와 결합되고, 나머지 제1링커 및 제2링커의 일말단은 상기 항체와 결합되는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역 크로마토그래피용 시약 조성물을 포함하는 래피드(rapid) 키트를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 키트를 이용하여 생물학적 시료를 항체와 접촉시키는 단계(단계 1); 및 검사선에서 검출대상 항원 또는 호르몬과 상기 항체의 결합을 검출하는 단계(단계 2);를 포함하는 항원 또는 호르몬 존재 여부를 판단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료를 상기 키트의 샘플 패드에 주입하여 스트립에 전개시키는 단계(단계 1); 검사선으로부터 분광 신호 세기를 측정하여, 항원 또는 호르몬의 양을 측정하는 단계(단계 2);를 포함하는 생물학적 시료 내 존재하는 항원 또는 호르몬의 정량 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 라텍스 비드를 이용한 진단키트는 라텍스 비드에 항체와 결합가능한 길이가 다른 제1링커 및 제2링커를 도입하여 항체-라텍스 비드 복합체에서 항체의 로딩율을 높이고 물리적 그물망 형태를 구축함에 따라서 기존 진단키트에 비해 검출효율이 현저히 향상되는 효과가 있다.
도 1은 제1링커(120) 및 제2링커(130)이 도입된 항체-라텍스 비드 복합체(100)의 개략적인 이미지를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 래피드 키트의 개략도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
면역크로마토그래피용 시약 조성물
본 발명은 라텍스 비드; 제1링커; 제2링커; 및 항체;를 포함하는 복합체를 포함하고, 상기 제1링커 및 제2링커는 양말단에 반응성 작용기를 갖으며, 제1링커의 주쇄 길이 대비 제2링커의 주쇄 길이가 더 긴 것을 특징으로 하고, 상기 제1링커 및 제2링커의 일말단은 상기 라텍스 비드 표면의 반응성 작용기와 결합되고, 나머지 제1링커 및 제2링커의 일말단은 상기 항체와 결합되는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피용 시약 조성물을 제공한다.
상기 라텍스 비드는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리비닐톨루엔(polyvinyltoluene), 폴리스티렌-아크릴산(polystyrene-acrylic acid), 폴리아크롤레인(polyacrolein), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 이의 유도체 등을 사용할 수 있고, 종래 면역 크로마토그래피에 사용하는 라텍스 비드라면 아무런 제약없이 사용할 수 있다.
상기 제1링커는 1 내지 5의 반복 단위를 갖는 PEG(polyethylene glycol), 1 내지 5의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
[화학식 1]
상기 식에서,
x는 1 내지 5의 정수이다.
상기 제2링커는 상기 제2링커는 6 내지 15의 반복 단위를 갖는 PEG(polyethylene glycol), 6 내지 15의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
[화학식 2]
상기 식에서,
y는 6 내지 15의 정수이다.
또한, 상기 항체는 라텍스 비드와 직접적으로 또는 링커를 이용하여 간접적으로 결합할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 모든 종류의 항체(예를 들어, 코로나 바이러스-19(Corona virus-19) 항체, 인플루엔자 항체, 임신 관련 항호르몬 항체 등)를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 항원 또는 호르몬을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체, 항체 단편 등을 포함할 수 있다.
상기 임신 관련 항호르몬 항체에서 호르몬은 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin), 황체형성호르몬(luteinzing hormone), 여포자극호르몬(follicle-stimulating hormone), 에스트라디올(estradiol), 프로게스테론(progesterone), 테스토스테론(testosterone) 등을 포함하며, 임신 진단에 이용될 수 있는 호르몬이면 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "반응성 작용기"는 유기화학에서 화학반응을 통해 공유결합을 이룰 수 있는 작용기라면 모두 사용할 수 있고, 일례로서 아민기, 카르복실기, 알데히드기, 아미딘기, 설페이트기, 클로로메틸기 등을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "주쇄(main chain)"는 링커의 주축 방향을 이루는 분자 구성을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "결합"은 공유결합(covalent bond), 이온결합(ionic bond), 수동흡착(passive adsorption) 등을 의미한다.
래피드(rapid) 키트
본 발명은 상기 면역 크로마토그래피용 시약 조성물을 포함하는 래피드(rapid) 키트를 제공한다.
상기 키트는 (a) 생물학적 시료를 수용하는 샘플 패드(sample pad);
(b) 상기 항체, 제1링커, 제2링커 및 라텍스 비드가 결합된 항체-라텍스 비드 복합체를 포함하는 면역 크로마토그래피용 시약 조성물을 포함하고, 상기 생물학적 시료에 존재하는 항원 또는 호르몬과 상기 복합체의 항체가 서로 결합하는 장소로서의 역할을 하는 접합체 패드(conjugate pad);
(c) 상기 항원 또는 호르몬이 결합된 복합체가 결합하는 항체가 고정화된 검사선 및 상기 복합체와 결합하는 항체가 고정화된 대조선이 각각 인쇄된 멤브레인(membrane); 및
(d) 흡수 패드(absorbent pad);
를 순차적으로 연결하여 포함할 수 있다(도 2 참조).
상기 접합체 패드는 상기 항체(140), 제1링커(120), 제2링커(130) 및 라텍스 비드(110)가 결합된 복합체(100)를 포함하는 면역 크래마토그래피용 시약 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 멤브레인은 상기 항원 또는 호르몬이 결합된 복합체가 결합하는 항체 및 대조군 항체를 고정화하도록 구성될 수 있다. 상기 멤브레인은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 항체가 결합될 수 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인 등을 사용할 수 있다.
상기 (b)의 항체 및 (c)의 항체는 검출대상 항원 또는 호르몬의 서로 다른 부위에 결합되는 것일 수 있다.
상기 라텍스 비드(110)는 항체의 결합 가능한 표면적을 향상시킬 목적으로 사용하는 것으로서, 본 발명에서는 여기서 한 단계 나아가 라텍스 비드(110)에 서로 길이가 상이한 제1링커(120) 및 제2링커(130)를 도입하여 항체-라텍스 비드 복합체(100)의 항체의 로딩율(결합비율)을 높이고 물리적 그물망 형태를 구축하여 기존 라텍스 비드 표면에 항원 또는 호르몬과 결합하는 항체를 직접 결합시키는 기술 대비 검출 효율 측면에서 유리한 효과가 있을 수 있다.
상기 생물학적 시료는 질환이 의심되는 환자 또는 가임기 여성으로부터 분리된 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등을 포함할 수 있다.
상기 키트는 생물학적 시료 전개액을 포함할 수 있다. 상기 전개액에 포함된 완충용액은 시료 전달 및 항원 또는 호르몬과 항체의 결합반응을 보조하는 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 붕산염 완충용액, 트리스 완충용액, 인산염 완충용액 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료 전개액은 비특이반응(non-specific reaction)을 억제할 수 있는 BSA, 알부민, Triton X-100, Tween 20, 카제인 등을 포함할 수 있다.
키트에 사용하기 위한 검정 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱디바이스, 면역크로마토그래피법, 방사 분할 면역검정 디바이스, 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하게는 면역크로마토그래피법(immunochromatographic assay: ICA)을 이용한 스트립 형태 또는 디바이스 형태의 진단 키트를 이용할 수 있다.
항원 또는 호르몬의 존재 여부를 판단하기 위한 정보를 제공하는 방법
본 발명은 상기 래피드 키트를 이용하여 생물학적 시료를 항체와 접촉시키는 단계(단계 1); 및 검사선에서 검출대상 항원 또는 호르몬과 상기 항체의 결합을 검출하는 단계(단계 2);를 포함하는 항원 또는 호르몬 존재 여부를 판단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
정량 분석 방법
본 발명은 상기 키트를 이용하여 생물학적 시료 내 존재하는 항원 또는 호르몬의 정량 분석 방법을 제공한다.
상기 방법은 생물학적 시료를 상기 래피드 키트의 샘플 패드에 주입하여 스트립에 전개시키는 단계(단계 1); 및 검사선으로부터 분광 신호 세기를 측정하여, 항원 또는 호르몬의 양을 측정하는 단계(단계 2);를 포함할 수 있다.
여기서, 상기 분광 신호는 종래의 분광분석기라면 아무런 제약 없이 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 면역크로마토그래피 래피드 키트의 제조
1-1. 서로 다른 길이의 링커가 부착된 라텍스 비드의 제조
말단에 카르복실기를 포함하는 400nm 폴리스티렌 입자(라텍스 비드), H2N(CH2)3NH2의 분자식을 가지는 펩타이드(제1링커), H2N(CH2)10NH2의 분자식을 가지는 펩타이드(제2링커)를 준비한 후, 카르보디이미드 반응(carbodiimide method)을 이용하여 라텍스 비드에 제1링커 및 제2링커를 부착하여 서로 다른 길이의 링커가 부착된 라텍스 비드를 제조하였다.
구체적으로, 상기 폴리스티렌 입자(라텍스 비드)를 포함하는 pH 5의 12.5 mM 인산 나트륨 완충액 (sodium phosphate buffer)에 카르보디이미드(carbodiimide) 시약을 첨가하고 실온에서 2-3 분 동안 인큐베이션(incubation)한 후, 상기 혼합물을 제1링커 및 제2링커를 포함하는 pH 8의 0.2 M 인산 나트륨 완충액(sodium phosphate buffer)에 첨가하여 실온에서 24 시간 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 pH 8의 0.1 M 인산 나트륨 (sodium phosphate)으로 투석(dialysis)하여 라텍스 비드에 부착되지 않은 링커를 제거함으로써 서로 다른 길이의 링커가 부착된 라텍스 비드를 수득하였다.
1-2. 라텍스 비드를 포함하는 면역크로마토그래피용 시약 조성물의 제조
항 I-hCG 항체(Monoclonal anti-hCG)를 MES 완충액(2-(N-mophorino)ethane sulfonic acibiffer) 에 가하여 HCG 항체 250㎍/600㎕ MES가 되도록 준비하였다. 한편 상기 실시예 1-1에서 제조한 라텍스 비드를 MES에 완충액에 가한 2% 라텍스용액 200㎕를 제조하고, 이 라텍스 용액을 상기 단일클론 항체에 서서히 첨가하여 25℃에서 2.5시간 반응시킨 후 22,000ｇ로 원심분리하여 결합되지 않은 hCG 항체를 제거하고 4% 소혈청 알부민이 포함된 인산염 완충액(pH7.2)으로 침전물을 풀어주었다. 이 상태로 25℃에서 2시간 이상 반응시켜 라텍스에 항체가 결합되지 않는 부위를 소혈청 알부민으로 결합시킨 다음 22,000ｇ로 원심 분리하여 인산염 완충액으로 세척하였다. 세척한 라텍스를 최종함량 1%가 되게 인산염 완충액으로 희석하여 제1접합체 용액을 제조하였다.
이어서, 상기와 동일한 방법으로 실시예 1-1에서 제조된 라텍스 비드 및 쥐 면역글로불린(Mouse IgG)이 결합된 제2접합체 용액을 준비하였다.
1-3. 면역크로마토그래피 래피드 키트의 제조
A. 검사선(T) 및 대조선(C)을 포함하는 멤브레인(membrane)의 제조
2개의 분석선을 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 분주하였다. 라미네이터기(laminator)를 이용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인을 플라스틱카드에 라미네이션(lamination)하였다.
구체적으로, 검사선(Test line)으로 단일클론 항-인간융모성성선자극호르몬 항체 (moclonal anti-hCG, Medix, Finland), 및 대조선(Control line)으로 산양 항-쥐면역글로불린 항체(antimouse antibody from goat, arista, USA)를 각각 자동분주기를 이용하여 일정 간격 떨어진 지점에 일직선 형태로 분주하여 흡착시킨 후, 18~22
Figure 112021078769992-pat00003
에서 2일(48시간) 동안 건조시켰다.
여기서, 플라스틱카드에 라미네이션된 멤브레인은, 가로 300 mm x 세로 1 mm로 하여 분주를 진행하고, 이를 4mm 단위로 절단하여 검사선은 가로 4mm X 세로 1mm로 면적이 4mm2, 대조선은 가로 4mm X 세로 1mm로 면적이 4mm2이 되도록 하였다.
B. 접합체 패드(conjugate pad)의 제조
0.5% PVA (polyvinylalcohol) 및 0.5% BSA (Bovine Serum Albumin)가 함유된 트리스완충액(10mM, pH 8.5)으로 패드를 충분히 적셔 건조기에서 완전히 건조시켜 접합체 패드를 전처리하였다.
이어서, 상기 실시예 1-2의 제1접합체 용액 및 제2접합체 용액을 전처리된 접합체 패드에 분주하고, 완전히 건조시킨 후, 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.
C. 샘플 패드(sample pad)의 제조
0.05% Triton X-100이 함유된 0.08 M borate 완충액을 유리섬유 패드에 충분히 적셔, 건조기에서 완전히 건조시킨 후, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.
D. 흡습 패드(absorbent pad)의 제조
건조기에서 수분을 완전히 건조시킨 상태로 아무런 처리없이 그대로 사용하며, 이를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.
E. 면역크로마토그래피 스트립의 제작
위의 각 과정을 통해 준비된 샘플 패드, 접합체 패드, 멤브레인 및 흡습 패드를 순서대로 조립하여 면역크로마토그래피 스트립을 제작하였다. 구체적으로, 샘플 패드의 일 말단에 접합체 패드의 일 말단이 중첩되도록 부착하고, 접합체 패드의 다른 일 말단에 멤브레인의 일 말단이 중첩되도록 부착하고, 멤브레인의 다른 일 말단에 흡습 패드의 일 말단이 중첩되도록 부착하였다.
F. 케이스 조립
상기 면역크로마토그래피 스트립을 플라스틱 하부 케이스의 스트립 고정 위치에 넣은 후 검체투입구와 결과 확인창이 있는 상부 케이스를 끼운 후 압착기로 눌러 조립한다.
<비교예 1> 면역크로마토그래피 래피드 키트의 제조
실시예 1-1에서 제1링커만 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 래피드 키트를 제조하였다.
<실험예 1> hCG 농도에 따른 면역크로마토그래피 스트립 분석
실시예 1 및 비교예 1에서 각각 제조한 래피드 키트를 이용하여, 라텍스 비드에 따른 임신 진단 표지자로서 인간융모성성선자극호르몬(hCG)의 정량분석 정확도를 알아보기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 비임신 소변에 인간융모성성선자극호르몬(hCG) 표준물질을 0mIU/ml, 100mIU/ml, 200mIU/ml, 400mIU/ml, 800mIU/ml, 1600mIU/ml, 3200mIU/ml 농도로 스파이킹하여 표준검체를 제조하였다. 제조된 표준검체 용액을 래피드 키트의 샘플 패드에 100㎕씩 점적후 5분간 전개시켰다. 다음으로, 검사선에서 나타나는 신호 세기를 분광분석기로 정량분석하였고, 그 결과를 표준검체의 농도와 비교하여 정량분석의 정확도를 비교평가하였다.
정량분석 정확도 백분율(%)
hCG 농도(mIU/ml) 비교예 1 실시예 1
0 98 99
100 71 95
200 74 98
400 75 96
800 83 96
1600 79 94
3200 81 98
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 라텍스 비드에 길이가 서로 다른 링커를 부착하는 경우 정량분석의 정확도가 현저히 향상되는 것을 알 수 있었다.
<실험예 2> 고농도 hCG에 의한 위음성 평가
실시예 1 및 비교예 1에서 각각 제조한 래피드 키트를 이용하여 고농도의 인간융모성성선자극호르몬(hCG)를 포함하는 검체의 위음성 유무를 알아보기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 비임신 소변에 인간융모성성선자극호르몬(hCG) 표준물질을 100,000mIU/ml, 200,000mIU/ml, 400,000mIU/ml, 800,000mIU/ml 농도로 스파이킹하여 표준검체를 제조하고, 제조된 표준검체 용액을 래피드 키트의 샘플 패드에 100㎕씩 분주 후 5분간 전개시킨 후 육안으로 검사 결과를 판정하였다. 검사선(T) 및 대조선(C)에서 나타나는 신호의 세기를 육안으로 확인하였으며, 대조선 강도를 ++로 기준으로 하여 검사선의 신호 세기를 상대적으로 평가하였다. 실시예 1의 위음성 평가 결과는 표 2에 나타내었으며, 비교예 1의 위음성 평가 결과는 표 3에 나타내었다.
hCG 농도(mIU/ml) 100,000 200,000 400,000 800,000
검사선(T) 강도 +++ +++ +++ ++
대조선(C) 강도 ++ ++ ++ ++
hCG 농도(mIU/ml) 100,000 200,000 400,000 800,000
검사선(T) 강도 ++ + +/- -
대조선(C) 강도 ++ ++ ++ ++
+++: 검출신호가 강함++: 검출신호가 양호함
+: 검출신호가 약함
+/-: 검출신호가 거의 없음
-: 검출되지 않음
그 결과, 비교예 1의 래피드 키트의 경우 400,000 mIU/ml 이상의 hCG를 포함하는 검체에서는 밴드가 희미하게 발색되거나 아예 나타나지 않아, 위음성의 소지가 있음을 확인하였다(표 3).
그러나, 실시예 1의 래피드 키트의 경우 800,000 mIU/ml 농도의 hCG를 포함하는 검체에서도 육안으로 식별가능한 발색을 보였다(표 2).
이와 같이, 본 발명의 서로 다른 길이의 링커가 부착된 라텍스 비드를 포함하는 면역크로마토그래피 시약 조성물을 이용하여 진단할 경우, 물리적 그물망 형태를 구축함에 따라 검출효율이 현저히 향상될 뿐만 아니라, 후크 효과를 감소시켜 고농도의 항원을 포함하는 검체에서도 질병 또는 임신 여부를 정확하게 진단할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
100: 항체-라텍스 비드 복합체
110: 라텍스 비드
120: 제1링커
130: 제2링커
140: 항체

Claims (11)

  1. 라텍스 비드;
    제1링커;
    제2링커; 및
    항체;
    를 포함하는 복합체를 포함하고,
    상기 제1링커 및 제2링커는 양말단에 반응성 작용기를 갖으며, 제1링커의 주쇄 길이 대비 제2링커의 주쇄 길이가 더 긴 것을 특징으로 하고,
    상기 제1링커 및 제2링커의 일말단은 상기 라텍스 비드 표면의 반응성 작용기와 결합되고, 나머지 제1링커 및 제2링커의 일말단은 상기 항체와 결합되는 것을 특징으로 하며,
    상기 제1링커는 1 내지 5의 반복 단위를 갖는 PEG(polyethylene glycol), 1 내지 5의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 중 1종이고,
    상기 제2링커는 6 내지 15의 반복 단위를 갖는 PEG(polyethylene glycol), 6 내지 15의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 중 1종인 것을 특징으로 하는,
    면역 크로마토그래피용 시약 조성물.
    [화학식 1]

    (상기 화학식 1에서,
    x는 1 내지 5의 정수이다.)

    [화학식 2]

    (상기 화학식 1에서,
    y는 6 내지 15의 정수이다.)
  2. 제1항에 있어서,
    상기 라텍스 비드는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리비닐톨루엔(polyvinyltoluene), 폴리스티렌-아크릴산(polystyrene-acrylic acid), 폴리아크롤레인(polyacrolein), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 및 이의 유도체 중에서 선택된 중합체 물질인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피용 시약 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 코로나 바이러스-19(Corona virus-19) 항체, 인플루엔자 항체 또는 임신 관련 항호르몬 항체인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피용 시약 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 임신 관련 항호르몬 항체에서 호르몬은 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin), 황체형성호르몬(luteinzing hormone), 여포자극호르몬(follicle-stimulating hormone), 에스트라디올(estradiol), 프로게스테론(progesterone) 및 테스토스테론(testosterone)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피용 시약 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 래피드(rapid) 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 래피드 키트는,
    (a) 생물학적 시료를 수용하는 샘플 패드(sample pad);
    (b) 제1항의 복합체를 포함하는 면역 크로마토그래피용 시약 조성물을 포함하고, 상기 생물학적 시료에 존재하는 항원 또는 호르몬과 상기 복합체의 항체가 서로 결합하는 장소로서의 역할을 하는 접합체 패드(conjugate pad);
    (c) 상기 항원 또는 호르몬이 결합된 복합체와 결합하는 항체가 고정화된 검사선 및 상기 복합체와 결합하는 항체가 고정화된 대조선이 각각 인쇄된 멤브레인(membrane); 및
    (d) 흡수 패드(absorbent pad);
    를 순차적으로 연결하여 포함하는 것을 특징으로 하는 래피드 키트.
  9. 삭제
  10. 제7항의 키트에 생물학적 시료를 주입하여 스트립에 전개시키는 단계(단계 1); 및
    검사선에서 검출대상 항원 또는 호르몬을 검출하는 단계(단계 2);를 포함하는,
    항원 또는 호르몬 존재 여부를 판단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 생물학적 시료를 제7항의 키트의 샘플 패드에 주입하여 스트립에 전개시키는 단계(단계 1); 및
    검사선으로부터 분광 신호 세기를 측정하여, 항원 또는 호르몬의 양을 측정하는 단계(단계 2);를 포함하는,
    생물학적 시료 내 존재하는 항원 또는 호르몬의 정량 분석 방법.
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