KR101994411B1

KR101994411B1 - 고감도 체외 진단 키트 및 이를 이용한 진단 분석 방법

Info

Publication number: KR101994411B1
Application number: KR1020170014309A
Authority: KR
Inventors: 오택규; 이상웅
Original assignee: 주식회사 제트바이오텍
Priority date: 2017-02-01
Filing date: 2017-02-01
Publication date: 2019-06-28
Also published as: KR20180089675A

Abstract

본 발명은 고감도 체외 진단 키트 및 이를 이용한 진단 분석 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 Platinum 입자를 Gold Colloidal에 도금함으로써 PEG 층의 효율적인 S-S 결합을 가능하게 하고 항체 등 단백질이 더 효율적으로 결합함으로써, 고감도 진단을 할 수 있는 고감도 체외 진단 키트 및 이를 이용한 진단 분석 방법에 관한 것이다.

Description

고감도 체외 진단 키트 및 이를 이용한 진단 분석 방법{Highly sensitive in vitro diagnostic kit and diagnostic analysis method using the same}

최근, 바이러스나 세균 등의 병원체 감염의 유무, 임신의 유무, 암 마커의 유무, 식품 중의 특정 원재료나 잔류 농약 등의 유해 물질의 유무 등의 여러가지 검사를 단시간에 행하는 간이 검사 시약이나 진단약, 진단 키트가 개발되고 있다. 이들은 각각의 검사 대상 물질과, 검사 대상 물질에 특이적으로 반응하는 물질에 의한 특이적 반응이 이용된다. 특히, 항원과 항체에 의한 항원 항체 반응을 이용하는 면역학적 측정법은, 면역크로마트 측정법, 비탁 면역 측정법, 효소 면역 측정법, 화학 발광 측정법, 방사 면역 측정법, 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 측정법 등, 많은 측정법이 개발되고 있다. 그리고 이들 측정법은 병원, 진료소 등에서의 병 등의 검사나,

식품 회사 등에서의 음식물 검사 등에 이용되고 있다. 그 중에서도 면역크로마트 측정법은, 특별한 설비, 기기, 지식을 필요로 하지 않고 조작도 간편하며 저렴하고, 신속한 진단이 가능하다는 특징으로부터 매우 많은 검사가 실시되고 있다. 최근에는 임신 검사약이나 HIV 검사약 등은 일반 약국에서 시판되어 일반 소비자도 측정할 수 있게 되고, 나아가서는 검사 대상 물질의 유무를 검사하는 정성 검사뿐만 아니라 양을 측정하는 정량 검사 등도 할 수 있다.

면역크로마트 측정법의 측정 원리로는, 플로우 스루형이나 래터럴 플로우형이라고 불리는 방법이 있다. 검체 중의 검사 대상 물질로는 여러 가지 물질을 검출할 수 있지만, 전형적인 예로는 샌드위치법에 의해 항원을 검출하는 측정이 있으며, 이하와 같은 조작이 순차 실행된다.

먼저, 검사 대상 물질인 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 니트로셀룰로오스막 등의 크로마토그래프 매체의 소정의 부위에 고정화하여, 크로마토그래프 매체의 임의의 위치에 테스트 라인이라고 불리는 반응 부위를 형성한다.

다음으로, 효소, 발색 입자, 형광 발색 입자, 자성 입자 등의 표지 물질에, 검사 대상 물질과 특이적으로 결합하는 항체를 담지시킨 검출 시약을 조제하고, 컨쥬게이트 패드 등에 검출 시약을 도포 건조하여, 검출 시약 함유부를 형성시키고, 상기 크로마토그래프 매체와 조합하여 면역크로마트 진단 키트를 형성한다.

그 다음으로, 항원을 포함하는 검체 자체, 또는 그것을 임의의 액체로 희석한 용액을 상기 면역크로마트 진단 키트의 소정의 위치에, 예컨대, 샘플 패드에 적하하여, 항원과 검출 시약을 크로마토그래프 매체 상에 전개시킨다.

이들 조작에 의해, 반응 부위에 있어서 크로마토그래프 매체 상에 고정화된 항체에, 항원을 통해 표지 물질이 포착되고, 표지 물질의 신호를 검출함으로써 면역크로마트 진단 키트에 의한 진단을 행한다. 일반적인 진단은 항원의 유무만을 검사하는 정성 진단이지만, 최근에는 그 신호의 강도를 육안 혹은 기계로 검출함으로써 정량 진단을 행할 수도 있다.

이러한 표지 물질의 한 예인 Gold Colloidal에 대한 기술의 발달로 생체시료 및 단백질에 대한 표지에 중요한 역할을 할 수 있게 되었다. 앞으로는 신속성, 정확성과 더불어 소량의 양에도 민감도를 높이는, 즉 고감도의 진단 키트 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2015-0053386호(2015.05.18.공개) 대한민국 공개특허 제10-2011-0130870호(2011.12.06.공개) 대한민국 공개특허 제10-2007-0116615호(2007.12.10.공개) 대한민국 공개특허 제10-2016-0003240호(2016.01.08.공개) 대한민국 등록특허 제10-1540608호(2015.08.03.공고)

본 발명은 종래 기술에 따른 문제를 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 본 발명의 주된 목적은, Platinum 입자가 Gold Colloidal에 비해 전자를 받기가 쉽다는 특징을 이용한 것으로 Platinum 입자를 Gold Colloidal에 도금함으로써 PEG 층의 효율적인 S-S 결합을 가능하게 하고 항체 등 단백질이 더 효율적으로 결합함으로써, 고감도 진단을 할 수 있는 고감도 체외 진단 키트 및 이를 이용한 진단 분석 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트용 진단 입자는 제1금속 입자와; 상기 제1금속 입자를 둘러싸는 제2금속과; 상기 제2금속을 둘러싸는 고분자층;을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트용 진단 입자에 있어서, 제1금속 입자는 금 입자이고, 상기 제2금속은 백금이며, 상기 고분자층은 복수의 PEG(Polyethylene glycol)로 이루어지는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트용 진단 입자에 있어서, 각 PEG는 길이가 다르고, 그 말단에는 타겟 물질과 결합 가능한 제1항체가 결합된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트용 진단 키트는, 테스트 라인(test line) 및 컨트롤 라인(control line)이 배치되는 다공성 막과; 상기 다공성 막의 일단에 배치되며 상기 진단 입자가 적층되는 컨쥬게이션 패드(conjugation pad)와; 상기 컨쥬게이션 패드 일단에 마련되는 샘플 패드(sample pad);를 포함하며, 상기 진단 입자에는 타겟 물질과 결합 가능한 제1항체가 마련되고, 상기 테스트 라인에는 상기 타겟 물질과 결합한 제1항체와 결합하는 제2항체가 마련되며, 상기 컨트롤 라인에는 타겟 물질과 결합하지 않은 제1항체와 비특이적으로 결합하는 제3항체가 마련되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트용 진단 입자 제조방법은, 백금으로 표면 도금된 금 입자를 마련하는 S1단계와; 상기 백금으로 표면 도금된 금 입자에 PEG로 이루어지는 고분자층을 형성하는 S2단계와; 상기 PEG의 -COOH기를 NHS로 치환한 중간체를 형성하는 S3단계와; 상기 중간체에 일차 아민(primary amime)을 갖는 제1항체를 반응시켜 PEG 말단에 항체를 결합시키는 S4단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트용 진단 방법은, 본 발명의 고감도 체외 진단 키트를 활용한 진단 방법은 타겟 물질이 존재하는 샘플을 샘플 패드에 투하하는 단계와; 상기 샘플이 컨쥬게이션 패드로 이동해 제 1항체와 결합하고, 테스트 라인과 컨트롤 라인에서 결합해 나타나는 키트의 밴드(band)를 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 Platinum 입자가 Gold Colloidal에 비해 전자를 받기가 쉽다는 특징을 이용한 것으로 Platinum 입자를 Gold Colloidal에 도금함으로써 PEG 층의 효율적인 S-S 결합을 가능하게 하고 항체 등 단백질이 더 효율적으로 결합함으로써, 고감도 진단을 할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트용 진단 입자를 도시하는 도면이다.
도 2a는 본 발명에 따른 Platinum이 도금된 금 입자에 PEG 층을 씌우고 그 표면을 -COOH기로 만드는 과정을 도시한 도면이다.
도 2b는 도 2a의 생성물에 대한 구체적인 구조로 Au-Pt-PEG-COOH의 구조를 나타내는 도시한 도면이다.
도 2c는 도 2a의 생성물에 -COOH기를 -NHS로 바꾸는 과정을 나타내는 도면이다.
도 2d는 도 2c에 대한 과정을 순차적으로 나타내는 도면이다.
도 2e는 최종 생성물에 대한 구조를 나타내는 도면이다.
도 2f는 최종 생성물에 대한 구체적인 구조를 나타내는 도면이다.
도 3a는 본 발명의 스트립 구조를 나타내는 도면이고, 도 3b는 고감도 체외 진단 키트를 이용한 분석 과정시 일어나는 흐름의 변화를 모식적으로 나타내는 도면이다.
도 4a는 기존의 Gold Colloidal의 스트립(위 사진)에 대한 음성 결과와, 실험예 1의 진단 키트의 스트립(아래 사진)의 음성 결과를 비교 실험한 결과를 나타내는 사진이며, 도 4b는 기존의 Gold Colloidal의 스트립(위 사진)에 대한 양성 결과와, 실험예 1의 진단 키트의 스트립(아래 사진)의 양성 결과를 비교 실험한 결과를 나타내는 사진이다.

본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 판례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트용 진단 입자를 도시하는 도면이다.

도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트용 진단 입자는 크게, 제1금속 입자와, 상기 제1금속 입자를 둘러싸는 제2금속과, 상기 제2금속을 둘러싸는 고분자층을 포함한다.

상기 제1금속 입자는 금 입자(Gold Colloidal)이고, 상기 제2금속은 백금(Platinum)이며, 상기 고분자층은 복수의 PEG(Polyethylene glycol)로 이루어지는 것을 예시할 수 있다.

즉, 본 발명의 진단 입자는 백금이 도금된 금 입자 표면에 고분자층을 코팅한 형태로 이루어진다.

일반적으로 금 입자에 PEG(Polyethylene glycol)를 씌어서 코팅하게 되는데,금 입자 표면에 코팅되는 PEG 코팅시 S-S 결합을 하면서 층을 형성한다.

그런데, 본 발명에서는 단백질이 금 입자 보다 Platinum 입자에 좀 더 효율적으로 결합할 수 있다는 특징을 이용하여 금 입자 표면에 백금을 도금한 것을 특징으로 한다.

즉, 백금(Platinum)과 금의 전자배치를 비교해보았을 때, 금의 최 외각전자 층 보다 백금(Platinum)의 최외각전자 층에 전자가 더 접근하기 쉽다는 것을 이용한 것이다. 백금 도금을 하게 되면 PEG가 S-S 결합을 할 때 더 견고하게 쌓이기 때문에 항체와 같은 단백질가 더 효율적으로 결합할 수 있게 된다.

그리고 Platinum 자체는 육안으로 분석을 할 수는 없지만 금 입자(Gold Colloidal)는 발색을 하기 때문에 진단 육안 분석이 가능하기 때문에 금 입자와 백금을 함께 사용하게 되었다.

이하에서는 본 발명에 따른 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트용 진단 입자의 제조방법을 상세히 설명한다.

먼저, 도 2a는 본 발명에 따른 Platinum이 도금된 금 입자에 PEG 층을 씌우고 그 표면을 -COOH기로 만드는 과정을 도시한 도면이고, 도 2b는 도 2a의 생성물에 대한 구체적인 구조로 Au-Pt-PEG-COOH의 구조를 나타내는 도시한 도면으로서, 이들을 참조하면, PEG(Polyethylene glycol)를 room temperature에서 equilibrate 시킨 다음, PEG를 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹이고, 그 용액에 DTT(Dithiothreitol)를 PEG와 같은 양으로 첨가한다. Platinum으로 도금된 Gold Colloidal(NANOPARTZ INC, 미국)를 BSA(Bovine serum albumin)가 존재하는 용액에 첨가해 room temperature에서 교반한다. 만들어진 두 용액을 섞고, 15분 동안 room temperature에서 교반하여 생성물 1을 마련한다.

다음으로, 도 2c는 도 2a의 생성물에 -COOH기를 -NHS로 바꾸는 과정을 나타내는 도면이고, 도 2c에 대한 과정을 순차적으로 나타내는 도면으로서, 이들을 참조하면, pH 5~6의 MES buffer(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)에 EDC/NHS(Thermo fisher, 미국)를 넣고 충분히 교반한 다음, 생성물 1을 포함한 용액을 첨가해 교반한다. 남은 EDC/NHS를 제거하기 위해 MES buffer로 washing을 하여 생성물 2를 마련한다. 여기서, EDC/NHS는 [1-ethyl-3 3-dimethylaminopropyl carbodiimide)/(N-Hydroxysuccinimide) ester]을 의미한다.

그 다음으로, 도 2e는 최종 생성물에 대한 구조를 나타내는 도면이고, 도 2f는 최종 생성물에 대한 구체적인 구조를 나타내는 도면으로서, 항체인 Anti CRP 13307(Boreda biotect, 한국)를 pH 7.0이상의 PBS buffer에 충분히 녹인다. pH를 높여주기 위해 생성물 2를 포함한 용액에 PBS buffer(Phosphate-Buffered Saline)를 첨가해준 다음, 즉시 항체를 포함한 용액을 첨가해주고 2시간 정도 교반하면 최종 생성물 3인 진단 입자가 얻어진다.

이하에서는 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트의 구조 및 그 제조방법을 상세히 설명한다.

도 3a는 본 발명의 스트립 구조를 나타내는 도면이고, 도 3b는 고감도 체외 진단 키트를 이용한 분석 과정시 일어나는 흐름의 변화를 모식적으로 나타내는 도면이다.

도 3a 및 도 3b를 참조하면, 본 발명에 따른 고감도 체외 진단 키트(100)는 측방 유도형(LFA,Lateral flow array) 형태의 스트립(110)을 포함하는 것으로서, 크게 스트립(strip)(110)을 포함하여 이루어진다.

상기 스트립(110)은 다공성 막(111)과, 상기 다공성 막(membrance)(111)의 일단에 배치되는 컨쥬게이션 패드(conjugation pad)(120)와, 상기 컨쥬게이션 패드(120)의 일단에 마련되는 샘플 패드(sample pad)(130)와, 상기 다공성 막(111)의 타단에 배치되는 흡수 패드(absobtion pad)(140)를 포함한다.

상기 다공성 막(111)은 모세관 현상에 의해 시료를 이동할 수 있도록 해주는 것으로서, 니트로 셀룰로오스(nitro cellulose)로 이루어지는 것을 예시할 수 있다.

상기 컨쥬게이션 패드(120)에는 진단 입자가 적층된다. 시료가 상기 샘플 패드(130)를 지나 제1항체(121)가 존재하는 컨쥬게이션 패드(120)로 이동하면 시료에 포함된 타겟 물질(예를 들어, 항원)과, 제1항체(121)가 항원-항체 결합을 하여 상기 타겟 물질은 라벨링된다.

상기 다공성 막(111)에는 상호 이격하여 배치되는 테스트 라인(test line)(113) 및 컨트롤 라인(control line)(117)이 형성된다.

상기 테스트 라인(113)에는 상기 타겟 물질과 결합한 제1항체(121)와 결합하는 제2항체(122)가 형성된다.

상기 컨트롤 라인(117)에는 상기 타겟 물질과 결합하지 않은 제1항체와 비특이적으로 결합하는 제3항체(123)가 형성된다.

상기 흡수 패드(absobtion pad)(140)는 상기 샘플 패드(130), 컨쥬게이션 패드(120) 및 테스트 라인(113)과 컨트롤 라인(117)을 거쳐 이동한 시료를 흡수하고, 모세관 현상을 통해 시료가 이동할 수 있는 동력을 제공하는 역할을 수행한다.

샘플 패드(130)에 샘플(101)이 담긴 용액이 투하되면, 컨쥬게이션 패드(120)에 존재하는 나노 금 입자와 라벨링 된 제1항체(121)와 결합하여 테스트 라인(113)으로 흘러가게 된다.

샘플(1)과 결합된 제1항체(121)가 테스트 라인(113)에 존재하는 제2항체(122)와 결합하게 된다. 결합하고 남은 제1항체들은 컨트롤 라인(117)으로 흘러가게 되는데 컨트롤 라인(117)에 존재하는 제3항체(123)와 비특이적으로 결합을 하게 된다. 테스트 라인(113)과 컨트롤 라인(117)에 각각 항체가 결합함으로써 각 라인에 해당하는 위치에 밴드(band)가 생긴다.

1. 스트립의 제조

도 3a를 참조하면 본 발명의 스트립 제조에 있어서, Sample pad는 grade 222, conjugation pad는 grade 8964, NC membrane은 HF-135를 사용하며, Absorption pad로는 grade 319을 사용하여 strip을 제조한다.

2. DISPENSER SYSTEM(ZETA corporation, 한국)을 사용한 라인 분주 및 키트 제조

DISPENSER SYSTEM은 60mm/sec의 속도와 1.0uL/cm의 양으로 진단 키트 스트립에 존재하는 컨트롤 라인, 테스트 라인에 속하는 영역의 NC membrane에 capture antibody를 붙인다. 컨트롤 라인의 캡쳐 역할을 하는 항체 Rat Ig G(Jackson Immuno research, 미국)를 1XPBS에 1mg/ml의 농도로 녹이고, DISPENSER SYSETEM 장비를 사용하여 분주를 시작한다. 테스트 라인의 캡쳐 역할을 하는 항체 Anti CRP 13300(Boreda Biotect, 한국)도 1mg/ml의 농도로 1XPBS에 녹여 라인 분주를 한다. 분주가 완료 되면 컷팅을 하고, 조립하여 키트를 제조한다.

3. Base buffer의 제조

Sample을 희석하는 용도로 base buffer를 제조한다. 0.5% Tween 20,1% BSA, 0.1% NaN, 1XPBS를 첨가하고, 다 녹을 때까지 교반하고, pH meter로 pH를 측정한다.

[실험예 1]

진단 키트 분석 방법 및 결과 밴드(band) 분석

샘플을 실시예 2에서 만든 buffer에 희석하고, 마이크로 피펫으로 100ul를 샘플 패드에 투하한다. 10분 정도 기다리고, 진단 키트의 스트립에서 나오는 밴드(band)의 결과를 분석한다.

도 4a는 기존의 Gold Colloidal의 스트립(위 사진)에 대한 음성 결과와, 실험예 1의 진단 키트의 스트립(아래 사진)의 음성 결과를 비교 실험한 결과를 나타내는 사진이며, 도 4b는 기존의 Gold Colloidal의 스트립(위 사진)에 대한 양성 결과와, 실험예 1의 진단 키트의 스트립(아래 사진)의 양성 결과를 비교 실험한 결과를 나타내는 사진이다.

도 4a 및 도 4b에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따라 Platinum이 도금 된 Gold Colloidal를 사용한 경우, 기존의 Gold Colloidal을 사용한 경우에 비해, 음성 및 양성 모두 고감도 진단을 할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 설명된 본 발명은 예시적인 것에 불과하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 잘 알 수 있을 것이다. 그러므로 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다. 또한, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

100 : 체외 진단 키트 101 : 샘플
110 : 스트립 111 : 다공성 막
113 : 테스트 라인 117 : 컨트롤 라인
120 : 컨쥬게이션 패드 121 : 제1항체
121a : 진단 입자 121b : 항체
122 : 제2항체 123 : 제3항체
130 : 샘플 패드 140 : 흡수 패드

Claims

PEG(Polyethylene glycol)를 room temperature에서 equilibrate 시킨 다음, PEG를 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹이고, 그 용액에 DTT(Dithiothreitol)를 PEG와 같은 양으로 첨가하고,
Platinum으로 도금된 Gold Colloidal를 BSA(Bovine serum albumin)가 존재하는 용액에 첨가해 room temperature에서 교반하며,
만들어진 두 용액을 섞고, 15분 동안 room temperature에서 교반하여 생성물 1을 마련하며,
다음으로, pH 5~6의 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid인 MES buffer에 EDC/NHS를 넣고 충분히 교반한 다음, 생성물 1을 포함한 용액을 첨가해 교반하며,
남은 EDC/NHS를 제거하기 위해 MES buffer로 washing을 하여 생성물 2를 마련하며,
그 다음으로, 항체인 Anti CRP 13307를 pH 7.0이상의 PBS buffer에 충분히 녹이고, pH를 높여주기 위해 생성물 2를 포함한 용액에 PBS buffer를 첨가해준 다음, 항체를 포함한 용액을 첨가해주고 교반하여 진단 입자가 얻는 것을 특징으로 하는
고감도 체외 진단 키트용 진단 입자 제조방법.

여기서, EDC/NHS는 [1-ethyl-3 3-dimethylaminopropyl carbodiimide)/(N-Hydroxysuccinimide) ester]을 의미한다.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제