JP2003262638A

JP2003262638A - 金属コロイド粒子

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Publication number: JP2003262638A
Application number: JP2002063024A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Ishizuka; 康司石塚; Fumihiko Hasumi; 文彦蓮実; Yasuharu Nanba; 靖治難波; Urao Nonaka; 浦雄野中; Ichiro Okura; 一郎大倉
Original assignee: BL KK
Current assignee: BL KK
Priority date: 2002-03-08
Filing date: 2002-03-08
Publication date: 2003-09-19
Anticipated expiration: 2022-03-08
Also published as: JP3886000B2

Abstract

(57)【要約】【課題】金コロイド粒子よりも一層高感度で、免疫学
的測定用標識剤及びタンパク質染色剤として好適な金属
コロイド粒子を提供することを目的とする。【解決手段】溶媒中にて塩化金酸を還元して金コロイ
ド粒子を生成せしめた後、該金コロイド粒子の存在下で
塩化白金酸を還元することによって、金コロイド粒子の
表面に白金を担持させてなる金属コロイド粒子、およ
び、当該金属コロイドによって標識された抗体または抗
原を用いる免疫学的測定法および測定キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫学的測定用標
識剤及びタンパク質染色剤として好適な金属コロイド粒
子およびその製造方法に関し、さらに詳細には、該金属
コロイド粒子を用いた標識抗体または抗原、ならびに、
該標識抗体または抗原が組み込まれた免疫学的測定用キ
ットおよび免疫学的測定法に係る。

【０００２】

【従来の技術】免疫学的測定法、就中、イムノクロマト
法（ＩＣＡ法）は、その高い特異性に加え、簡易、迅速
を特徴とする臨床診断法として実用化されている。イム
ノクロマト法は、操作が煩雑で重厚な設備、機器などを
必要とせず、軽便な器具を使用した簡便な操作により、
目視だけでも被検出物の有無を判定できる点で好都合で
ある。

【０００３】近年、感染症の診断にイムノクロマト法が
用いられているが、その検出感度は、一般に、細菌の場
合、１０^５〜１０^７ＣＦＵ／ｍｌである。細菌の検出感
度は遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）によれば１０^３〜１０^４
ＣＦＵ／ｍｌまで達成されている。しかしながら、遺伝
子増幅法は重厚な設備、機器および煩雑な操作が必要で
あり、しかも、検出までに数時間という長時間を要す
る。

【０００４】また、従来、Ｂ型肝炎ウイルスの免疫学的
測定法による検出も行われているが、その感度は、最も
高感度の酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）でも１０^４〜
１０ ^５ＰＦＵ／ｍｌである。感染可能なウイルスの濃度
は１０^３ＰＦＵ／ｍｌであるため、早期の診断感染予防
には、現行の１０倍から１００倍の感度を有する診断法
の開発が求められている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従来、イムノクロマト
法（ＩＣＡ法）では、細菌やウイルスを特異的に検出す
るために、金コロイドで標識された抗体を用いることが
一般的である。しかしながら、この金コロイド標識を用
いたイムノクロマト法の感度は、上記感染症診断に要求
される感度を達成するためには必ずしも十分とは言え
ず、一層高感度な標識が求められている。タンパク質の
染色に従来使用されている白金コロイド粒子を抗体の標
識に用いることも考えられるが、イムノクロマト法にお
いては白金コロイド粒子の平均粒径が小さいために発色
が不充分であり、実用には適さないとされていた。

【０００６】本発明は、金コロイド粒子よりも一層高感
度で、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤とし
て好適な金属コロイド粒子を提供することを目的とす
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
の下に鋭意研究した結果、金コロイド粒子の表面に白金
微粒子を担持させることにより、金コロイドよりも一層
高感度で、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤
として好適な金属コロイド粒子が得られることを見出
し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明によれば、金コロイド粒
子の表面に白金を担持させてなる金属コロイド粒子が提
供される。本発明では、金コロイド粒子の表面が部分的
にまたは全体的に白金で被覆されている態様も包含さ
れ、したがって、上記「担持」の用語は、この白金で被
覆された態様も含むものである。

【０００９】タンパク質の染色に従来用いられている白
金コロイド粒子は、粒径が最大で３２オングストローム
程度であったが、本発明の金属コロイド粒子は、金コロ
イド粒子の表面に白金を担持させた構成であるため、従
来の白金コロイド粒子よりも見かけ上大きな粒径を有す
る白金コロイド粒子として機能するため、視認性に優
れ、しかも、その表面は良好な白金活性を維持してい
る。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の金属コロイド粒子は、溶
媒中にて塩化金酸を還元して金コロイド粒子を生成せし
め（以下「第１段還元」と記す）、しかる後、溶媒中に
て該金コロイド粒子の存在下で塩化第二白金酸（Ｈ
_２［ＰｔＣｌ_６］（以下「塩化白金酸」と記す）を還元
する（以下「第２段還元」と記す）ことによって製造す
ることができる。とりわけ、還元剤を含む溶媒中にて塩
化金酸を還元して適当な粒径まで金コロイド粒子を生成
せしめた後、直ちに前記溶媒中に適量の塩化白金酸を添
加して還元させることにより、前記溶媒中の金コロイド
粒子の表面に白金または白金微粒子を担持させることが
好ましい。

【００１１】還元剤としては、クエン酸ナトリウムおよ
びアスコルビン酸ナトリウムなどが好適に使用されるが
他の化合物を使用することを妨げない。

【００１２】溶媒としては、通常、水が用いられるが、
超純水や、イオン交換水を数回蒸留したものを使用する
ことが好ましい。また、第１段還元及び第２段還元の何
れも、溶媒を沸騰させるか、または、溶媒に窒素ガスな
どの不活性気体を吹き込んで７０℃付近に維持して、溶
媒から溶存酸素を除去した状態で行うことが好ましい。

【００１３】上記製造方法において、白金を担持させる
前の金コロイド粒子の平均粒径は、好ましくは、３０〜
１００ｎｍ（ナノメートル）程度とされ、さらに好まし
くは、４０〜８０ｎｍ（ナノメートル）程度とされる。
金コロイド粒子の平均粒径が過小の場合、白金層が厚く
なり触媒活性が低下する。また、過大の場合には金コロ
イド粒子表面が安定化し、白金の担持が不可能となる。

【００１４】また、本発明の金属コロイド粒子の平均粒
径は、実用上、通常は、５０〜１５０ｎｍナノメートル
程度とされ、さらに好ましくは、６０〜１２０ｎｍ（ナ
ノメートル）程度とされる。金属コロイド粒子の平均粒
径が過小の場合、抗体の標識が十分に行えなくなり抗体
の機能が失われ、また、過大の場合、メンブレンフィル
ターを目詰まりさせることになる。

【００１５】本発明において、金コロイド粒子および金
属コロイド粒子のそれぞれの平均粒径は、いわゆる重力
的光散乱法により求められ、具体的には、各コロイド粒
子をゾル状態のままで１４０００〜５５３００００×ｇ
（重力の大きさ）にて回転せしめた超遠心分離機にかけ
た際のコロイド粒子の沈降速度から求められる。なお、
このようにして求められた金粒子および白金粒子のそれ
ぞれの平均粒径は電子顕微鏡観察により直接測定された
金粒子および白金微粒子のそれぞれの平均粒径と実質的
に一致する。

【００１６】金コロイドおよび金属コロイドの粒径なら
びに担持される白金の量及び厚さは、第１段還元および
第２段還元のそれぞれにおける塩化金酸および塩化白金
酸の添加量、還元剤の濃度、還元時間などの各種条件を
変更することに適宜調節できる。還元剤の濃度は、第１
段還元及び第２段還元の何れにおいても、溶媒全量に対
して、０.０２〜０.５重量／容量％（以下、特に断らな
い限り、「％」は「重量／容量％（w/v%）」を意味す
る）とすることが好ましい。

【００１７】第１段還元における塩化金酸の添加量は、
溶媒全量に対して、０.００１〜０.０５％とすることが
好ましい。第２段還元における塩化白金酸の添加量は、
第１段還元で添加した塩化金酸１００重量部に対して、
１００〜５００重量部とすることが好ましい。還元時間
は、一般に、第１段還元及び第２段還元のそれぞれにお
いて、添加された全ての金コロイド及び白金コロイドが
還元される時間に設定することが好ましいが、これに限
定されるものではない。

【００１８】本発明の金属コロイド粒子は、通常の白金
コロイド粒子と同様に、タンパク質に吸着して集積する
ことにより黒色を呈するので、各種タンパク質の染色剤
として使用でき、また、通常の金コロイド粒子と同様
に、免疫学的測定用標識剤として用いることができる。
本発明の金属コロイド粒子は、表面に白金が存在するた
め、パーオキシダーゼ活性など、高い酸化還元触媒活性
を有する。したがって、酸化還元反応によって呈色する
発色剤と本発明の金属コロイド粒子とを併用することに
よって、タンパク質を高感度で検出できる。かかる発色
剤としては、硫酸銅などの銅（ＩＩ）イオンや、３，
３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）
などが好適である。本発明の金属コロイド粒子は、ＴＭ
ＢＺの存在下では濃厚な青色に変色し、また、酸化銅や
硫酸銅などの銅（ＩＩ）イオンの存在下ではさらに濃厚
な黒色を呈する。

【００１９】本発明の金属コロイド粒子は、常法により
抗原および抗体のそれぞれを標識することができ、イム
ノクロマト法やその他の各種免疫学的測定法に使用でき
る。また、このようにして標識された抗原および抗体
は、イムノクロマト法測定キットやその他の各種免疫学
的測定キットに組み込むことができる。

【００２０】

【実施例】実施例１［白金微粒子被覆金コロイド粒子の
調製］（１）使用するガラス器具の全てを王水で洗浄した。（２）３９０ｍｌの超純水をフラスコに入れて沸騰さ
せ、この沸騰水に塩化金酸水溶液（水溶液１リットル当
たり金として１ｇ、片山科学工業株式会社製）３０ｍｌ
を加え、その後、１重量％クエン酸ナトリウム水溶液６
０ｍｌを加え、６分４５秒後に、塩化白金酸水溶液（水
溶液１リットル当たり白金として１ｇ、和光純薬工業株
式会社製）３０ｍｌを加えた。塩化白金酸水溶液添加か
ら５分後に１重量％クエン酸ナトリウム水溶液６０ｍｌ
を加え、４時間、還流を行い、白金微粒子被覆金コロイ
ド懸濁液を得た。（３）得られた白金微粒子被覆金コロイド懸濁液１ｍｌ
を１３８００×ｇで２５分間遠心分離を行い、遠心分離
後、上清を除き、残った沈殿に超純水を０．５ｍｌ加
え、攪拌後、超音波で沈殿を再懸濁せしめ、この懸濁液
を２００ｍＭ炭酸カリウム水溶液でｐＨ９．０に調整
し、これに超純水を加えて全量を１００ｍｌとして白金
微粒子被覆金コロイド再懸濁液を得た。この再懸濁液中
の白金微粒子被覆金コロイドの平均粒径を、動的光散乱
式粒径分布測定装置ＬＢ−５００（（株）堀場製作所
製）によって測定したところ、９０ナノメートル（ｎ
ｍ）であった。

【００２１】実施例２［白金−金コロイド標識抗体の調
製］抗ヒトＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白、Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ）マウス単クローン抗体（株式会社日本
バイオテスト研究所製）の蛋白換算重量１μｇ（以下、
抗体の重量を示すとき、その蛋白換算重量を示す）と、
実施例１で得られた白金微粒子被覆金コロイド再懸濁液
１ｍｌとを混合し、室温で２分間静置して、この抗体の
全量を該再懸濁液中の白金微粒子被覆金コロイド粒子
（以下「白金−金コロイド粒子」と記す）と結合させ
た。

【００２２】これに最終濃度が０．２％となるように１
％ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」と記す）水溶液
を加えて、上記抗体に結合せしめられた白金−金コロイ
ド粒子の表面をブロックした。この懸濁液を５５３×ｇ
で２５分間遠心分離して、白金−金コロイド粒子の表面
がＢＳＡでブロックされた白金−金コロイド標識抗体を
沈殿せしめて集めた。この白金−金コロイド標識抗体
を、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および１％
ＢＳＡを含有する５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ
７．４）に再懸濁して、精製白金−金コロイド標識抗体
懸濁液を得た。

【００２３】実施例３［イムノクロマト法テストストリ
ップの作成］図１に示されるイムノクロマト法テストストリップを作
成した。すなわち、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯
状のニトロセルロース製メンブレンフィルターをクロマ
トグラフ媒体のクロマト展開用膜担体３として用意し
た。該膜担体のクロマト展開始点側の末端から７．５ｍ
ｍの位置に、抗ヒトＣＲＰマウス単クローン抗体６．３
ｍｇ／ｍｌを含有した抗体液０．５μｇをスポット状に
塗布して、これを室温で乾燥して捕捉部位３１とした。
この捕捉部位３１が発色を観察する判定ゾーンとされ
る。なお、この抗ヒトＣＲＰマウス単クローン抗体は、
免疫反応において、抗原であるヒトＣＲＰに対する結合
部位が、実施例２の白金−金コロイド標識抗体の調製に
使用された抗体とは異なる抗体をいう。（２）また、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織
布に、実施例２で得られた精製白金−金コロイド標識抗
体懸濁液３７．５ｌμｌを含浸せしめ、これを室温で乾
燥させて精製白金−金コロイド粒子標識抗体含浸部材２
とした。

【００２４】（３）次に、試料添加用部材である綿布
５、上記の精製白金−金コロイド標識抗体含浸部材２、
クロマト展開用膜担体３および吸収用部材４である帯状
の濾紙のそれぞれを、図１に示されるように、帯状の粘
着シート１の粘着面の所定位置に貼着してイムノクロマ
ト法テストストリップとした。すなわち、このクロマト
展開用膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担
体３のクロマト展開の開始点側（すなわち図１の左側、
以下「上流側」と記す、また、その逆の側、すなわち図
１の右側を、以下「下流側」と記す）の末端の上に、精
製白金−金コロイド粒子標識抗体含浸部材２の下流側末
端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の
上流側部分を粘着シート１に貼着し、該含浸部材２の上
面に試料添加部材５の下流側部分を載置するとともに、
該試料添加部材５の上流側部分を粘着シート１に貼着し
た。さらに、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材
４の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材４の
下流側部分を粘着シート１に貼着せしめて、イムノクロ
マト法テストストリップを得た。

【００２５】比較例１［金コロイドの調製］（１）使用するガラス器具の全てを王水で洗浄するかま
たはシリコンコーティングした。（２）９９ｍｌの超純水をフラスコに入れて沸騰させ、
この沸騰水に塩化金酸（片山科学工業株式会社製）水溶
液（水溶液１リットル当たり金として５.８ｇ）１ｍｌ
を加え、さらにその１分後に、１重量％クエン酸ナトリ
ウム水溶液１．５ｍｌを加え、５分間還流を行い、その
後、室温に放置して冷却し、懸濁液を得た。次いで、こ
の懸濁液を２００ｍＭ炭酸カリウム水溶液でｐＨ９．０
に調整し、これに超純水を加えて全量を１００ｍｌとし
て金コロイド懸濁液を得た。

【００２６】比較例２［金コロイド標識抗体の調製］白金微粒子被覆金コロイド再懸濁液の代わりに比較例１
の金コロイド懸濁液を用いた以外、実施例２と同様にし
て、金コロイド標識抗体を得た。

【００２７】比較例３［イムノクロマト法テストストリ
ップの作成］白金−金コロイド標識抗体の代わりに比較例２の金コロ
イド標識抗体を使用した以外、実施例３と同様にして、
イムノクロマト法テストストリップを得た。

【００２８】試験例１［イムノクロマト法による測定］実施例３及び比較例３で得られたイムノクロマト法テス
トストリップを使用して、抗原であるリコンビナントＣ
ＲＰを測定した。すなわち、リコンビナントＣＲＰ（オ
リエンタル酵母工業株式会社製）を、０．２５％ツイー
ン（Ｔｗｅｅｎ）２０および０．２５％ＢＳＡを含む
０．１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）と混合し、リコ
ンビナントＣＲＰの濃度が１５．６、３１．３、６２．
５、１２５および２５０ｐｇ（ピコグラム）／ｍｌの供
試液を調製した。これらの供試液１００μｌを、上記の
イムノクロマト法テストストリップの試料添加部材５上
に滴下して膜担体３に展開せしめ、１５分後に捕捉部位
３１の発色の濃度を肉眼で観察した。ブランクは０．２
５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および０．２５％ＢＳ
Ａを含む０．１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）とし
た。結果を表１に示す。発色濃度の判定は、下記４段階
基準に従った。

【００２９】＋＋：濃い黒色に発色、＋：黒色に発色、 ± ：薄い黒色に発色、 − ：発色せず。

【００３０】

【表１】

【００３１】表１の結果から、本発明の白金−金コロイ
ド粒子で標識された抗体を使用した場合には、抗原であ
るリコンビナントＣＲＰを１５．６ｐｇ／ｍｌまで測定
できるのに対し、金コロイド粒子で標識された抗体を使
用した場合には抗原であるリコンビナントＣＲＰを２５
０ｐｇ／ｍｌまでしか測定できないことが判る。したが
って、本発明の白金−金コロイド粒子は、従来の金コロ
イド粒子よりも約１６倍の感度を有する。

【００３２】試験例２［発色剤を併用したイムノクロマ
ト法による測定］試験例１における展開後のイムノクロマト法テストスト
リップの捕捉部位３１に３，３’，５，５’−テトラメ
チルベンチジン（ＴＭＢＺ）（ペルオキシダーゼ用発色
キットＳＴ（株式会社タウンズ製））を１μｌ加え、１
０分間静置後に青色の発色の濃度を肉眼で観察した。発
色の濃度の判定は、下記５段階基準に従った。

【００３３】＋＋＋：非常に濃い青色に発色、＋＋：濃い青色に発色、＋：青色に発色、 ± ：薄い青色に発色、 − ：発色せず。

【００３４】

【表２】

【００３５】表２の結果から、白金−金コロイド粒子で
標識された抗体とＴＭＢＺを併用した場合には、抗原で
あるリコンビナントＣＲＰを３．９１ｐｇ／ｍｌまで測
定できることが示された。したがって、本発明の白金−
金コロイド粒子に発色剤を併用することによって、従来
の金コロイド粒子の約６０倍以上も感度を向上できる。

【００３６】

【発明の効果】本発明の金属コロイド粒子は、タンパク
質染色剤および免疫学的測定用標識剤として有用であ
り、特に、イムノクロマト法の標識剤として用いた場
合、従来の金コロイドの１０倍以上の感度が得られる。
さらに、本発明の金属コロイド粒子は、白金同様の酸化
還元触媒活性を有するので、酸化還元反応によって呈色
する発色剤と併用することにより、従来の金コロイドの
６０倍以上の感度が得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ａは本発明によるイムノクロマト法テストスト
リップの平面図、ｂはａで示されたクロマト法テストス
トリップの縦断面図。

【符号の説明】

１粘着シート２標識抗体含浸部材３クロマト展開用膜担体３１捕捉部位４吸収用部材５試料添加部材

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者難波靖治静岡県沼津市大平1126番地の９株式会社ビーエル内 (72)発明者野中浦雄静岡県沼津市大平1126番地の９株式会社ビーエル内 (72)発明者大倉一郎神奈川県横浜市青葉区大場町930−77

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】金コロイド粒子の表面に白金を担持させ
てなる金属コロイド粒子。
【請求項２】金属コロイド粒子の平均粒径が５０〜１
５０ナノメートルである請求項１に記載の金属コロイド
粒子。
【請求項３】金コロイド粒子の平均粒径が３０〜１０
０ナノメートルである請求項１記載の金属コロイド粒
子。
【請求項４】溶媒中にて塩化金酸を還元して金コロイ
ド粒子を生成せしめた後、該金コロイド粒子の存在下で
塩化白金酸を還元することを特徴とする金属コロイド粒
子の製造方法。
【請求項５】請求項１に記載の金属コロイド粒子を含
有するタンパク質染色剤。
【請求項６】請求項１に記載の金属コロイド粒子を含
有する免疫学的測定用標識剤。
【請求項７】請求項１に記載の金属コロイド粒子によ
って標識された抗体または抗原。
【請求項８】請求項７に記載の抗体または抗原を備え
る免疫学的測定用キット。
【請求項９】請求項７に記載の抗体または抗原を使用
することを特徴とする免疫学的測定法。
【請求項１０】免疫学的測定がイムノクロマト法に基
づくものである請求項８に記載の免疫学的測定用キッ
ト。
【請求項１１】免疫学的測定法がイムノクロマト法で
ある請求項９に記載の免疫学的測定法。